CN100999766B - 长穗偃麦草e染色体rga-scar特异分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长穗偃麦草E染色体RGA-SCAR特异分子标记的方法，该方法通过在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物，PCR扩增后获得不同E染色体上的抗性基因类似片段，在NBS及LRR保守区域设计E染色体RGA-SCAR特异性引物，并确定针对不同引物的PCR扩增程序与反应体系。本发明能够在短时间内精确鉴定二倍体长穗偃麦草不同染色体，效果快捷明显，有良好的推广前景，为小麦野生近缘种长穗偃麦草外源基因源高效转育并改良普通栽培小麦提供了分子辅助选择基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术和遗传育种领域，具体涉及到一种开发长穗偃麦草E染色体特异性引物及其新型分子标记的方法，以及该分子标记技术在小麦遗传育种改良方面的应用。
背景技术
长穗偃麦草[Agropyron elongtum(Host)Beauv.＝Elytrigia elongate(Host)Nevski＝Thinopyrum elongatum(Host)D.R.Dewey]是小麦的一个重要近缘种，具有蛋白质含量高、抗多种真菌和病毒病害、耐旱、耐寒、大穗多花等优异性状，是在小麦品种改良中应用最广泛的野生种之一。在自然界，长穗偃麦草有二倍体、四倍体和十倍体3种倍性类型。其中二倍体长穗偃麦草(Lophopyrumelongatum(Host)A.L
ve EE，2n＝14)含有的E(或Ee)被认为是长穗偃麦草的基本染色体组。二倍体长穗偃麦草具有抗盐、抗旱等许多优良性状，因而人们较早地开展了小麦与偃麦草的远缘杂交和回交转育工作，相继育成了一套完整的小麦-长穗偃麦草二体附加系和代换系。另外，二倍体长穗偃麦草E基因组中1E、2E、3E、4E、5E、6E、7E分别与小麦染色体的1、2、3、4、5、6、7部分同源群具有部分同源的关系，与小麦A、B、D基因组在遗传上具有较高的部分代偿能力。因此，利用具有小麦遗传背景的小麦-长穗偃麦草异源附加系及代换系等作为改良普通栽培小麦的桥梁亲本，提高长穗偃麦草携带的抗白粉病、条锈病及赤霉病等优异基因向栽培小麦的转育效率。
自1992年应用转座子标签法(Transposon Tagging)分离出第一个抗病基因Hml以来，迄今已有50多个抗病基因(R基因)从12种不同植物中获得克隆。R基因在序列上有很大同源性，而且R基因表达产物(R protein)的氨基酸序列表现出许多高度保守的区域(核苷酸结合位点、富亮氨酸重复序列、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、亮氨酸拉链结构、跨膜结构域、Toll白介素-1区域等)。这一特性使得同源性克隆成为可能。根据这些保守序列，合成寡核苷酸引物，通过 PCR扩增R基因同源类似序列(Resistance Gene Analogs，RGA)，这种基于抗病基因(R基因)同源序列的候选基因法(Homology-Based Candidate Gene Method)是近年来兴起的基因分离技术，已经成为一条很有前途的克隆抗病基因的新途径，目前已广泛应用于植物抗病基因及其同源物的分离。
目前尽管利用抗病基因同源序列的候选基因法已经从小麦族中分离到相当的RGAs片段，但迄今未见从二倍体长穗偃麦草中利用该方法克隆到相关抗病基因片段的报道。本发明通过发明人长期反复的对植物抗病基因的详细研究，利用抗病基因同源序列的候选基因法首次成功克隆到二倍体长穗偃麦草的RGAs片段，并利用SCAR(Sequence Charactered Amplified Region，序列特征化扩增区域，简称SCAR)分子标记技术，依据已获得的长穗偃麦草不同E染色体上的RGAs片段核苷酸信息，设计特异标记引物，扩增一整套中国春-长穗偃麦草二体附加系，进而获得二倍体长穗偃麦草E染色体特异RGA-SCAR分子标记，为小麦野生近缘种长穗偃麦草外源基因源高效转育并改良普通栽培小麦提供了分子辅助选择基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种开发抗性基因类似序列(RGAs)分子标记方法，从而获得长穗偃麦草E染色体组RGA-SCAR特异分子标记，为小麦野生近缘种长穗偃麦草外源基因源高效转育到栽培小麦背景中提供分子信息基础。通过本发明开发出特异扩增二倍体长穗偃麦草1E～7E不同染色体的特异标记引物。能够应用普通PCR技术快速精确鉴定E基因组中特定染色体。
为了达到本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：
a、从NCBI数据库中获得植物抗性基因相关序列，并利用DNAMAN5.0软件将其翻译为氨基酸编码序列，对获得的序列资源进行鉴定，筛选合适的序列进行深入分析。
b、根据抗性基因编码氨基酸保守区域NBS和LRR序列，利用DNAMAN 5.0软件和Primer5.0软件设计简并引物对一套完整的中国春-二倍体长穗偃麦草二体附加系进行扩增，获得不同E染色体上的抗性基因类似片段。
c、将b步获得的来源于长穗偃麦草基因组中将具有NBS及LRR保守区域的序列进行加工后，根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前特定碱基处根据染色体位点特异性开发E染色体RGA-SCAR特异性引物。
d、在中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系中验证不同E染色体上RGA-SCAR引物的特异性和稳定性，并确定针对不同引物的PCR扩增程序与反应体系。
通过上述步骤，获得偃麦草E染色体的RGA-SCAR特异分子标记引物：
1、特异扩增长穗偃麦草1E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F1E：5’-TATATGTAGACTAGTCGTGCACA-3’
