CN101035433B - 含受体配体的发酵乳或蔬菜蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本方明涉及对含有受体配体的组合物的利用，该受体配体可经过乳酸菌对包括动物乳或蔬菜蛋白在内的食物进行发酵，以获得含肾上腺素受体和/或5-羟色胺受体的特异性配体的经发酵的食物或饲料原料而获得。经发酵的食物或饲料原料可用于降低和/或稳定哺乳动物的心率，以及还可能被进一步用于治疗和/或减轻哺乳动物的勃起功能障碍，以及治疗和/或减轻哺乳动物的前列腺增生(BPH)。

Description

含受体配体的发酵乳或蔬菜蛋白及其应用
发明领域：
本方明涉及对含有受体配体的组合物的利用，制备该受体配体的方法包括用至少一种乳酸菌对包括动物乳或蔬菜蛋白在内的食物材料进行发酵，以获得含活性成分的发酵的食物材料。发酵的食物材料能影响特异性的肾上腺素受体(adrenorecepter)和/或5-羟色胺(5-HT，serotonin)受体，可用于如降低和/或稳定哺乳动物的心率，以及治疗和/或减轻哺乳动物的勃起功能障碍及治疗和/或减轻哺乳动物的良性前列腺增生(BPH)。
背景技术：
低的静止心率与改善的存活率有关已明确得到一些研究的支持。已有一些研究表明，在一般人群中，较高的静止心率与死亡率的增加有很强的正关联性。已观察到静止心率超过88次/分钟(bpm)的男性的死亡率的增加是静止心率低于65bpm的男性组的两到三倍。心率不仅与心血管导致的死亡率相关，而且视乎也与其他疾病如癌症导致的死亡相关。Zaza等提出了通常在低心率和期望寿命之间存在某种关系的假设(Zaza et al.，2001)。
当今，在工业化国家中，最常见的心血管疾病是冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏疾病(CHD)，它们均是心脏病的主要诱因。CAD和CHD是在心脏表面的动脉发生“硬化”。这里的术语“硬化”是指导致动脉变得狭窄和僵硬以致血液的自由流动受阻的状况。
较低的心率与较好的心脏状况相关，特别是与降低心律不齐的危险有关。较高的心率可能反映出较高的新陈代谢速率和较低的迷走神经紧张(vagal tone)，从而增加局部缺血的危险。此外，较高的心率还可能导致心室功能恶化(Lombardi，F in Zaza et al.，2001)。因此，高心率 成为与CAD或CHD相关的一个重要的危险因子就不足为奇了。通常CAD或CHD都是用药物进行治疗。这些药物落入以下不同的类别，例如：
1.β-阻滞剂，其通过阻滞某些化学物质与心脏中的β-受体结合，而降低心脏的负荷。
2.硝酸盐，其直接作用于血管，致使血管松弛从而容许更多的富氧血抵达心脏。
3.钙通道阻滞剂，其提高通过心脏的血流量，并可通过阻滞钙离子传信给血管进行收缩或紧缩，而降低心脏负荷。
4.抗血小板剂(例如阿司匹林)，其通过降低血小板(存在于血液中微粒子)凝聚形成血块的能力，而抑制血块的形成。
在疾病发展的早期进行高心率的预防可作为药物治疗高心率的替代疗法。大量的由食物衍生的生物活性的化合物目前被认为对总体幸福指数或促进健康有利。
已经知道用乳酸菌(LAB)对乳进行发酵可产生抗高血压的效果，这得利于乳酸菌的蛋白分解活性，其使得肽从乳的酪蛋白中得以释放。对此的说明可参见如EP821968(Calpis Food Industry)，EP1016709(CalpisFood Industry)和WO0132836(Valio Ltd.)。
Yamamoto等(1996)的文章揭露了用含瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的发酵剂发酵的乳降低了心脏的收缩压和舒张压，然而，在包括脉冲率在内的其他指标中却未观察到有何变化。
WO0185984(Davisco International Foods，Inc.)也指出了肽具有抗高血压的作用(降低血压的作用)，其中的肽来自对乳清蛋白的酶消化。另外，还对心率和血压的变化进行了测量。观察到明显的平均动脉血压的降低，并且，除了在75mg/kg剂量下引起心率降低之外，在30和150mg/kg的剂量下，没有观察到明显的心率反应的差别。
如在Yamamoto等(1996)的文章中所描述的，Fuglsang，A.，等(2002)的文章也描述了发酵乳的肽具有抗高血压的功性。然而，在第3569页， 第1栏2段的关于测试样品的部分写到：“与未发酵的乳(即安慰剂)相比，其心率效果是不明显的”，这意味着其对心率的影响被认为是不明显的。
上述提及的Yamamot等(1996)的文章和Fugl sang(2002)的文章，以及WO0185984文件中认为尽管乳酸菌发酵的制品具有降低血压的功性，但却没有理由相信其也具有降低心率的功性。
发明内容：
本发明解决的问题是提供一种可替换的组合物，以用于降低心率，和/或减轻和/或治疗良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍。
解决方案是基于本发明的发明人出乎意料的发现，即通过用乳酸菌(LAB)发酵食物材料，优选发酵乳，结果所得的活性组分是若干种特异性肾上腺素-受体和5-羟色胺-受体的配体，并且对上述疾病有作用。
因此，本发明的第一方面涉及本发明的组合物在制造降低哺乳动物心率的制品中的应用，得到该组合物的方法包含用至少一种乳酸菌对包括动物乳或蔬菜蛋白在内的食物材料进行发酵，所获得的发酵的食物材料中包含至少一种组分是肾上腺素受体或5-羟色胺受体的配体。
接下来另一有趣的方面涉及到上述本发明第一方面在治疗和/或预防良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍中的应用。
本发明的再一方面提供了发酵的食物材料，其具有降低心率功性、和/或用于预防和/或治疗哺乳动物中的良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍，且是经至少一种乳酸菌菌株对食物材料进行发酵而获得，其中包含至少一种组分是肾上腺素受体或5-羟色胺受体的配体。其中，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)和/或嗜热链球菌对食物材料发酵是优选的实施方式。
含活的细菌的食物常常被认为对吸收特别有益(例如，益生菌)。因此，本发明的又一方面提供了含活的细菌的发酵的食物材料，其具有降低心率的功性，和/或可用于预防和/或治疗哺乳动物中良性前列腺增生 (BPH)和/或勃起功能障碍。在一优选的实施方式中，发酵的食物制品含有的活的细菌细胞是瑞士乳杆菌菌株DSM14998和/或嗜热链球菌或它们的突变体。
如剂量反应实验(例2)中所示，如果组合物是用更高浓度的降低心率的化合物制成，则有可能获得更大的反应。因此，本发明有趣的一方面是提供了从发酵的食物材料中分离出的活性成分。
在另一方面，本发明描述了发酵的食物材料或从中分离出的作为肾上腺素受体和/或5-羟色胺受体的α-或β-家族的配体的组分在制备治疗或减轻冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏疾病(CHD)，例如心绞痛、高血压、动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞、脑梗塞和血管重建术后的再狭窄、心律不齐、快速性心律失常、慢性充血性心力衰竭(CHF)、主动脉瓣关闭不全、慢性肾功能衰竭、异常脂血症、异常脂蛋白血症，和/或治疗和/或减轻良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍中的应用。
