CN105481754A

CN105481754A - 一种异吲哚生物碱类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105481754A
Application number: CN201510960124.9A
Authority: CN
Inventors: 胡秋芬; 周敏; 吴海艳; 李银科; 高雪梅; 叶艳清; 黄相忠; 江智勇; 杜刚; 杨海英; 李干鹏
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2016-04-13

Abstract

本发明公开了一种异吲哚生物碱类化合物及其制备方法和应用，所述异吲哚生物碱类化合物是从傣族药用植物豆科腊肠树（<i>Cassia？fistula</i>）的干燥树皮中分离得到，化合物命名为：2-(2-羟乙基)-5-甲基-6-异戊烯基-异吲哚-1-酮，英文名为2-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6-prenyl-isoindolin-1-one，其分子式为C₁₆H₂₁NO₂，具有下述结构：所述异吲哚生物碱类化合物制备方法是以傣族药用植物豆科腊肠树（<i>Cassia？fistula</i>）的干燥树皮为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而分离得到。所述异吲哚生物碱类化合物经细胞毒活性实验，对部分肿瘤细胞株具有较好的细胞毒活性。本发明化合物结构新颖，具有较好的生物活性，可作为抗癌药物的先导化合物。

Description

一种异吲哚生物碱类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于民族特色药用植物有效成分提取、分离和结构鉴定技术领域，具体涉及一种异吲哚生物碱类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

豆科决明属植物腊肠树（Cassiafistula），是泰国的国花，原产于南亚南部，分布在缅甸、斯里兰卡、印度以及中国大陆的南部、西南部等地，生长于海拔1,000米的地区。在中国傣族民间广泛用于皮肤感染、肥胖症、周期性发热以及肿瘤病等的治疗。而腊肠树在傣语中又叫“锅拢良”，在云南省西双版纳州主治止血，通便，退热。据报道，该植物的不同部位具有抗糖尿病、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化的活性。本发明从腊肠树中分离得到一个异吲哚生物碱类化合物，且该化合物具有显著的细胞毒活性。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种异吲哚生物碱类化合物；第二目的在于提供所述异吲哚生物碱类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述异吲哚生物碱类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的异吲哚生物碱类化合物是从豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的干燥树皮中分离得到，其分子式为C₁₆H₂₁NO₂，具有下述结构：

该化合物为浅黄色固体，命名为：2-(2-羟乙基)-5-甲基-6-异戊烯基-异吲哚-1-酮，英文名为：2-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6-prenylisoindolin-1-one。

本发明的第二目的是这样实现的，所述异吲哚生物碱类化合物的制备方法，是以豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的干燥树皮为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高效液相色谱制备分离步骤，具体为：

A、浸膏提取：将豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的树皮粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，合并提取液、过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；

B、有机溶剂萃取：在浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，然后用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；

C、MCI脱色：在浸膏b加入重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇水洗脱，合并有机相，减压浓缩成浸膏c;

D、硅胶柱层析：浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，用量为浸膏c重量6~10倍量；以体积配比为1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高效液相色谱分离：将以体积含量为50~90%石油醚－丙酮溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的异吲哚生物碱类化合物。

