CN101343274B

CN101343274B - 一种咔唑类生物碱及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101343274B
Application number: CN2008100302082A
Authority: CN
Inventors: 漆淑华; 张偲
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2008-08-18
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2028-08-18
Also published as: CN101343274A

Abstract

本发明涉及一个由下述式(1)表示新的咔唑类生物碱，还涉及其制备方法和应用。其特征是将二叉黑角珊瑚(Antipathes dichotcma(Pallas))有机溶剂粗提取物悬浮于水后用乙酸乙酯或氯仿萃取，收集乙酸乙酯层或氯仿层进行常压硅胶柱层析，用薄层层析追踪合并，并用体积比9:1的氯仿-丙酮溶剂系统洗脱，收集R_f值约为0.5～0.7，且在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，得到粗产物，进一步提纯得到纯品。本发明的咔唑类生物碱可用于制备治疗胃癌，肝癌和抗单纯疱疹病毒的药物中，其对人胃腺癌细胞株SGC-7901和人肝癌细胞Hep_G2的半数抑制率IC50分别为67.38μg/mL和73.65μg/mL；抗单纯疱疹HSV-I病毒的IC50值为30.68μg/mL。

Description

一种咔唑类生物碱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一个新的生物碱，具体来说是涉及一个由下述式(1)表示的新的咔唑类生物碱，另外还涉及这种生物碱的制备方法以及其在抑制癌细胞生长和抗病毒方面的应用。

背景技术

二叉黑角珊瑚(Antipathes dichotcma(Pallas))药名海铁树，铁树，《中华本草》记载它有清热，收涩，软坚的功效，主治食粘膜损伤，血痢，盗汗瘰疬，骨哽等。但是目前国内外还没有关于二叉黑角珊瑚的研究报道，只有国外的两篇关于从该属的另一种黑角珊瑚(Antipathes subpinnata)中分离出9个新的多羟基甾醇的研究报道([1]Aiello A，Fattorusso E，Menna M.Steroids，1991，56(10)：513-517.[2]Aiello A，FattorussoE，Menna M.J Nat Prod，1992，55(3)：321-325.)。

发明内容

本发明的目的在于从二叉黑角珊瑚中分离出一个新的咔唑类生物碱，另一个目的是提供该咔唑类生物碱的制备方法，进一步的目的是提供该咔唑类生物碱在制备抗癌药物和抗病毒药物中的应用。

我们利用常压柱层析，从南海二叉黑角珊瑚中分离得到一个新的咔唑类生物碱，该咔唑类生物碱对人胃腺癌细胞株SGC-7901和人肝癌细胞(Hep_G2)的生长有较好抑制作用，也具有较强的抗单纯疱疹病毒HSV-I病毒活性，从而实现了本发明的目的。

本发明的咔唑类生物碱，其结构由式(1)表示：

式(1)

本发明的咔唑类生物碱的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将二叉黑角珊瑚用有机溶剂提取，得到的提取液浓缩得到粗提取物；

(2)将步骤(1)得到的粗提取物悬浮于水，用乙酸乙酯或氯仿萃取，收集乙酸乙酯层或氯仿层；

(3)将上述乙酸乙酯层或氯仿层进行常压硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、氯仿-乙酸乙酯或氯仿-丙酮溶剂系统为洗脱剂，从体积比10:0到0:10变化进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并，得到的组分在薄层层析上用体积比9:1的氯仿-丙酮溶剂系统从体积比10:1到9:1变化进行冲洗，收集R_f值为0.5～0.7，且在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，得到粗产物，纯化得到由式(1)表示的化合物。

步骤(1)所述的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷的混合物或者乙醇和二氯甲烷的混合物等。

