CN101020049A - 乌司他丁在制备治疗和/或预防脊髓损伤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乌司他丁(Urinary Trypsin Inhibitor，UTI)应用于制备治疗和/或预防脊髓损伤的药物用途。本发明的乌司他丁对脊髓损伤有明显的治疗和/或预防作用。本发明的药物通常以冻干粉针剂或注射液剂的形式使用。

Description

乌司他丁在制备治疗和/或预防脊髓损伤药物中的用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域。具体而言，本发明涉及乌司他丁的新医药用途，即乌司他丁在制备治疗和/或预防脊髓损伤药物中的应用。

背景技术

乌司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(Human Urinary Trypsin Inhibitor)，是一种从人尿中分离纯化的糖蛋白，由143个氨基酸组成，分子量经SDS-PAGE测定为40～50KD，等电点为2.6，是一种对热稳定的酸性蛋白，乌司他丁属典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂，具有两个活性功能区。

乌司他丁能有效抑制多种水解酶，对细胞膜、溶酶体膜有明显的稳定作用。乌司他丁在人体内不仅是一种酶抑制剂，同时还是参与细胞表达分泌调控的重要生理活性物质，在炎症等疾病状态下，乌司他丁由粒细胞酶水解释放到血液中，参与炎症反应的调控，局限炎症反应，帮助组织的修复；在机体遭遇重大打击，发生全身炎症反应时，减轻过度释放的炎症介质对机体组织造成的损伤。乌司他丁在临床上主要用于急性胰腺炎、急性循环障碍的治疗等。

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是由于各种不同的致病因素(外伤、炎症、肿瘤等)引起脊髓结构、功能的损害，造成损伤平面以下运动、感觉、自主神经功能的障碍。世界上脊髓损伤瘫痪病人有上千万，我国亦逾百万。据统计美国每年新增1万多伤病员，我国仅北京地区脊髓损伤发生率就有约800人/年，已成为高发伤病之一。

脊髓损伤分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损伤包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、脂质过氧化作用、钙离子超载等；疾病最终导致脊髓灰白质缺血、变形、坏死。继发性损伤在原发性损伤后较长一段时间内起作用，是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损伤可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫。如能阻断此连锁反应中的某一环节，则可明显减轻继发损伤，促进脊髓功能的恢复。对原发性脊髓损伤的治疗主要是依靠外科手术，到目前为止尚无有效的治疗方法；对继发性损伤进行药物控制，有可能作为减轻脊髓损伤的有效途径。

关于治疗脊髓损伤药物的研究较多，大多数尚处于动物实验阶段，甲基强的松龙(Methylprednisolone，MP)是目前应用最为广泛且公认有效的治疗脊髓损伤的药物。研究表明，大剂量应用甲基强的松龙可通过多种机制阻止脊髓继发性损伤的发生，但是长期使用大剂量激素会发生一些严重的不良反应，最近几年，关于MP的大剂量应用引起了不少争议，众多研究者仍在致力于寻找能够更加安全有效治疗脊髓损伤的药物。迄今为止，还未发现乌司他丁治疗脊髓损伤的报道。

当代医学对脊髓损伤还缺少有效的治疗和/或预防药物。本发明人经过认真研究和动物试验发现，乌司他丁对脊髓损伤有明显的治疗和/或预防作用。

发明内容

本发明的目的是提供乌司他丁应用于制备治疗和/或预防脊髓损伤药物的用途。

本发明的另一目的是提供一种用于治疗和/或预防脊髓损伤的含有乌司他丁的药物组合物。

本发明的乌司他丁对脊髓损伤有明显的治疗和/或预防作用。

本发明的乌司他丁一般以药物组合物的形式使用，这种组合物含有治疗有效量的作为活性成分的乌司他丁和一种或多种制药可接受的载体或添加剂。含有乌司他丁的药物组合物通常以静脉注射途径给药，主要剂型包括乌司他丁冻干粉针剂和注射液剂。

经静脉注射给药的灭菌组合物，一般是固体的灭菌组合物形式，即冻干粉针剂。这些组合物可以含有一种或多种制药可接受的载体或添加剂，特别是甘露醇、乳糖、水解明胶、氯化钠或葡萄糖中的一种或其任意混合物，在使用时可以溶解于灭菌的注射用水或其他注射用介质中。

