CN100528877C

CN100528877C - 一种嘌呤类生物碱及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN100528877C
Application number: CNB2007100313720A
Authority: CN
Inventors: 漆淑华; 张偲
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2009-08-19
Anticipated expiration: 2027-11-13
Also published as: CN101157695A

Abstract

本发明涉及一种式(1)表示的嘌呤类生物碱，还涉及这种生物碱的制备方法及其在抗肿瘤的应用。首先将侧扁软柳珊瑚(Subergorgia suberosa)用有机溶剂提取得到的粗提取物悬溶于水，先用氯仿或乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，减压浓缩得氯仿层或乙酸乙酯层以及正丁醇层；将正丁醇层进行常压硅胶柱层析，用氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分；将在TLC上能用体积比1∶1的氯仿-甲醇溶剂系统展开、且在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，纯化得到式(1)化合物。本发明的化合物对乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等癌细胞都有一定的抑制作用。

Description

一种嘌呤类生物碱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一个新的嘌呤类生物碱，还涉及其制备方法以及它在抑制癌细胞生长方面的应用。

背景技术

侧扁软柳珊瑚(Subergorgia suberosa)中富含倍半萜，据文献报道到目前为止国内外科研工作者已从世界不同水域的侧扁软柳珊瑚中分离到多个倍半萜和甾醇，并开展了一系列细胞毒性的筛选，发现其中部分化合物对人肺腺癌细胞系P-388、A549、HT-29细胞株和宫颈癌HeLa细胞株显示潜在的细胞毒性，我们也曾从中分离到一个新倍半萜生物碱具有强抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的在于从侧扁软柳珊瑚中分离出一个新的对癌细胞有强抑制作用的嘌呤类生物碱，另一个目的是提供该嘌呤类生物碱的制备方法，进一步的目的是提供该嘌呤类生物碱在制备抗癌药物中的应用。

本发明通过多种常压柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从南海侧扁软柳珊瑚中分离得到一个新的嘌呤类生物碱，该嘌呤类生物碱对人乳腺癌细胞株和肝癌细胞株等都有不同程度的抑制作用，从而实现了本发明的目的。

本发明的嘌呤类生物碱由式(1)表示：

式(1)

结构鉴定：

式(1)中化合物，根据其NMR谱以及高分辨质谱HRESIMS，推导其分子式为C₁₃H₁₄N₇O₃。其¹³C NMR(DEPT)谱显示9个低场碳信号[δ_C107.8(s)，117.4(d)，131.8(s)，136.9(s)，139.0(s)，150.3(s)，154.3(s)，155.4(s)，162.4(s)]、以及1个甲基(δ_c28.5)、2个亚甲基(δ_c42.4，46.2)和1个次甲基(δ_c28.2)。¹H NMR谱显示1个甲基[δ_H3.24(3H，s)]、2个亚甲基[δ_H3.82(1H，dd，J＝9.0，12.9Hz)，4.25(1H，dd，J＝4.2，12.9Hz)，4.29(1H，dd，J＝8.8，12.9Hz)，4.62(1H，dd，J＝4.4，12.9Hz)]、1个次甲基[δ_H4.48(1H，m)]和2个烯氢[δ_H5.95(1H，d，J＝9.5Hz)，8.83(1H，s)]。将这些低场碳信号的NMR数据和我们曾从同物种柳珊瑚中分离到的生物碱6-(9’-purine-6’，8’-diolyl)-2β-suberosanone中低场碳信号的NMR数据很相似，故推测本发明的生物碱也是一个连有6，8-二羰基嘌呤基团的生物碱。