步骤(2)所述的乙酸乙酯或氯仿的萃取次数可以是3～4次。

步骤(3)所述的粗产物纯化可以采用常用的方法如重结晶或柱层析分离等。

本发明的咔唑类生物碱为淡黄色无定形粉末，通过碘化铋钾试剂显色(呈含氮化合物的显色反应)为阳性反应，从NMR和HRESIMS谱推出其分子式为C₁₆H₁₃N₃O₂，UV(MeOH)显示在波长220，240，264，301，336，348nm处有强吸收。在¹³C(DEPT)NMR谱中可以观察到16个碳信号，包括2个甲基(δ_C：28.4，30.9)、6个低场区的芳环次甲基(δ_C：104.7、110.1，111.9，119.5，122.0，128.4)、8个季碳(δ_C：114.4，122.8，129.7，133.9，136.8，143.5，151.0，162.6)。¹HNMR谱显示有2个单峰甲基质子信号(δ_H：3.57，3.66)，结合¹³CNMR谱提示应是与N相连的甲基；另外¹HNMR谱低场区显示有一个属于AA’BB’系统的4个芳香质子δ_H7.35(1H，t，J＝7.5Hz)、7.60(1H，t，J＝7.5Hz)、7.66(1H，d，J＝7.5Hz)、8.42(1H，d，J＝7.5Hz)、两个芳香环单质子δ_H8.14(1H，s)、8.66(1H，s)、以及一个低场活泼质子δ_H12.73(1H，s)。通过以上数据初步推测该化合物是1，3-二取代-9H-咔唑类生物碱。[参考文献：1)Ito C.，Wu T.S.，Furukawa H.Novel binary carbazolealkaloids from Murraya euchrestifolia.1990，38(5)：1143-1146.2)Itoigawa，M.etal.，J.Nat.Prod.，2000，63，893-897.]这个推测得到二维核磁共振HMBC实验的论证。在HMBC谱中，H-4(δ_H8.14)/H-5(δ_H7.66)/H-6(δ_H7.35)和C-5a(δ_C122.8)相关，H-7(δ_H7.60)/H-8(δ_H8.42)和C-8a(δ_C143.5)相关，H-2(δ_H8.66)和C-4(δ_C104.7)/C-1a(δ_C136.8)相关，NH(δ_H12.73)和C-8(δ_C111.9)/C-8a/C-1a/C-1(δ_C129.7)相关。此外，HMBC谱也显示H-2和C-4/C-3(δ_C133.9)/C-10(δ_C162.6)相关，Me-15(δ_H3.57)和C-10/C-12(δ_C151.0)相关，Me-14(δ_H3.66)和C-3/C-12相关，这表明有一个-CO-NCH₃-CO-NCH₃-基团连接于1，3-二取代-9H-咔唑骨架的C-1/3位置上。二维NOESY谱显示H-4和Me-14相关，进一步论证有一个-N(13)CH₃-基团连接于C-3位置上。因此证实本发明的咔唑类生物碱为式(1)的化合物。

通过体外活性定量筛选，发现本发明的咔唑类生物碱对人胃腺癌细胞株SGC-7901和人肝癌细胞(Hep_G2)的生长有较好抑制作用，其半数抑制率IC50分别为67.38μg/mL和73.65μg/mL。此外，该咔唑类生物碱具有较强的抗单纯疱疹病毒HSV-I病毒活性，其IC50值约为30.68μg/mL。

本发明的咔唑类生物碱可以用于制备治疗胃癌，肝癌的药物和抗单纯疱疹病毒的药物。

具体实施方式

以下的实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

以湿重3Kg的二叉黑角珊瑚(Antipathes dichotcma(Pallas))为原料，冷冻干燥切碎后用体积比2:1的乙醇-二氯甲烷混合有机溶剂15L提取3次，将提取液减压浓缩得粗提取物。将粗提取物悬溶于水，依次用乙酸乙酯萃取3次(每次各500mL)，取乙酸乙酯层，减压浓缩得到27g。用氯仿-甲醇混合溶剂将乙酸乙酯层溶解拌硅胶，用约600mL石油醚拌约500g硅胶进行湿法装柱，以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统从体积比10:0到0:10变化进行梯度洗脱，薄层层析TLC(GF₂₅₄)追踪合并得8个组分。将这8个组分在TLC(GF₂₅₄)上用氯仿-丙酮溶剂系统从体积比10:1到9:1变化进行冲洗，收集R_f值约为0.6，并能在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，得到粗产物。