在进一步方面，本发明的发酵的食物材料或组合物包含至少一种组分，其选自由一氧化氮或抑制磷酸二酯酶-5或5-α还原酶的成分组成的组，以用于制备治疗或预防良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍的制品中的应用。
定义：
在对本发明的实施例进行详细描述前，先给出与本发明主要方面相关的特定术语的定义。
术语“用于降低哺乳动物的心率”是指相比于施用在此描述的组合物之前的心率的降低。优选的是在进行人体实验前，心率降低的功性应当已在动物模型中得以确认。在一种有用的动物模型中，用强饲法给自发性高血压大鼠(SHR)施用发酵的制品，并在强饲后用遥感勘测法确定尚有意识的SHR在24小时内不同时间点的心率。安慰剂应为相应的未发酵的食物材料，例如未发酵的乳。要获得更详细的信息，请参见实施例1。另外，也可用实施例4中描述的基于正常血压威斯达大鼠(Wistar rats)的模型来评估心率的降低。
在本文中，术语受体的“配体”被用来描述可结合到受体，从而可起到兴奋作用(“兴奋剂”)或抑制作用(“拮抗剂”)的组分。最终其可为受体竞争。
“肾上腺素受体(adrenoreceptor)”也被称为“肾上腺素能受体(Adrenergic Receptor)”，是去甲肾上腺素(noradrenaline)和肾上腺素(adrenalin)的受体。
在本文里，术语“5-羟色胺受体”是指在Peroutka(1979)中描述的结合到[3H]5-羟基色胺上的受体。
术语“乳酸菌”是指由革兰氏阳性、触酶阴性、非运动性、微嗜氧菌或厌氧菌组成的一组细菌，它们对糖进行发酵，所产生的酸中主要产物为乳酸，并含有醋酸、甲酸和丙酸。乳酸菌优选为厚壁菌门，更优选为杆菌种，进一步优选为乳酸杆菌。按此顺序，优选的乳酸菌是乳酸杆菌菌群种的细菌，更优选的是乳酸菌属的细菌。优选的是瑞士乳杆菌菌株。关于分类学的进一步详细信息可参见(Bergey’s Manual of SystematicBacteriology，Second Edition，Volume1：The Archea and the DeeplyBranching and Phototrophic Bacteria)。在工业上用的最多的乳酸菌是存在于二丁酮链球菌属(Lactococcus spp.)、粪链球菌属(Streptococcusspp.)乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostocspp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)、表皮短杆菌属(Brevibacterium spp.)和初油酸菌属(Propionibacterium spp.)中的乳酸菌。此外，属于严格厌氧菌群的产乳酸菌的双歧杆菌(Bifidobacteria)，即常被单独用作食物发酵剂或与乳酸菌结合使用的培养菌双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)通常被包括在乳酸菌中。
本发明的实施例描述如下，但仅作为示例目的。
发明的详细揭示：
食物材料
食物材料应当含有动物乳蛋白或蔬菜蛋白。
优选的食物材料含有动物乳蛋白，例如乳蛋白组分，例如全脂或脱脂动物乳或乳酪蛋白。最优选的乳是来自牛(黄牛，Bos taurus)的乳。
优选的含有蔬菜蛋白的食物材料，例如玉米、玉米蛋白、小麦、小麦 蛋白、大豆、脱脂大豆或大豆蛋白。
含有至少一种组分为肾上腺素受体或5-羟色胺受体的拮抗剂的制品，其中的肾上腺素受体或5-羟色胺受体可被用于降低心率，和/或治疗和/或减轻良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍。
如在实施例5和6中所描述的，使用在此描述的乳酸菌，在发酵后就直接提供了有用量的活性成分，该活性成分是特异性肾上腺素受体或5-羟色胺受体的配体。
对各种各样的肾上腺素受体的亚型已有记述。它们被归类为三族受体：β-受体(包括β-1和β-2)，α-1受体和α-2受体。这些受体均为7次跨膜G-蛋白偶联的受体，以不同的方式连接到腺苷酸环化酶(adenylatecyclase，AC)和磷酸肌醇酶(phosphoinosisitidase)第二信使通道上。儿茶酚胺荷尔蒙(catecholamine hormones)和神经传递素(neurotransmitters)：去甲肾上腺素(norepinepherine，noradrenaline)和肾上腺素肾上腺素(epinephrine，adrenaline)是肾上腺素的受体的正常生理性拮抗剂。并且，与心血管系统的调节有关的许多正常的和失常的生理性反应是通过肾上腺素的受体来介导。
α-肾上腺素的受体是交感神经系统反应，特别是那些涉及心血管自体调节的重要介导物质。这里的心血管自体调节例如，动脉平滑肌细胞收缩和心脏收缩，它们均可导致血压和心率的增加。另外，β-肾上腺素的受体在调节心血管系统中也扮演着重要的角色。对心脏收缩性的刺激是通过如β-1肾上腺素的受体和β-2肾上腺素的受体的活化而介导的，而β-1肾上腺素的受体引起心率的增加。因此，这些受体的拮抗剂可被用作降低或稳定心率。
尽管5-羟色胺受体的拮抗剂被认为与中枢神经系统的许多活动有关，它们也被认为参与了心血管系统的调节。经临床研究发现，5-羟色胺受体的拮抗剂酮色林(ketaserin)是有效的抗高血压剂。但是由于酮色林也可阻滞α-1肾上腺素受体(adreno receptor)(Borne，1994)，抗高血压的效果可能不能完全归功于酮色林的5-羟色胺受体的拮抗活性。
因此，本发明的一个实施方式是关于包含了选自含α-肾上腺素受体、β-肾上腺素受体、和5-羟色胺受体的组中的受体的拮抗剂的组合物在制备降低哺乳动物的心率的制品中的应用。
由实施例5和6可以看到，根据本发明，牛乳发酵后产生的化合物是一系列的α-和β-肾上腺素能受体，包括α1A-、α1B-、α2A(h)-、α2B(h)-、α2C(h)-、β1(h)-、β2(h)-、β3(h)-肾上腺素受体，甚或5-羟色胺受体的配体(很有可能是拮抗剂)。因此，本发明的一个实施方式是关于包含了选自含α1A-、α1B-、α2A(h)-、α2B(h)-、α2C(h)-、β1(h)-、β2(h)-、β3(h)-肾上腺素受体，甚或5-羟色胺受体的组中的受体的拮抗剂的组合物的应用。最为优选的是包含了选自含α2A(h)-、α2B(h)-和β2(h)-肾上腺素受体的组中的受体的拮抗剂的组合物的应用。