其HMBC谱显示δ_H8.83(1H，s，H-2)和δ_C107.8(s)，139.0(s)，155.4(s)相关，论证了6，8-二羰基嘌呤基团的存在。HMBC谱显示δ_H4.29(1H，dd，J＝8.8，12.9Hz，H-1’a)，4.62(1H，dd，J＝4.4，12.9Hz，H-1’b)，3.82(1H，dd，J＝9.0，12.9Hz，H-5’a)，4.25(1H，dd，J＝4.2，12.9Hz，H-5’b)，和δ_C28.2(d，C-2’)，117.4(d，C-3’)相关，δ_H4.48(1H，m，H-2’)和δ_C46.2(t，C-1’)，42.4(t，C-5’)，117.4(d，C-3’)，131.8(s，C-4’)相关，δ_H5.95(1H，d，J＝9.5Hz，H-3’)和δ_C46.2(t，C-1’)，42.4(t，C-5’)，131.8(s，C-4’)相关，¹H-¹H COSY谱显示H-2’和H-1’a，H-1’b，H-5’a，H-5’b，H-3’，相关，说明存在一个异戊烯基团。HMBC谱中H-1’a/1’b，H-5’a/5’b和C-4(δ_C139.0，s)相关，H-1’a/1’b和C-2(δ_C136.9，s)相关，H-5’a/5’b和C-8(δ_C150.3，s)相关，这些数据表明该异戊烯基团通过C-1’与N(3)、以及C-5’与N(9)这两个C-N键和6，8-二羰基嘌呤基团相连。HMBC谱中H-3’和δ_C162.4(s)相关，δ_H3.24(3H，s，Me-10’)和C-4’、C-8’(δ_C154.3，s)相关，另外根据分子式中氮、氧原子数量的需要，以及与连有咪唑类基团的化合物相比照(文献1：Aiello A，D’Esposito M，Fattorusso E，etal.Bio Med Chem，2006，14(1)：17-24.2：Cafieri F，Fattorusso E，MangoniA，et al.Tetrahedron Lett，1996，37(20)：3587-3890.)，说明该化合物中含有一个2-imino-5-isopropenely-1-methyl-4-imidazolidinone片段。因此，本发明的嘌呤类生物碱的结构由式(1)表示。

本发明式(1)的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将侧扁软柳珊瑚(Subergorgia suberosa)用甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷中的一种提取，将提取液减压浓缩得粗提取物，将粗提取物悬溶于水，先用氯仿或乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，减压浓缩得氯仿层或乙酸乙酯层以及正丁醇层；

(2)将上述得到的正丁醇层进行常压硅胶柱层析，用体积比从10∶0到0∶10变化的氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上能用体积比1∶1的氯仿-甲醇溶剂系统展开的组分用体积比从3∶2到2∶3变化氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，收集在TLC上用体积比1∶1的氯仿-甲醇溶剂系统展开时R_f值为0.20～0.40，而且在紫外灯254nm波长下有紫外吸收的组分，得式(1)化合物的粗品，将该粗品纯化得纯的式(1)化合物。

步骤(1)所述的溶剂提取最好是用体积比2∶1的乙醇-二氯甲烷混合溶剂，所述的氯仿或乙酸乙酯萃取最好为3～4次，所述的正丁醇萃取最好为3～4，所述的浓缩可以采用常规的方法例如减压浓缩，步骤(2)所述的纯化可以采用常规的方法例如过柱和重结晶等。

以下实验证明本发明式(1)表示的嘌呤类生物碱可在治疗乳腺癌、肝癌等癌症中应用。

通过体外活性定量筛选，发现本发明式(1)表示的嘌呤类生物碱对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人肝癌细胞株A435的生长有较好抑制作用，其半数抑制率IC50分别为16.50μg/mL和20.86μg/mL；此外，该嘌呤类生物碱对小鼠淋巴细胞白血病L1210、人口腔癌KB细胞系和肺癌细胞株等也分别显示不同程度的潜在的抑制作用。