将粗产物用氯仿-甲醇混合溶剂重结晶，得到淡黄色无定形膨松状粉末。经检测证实是式(1)的化合物。检测数据如下：一般显色剂不显色，改良碘化铋钾显桔红色；UV(MeOH)λ_max220，240，264，301，336，348nm；¹H NMR(C₅D₅N，500MHz)δ_H：3.57(3H，s，Me-15)，3.66(3H，s，Me-14)，7.35(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，7.60(1H，t，J＝7.5Hz，H-7)，7.66(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，8.14(1H，s，H-4)，8.42(1H，d，J＝7.5Hz，H-8)，8.66(1H，s，H-2)，12.73(1H，s，NH)；¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)δ_C：28.4(15-Me)，30.9(14-Me)，104.7(C-4)，110.1(C-2)，114.4(C-4a)，111.9(C-8)，119.5(C-6)，122.0(C-5)，122.8(C-5a)，128.4(C-7)，129.7(C-1)，133.9(C-3)，136.8(C-1a)，143.5(C-8a)，151.0(C-12)，162.6(C-10)；Negative-ion ESI^--MS m/z：278[M-H]^-，263，238，211；HRESIMS m/z：278.1004[M-H]^-(calcd.for C₁₆H₁₃N₃O₂278.1007).

实施例2：

收集对数生长期SGC-7901、Hep_G2细胞株，分别接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0×10⁵/100μL，置于5％CO₂培养箱培养，次日去掉培养基，加入不同浓度药物100μL(药物浓度采用对倍稀释)，阴性对照组不加药物，48h后，每孔加入MTT10μL，继续培养4h，再每孔加入DMSO100μL终止反应，常温放置1h，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率，计算式为：生长抑制率(％)＝[(A_阴性-A_实验)/(A_阴性-A_空白)]×100％。得到对SGC-7901、Hep_G2细胞生长的半数抑制率IC50分别为67.38μg/mL和73.65μg/mL。

实施例3：

收集对数生长期vero细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0×10⁵/100μL，置于5％，CO₂培养箱培养。次日将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的实施例1的式(1)化合物的溶液50μL，立即加入HSV-I病毒使用液50μL，同时设正常细胞对照，病毒对照，37℃，5％CO₂培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE)，每天观察细胞长势，以-、+、++、+++、++++表示细胞病变情况。结果显示，本发明的化合物对vero细胞的最大无毒浓度为25ug/ml，其抑制单纯疱疹病毒I型病变的IC₅₀值为30.68ug/mL。

Claims

1.以下式(1)的化合物：

2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将二叉黑角珊瑚(Antipathes dichotcma(Pallas))用有机溶剂提取，得到的提取液浓缩得到粗提取物，所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷的混合物或者乙醇和二氯甲烷的混合物；

(3)将上述乙酸乙酯层或氯仿层进行常压硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、氯仿-乙酸乙酯或氯仿-丙酮溶剂系统为洗脱剂，从体积比10∶0到0∶10变化进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并，得到的组分在薄层层析上用体积比9∶1的氯仿-丙酮溶剂系统从体积比10∶1到9∶1变化进行冲洗，收集R_f值为0.5～0.7，且在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，得到粗产物，纯化得到由式(1)表示的化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(2)所述的乙酸乙酯或氯仿的萃取次数是3～4次，步骤(3)所述的粗产物纯化用重结晶或柱层析方法。

4.权利要求1所述化合物在制备治疗胃癌，肝癌的药物和抗单纯疱疹病毒的药物中的应用。