普遍认为性健康和性功能是决定生活质量高低的一项重要指标。随着人口的老年化，包括勃起功能障碍和女性性功能障碍在内的失调越来越显得突出。由于媒体对此现象广为关注，各年龄段的男女均在寻求改善他们的关系和经历和谐的性生活的途径。性功能障碍大多与糖尿病、高血压、冠状动脉疾病、神经疾病和抑郁症等疾病有关。在部分病人中，性功能障碍会是这些疾病的征状。此外，勃起功能障碍(ED)通常是由许多药物的副作用导致的。令人惊讶的是，荷尔蒙缺乏比起糖尿病或血管病来说，并不是导致勃起功能障碍的常见因素。对于50岁以上的男性而言，近一半的ED病例是由血管病引起的。血管疾病包括动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗塞和动脉高血压。目前用于治疗勃起功能障碍的口服药物包括选择性酶抑制剂例如西地那非(sildenafil)(枸橼酸西地那非，sildenafilcitrate，
Figure S05829621120070306D000071
)、盐酸伐地那非(vardenafil HCl)()、他达那非(Tadalafil)(
Figure S05829621120070306D000073
)和育亨宾碱(Yohimbine)(
Figure S05829621120070306D000074
Figure S05829621120070306D000075
)。
通过酚妥拉明(phentolamine)和类似化合物对α1-肾上腺素受体的阻滞提高了血管扩张剂在阴茎海绵体中的效果(Kim，2000)。具体的，早在100多年前，α-2肾上腺素的受体的拮抗剂就通过选择性药物如育亨宾碱(Yohimbine)(Morales，2000)，而用于治疗勃起功能障碍。此外， 对α-1肾上腺素的受体具有竞争性和相对选择性阻滞作用的莫西赛利(Thymoxamine，moxisylyte)在海绵体内注射后也有勃起产生(Brindley，1986)。这样，α-1和α-2肾上腺素的受体的拮抗剂就都能用于勃起功能障碍(阳痿)的治疗。
再有，本发明的另一个实施方式是关于包含了选自含α-肾上腺素受体的组中的受体的拮抗剂的组合物在制备治疗或预防哺乳动物的勃起功能障碍的制品中的应用。
对于50岁以上的男性而言，近一半的ED病例是由血管病引起的。因此认为除了含有α-1和α-2肾上腺素的受体的拮抗剂外，如果组合物还进一步含有β-肾上腺素的受体的拮抗剂以及甚或含有5-羟色胺受体的拮抗剂并且还进一步含有包括γ-丁酸(GABA)在内的化合物，则在治疗ED方面将显示出优势。因此，本发明的一实施方式是关于包含了选自含α-肾上腺素受体、β-肾上腺素的受体和5-羟色胺受体的组中的受体的拮抗剂的组合物在制备治疗或预防勃起功能障碍的制品中的应用。制品还可进一步包含GABA受体的拮抗剂，例如GABA本身。
良性前列腺增生(BPH)是老年男性的常见疾病。其表现为前列腺的大小、组成和功能的改变，并导致对中年和老年男子的膀胱和尿道的妨碍。主要由α-1肾上腺素的受体介导的前列腺平滑肌的正常伸缩性在BPH的临床表现中为一关键因子。因此，α-1肾上腺素的受体的拮抗剂将BPH的治疗剂从外科处理转化为药理上外来干预(Altwein，1995；Barry andRoehrborn，1997)。另外，α-2肾上腺素的受体的拮抗剂也表现出对BPH有有益的影响。
由实施例6可看到，在按照本发明对食物材料进行发酵时，产生了一系列的α-1和α-2肾上腺素的受体的拮抗剂，它们包括α1A-、α1B-、α 2A(h)-、α2B(h)-、α2C(h)-肾上腺素受体。因此，本发明的一个重要实施方式是由发酵的食物材料中获得的组合物在制备治疗或预防哺乳动物的良性前列腺增生(BPH)的制品中的应用，该发酵的食物材料中包含一种或多种选自含有α-肾上腺素受体和β-肾上腺素受体的组中的受体的拮抗剂。
本发明的特别重要的一实施方式是由发酵的食物材料中获得的组合物的应用，该发酵的食物材料中包含一种或多种选自含有α1A-、α1B-、α 2A(h)-、α2B(h)-、α2C(h)-、β1(h)-、β2(h)-和β3(h)-肾上腺素受体和5-羟色胺受体的组中的受体的拮抗剂。特别的优选的是含有α2A(h)-、α 2B(h)-或β2(h)-肾上腺素受体的拮抗剂的制品。
如果由发酵的食物材料得到的组合物中含有更多的各种相关受体的拮抗剂，例如，如果发酵的食物材料含有至少一种组分为肾上腺素的受体的配体和至少一种组分为5-羟色胺受体的配体，或如果发酵的食物材料含有至少一种组分为α-肾上腺素受体和β-肾上腺素受体的配体，则可预期获得更高的效率。可以预见的是，最为相关的配体类型是具有作为相应受体的拮抗剂特征的配体。
由实施例2～5，特别是由实施例6可看出，即使存在一定的剂量依赖关系，非浓缩的发酵物中仍含有一定量的拮抗剂以产生对特异性受体的特异性抑制，从而可被用于预防、减轻和/或治疗哺乳动物的BPH和/或勃起功能障碍，以及降低心率。因此，根据本发明，没有必要对发酵的食物材料作配体的进一步的纯化或浓缩即可获得效果。故在一实施方式中，发酵的食物材料可以直接包装，并作为食物制品而进入市场，优选是作为功能性食物制品，或食物添加剂，例如以冻干的形式供应。
本发明的乳制品可以是任何已知的或未知的发酵乳制品，例如乳酪、酸乳酪和饮用型酸乳酪。
应当理解的是，本发明的制品可含有活的微生物以产生对总体健康有益的效果。因此，这些制品可被描述为益生素制品而进行销售。
这在实施例1中得以证明。简言之，实施例1的结果表明，未经任何进一步处理的发酵乳其自身就具有很好的心率降低效果。进一步冻干的发酵乳可被悬浮于中性乳中，从而得到具有本发明的效果的适合的食物制品。冻干的发酵乳可被视作为适合的食物添加剂制品。
从实施例5中可看出，存在于发酵乳制品中以及存在于乳清部分中的活性成分结合到α-肾上腺素受体上。因此，可以预期本发明的制品可用 于预防、减轻和/或治疗涉及该特异性受体的疾病和症状。这样的疾病和症状包括但不限于心脏疾病、BPH和勃起功能障碍。
另外，基于本发明的活性成分是多种α-肾上腺素受体、β-肾上腺素受体，甚或5-羟色胺受体的配体(拮抗剂)的事实，可将本发明的制品用于与通过其他作用机理而产生类似效果的药物、化合物配体等进行联合给药。在进一步降低心率的化合物中，这样的化合物包括γ-丁酸，简称为GABA。GABA是由谷氨酸盐(Glu)经谷氨酸盐脱羧酶(GAD；EC4.1.1.15)的脱羧作用得到，并以吡哆醛磷酸盐(pyridoxal phosphate)作为辅助因素。据报道，微生物，特别是乳酸菌，例如乳酸乳杆菌属(Lactobacillussp.)、乳酸乳球菌属(Lactococcus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacteriumsp.)和链球菌属(Streptococcus sp.)，具有谷氨酸脱羧酶活性，并从谷氨酸产生GABA。
多年来GABA就以其有益于健康而引起人们的兴趣。这种分子含有中枢神经系统的一个主要抑制性神经传递素。其存在于哺乳动物的脑和脊柱中，并广为分布到皮层的神经元中，其与运动神经控制、视觉和其他许多皮层的功能密切相关。其促进脑部血液流动，以增加氧气的供给，从而加强脑的新陈代谢。此外，GABA抑制后叶加压素(vasopressin，抑制尿分泌的荷尔蒙)的分泌，通过其血管扩张作用来降低血压，并通过作用于脊柱的血管舒缩中心来降低血压。
GABA通过受体GABA-A和GABA-B作用。
因此，可以预期，GABA-A和/或GABA-B受体(即GABA自身)的拮抗剂或其他的提高人体中GABA释放的潜在组分可含于制品，即本发明的发酵乳制品中。