经静脉注射给药灭菌组合物也可以是水溶液，即注射液剂，这些组合物可以含有一种或多种制药可接受的载体或添加剂，特别是注射用水、甘露醇、氯化钠或葡萄糖中的一种或其任意混合物。

乌司他丁冻干粉针的制备方法：取过滤灭菌的乌司他丁水溶液50000万单位，加100克甘露醇溶解，调pH至中性，加注射用水至10000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于5000个西林瓶中，无菌条件下冷冻干燥，即得。

乌司他丁注射液的制备方法：取过滤灭菌的乌司他丁水溶液50000万单位，加100克甘露醇溶解，调pH至中性，加注射用水至10000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于5000个西林瓶中，即得。

在本发明涉及的乌司他丁在制备治疗和/或预防脊髓损伤的药物中的用途，其治疗剂量根据病情的严重程度、治疗时间而定，一般乌司他丁静脉注射给药，药物的给药量是每次10-500万单位，每天给药1-4次。优选，药物的给药量每次30-300万单位，每天给药2-3次。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1  乌司他丁干粉针制备

取过滤灭菌的乌司他丁水溶液50000万单位，加100克甘露醇溶解，调pH至中性，加注射用水至10000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于5000个西林瓶中，无菌条件下冷冻干燥，即得。

实施例2  乌司他丁注射剂制备

取过滤灭菌的乌司他丁水溶液50000万单位，加100克甘露醇溶解，调pH至中性，加注射用水至10000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于5000个西林瓶中，即得。

实施例3  乌司他丁对实验性打击致脊髓损伤大鼠的治疗作用

动物模型和分组：SD大鼠60只，体重260g-300g，雌雄不限。用以下方法制作脊髓损伤大鼠模型：2％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉。俯卧位固定大鼠四肢，作背部后正中切口。切开皮肤及皮下组织，显露并咬除T₁₀～T₁₂椎板及棘突。采用改良Allen’s打击法致伤脊髓.用自制的10g重锤在玻璃导管引导下重力打击脊髓(强度为10g×2.5cm)，打击成功后大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。术后3日予青霉素20万u/kg肌注每日2次，并每日予大鼠人工排泄大小便2次。

分别采用乌司他丁(UTI)和甲基强的松龙(MP)为治疗剂，并将动物随机分为三组(每组20只大鼠)：

①对照组：脊髓损伤后不进行脊髓保护处理。

②UTI治疗组：脊髓损伤后分别于30min、2h、8h、24h、48h、60h、72h

按5万u/kg剂量静脉注射UTI。

③MP治疗组：脊髓损伤后分别于30min、2h、8h、24h、48h、60h、72h

按30mg/kg剂量静脉注射MP。

检测指标和方法：依据改良Tarlov评分标准，分别于术后1、2、3、4、6周末进行评定，并遵循盲法观察原则，采用功能恢复率来评价动物双后肢功能状况，恢复率＝评分/正常分×100％；全部动物于伤后即刻及伤后2周、5周进行脊髓诱发电位(SCEP)检查，观察其波形及潜伏期和波幅的变化，以波形完整、波幅恢复至正常10％以上者及潜伏期不超过正常2.5倍者为恢复。

结果：各组脊髓损伤大鼠Tarlov评分和SCEP的检测结果如下表1和表2。

表1各组脊髓损伤大鼠不同时间点神经功能恢复率比较

                                                  (x±s)(％)

	1周	2周	3周	4周	6周
						对照组	8.1±8.2(19)	12.3±8.6(17)	18.6±8.1(14)	22.9±7.8(13)	28.0±8.5(12)
UTI组	10.7±7.9(19)	19.8±8.2(17)	37.3±13.8*(16)	53.6±17.2*(15)	70.2±16.5*(13)
						MP组	11.0±8.0(19)	19.4±8.1(17)	35.2±14.7*(16)	49.1±15.9*(15)	62.8±16.2*(13)

注：*表示与对照组比较P＜0.01；括号内为动物数。

表2各组脊髓损伤大鼠伤后3周和6周脊髓诱发电位恢复情况

                                                     (x±s)(％)

	例数		恢复数		百分比(％)
							2周	5周	2周	5周	2周	5周
	对照组	14	10	1	2	7.1							20.0
UTI组							16	12	7	8	43.7*	66.7*
	MP组	16	13	7	8	43.7*							61.5*