RGA-R1E：5’-GTTCACAGAGGACGAACCATC-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系。扩增片段大小为495bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)：1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μM RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 50℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39 Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草1E二体附加系在495bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
2、特异扩增长穗偃麦草2E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F2E：5’-GCCCTCTGGCTTGTCACTTG-3’
RGA-R2E：5’-GCGTATCATAATAAAGCAGC-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系。扩增片段大小为512bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)∶1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μM RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 55℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草2E二体附加系在512bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
3、特异扩增长穗偃麦草3E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F3E：5’-AGCCGTTAAGCATGGTGTAC-3’
RGA-R3E：5’-TGAAAACTACTCCATCTGAC-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系。扩增片段大小为420bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)∶1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μM RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 58℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草3E二体附加系在420bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
4、特异扩增长穗偃麦草4E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F4E：5’-CTCCAATATTATGAATATGTGCCTT-3’
RGA-R4E：5’-TTCTGTTGCTAATATTTGCACAC-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系。扩增片段大小为485bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)∶1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μM RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 54℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草4E二体附加系在485bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
5、特异扩增长穗偃麦草5E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F5E：5’-CAACATCAACAATGAAGGAC-3’
RGA-R5E：5’-AAGATGCGAATGGACTCAAG-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系。扩增片段大小为450bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)∶1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μ M RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 60℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草5E二体附加系在450bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
6、特异扩增长穗偃麦草6E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F6E：5’-GTTATTTGGTGCCAGCGTTG-3’
RGA-R6E：5’-TGGTTCCAAAAGTCCATCAG-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加 系。扩增片段大小为560bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)∶1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μM RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 50℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草6E二体附加系在560bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
7、特异扩增长穗偃麦草7E染色体RGA-SCAR分子标记：