在一优选的实施方式中，通过在其他的用于进行发酵的微生物中加入产生GABA的微生物，而确保在发酵食品或饲料制品中存在GABA组分。在一特别优选的实施方式中，加入了产生GABA的嗜热链球菌。
术语“功能性食物”在这里所指的食物制品是消费者以某种方式获知该制品具有与在此描述的疾病和/或病症相关的有益功能。当使用术语“食 物”时，其也包括“饲料”之意。但优选的还是指食物制品。
因此，本发明的一实施方式涉及在此所述的应用，其中的组合物是含有如上所述性能的活性组分的食物制品，其通过以下步骤获得：
(i)按照制备具有在此所述性能的活性组分的方法准备发酵的食物材料，
(ii)干燥发酵的食物材料，和
(iii)以适当的方式进行包装，以得到食物制品或食物制品添加剂。步骤(ii)优选采用冻干。
应当对术语“包装”的含义进行较宽的理解。其是指一旦食物材料经发酵并获得发酵的食物材料，该发酵的食物材料就被进行包装而可提供给消费者。其可以包装在瓶子或覆塑膜盒等中。优选的在包装盒或相应的销售材料上注明该制品具有降低心率的性能。这适用于这里所述的制品的任何一方面或其实施方式。
如实施例1中所示，食物制品中的乳酸菌可以是以细菌细胞的形式提供。热处理的发酵食物材料也具有降低心率的效果，因此，可以预期使用乳酸菌细胞可获得上述效果。
在优选的实施方式中，发酵的食物制品中所含的活的细菌细胞对哺乳动物寄主的健康有益。这样的微生物通常被称为“益生素”。
通常，益生素包括被定义为一群活的微生物有机体的有机物，它们对动物或人类寄主有有益的影响。乳酸菌通常被视为与益生素或益生活性有机物，特别是与在乳酸乳杆菌、链球菌和双歧杆菌属中发现的乳酸菌同样有用。
具有如上所述性能的制品的应用
如实施例1中所示，心率降低性能可通过用强饲法给自发性高血压大鼠(SHR)施用制品，并在强饲后用遥感勘测法确定尚有意识的SHR在24小时内不同时间点的心率而确定。然而，其他的动物模型也可用于评价发 酵制品对心率的效率。其中一个例子是在实施例4中描述的正常血压威斯达(Wistar)大鼠模型。
制品可用于治疗冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏疾病(CHD)，例如心绞痛、高血压、动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞、脑梗塞和血管重建术后的再狭窄、心律不齐、快速性心律失常、慢性充血性心力衰竭(CHF)、主动脉瓣关闭不全、慢性肾功能衰竭、异常脂血症、异常脂蛋白血症。在这种情况下，制品优选是药物。疾病优选是心绞痛、高血压和动脉粥。
除了如上刚提及的疾病外，心率波动的问题也引起人们的兴趣。在实施例1、2和3中证明了发酵的制品除了有效地降低心率外，还出乎意料地降低了实验动物活跃期间心率的波动。特别是，在观察到严重的心率波动的压力存在的情况下，对心率波动的抑制可能为一重要的特征，这是由于心率的改变与实验模型中的死亡率相关(Zaza et al2001)。
由于冠状动脉疾病一般是经长时间发展而成的，因此人们有机会去预防和控制它。如果尽早开始作好预防工作，则可以降低动脉硬化症的发展速度。因此，本发明制品的另一优选的应用是用作预防。在这种情况下，制品可优选为食物制品或食物添加剂，可供人们日常连续使用。
优选的是制品具有至少高于安慰剂10％的心率降低效果，其中的安慰剂如上定义为相应的未经发酵的食物材料。使用该定义，更优选的是制品具有至少高于安慰剂15％的心率降低效果，进一步优选的是制品具有至少高于安慰剂20％的心率降低效果，最优选的是制品具有至少高于安慰剂25％的心率降低效果。
对发酵的食物材料中的受体-配体组分的后续纯化
如上所述，使用乳酸菌可在发酵后直接提供有用量的活性组分，其具有非常好的心率降低性能以及具有预期的对如上所述的其他疾病和病症有效的效果。
然而，在一些情况下，最好对发酵的食物材料进行后续的纯化或浓缩。 例如，当活性组分用于药物，如药片或其他要求高浓度活性组分的制剂形式时，需要进行后续的纯化或浓缩。因此，在本发明的一实施方式中，制品是药物。
另外，实施例1显示出心率降低效果与制品的浓度因子成正比。
因此，本发明的一实施方式是关于使用在此所述的应用，其中，对发酵的食物材料进行后续处理，经过纯化或浓缩其活性组分的方法来获得作为α-肾上腺素受体、β-肾上腺素受体，或5-羟色胺受体的配体，该方法包含以下步骤：
(i)按照制备具有在此所述性能的活性组分的方法准备发酵的食物材料，
(ii)步骤(i)的发酵的食物材料被进一步加工，以纯化或浓缩具有心率降低性能的活性组分，
(iii)以适当的方式进行包装，以得到制品。
该方法适用于需要在制品中有相对高浓度的具有预期性能的活性组分的情况。
如果制品为食物制品，该方法可进一步包括步骤(iv)，其中(ii)中经浓缩的活性组分被加入到食物制品中。
用于以上步骤(ii)的浓缩的优选的实施方式是将含活性组分的食物材料进行离心分离，并回收含活性组分的上清液。如果食物材料是乳，则该制品可能为乳清。如实施例1中所示，乳清是一种具有优良的心率降低性能的制品。因此，在一实施方式中，制品为乳清，但发酵食品或饲料材料的其他的部分也可被考虑在内。
离心优选在2,000到20,000rpm下进行1到20分钟。离心也可在离心机中进行。
所得的上清液也可用逆相树脂做进一步的纯化处理，从而获得活性组分含量增加的样品。用逆相树脂进行的纯化处理可通过吸收和洗脱进行，可通过逆相树脂和/或逆相色谱进行，从个人提高活性组分的纯度。
关于逆相树脂协议的详细技术说明请参见EP821968。
可选择的，对发酵的食物材料进行进一步加工，其中，采用纳米过滤发酵的食物材料以期除去其中的乳酸或单价离子。
关于该纳米过滤协议的详细技术说明请参见WO01/32905。
实施例2中所描述的，在浓缩到浓度因子达到21倍的情况下，都明显存在着乳清制品对的心率的剂量依赖效果。在实验中没有迹象表明有达到固定的或渐近线水平。这意味着含有大量活性组分的组合物可在药物中发挥很重要的作用。
发酵
在本发明的方法中，食物材料是在一定的操作条件下经乳酸菌发酵的。这里的操作条件根据食物材料的类型和/或乳酸菌的组合而有所不同。优选的，如果食物材料不是存在于水溶液中，则先将其溶解到适合的水溶液中，然后再与乳酸菌混合并通过发酵培养。
用乳酸菌进行的培养可通过向食物材料介质中加入预培养的乳酸菌发酵剂培养物，其可以经预先加热灭菌并冷却到培养预设温度。乳酸菌发酵剂的接种量优选为105到107个乳酸菌细胞/ml培养基，然而，依据特定的发酵剂培养物，其他量的发酵剂培养物也可以考虑。培养温度通常是20到50℃，优选为30到45℃。培养时间通常为3到48小时，优选为6到24小时。特别的，优选在具有pH在3.5到7范围的培养基中进行培养，更优选为在pH在5到6的介质中，以有效地进行乳酸菌的培养。再有，优选地进行所谓的将pH维持在4到7的范围内的“恒pH”培养法。当乳酸菌超过108细胞/ml时，可不受限制地随时停止培养。
一优选的实施方式涉及在此描述的方法，其中，在食物材料的发酵条件下，每100ml的食物材料产生0.5到25mg的活性组分，更优选的是每100ml的食物材料产生1到5mg的活性组分。
哺乳动物
哺乳动物包括如驯养的动物(例如，猫和狗)、猪、牛、羊在内的动物。在一优选的实施方式中，哺乳动物为人。
乳酸菌
如上所述，术语“乳酸菌”指由革兰氏阳性、触酶阴性、非运动性、微嗜氧菌或厌氧菌组成的一组细菌，它们对糖进行发酵，所产生的酸中主要产物为乳酸，并含有醋酸、甲酸和丙酸。