具体实施方式

以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

实施例1：嘌呤类生物碱的制备

以湿重5Kg的侧扁软柳珊瑚(Subergorgia suberosa)为原料，冷冻干燥切碎后用乙醇和二氯甲烷(体积比2∶1)的混合有机溶剂(约40L)提取3次，将提取液减压浓缩得粗提取物，将粗提取物悬溶于水，依次用氯仿和正丁醇分别萃取3次(每次1000mL)，减压浓缩得氯仿层80g和正丁醇层9g。用氯仿和甲醇的混合溶剂(体积比1∶1)将正丁醇层溶解拌硅胶，用约180mL氯仿拌约90g硅胶进行湿法装柱，以氯仿-甲醇(体积比从10∶0到0∶10变化)溶剂系统梯度洗脱，薄层层析TLC(GF₂₅₄)追踪合并得6个组分。将在TLC(GF₂₅₄)上能用氯仿-甲醇(体积比1∶1)溶剂系统展开的组分用氯仿-甲醇(体积比从3∶2到2∶3变化)溶剂系统冲洗，得式(1)化合物的粗品，将该粗品用氯仿-甲醇的混合溶剂重结晶。得到的产物在紫外灯254nm波长下有紫外吸收，用氯仿-甲醇体积比为1∶1的溶剂系统展开时R_f值为0.20～0.40，经下述光谱数据验证，证实为式(1)化合物：

3，9-(2-imino-1-methyl-4-imidazolidinone-5-yl)isopropenely-purine-6，8-dione(1)：白色粉末，易溶于水(加1滴盐酸)；UV(MeOH)λ_max212，264；IR(KBr)：3500，3115，1740，1710，1670，1600cm^-1；¹H-NMR(500MHz，D₂O+0.5N HCl)δ_H：3.24(3H，s，NMe)，3.82(1H，dd，J＝9.0，12.9Hz，H-5’a)，4.25(1H，dd，J＝4.2，12.9Hz，H-5’b)，4.29(1H，dd，J＝8.7，12.9Hz，H-1’a)，4.62(1H，dd，J＝4.4，12.9Hz，H-1’b)，4.48(1H，m，H-2’)，5.95(1H，d，J＝9.5Hz，H-3’)，8.83(1H，s)；¹³C-NMR(125MHz，D₂O+0.5N HCl)δ_C：28.2(d，C-2’)，28.5(q，C-10’)，42.4(t，C-5’)，46.2(t，C-1’)，117.4(d，C-3’)，131.8(s，C-4’)，136.7(d.C-2)，139.0(s，C-4)，150.3(s，C-8)，154.3(s，C-8’)，155.4(s，C-6)，162.4(s，C-6’)；ESIMS(+)m/z：316[M+H]⁺；HRFABMSm/z：316.1076[M+H]⁺(calcd.for C₁₃H₁₄N₇O₃ 316.1080).

实施例2：MTT法测试式(1)化合物体外抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人肝癌细胞株A435的细胞生长的实验

收集对数生长期MDA-MB-231和A435细胞，分别接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0×10⁵/100μL，置于5％CO₂培养箱培养，次日去掉培养基，加入不同浓度药物100μL(药物浓度采用对倍稀释)，阴性对照组不加药物，48h后，每孔加入MTT 10μL，继续培养4h，再每孔加入DMSO 100μL终止反应，常温放置1h，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率，计算式如下：

生长抑制率(％)＝[(A_阴性-A_实验)/(A_阴性-A_空白)]×100％式(2)

得到对MDA-MB-231和A435细胞生长的半数抑制率IC50分别为16.50μg/mL和20.86μg/mL。

Claims

1.下述式(1)的化合物：

式(1)。

2.权利要求1的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将侧扁软柳珊瑚Subergorgia suberosa用甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷中的一种提取，将提取液减压浓缩得粗提取物，将粗提取物悬溶于水，先用氯仿或乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，减压浓缩得氯仿层或乙酸乙酯层以及正丁醇层；

(2)将上述得到的正丁醇层进行常压硅胶柱层析，用体积比从10∶0到0∶10变化的氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上能用体积比1∶1的氯仿-甲醇溶剂系统展开的组分用体积比从3∶2到2∶3变化的氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，收集在TLC上用体积比1∶1的氯仿-甲醇溶剂系统展开时R_f值为0.20～0.40，而且在紫外灯254nm波长下有紫外吸收的组分，得式(1)化合物的粗品，将该粗品纯化得纯的式(1)化合物。

3.权利要求1的化合物在制备治疗乳腺癌和肝癌的抗癌药物中的应用。