注：*表示与对照组比较P＜0.01。

由于近来神经电生理科学的进展，诱发电位已成为脊髓损伤程度及预后估计的评价指标，是衡量运动功能重要的客观依据。脊髓诱发电位是由一组不同极性的波组成，潜伏期和波幅各不相同。脊髓损伤后诱发电位的表现是由脊髓破坏程度所决定的：白质纤维脱髓鞘越重，前角运动细胞损伤数目越多，运动诱发电位的潜伏期延长、波幅下降越显著。因此，通过观察脊髓诱发电位的潜伏期和波幅的改变，可以对脊髓运动功能伤程度以及预后情况作出判断。

本实验发现，在神经功能和诱发电位测量中，UTI组和MP组明显优于对照组。其中UTI初期效应不如MP明显，2周后效果与MP相当，在3周后UTI组效果略好于MP组，但无统计学差异。说明UTI可以改善脊髓损伤大鼠的运动和神经功能，对急性脊髓损伤有治疗和保护作用。

实施例4乌司他丁对实验性打击致脊髓损伤家兔的治疗作用

动物模型和分组：健康家兔45只，体重3.0-3.5kg，雌雄不拘。用以下方法制作脊髓损伤家兔模型：3％戊巴比妥钠30mg/kg静脉全麻后，以T₈棘突、椎板，暴露脊髓8mm×6mm，采用改良A1len’s法12g×10cm打击致伤脊髓，然后关闭切口，造成脊髓损伤家兔模型。术后头3日青霉素20万U/肌注每日2次，定时挤压下腹排尿3次/天至自主排尿恢复。

分别采用UTI和甲基强的松龙(MP)为治疗剂，并将动物随机分为三组(每组15只家兔)：

①损伤对照组：脊髓损伤后不予任何保护处理。

②UTI治疗组：脊髓损伤后分别于30min、1h、3h、12h、48h静脉注射UTI4万u/kg。

③MP治疗组：脊髓损伤后分别于30min、1h、3h、12h、48h静脉注射甲基强的松龙20mg/kg。

检测指标和方法：依据改良Tarlov评分法，分别在术前1h，损伤后24h、7d、14d、28d观察动物双后肢运动功能；所有动物分别于伤前、伤后即刻、伤后2周和5周进行脊髓诱发电位(SCEP)检查，观察其波形及潜伏期和波幅的变化情况。

结果：各组脊髓损伤家兔Tarlov评分和SCEP的检测结果如下表1和表2：

表1各组脊髓损伤家兔的改良Tarlov评分结果

                                         (x±s)(％)

	术前1h	术后24h	术后7d	术后14d	术后28d
						对照组	5.98±0.00	2.18±0.49	2.34±0.50	2.49±0.31	2.58±0.54
UTI组	5.98±0.00	2.40±0.51	2.83±0.61*	3.14±0.23*	3.34±0.31*
						MP组	5.98±0.00	2.44±0.53	2.85±0.57*	3.09±0.38*	3.30±0.20*

注：*表示与对照组有显著性差异(P＜0.05)

表2各组脊髓损伤家兔SCEP的检测结果[P2潜伏期(ms)，P2波幅(μv)]

                                                            (x±s)(％)

	伤前		伤后即刻		伤后2周		伤后5周
									P2潜伏期	P2波幅	P2潜伏期	P2波幅	P2潜伏期	P2波幅	P2潜伏期	P2波幅
	对照组	13.36±0.70	0.72±0.55	15.30±0.94	0.24±0.19	15.01±0.94	0.26±0.16	14.89±0.62									0.26±0.19
UTI组									13.14±0.85	0.76±0.44	15.27±0.77	0.23±0.17	4.36±0.82*	0.31±0.22	14.06±0.71*	0.35±0.22
	MP组	13.13±0.86	0.77±0.43	15.26±0.78	0.22±0.18	14.38±0.83*	0.35±0.20	14.10±0.73*									0.40±0.21

注：*表示与对照组有显著性差异(P＜0.05)