其中，包括属于乳酸乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌，例如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌亚种(Lactobacillusdelbruekii subsp.)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)等；属于乳酸乳球菌(Lactococcus)属的乳酸菌，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；属于链球菌(Streptococcus)属的乳酸菌，例如嗜热唾液链球菌亚种(Streptococcus salivarius subsp.)、嗜热链球菌(thermophilus)；属于明串珠菌属(Leuconostoc)的乳酸菌，例如乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)；属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)的乳酸菌，例如长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)或短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)；以及属于乳酸片球菌属(Pediococcus)的乳酸菌。
乳酸菌可被用于含有其他微生物如酵母的混合物。本领域的技术人员可通过公众途径获得各式各样的乳酸菌，并且可以预计特别有用的混合物包括瑞士乳杆菌和嗜热链球菌的结合。例如，可从Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)获取；以及由NCB1的网页获取[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/在申请日即可获得]。
一种特别有效的样品，瑞士乳杆菌菌株CHCC5951被寄存于DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul turen GmbH)，其登记号为DSM14998，寄存日为2002年5月15日。寄存是在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约规定的条件下进行的。
另外，一瑞士乳杆菌菌株CHCC4080样品被寄存于DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorgani smen und Zellkul turen GmbH)，其登记号为 DSM14997，寄存日为2002年5月15日。寄存是在际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约规定的条件下进行的。
附图说明：
图1：用浓度3(乳清组合物，含固体乳清组分，浓度因子为14.3倍)或安慰剂治疗的动物中心率的测量。每一数据点代表8只动物的平均值。注意动物的活跃期间与无光线的期间一致，即由黑色方条表示的期间。
图2：在动物接受乳清组合物12～15小时后的心率的降低，其中乳清组合物含浓缩到乳发酵后获得的固体乳清含量的2、6、14.3和21倍的固体乳清成分。用强饲法，即用胃管给动物服用乳清制品。
(○)代表安慰剂。动物的心率按实施例1中所描述的进行测定，并与未治疗的动物的心率进行比较。
实施例：
实施例1：心率降低性能的体内测试
材料和方法
菌株和培养
在MRS琼脂上将菌株进行种菌划线，且在无氧下于37℃培养48小时。挑取单个菌落，接种到MRS培养液中并于37℃下生长过夜。从该过夜培养物中制备母培养液，并储存在-80℃下的20％的甘油中。将菌株在乳中预先培养过夜，并将1％(v/v)的接种到乳中用于发酵。
样品的制备
乳清：样品1
用单培养菌株对乳(含9.5％的蛋白)进行发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。发酵产物经离心，舍弃颗粒状物，用0.45mm过滤器过滤乳清，并冻干。在与该第一批发酵相同的条件下，进行第二批发酵，发酵物经离心，获得乳清部分。舍弃颗粒状物，用0.45mm过滤器过滤乳清，并冷冻。乳清 被用于溶解冻干的乳清粉末，使之浓缩到浓缩因子为21，然后用于喂养鼠。溶解于乳清中的冻干的发酵乳：样品2
用单培养菌株对乳(含9.5％的蛋白)进行发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。将所有产物进行冻干。在与该第一批发酵相同的条件下，进行第二批发酵，并离心。舍弃颗粒状物，用0.45mm过滤器过滤乳清，并冷冻。乳清被用于溶解冻干的乳清粉末，使之浓缩到浓缩因子为5，然后用于喂养鼠。
溶解于乳中的冻干的发酵乳：样品3
用单培养菌株对乳(含9.5％的蛋白)进行发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。将所有产物进行冻干。
乳(含9.5％的蛋白)被用于溶解冻干的粉末，使之浓缩到浓缩因子为5，然后用于喂养鼠。
过夜乳发酵制品：样品4
用单培养菌株对乳(含9.5％的蛋白)进行发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。
过夜乳发酵制品，经热处理：样品5
用单培养菌株对乳(含9.5％的蛋白)进行发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。
自发性高血压大鼠
自发性高血压大鼠(SHR)由IFFA CRED0(a Charles River company)，Lyon，France获得。
在9.15h和9:30h之间通过强饲法进行施药，每只动物接受的总体积为2.5ml/每只动物。
实验设计
形成三组：
第1组(n＝16)：接受治疗1(乳；n＝16)
第2组(n＝12)：接受连续治疗，每次施药间隔3天清洗期
分组：1)安慰剂(乳)
2.样品1(悬浮于乳清中的冻干的乳清，浓缩到浓缩因子为21后施用)
2)样品2(悬浮于乳清中的冻干的发酵乳，浓缩到浓缩因子为5后施用)
3)样品3(悬浮于中性pH乳中的冻干的发酵乳，浓缩到浓缩因子为5后施用)
4)样品4(仅为发酵的乳制品)
5)样品5(发酵后经热处理的发酵乳)
6)样品6(未经发酵但含有活的细菌的乳)
在实验前，所有的SHR均经过为期9周的对动物研究室的环境的适应期。另外，所有的动物均习惯于强饲法，并在进行第一次强饲前的3天测定心脏收缩压。
研究参数
强饲后用遥感勘测器(Data Sciences Int)测定尚有意识的SHR在24小时内不同时间点的心脏收缩压和心率。
简言之，在施药前24小时和试药后48小时内，每隔15分钟记录一次平均(每1分钟)的心脏收缩压和心脏舒张压以及心率。
由这些记录可计算出每组的24小时的平均心脏收缩压和心脏舒张压以及心率。
另外，相对于未治疗情况下的值，计算出在强饲后24小时内、在3～6、12～15和21～24小时期间，由各物质引起的心脏收缩压和心脏舒张压的变化。
统计学