RGA-F7：5’-GCAGCAACTTGTGC-3’
RGA-R7：5’-TCTTCAGCTATCTGC-3’
扩增中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系。扩增片段大小为610bp。扩增反应程序如下：
PCR反应体系(25μl)∶1×PCR缓冲液
2mM MgCl2
0.2mM dNTP Mix
1U Taq Enzyme
0.5μM RGA-SCAR引物
100ng DNA模板
PCR程序为：
Step1 94℃预变性5min
Step2 94℃变性30sec
Step3 54℃退火45sec
Step4 72℃延伸1min
Step5 Go to Step 2 For 39Times
Step6 72℃延伸7min
电泳检测：
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。在所有供试材料中，仅有中国春-长穗偃麦草双二倍体和中国春-长穗偃麦草7E二体附加系在610bp位置出现PCR扩增电泳谱带。
本发明的积极性效果及应用如下：
1、本发明使用的PCR体系，不需要特殊的PCR仪器和特殊的反应试剂，普通商业公司生产的产品均能达到要求。
2、本发明的PCR条件中对扩增效果影响最大的是特异引物的设计。本发明中所开发的E染色体特异分子标记均来自本发明所获得的RGAs片段，且用于扩增的特异标记引物在染色体位置与碱基组成上差异较大，不会出现相互混淆或者干扰，可以保证结果准确。
3、利用碱基特异性设计了7对引物，结构简明，使用方便，且利用PCR技术检测快速高效，在短时间内能够精确鉴定二倍体长穗偃麦草不同染色体，效果快捷明显，有良好的推广前景。
4、本发明所获得的长穗偃麦草E染色体特异分子标记为小麦野生近缘种长穗偃麦草外源基因源高效转育并改良普通栽培小麦提供了分子辅助选择基础。
附图说明
图1：长穗偃麦草1E染色体特异分子标记检测图谱。
图2：长穗偃麦草2E染色体特异分子标记检测图谱。
图3：长穗偃麦草3E染色体特异分子标记检测图谱。
图4：长穗偃麦草4E染色体特异分子标记检测图谱。
图5：长穗偃麦草5E染色体特异分子标记检测图谱。
图6：长穗偃麦草6E染色体特异分子标记检测图谱。
图7：长穗偃麦草7E染色体特异分子标记检测图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1：
1、基因组DNA提取
采用CTAB法提取基因组DNA。取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB，1.4M NaCl，0.1MTris-HCl(pH8.0)，0.1MEDTA(pH8.0)，临用前加2％β-巯基乙醇15ml，混匀。
65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。
冷却至室温后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。
取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。
勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次，气干DNA，溶于适量pH8.0的TE溶液中。
0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F1：5’-GCATTGGAACAAGGTGAA-3’
RGA-R1：5’-AGGGGGACCACCACGTAG-3’
3、RGAs片段PCR扩增
3.1PCR反应体系
| DNA(50ng/μl) | 100ng | 2μl |
| 3.2 PCR扩增体系 | ||
| Step1Step2Step3Step4Step5Step6Step7Step8 | 94℃94℃降温至退火温度45-55℃72℃44 times to step 272℃12℃ | 5min30s-0.5℃ pre sec45s1min7minForever |
4、RGAs片段的获得
4.1产物回收、纯化
(1)在紫外灯下小心割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5ml的离心管中。
(2)按每100mg琼脂糖/300μl溶胶液的比例加入溶胶buffer，50℃水浴10min，使琼脂糖全部溶化，每2min颠倒一次。
(3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。
(4)在吸附柱中加入500μl洗涤液，静置1min后12000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
(5)重复第4步的操作。
(6)12000rpm离心2min。
(7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30μl洗脱液，静置1min后，12000rpm离心1min。
(8)将回收产物经琼脂糖凝胶电泳检测后贮存在-20℃的冰箱中待用。
4.2转化
扩增产物回收并纯化后连接到T载体反应体系如下：
T-vector 1μl(约50ng)
10×连接酶缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 350U
回收PCR产物 加至终反应体积20μl
16℃连接过夜
转化大肠杆菌DH10B
感受态细胞的制备
(1)取在无抗生素平板上生长良好的单个DH10B菌落，接种于2ml LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养。
(2)取500μl活化过夜的菌液于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3。
(3)将菌液倒入50ml离心管中，冰浴放置30min。
(4)在预冷至4℃的离心机中，4000rpm离心10min后去掉上清液，收集菌体。
(5)加入20ml冰冷的0.1M CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴30min。
(6)4℃下，4000rpm离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。