本研究结果表明，在伤后2周、1个月，UTI治疗组和MP治疗组Tarlov评分的变化较术前明显恢复，两组与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)，但两治疗组之间无明显差异。SCEP检测伤前在T_6～7棘突间记录到P1-N1-P2波型，以P2最为稳定，出现率为100％。与对照组相比，在伤后2周、1个月，UTI治疗组和MP治疗组潜伏期及波幅有恢复，具有显著性意义(P＜0.01)。

以上结果表明UTI可以改善脊髓损伤家兔的运动和神经功能，对急性脊髓损伤家兔有治疗和保护作用。

实施例5  UTI对慢性压迫性脊髓损伤大鼠的治疗作用

动物模型和分组：60只Wistar大鼠，体重300～350g，雌雄不限。用以下方法制作慢性压迫性脊髓损伤大鼠模型：2％的戊巴比妥(40mg/kg)腹腔内注射麻醉，常规消毒铺巾，取后正中切口，切除T₁₃棘突和部分椎板，暴露硬膜。置入后路渐进压迫装置：用直径3mm，螺距0.5mm的塑料螺钉旋人T₁₃椎板，以后每隔5d显露螺钉，将螺钉旋入0.25mm，共5～6次。至30d摄侧位X线片，观察椎管侵占率，使椎管侵占率达50％，约1.5mm。

分别采用UTI和甲基强的松龙(MP)为治疗剂，并将动物随机分为三组(每组20只大鼠)：

①对照组：脊髓损伤后静脉内注射生理盐水。

②UTI治疗组：脊髓损伤后30min，一次性由尾静脉内注射大剂量UTI(5万u/kg)。

③MP治疗组：脊髓损伤后30min，一次性由尾静脉内注射大剂量MP(30mg/kg)。

检测指标和方法：慢性压迫性脊髓损伤后1、4、8、14、28d对动物称重并进行行为学检查。(1)采用改良的Tarlov评分：0和1分，没有自主性运动，仅限于髋膝关节的非反射性运动；2分，肢体髋膝踝三个主要关节的运动；3分，能主动支持体重和不协调步态；4分，前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动；5分，正常步态。(2)斜板试验：测量抓握能力和维持姿势的能力，动物在斜板上维持5s不滑下的角度。

结果：慢性压迫性脊髓损伤后60只大鼠均出现不同程度的后肢瘫痪。各组脊髓损伤大鼠Tarlov评分和斜板试验的结果如下表1和表2：

表1慢性压迫性脊髓损伤大鼠的Tarlov评分结果

                                         (x±s)

	1d	4d	8d	14d	28d
						对照组	2.00±1.80	1.92±0.49	1.76±0.53	1.66±0.67	1.51±0.75
UTI治疗组	2.05±0.19	3.13±0.67*	3.74±0.62*	4.32±0.88*	4.96±1.87*
						MP治疗组	2.17±0.27	3.37±0.52*	3.53±0.71*	3.79±0.72*	3.88±2.32*

注：*表示与对照组有显著性差异(P＜0.05)

表2慢性压迫性脊髓损伤大鼠的斜板试验结果

                                        (x±s)

	1d	4d	8d	14d	28d
						对照组	43 82±4.87	40.41±4.94	38.98±5.82	37.09±5.06	36.05±4.43
UTI治疗组	43.21±5.22	55.36±5.68	64.15±6.23*	69.86±6.92*	72.43±5.87*
						MP治疗组	45.77±5.70	58.97±5.85	61.05±6.17*	63.25±7.82*	66.52±6.45*

注：*表示与对照组有显著性差异(P＜0.05)

慢性压迫性脊髓疾病是神经系统常见疾患，是具有占位性特征的椎管内病变，病理上具有缺血和创伤两方面的病理改变。本研究结果表明，脊髓损伤后3d，与对照组相比，UTI治疗组和MP治疗组运动功能恢复明显，Tarlov评分和斜板试验的检测结果与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。说明UTI对慢性压迫性脊髓损伤大鼠神经运动功能有明显改善，在慢性压迫性脊髓损伤后给予大剂量UTI可以起到治疗和保护作用。

实施例6  UTI对脊髓缺血再灌注损伤大鼠的治疗作用

动物和分组：纯种雄性成年SD大鼠108只，体重200～250g。分别采用UTI和甲基强的松龙(MP)为治疗剂，并将动物随机分为三组：对照组(缺血再灌注组)，36只；UTI治疗组，36只；MP治疗组，36只。