所有的结果均表达为平均值±均值的标准误差的形式。未经治疗的值和强饲各物质后的值之间的差别通过成对样本T检定进行评估，其中用SISTAT8.0程序进行计算。
结果
表1示出了测定的心率的变化。
表1：
表1.强饲后心率(次/分钟)
Figure S05829621120070306D000191
*：p<0.05与未治疗的比较
未治疗的1和未治疗的2分别是研究1和研究2的对照。未治疗的1是样品1的安慰剂，未治疗的2是所有其他样品的安慰剂。由于本研究是在两个不同的体内研究中独立进行，故采用两个安慰剂。
结果表明浓缩到浓缩因子为21的乳清制品(样品1)具有最强的心率降低性能。
结果还表明没有必要对已具有明显心率降低效果的发酵的乳制品进行进一步浓缩。样品4和5是发酵过夜的乳制品，就已具有降低心率的效果。 然而，心率降低的效果与制品的浓缩因子成正比。
显然的，含有肽或其他的活性成分制品的乳清部分在降低心率效果上起着决定作用。已观察到了制品的剂量-心率降低效果。
样品3是悬浮于中性pH乳中的冻干的发酵乳。其显著降低了心率。这表明在此描述的发酵制品由于可融解在不同的液体中以获得适当的最终用途，因此具有广泛的用途。不同的特性参数如pH值并不影响制品的心率降低能力。
在发酵后进行热处理的样品5也能降低心率。在该样品中，基本上所有的细菌均被杀死。这说明了在最终制品中无需存有活的细菌。
样品6没有发酵，当包含有活的细菌。其没有产生心率降低。这表明发酵步骤是必须的。
实施例2：剂量依赖实验
为了进一步证实实施例1的结果，进行剂量反应实验。实验是通过给自发性高血压大鼠(SHR)施用将不同含量的由发酵乳得到的冻干的乳清悬浮于由发酵乳得到的乳清中的组合物。
通常，材料、方法及实验设计均如实施例1中所述。
简言之，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)对乳进行发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。发酵乳经离心，舍弃颗粒状物，冻干乳清。在与该第一批发酵相同的条件下，进行第二批发酵，发酵物经离心。舍弃颗粒状物，将乳清放置在4℃下保存。乳清被用于溶解冻干的乳清粉末，得到含固体乳清成分浓缩到为第二批发酵物中乳清浓度的2，6和14.3倍的组合物。在完成最后一步溶解后立即将组合物喂给鼠。
如实施例1，使用未经发酵的乳作为安慰剂。
剂量实验是对相同的实验动物在3个分开的实验期间从最低剂量开始进行。每个实验期间间隔三天的“清洗”期，在“清洗”期内，动物不接受发酵的乳清制品，以消除前次剂量的影响。
结果示于表2中。
表2.强饲后心率(次/分钟)
Figure S05829621120070306D000211
注：未治疗的鼠没有接受乳或乳清制品。安慰剂是非发酵的乳。浓缩物1，2和3分别是含固体乳清组分浓缩到2，6和14.3倍的乳清组合物。注意动物的活跃期间与无光线的期间一致，即9～21的期间。
图1中显示出一个完整周期的浓度3(×14.3倍浓缩)。
此外，由冻干的乳清粉末得到了含固体乳清组分浓度为第二批发酵物中的乳清浓度的21倍的组合物。图2中示出了给动物喂养2，6，14.3及21倍浓缩的乳清制品的结果。
结果清楚地显示出最高浓缩到21倍的乳清制品对心率影响的剂量依赖效果。乳清制品的剂量越高，心率降低的程度越大。实验中没有迹象表明有达到固定的或渐近线水平，这意味着含有大量活性组分的组合物有望在降低心率上产生很高的效力。
实施例3：在高度活跃期心率波动的降低
在动物的活跃期，心率会增加。动物的活跃期间与无光线的期间一致，即由黑色方条表示的期间(见图1)。然而，由图1中所观察到的可看出，除了心率外，在未治疗的动物中的心率的波动比用14.3倍浓缩的发酵的乳清制品治疗的动物的心率波动大。
为了量化心率波动，对在12和15小时之间观察到的心率值的变化进行评价。采用如实施例1中描述的SISTAT8.0程序对经治疗的和未经治疗的动物的标准偏差进行估计，并计算出差异(标准偏差)2＝方差。
经治疗的动物的标准偏差约为5.9，相应的方差为(5.9)2＝34.8。
未治疗的动物的标准偏差约为10.4，相应的方差为(10.4)2＝108.2。
假定以方差为34.8分布的原始数据在统计学的95％的置信水平上，则以方差为108.2分布的原始数据有显著性的不同。
因此，可以认为在未治疗的动物中，其活跃期间的心率波动(以方差表示)明显比以14.3倍浓缩的发酵乳清制品治疗的动物大。
总之，由瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)发酵的乳清制品稳定了心率的波动。这可能是该制品的一项重要特征，这是由于已观察到心率的改变与实验兔子模型中的死亡率相关(Zaza et al 2001)，并且特别在有压力的情况下，通常能观察到明显的心率波动。
实施例4：由瑞士乳杆菌菌株CHCC5951发酵的乳制品与类似的用不同菌株发酵的商业制品的比较。
本实施例的目的是比较宣称具有降血压作用的用商业乳酸菌发酵的乳制品与由瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)发酵的制品。
通过向威斯达大鼠施用两种组合物，并测量尚未麻痹的动物的心脏收缩压、心脏舒张压和心率，来评价两制品对血压和心率的影响。
如无特别说明，材料和方法如实施例1中所述相同。
简言之，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)对乳发酵16小时，接 种水平为1％(v/v)，将所得产物冻干以获得冻干的粉末乳。在与该第一批发酵相同的条件下，进行第二批发酵，并离心。舍弃颗粒状物，乳清用0.45μm的过滤器过滤并冷冻。在乳清中溶解冻干的粉末乳后，立即将其喂给鼠。溶解的粉末的量与从发酵乳中获得的量相当，发酵乳的体积是溶解用的乳清体积的5倍(例如，4.28克粉末溶于30ml乳清中)。在该实施例中，我们称该组合物为×5倍浓度。在09:15h和09:30h之间，用强饲法将该组合物喂给过夜禁食的威斯达大鼠(300-320克)，剂量为7.5ml/kg的×5倍组合物。组合物的效果在14:30h和16:30h之间评价，即口服57小时后测量未麻痹的动物的动脉血压和心率值。
结果示于表3中。
表3两种不同发酵制品对血压和心率的影响
未治疗的 商业制品 CHCC5951发酵的乳制品
心脏收缩压(mm Hg) 134±3 125±3* 125±3*
心脏舒张压(mm Hg) 107±3 98±4* 96±2*
平均血压(mm Hg) 116±3 107±4* 106±2*
心率(次数.分钟-1) 390±7 387±6 353±6*
心脏收缩压、舒张压、平均血压和心率的值(平均值±SEM)是在三组不同组中经强饲5～7小时后测定的值。
*表示在p<0.05水平时，接受治疗的鼠与未接受治疗的鼠之间存在着显著差异。在进行多重比较的Tukey检验后，使用ANOVA进行统计分析。
实施例5：发酵制品对肾上腺素α受体的结合
本实验的目的是通过体外受体结合分析而研究，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)发酵的发酵乳可表现出对何种(如果有的话)特异性受体的结合。