热击转化和兰白斑筛选
(1)将连接产物加入75μl感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min。
(2)42℃热击2min 30s，冰浴1min后加入预热至37℃的LB液体培养基400μl。
(3)37℃低速(100rpm)振荡培养40min。
(4)在每个含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上加200μl菌液，0.1M IPTG 4μl和20mg/ml的X-gal 40μl均匀涂于平板上。
(5)37℃培养箱中过夜培养。
4.3阳性克隆筛选：
挑取培养过夜的培养平板上生长良好的白色、兰色单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37℃培养过夜)。
挑取少量白班菌落进行PCR扩增，所用引物同第2步，其扩增体系及反应体系同3.1和3.2。
4.4序列分析：
利用NCBI网址中的blast等分析软件以及DNAMAN5.0进行DNA序列与氨基酸序列分析。结合已发表的R基因序列，验证简并引物扩增的准确性。
4.5长穗偃麦草1E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对 获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前10bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草1E染色体的特异引物(引物的3’末端碱基表示为1E染色体的特异碱基位点，用粗体表示)。该引物具体如下：
RGA-F1E：5’-TATATGTAGACTAGTCGTGCACA-3’
RGA-R1E：5’-GTTCACAGAGGACGAACCATC-3’
4.61E染色体特异分子标记扩增：
PCR反应体系
4.7长穗偃麦草1E染色体组特异分子标记的鉴定
(1)1.5％琼脂糖胶进行PCR扩增产物分离。
(2)将电泳后的琼脂糖胶在凝胶成像系统中进行拍照、成像及分析。
实施例2：
1、同实施例1第1步
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F2：5’-CGCAACCACTAGAGTAAC-3’
RGA-R2：5’-ACACTGGTCCATGAGGTT-3’
3、同实施例1第3步
4、同实施例1第4步
4.1同实施例1第4.1步
4.2同实施例1第4.2步
4.3同实施例1第4.3步
4.4同实施例1第4.4步
4.5长穗偃麦草2E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前12bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草2E染色体的特异引物。该引物具体如下：
RGA-F2E：5’-GCCCTCTGGCTTGTCACTTG-3’
RGA-R2E：5’-GCGTATCATAATAAAGCAGC-3’
4.6同实施例1第4.6步
4.7同实施例1第4.7步
实施例3：
1、同实施例1第1步
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F3：5’-ATGGGAAGCAAGTATTCAAGGC-3′
RGA-R3：5’-TTGGCACAAAATTCTCATCAAGC-3’
3、同实施例1第3步
4、同实施例1第4步
4.1同实施例1第4.1步
4.2同实施例1第4.2步
4.3同实施例1第4.3步
4.4同实施例1第4.4步
4.5长穗偃麦草3E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前11bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草3E染色体的特异引物。该引物具体如下：
RGA-F3E：5’-AGCCGTTAAGCATGGTGTAC-3’
RGA-R3E：5’-TGAAAACTACTCCATCTGAC-3’
4.6同实施例1第4.6步
4.7同实施例1第4.7步
实施例4：
1、同实施例1第1步
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F4：5’-GGTGGGGTTGGGAAGACAACG-3’
RGA-R4：5’-CAACGCTAGTGGCAATCC-3’
3、同实施例1第3步
4、同实施例1第4步
4.1同实施例1第4.1步
4.2同实施例1第4.2步
4.3同实施例1第4.3步
4.4同实施例1第4.4步
4.5长穗偃麦草4E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前10-15bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草4E染色体的特异引物。该引物具体如下：
RGA-F4E：5’-CTCCAATATTATGAATATGTGCCTT-3’
RGA-R4E：5’-TTCTGTTGCTAATATTTGCACAC-3’
4.6同实施例1第4.6步
4.7同实施例1第4.7步
实施例5：
1、同实施例1第1步
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F5：5’-GCGGGTCTGGGAAATCTACC-3’
RGA-R5：5’-CTGCAGTAAGCAAAGCAACG-3’
3、同实施例1第3步
4、同实施例1第4步
4.1同实施例1第4.1步
4.2同实施例1第4.2步
4.3同实施例1第4.3步
4.4同实施例1第4.4步
4.5长穗偃麦草5E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前14bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草5E染色体的特异引物。该引物具体如下：
RGA-F5E：5’-CAACATCAACAATGAAGGAC-3’
RGA-R5E：5’-AAGATGCGAATGGACTCAAG-3’
4.6同实施例1第4.6步
4.7同实施例1第4.7步
实施例6：
1、同实施例1第1步