动物模型制作：动物以2％戊巴比妥钠按照40mg/kg进行腹腔麻醉。严格按照无菌操作腹正中纵行切口打开腹腔，暴露腹主动脉，辨认双侧肾动脉。缺血再灌注组于左肾动脉上方约lcm，右肾动脉分支下方.以无创伤动脉夹夹闭腹主动脉，30min后松开动脉夹，开始再灌注。UTI治疗组和MP治疗组在松开动脉夹以后，分别立即按照27.5万u/kg剂量和165mg/kg剂量进行尾静脉注射。对照组只暴露腹主动脉，然后关闭腹腔。

检测指标和方法：免疫组化染色观察钙蛋白酶的表达强度，棕黄色或棕褐色为阳性，并呈颗粒状，背景呈紫蓝色。以OLYMPUS BH2显微镜将图像转入电脑.每个切片随机选取三个视野，以IMS细胞图象分析系统对结果进行图像分析，取其平均值作为标本的测量数值。放大倍数100倍.以阳性面积和光密度的乘积作为calpain-I表达强度的指标；Western Blot分析观察神经细胞骨架蛋白68-KD NFP的降解产物。

结果：各组脊髓缺血再灌注损伤大鼠不同时间点脊髓calpain-I表达强度和68-KD NFP降解产物的检测结果如下表1和表2：

表1各组缺血再灌注后不同时间点脊髓calpain-I的表达强度(阳性面积×光密度)

	对照组	UTI治疗组	MP治疗组
				4h	249863±18447.9	290364.6±32906.4*	291364.6±31906.6*
24h	491574.9±61519.6	359477.2±26396.1*	359467.2±26406.2*
				4d	722487.4±60668.6	439079.9±27309.0*	439169.9±27399.2*
8d	319046 2±13265.4	166698.3±14035.4*	166898.3±14235.7*

注：*表示与对照组同时间点相比P＜0.01

表2各组缺血再灌注后各组不同时间点68-KD NFP的降解产物含量

	对照组	UTI治疗组	MP治疗组
				4h	9.63±0.96	13.23±0.57*	13.26±0.55*
24h	5.68±0.57	7.4±0.68*	7.6±0.52*
				4d	0.69±0.11	1.66±0.09*	1.68±0.13*
8d	0.58±0.11	0.57±0.12	0.65±0.10

注：*表示与对照组同时间点相比P＜0.01

脊髓缺血再灌注损伤后，会引起钙蛋白酶(calpain)的活化，出现细胞骨架蛋白的降解，脊髓功能受到损害，因此抑制calpain的活性可以对脊髓损伤起到一定的治疗作用。另外，钙蛋白酶能够特异性作用于其底物68-KD NFP，因此68-KDNFP降解产物的水平可以直接反映钙蛋白酶的活性。

本研究结果表明，在再灌注后不同时间点，UTI组和MP组脊髓中calpain-I阳性细胞的数量和密度较缺血再灌注组为低，表明UTI和MP可以抑制calpain的表达。Western Blot分析发现缺血再灌注组动物在脊髓缺血再灌注损伤后4h即已经能够检测到68-KDNFP的降解产物，随着时间的延长，降解产物量逐渐增加。再灌注后4h、24h、4d，UTI组和MP组68-KD NFP的降解得到明显的抑制，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。可见，UTI和MP对脊髓缺血再灌注损伤后所导致的68-KD NFP的降解也起到一定的抑制作用，这种作用在用药后24h最为显著。总之，以上结果显示UTI可以通过抑制钙蛋白酶的表达，对缺血再灌注损伤大鼠起治疗和保护作用。

Claims (7)

1.乌司他丁在制备治疗和/或预防脊髓损伤药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物的给药量是每次10-500万单位，每天给药1-4次；优选，药物的给药量每次30-300万单位，每天给药2-3次。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物是冻干粉针剂。

4.根据权利要求2抽述的用途，其中所述药物是注射液。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述的药物还含有选自甘露醇、乳糖、水解明胶、氯化钠或葡萄糖的一种或任意混合物的添加剂。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述的药物还含有选自注射用水、甘露醇、氯化钠或葡萄糖的一种或任意混合物的添加剂。

7.一种治疗和/或预防脊髓损伤药物，其包含乌司他丁和一种或多种制药可接受的载体或添加剂。