简言之，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)对乳发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。离心发酵物，舍弃颗粒状物，将乳清分为两部分。将一部分的乳清进行冻干，另一部分的乳清保存在+4℃待用。该部分被称为浓度1倍(1×)。
冻干的组合物保存在-50℃直到在合适的稀释液中重建。将冻干粉末溶解在一定体积的水中，得到相对于未冻干的乳清组合物其乳清蛋白浓度为200倍(200×)的母液，由此制备200倍(200×)的母液。
竞争性体外结合分析在如以下表4中描述的一系列受体上准备。
表4体外结合分析的竞争
受体家族 被分析受体 受体的生物来源 用于竞争的化合物 分析出处
肾上腺素 α1(非选择性) 鼠大脑皮层 哌唑唪(prazosin) Greengrass和 Bremner(1979)
肾上腺素 α2(非选择性) 鼠大脑皮层 育亨宾碱   (yohimbine) Uhlen和Wikberg             (1991)
竞争性体外结合分析的结果示于以下表5中。
表5竞争性体外结合分析的结果
受体类型 发酵制品的浓度 ％对照特异性结合的抑制
α1(非选择性) 0.05X 41
α1(非选择性) 0.1X 91
α1(非选择性) 10X 97
α1(非选择性) 20X 97
α2(非选择性) 10X 100
α2(非选择性) 20X 100
在为肾上腺素α1受体的情况下，IC50值(导致对照特异性结合的半数最 大抑制的浓度)和希尔系数(Hill coefficients)(nH)用非线性回归分析法对由希尔方程曲线拟合得到的竞争曲线进行分析而确定。抑制常数(Ki)是由Cheng Prusoff方程(Ki＝IC50/(1+(L/KD))计算得到，其中，L＝分析中放射配体的浓度，KD＝放射配体对受体的亲和性)。其结果是：IC50＝1.210-9M，Ki＝3.110-10M，nH＝0.7。
由数据可以得出，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)发酵的食物材料含有表现出剂量依赖性、特异性地结合到分离自鼠大脑皮层的肾上腺素α1受体上的组分。
实施例6：发酵制品对特异性肾上腺素受体和毒蕈碱受体(Muscar inicreceptor)的结合
本实验的目的是通过体外受体结合分析而研究，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)发酵的发酵乳制品可表现出对肾上腺素受体和毒蕈碱受体中的何种特异性受体的结合。
材料和方法
简言之，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)对乳发酵16小时，接种水平为1％(v/v)。离心发酵物，舍弃颗粒状物，将乳清保存在+4℃待用。该部分被称为浓度1倍(1×)。
基本上按照表6及表7中文献所述进行受体结合分析。受体结合分析的结果示于表8中。
表6受体结合分析
被分析物 配体 浓度 非特异性 培养 检测方法
α1A(h) [3H]哌唑唪          (prazosin) 0.06nM 哌唑唪(10μM) 60分钟/22℃ 闪烁计数
α1B(h) [3H]哌唑唪 0.05nM 哌唑唪(10μM) 60分钟/22℃ 闪烁计数
α2A(h) [3H]RX821002 1nM (-)肾上腺素 30分钟 闪烁计数
(epinephrine)(100μM) /22℃
α2B(h) [3H]RX821002 2.5nM (-)肾上腺素  (epinephrine)(100μM) 30分钟/22℃ 闪烁计数
β1(h) [3H](-)CGP12177 0.15nM 烯丙洛尔 (alprenolol)(50μM) 60分钟/22℃ 闪烁计数
β2(h) [3H](-)CGP12177 0.15nM 烯丙洛尔      (alprenolol)(50μM) 60分钟/22℃ 闪烁计数
β3(h) [1251]CYP(+1μM(-)普萘洛尔)         (propranolol) 0.6nM (-)普萘洛     尔)(propranolol)(1mM) 90分钟/37℃ 闪烁计数
5-HT(非选择性) [3H]5-羟色胺 2nM 5-羟色胺(10μM) 15分钟/37℃ 闪烁计数
表7竞争性体外结合分析
受体家族 被分析受体 受体的生物来源 竞争化合物 分析出处
肾上腺素 α1A 鼠唾腺 WB4101 Michel等(1989)
肾上腺素 α1B 鼠肝脏 螺环哌丁苯 (spiperone) Michel等(1989)
肾上腺素 α2A(h) 人重组体(CHO细胞) 育亨宾碱   (yohimbine) Langin等(1989)
肾上腺素 α2B(h) 人重组体(CHO细胞) 育亨宾碱   (yohimbine) Devedjian等(1994)
肾上腺素 α2C(h) 人重组体(CHO细胞) 育亨宾碱   (yohimbine) Devedjian等(1994)
肾上腺素 β1(h) 人重组体(HEK-293细胞) 阿替洛尔(atenolol) Levin等(2002)
肾上腺素 β2(h) 人重组体(Sf9细胞) ICI118551 Smith和Teitler(1999)
肾上腺素 B3(h) SK-N-MC细胞重组体(Sf9细胞) 氰洛尔       (cyanopindolol) Curran和Fishman(1996)
5-羟色胺 5-HT(非选择性) 鼠大脑皮层 5-羟色胺 Peroutka和Snyder(1979)
表8竞争性体外结合分析的结果
受体类型 发酵制品的浓度 ％对照特异性结合的抑制
α1A 0.05X0.1X -1178
α1B 0.05X0.1X 1876
α2A(h) 0.05X0.1X 3791
α2B(h) 0.05X0.1X 4393
α2C(h) 0.05X0.1X 1386
β1(h) 0.05X0.1X 1662
β2(h) 0.05X0.1X 83 103
β3(h) 0.05X0.1X -228
5-HT(非选择性) 0.05X0.1X 65 120
从这些数据可以看出，用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951(DSM14998)发酵的食物材料中含有表现出剂量依赖性、特异性地结合到肾上腺素受体和5-羟色胺受体上的组分。
由于不止一种受体被抑制，这就使得上清夜的组成复杂化。各种不同的效果最有可能是受到具有不同靶外形的肽所影响。
总而言之，存在于发酵物的乳清中的化合物对β2(h)和5-HTns表现出最高的抑制活性，两者的平均值均为93％，其次是α2B(h)(平均为68％)>α2A(h)(平均为64％)>α2C(h)(平均为50％)>α1B(h)(平均为47％)。在更低的抑制水平上，这些化合物对受体β1(h)的抑制活性平均为39％，对α1A(h)的抑制活性平均为34％。
这些化合物对受体β3(h)没有活性。
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关于寄存的微生物[专家方案] 
下述内容适用于在本专利申请中提及的所有寄存的微生物体。 
欧洲 