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F6：5’-TTGTCAGGCCAGATACCC-3’
RGA-R6：5’-GAGGAAGGACAGGTTGCC-3’
3、同实施例1第3步
4、同实施例1第4步
4.1同实施例1第4.1步
4.2同实施例1第4.2步
4.3同实施例1第4.3步
4.4同实施例1第4.4步
4.5长穗偃麦草6E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前15bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草6E染色体的特异引物。该引物具体如下：
RGA-F6E：5’-GTTATTTGGTGCCAGCGTTG-3’
RGA-R6E：5’-TGGTTCCAAAAGTCCATCAG-3’
4.6同实施例1第4.6步
4.7同实施例1第4.7步
实施例7：
1、同实施例1第1步
2、引物设计
从NCBI数据库中获得具有NBS-LRR编码氨基酸保守区的植物抗性基因相关序列，依据DNAMAN5.0软件序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物。该简并引物具体性质如下：
RGA-F7：5’-GCAGCAACTTGTGC-3’
RGA-R7：5’-TCTTCAGCTATCTGC-3’
3、同实施例1第3步
4、同实施例1第4步
4.1同实施例1第4.1步
4.2同实施例1第4.2步
4.3同实施例1第4.3步
4.4同实施例1第4.4步
4.5长穗偃麦草7E染色体特异引物设计
根据不同E染色体来源的RGAs片段进行分类，然后依据DNAMAN5.0软件对获得的序列进行比对，在各染色体克隆片段保守区域前12bp处根据染色体位点特异性设计特异扩增该位点的特异引物，该特异引物即代表了长穗偃麦草7E染色体的特异引物。该引物具体如下：
RGA-F7E：5’-GAAACGGTTCCAACGTCGATT-3’
RGA-R7E：5’-GCCACAAATAAGTTGCTCTG-3’
4.6同实施例1第4.6步
4.7同实施例1第4.7步
Claims (1)
1.一种长穗偃麦草E染色体RGA-SCAR特异分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、采用CTAB法从新鲜幼嫩叶片中提取基因组DNA，并检测DNA浓度及质量；
b、依据从NCBI数据库中获得的NBS-LRR类抗性基因或类似序列，通过比对软件DNAMAN5.0对序列比对结果，在NBS和LRR保守编码区上下游分别设计简并引物：
(1)RGA-F1：5’-GCATTGGAACAAGGTGAA-3’，
RGA-R1：5’-AGGGGGACCACCACGTAG-3’；
或(2)RGA-F2：5’-CGCAACCACTAGAGTAAC-3’，
RGA-R2：5’-ACACTGGTCCATGAGGTT-3’；
或(3)RGA-F3：5’-ATGGGAAGCAAGTATTCAAGGC-3′，
RGA-R3：5’-TTGGCACAAAATTCTCATCAAGC-3’；
或(4)RGA-F4：5’-GGTGGGGTTGGGAAGACAACG-3’，
RGA-R4：5’-CAACGCTAGTGGCAATCC-3’；
或(5)RGA-F5：5’-GCGGGTCTGGGAAATCTACC-3’，
RGA-R5：5’-CTGCAGTAAGCAAAGCAACG-3’；
或(6)RGA-F6：5’-TTGTCAGGCCAGATACCC-3’，
RGA-R6：5’-GAGGAAGGACAGGTTGCC-3’；
或(7)RGA-F7：5’-GCAGCAACTTGTGC-3’
RGA-R7：5’-TCTTCAGCTATCTGC-3’；
c、利用b步骤设计的简并引物对一套完整的中国春-二倍体长穗偃麦草二体附加系进行扩增，获得不同E染色体上的抗性基因类似片段；
d、将c步骤具有NBS及LRR保守区域的序列进行加工后，通过序列比对软件DNAMAN5.0比对，观察序列结构并依据序列间同源性设计E染色体RGA-SCAR特异性引物，其特征在于，所述的E染色体RGA-SCAR特异性引物是由下列碱基组成的特定序列的寡聚体，每条引物序列3’末端碱基含有具有特定染色体特征的特异碱基位点：
(1)RGA-F1E：5’-TATATGTAGACTAGTCGTGCACA-3’，
RGA-R1E：5’-GTTCACAGAGGACGAACCATC-3’；
或(2)RGA-F2E：5’-GCCCTCTGGCTTGTCACTTG-3’，
RGA-R2E：5’-GCGTATCATAATAAAGCAGC-3’；
或(3)RGA-F3E：5’-AGCCGTTAAGCATGGTGTAC-3’，
RGA-R3E：5’-TGAAAACTACTCCATCTGAC-3’；
或(4)RGA-F4E：5’-CTCCAATATTATGAATATGTGCCTT-3’，
RGA-R4E：5’-TTCTGTTGCTAATATTTGCACAC-3’；
或(5)RGA-F5E：5’-CAACATCAACAATGAAGGAC-3’，
RGA-R5E：5’-AAGATGCGAATGGACTCAAG-3’；
或(6)RGA-F6E：5’-GTTATTTGGTGCCAGCGTTG-3’，
RGA-R6E：5’-TGGTTCCAAAAGTCCATCAG-3’；
或(7)RGA-F7E：5’-GAAACGGTTCCAACGTCGATT-3’，
RGA-R7E：5’-GCCACAAATAAGTTGCTCTG-3’；
e、在中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及中国春-长穗偃麦草二体附加系中验证不同E染色体上RGA-SCAR引物的特异性和稳定性，并确定针对不同引物的PCR扩增程序与反应体系。
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| 尤明山等.偃麦草E染色体组特异RAPD和SCAR标记的建立.中国农业大学学报7 5.2002,7(5),1-6. |
| 尤明山等.偃麦草E染色体组特异RAPD和SCAR标记的建立.中国农业大学学报7 5.2002,7(5),1-6. * |
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