就寻求欧洲专利保护的指定国家和地区而言，在提及授予欧洲专利的文书公开或在该申请被拒绝或撤回或视为撤回日之前，仅向要求获得样品的人指定的专家提供寄存的微生物样品，且视情况而言需通过i)申请人和/或ii)欧洲专利局同意。(EPC Rule28(4)and28(5))。 
加拿大 
申请人请求，在专利申请被授予加拿大专利或该申请被拒绝、放弃和放弃恢复或撤回之前，专利局局长只能授权将专利申请中涉及的寄存的生物材料样品供给由局长指定的独立的专家，申请人必须在申请的国际公开的技术准备完成前，以书面方式通知国际局。 
挪威 
申请人在此请求，在专利申请被挪威专利局公开供公众检查，或由挪威专利局作出不公开供公众检查的最终决定之前，只能授权本领域专家获得样品。为此，申请人必须向挪威专利局提交请求，请求时间不迟于根据挪威专利法第22和33(3)规定的公众可获得专利申请的时间。如果申请人已提交了该项请求，则由第三方提出的获取样品的请求必须指明“将由专家取样”。该专家可以是在挪威专利局认可的专家名单上的任何人，也可以是由申请人在个案中认可的任何人。 
澳大利亚
申请人在此宣布，在授予专利前、或在终止、拒绝或撤回专利申请前，微生物样品只能由与本发明没有厉害关系得本领域技术人员获取(Regulation3.25(3)of the Australian Patents Regulations)。 
芬兰 
申请人在此请求，在专利申请被National Board of Patents andRegulations公开供公众检查，或由National Board of Patents andRegulations作出不公开供公众检查的最终决定之前，只能授权本领域专家获得样品。 
英国 
申请人在此请求，只能由本领域专家获得微生物样品。申请人必须在申请的国际公开的技术准备完成前，向国际局通知该请求。 
丹麦 
申请人在此请求，在专利申请被丹麦专利局公开供公众检查，或由丹麦专利局作出不公开供公众检查的最终决定之前，只能授权本领域专家获得样品。为此，申请人必须向丹麦专利局提交请求，请求时间不迟于根据丹麦专利法第22和33(3)规定的公众可获得专利申请的时间。如果申请人已提交了该项请求，则由第三方提出的获取样品的请求必须指明“将由专家取样”。该专家可以是在丹麦专利局认可的专家名单上的任何人，也可以是由申请人在个案中认可的任何人。 
瑞典 
申请人在此请求，在专利申请被瑞典专利局公开供公众检查，或由瑞典专利局作出不公开供公众检查的最终决定之前，只能授权本领域专家获得样品。为此，申请人必须向国际局提交请求，请求时间应早于自优先权日起的16个月的期满日(请求最好是以PCT/RO/134表的形式提出，该表被复制在PCT申请人指南第I卷的附录Z中)。如果申请人已提交了该项请求，则由第三方提出的获取样品的请求必须指明“将由专家取样”。该专家可以是在瑞典专利局认可的专家名单上的任何人，也可以是由申请人在个案中认可的任何人。
荷兰 
申请人在此请求，在专利申请被授予荷兰专利或该申请被拒绝、放弃和终止之前，依据Patent Rules第3IF(1)，只能将微生物提供给专家。申请人必须在Patents Act of the Kingdom of the Netherlands第22C或25节中规定的公众可获得申请的两者中较早的日期之前，提出该请求。

Claims (21)

1.通过包括发酵动物乳的方法获得的组合物在制备治疗或预防哺乳动物的良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍的制品中的应用，所述包括发酵动物乳的方法采用瑞士乳杆菌菌株CHCC5951对动物乳进行发酵，以获得含至少一种组分为肾上腺素或5-羟色胺受体的配体的发酵的食物或饲料材料。
2.权利要求1的组合物的应用，其中所述受体选自包含α-肾上腺素受体、β-肾上腺素受体和5-羟色胺受体的受体组。
3.权利要求2的组合物的应用，其中所述受体选自包含α1A-、α1B-、α2A(h)-、α2B(h)-、α2C(h)-、β1(h)-、β2(h)-和β3(h)-肾上腺素受体，以及5-羟色胺受体的受体组。
4.权利要求3的组合物的应用，其中所述受体选自包含α2A(h)-、α2B(h)-和β2(h)-肾上腺素受体的受体组。
5.权利要求1～3中任意一项的组合物的应用，其中所述发酵的食物含有至少一种组分是肾上腺素受体的配体，以及至少一种组分是5-羟色胺受体的配体。
6.权利要求1～4中任意一项的组合物的应用，其中所述发酵的食物材料含有至少一种组分是肾上腺素α受体的配体，以及至少一种组分是肾上腺素β受体的配体。
7.权利要求1中的组合物的应用，其中所述受体的配体具有为受体的拮抗剂的特性。
8.权利要求1中的组合物的应用，其中所述制品是食物或饲料制品。
9.权利要求1中的组合物在制备降低哺乳动物心率制品中的应用。
10.权利要求1中的组合物的应用，进一步包括至少一组分，所述至少一组分为GABA受体的配体。
11.权利要求10的应用，其中至少一组分为GABA受体的配体，所述至少一组分是通过包括发酵动物乳的方法获得，该方法采用产生GABA的嗜热链球菌对动物乳进行发酵以获得发酵的食物材料。
12.权利要求1中的组合物在制备制品中的应用，所述制品额外还具有降低心率的效力。
13.权利要求1中的组合物的应用，其中所述制品还被用于治疗或减轻冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏疾病(CHD)。
14.权利要求13中的组合物的应用，其中所冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏疾病(CHD)为心绞痛、高血压、动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞、脑梗塞和血管重建术后的再狭窄、心律不齐、快速性心律失常、慢性充血性心力衰竭(CHF)、主动脉瓣关闭不全、慢性肾功能衰竭、异常脂血症、异常脂蛋白血症。
15.权利要求1中的组合物的应用，其中所述治疗还额外导致了心率波动的减小。
16.权利要求1中的组合物的应用，进一步包含至少一种组分，其选自由一氧化氮或抑制磷酸二酯酶-5或5-α还原酶的成分组成的组，以用于制备治疗或预防良性前列腺增生(BPH)和/或勃起功能障碍的制品中的应用。
17.权利要求1中任意一项的组合物的应用，其中发酵的食物材料经进一步处理，以纯化或浓缩具有降低心率性质的活性组分，该活性组分通过含以下步骤的方法得到：
(i)制备如权利要求1中所述的发酵的食物材料，
(ii)步骤(i)的发酵的食物材料被进一步加工，以纯化或浓缩具有心率降低性能的活性组分，
(iii)以适当的方式进行包装，以得到制品。
18.权利要求17的应用，其中根据步骤(ii)的浓缩是通过离心进行，回收含活性组分的所得上清液。
19.权利要求17或18的应用，其中制品是乳清。
20.权利要求1中组合物的应用，其中发酵的食物或饲料材料含有瑞士乳杆菌CHCC5951活的细菌细胞。
21.发酵的动物乳食物材料在制备治疗和/或减轻良性前列腺增生和/或勃起功能障碍的药物中的应用，所述食物材料包含至少一活性组分为肾上腺素受体或5-羟色胺受体的配体，并通过用瑞士乳杆菌CHCC5951发酵所述食物材料制得。
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