本发明所制备的异吲哚生物碱类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为浅黄色固体；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ_max(logε）：210(4.32)、260(3.86)、298(3.05)；红外光谱（溴化钾压片）ν_max：3312、2930、1665、1610、1547、1460、1354、1213、1152、1068、838、746cm^–1；高分辨质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z260.1658[M+H]⁺（计算值260.1651），可推测其分子式为C₁₆H₂₁NO₂。其红外光谱显示化合物中有羟基(3312cm^-1)、羰基(1665cm^-1)，和芳环(1610、1547、1460cm^-1)信号，紫外光谱在210、260、298nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的¹H-和¹³C-NMR谱(表-1)显示其含有16个碳和21个氢，包括1个异吲哚-1-酮母核(C-1~C-7a，H-3、H-4和H-6)，一个异戊烯基(C-1'~C-5'，H-1'、H-2'、H-4'和H-5')，一个甲基(C-6'，H-6')，和一个N-羟乙基(C-7'和C-8'，H-7'和H-8')。化合物中H₂-3和C-1、C-3a、C-4、C-7a、C-7'，H-4和C-3，H-7和C-1，H₂-7'和C-1、C-3的HMBC(图3)进一步证实化合物中存在异吲哚-1-酮母核。化合物的骨架类型得到确认后，可进一步通过HMBC相关谱确定取代基位置；根据H₂-1′和C-5、C-6、C-7，H-2′和C-6的HMBC相关可确定异戊烯基取代在C-6位；甲基取代在C-5位可通过甲基氢(H₃-6′)和C-4、C-5、C-6的HMBC相关证实。羟乙基和氮原子相连和通过H₂-7′和C-1、C-3，以及H₂-3和C-7′的HMBC相关确认。至此化合物的结构得到确定，该化合物被命名为：2-(2-羟乙基)-5-甲基-6-异戊烯基-异吲哚-1-酮，英文名为：2-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6-prenylisoindolin-1-one。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的异吲哚生物碱类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明化合物是首次从腊肠树树皮中分离出来的，通过核磁共振和质谱法确定为异吲哚生物碱类化合物，并表征了其具体结构。以本发明化合物为原料，对NB4、A549、SHSY5Y、PC3和MCF7细胞株具有较好的细胞毒活性，IC₅₀值分别达1.1、0.62、0.43、0.58、0.36μM。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗癌药物研发的先导性化合物。

附图说明

图1为化合物的核磁共振碳谱（¹³CNMR）；

图2为化合物的核磁共振氢谱（¹HNMR）；

图3化合物的关键HMBC相关。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的异吲哚生物碱类化合物，是从豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的干燥树皮中分离得到，其分子式为C₁₆H₂₁NO₂，

命名为：2-(2-羟乙基)-5-甲基-6-异戊烯基-异吲哚-1-酮，英文名为：2-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6-prenylisoindolin-1-one。

本发明所述异吲哚生物碱类化合物的制备方法，是以豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的干燥树皮为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高效液相色谱制备分离步骤，具体为：

所述A步骤的有机溶剂为70~100%的丙酮、90~100%的乙醇或90~100%的甲醇。

所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚。

所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的丙酮或者甲醇溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。

所述D步骤的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积配比为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1。

所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以30~60%的甲醇为流动相，流速12~18ml/min，以21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为298nm，每次进样10~100μL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干。

本发明异吲哚生物碱类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明所述的决明属植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。

实施例1

取干燥豆科植物决明属腊肠树（Cassiafistula）的树皮3.2kg，粗粉碎至30目，用70%的丙酮超声提取4次，每次60分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成108g的浸膏a；在浸膏a中加入250g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成63g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入240g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水2至6升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到46g浸膏c；浸膏c在浸膏c中加入120g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶62g拌样，拌样后，用200目硅胶400g装柱；用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品B部分11.6g，再重复硅胶柱层析，用体积比9:1-1:2的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分B1-B6，其中第B4部分，即6:4部分约1.08g,再以52%的甲醇为流动相，流速15ml/min，21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为298nm，每次进样50μL，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述新化合物。

实施例2

取干燥豆科植物决明属腊肠树（Cassiafistula）的树皮10kg，粗粉碎至40目，用80%的甲醇冷浸提取4次，每次40分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成300g浸膏a；在浸膏a中加入350g水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成210g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入600g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水5至15升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到150g浸膏c；浸膏c中加入300g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶150g拌样，用200目硅胶1Kg装柱，拌样后上柱；用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品B部分28g，再重复硅胶柱层析，用体积比9:1-1:2的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分B1-B6，其中第B4部分，即6:4部分约2.5g,再以52%的甲醇为流动相，流速15ml/min，21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为298nm，每次进样80μL，收集26.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述新化合物。

实施例3

取实施例1-2制备的化合物，为浅黄色固体；

测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

本发明所制备的新型异吲哚生物碱类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为浅黄色固体；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ_max(logε）：210(4.32)、260(3.86)、298(3.05)；红外光谱（溴化钾压片）ν_max：3312、2930、1665、1610、1547、1460、1354、1213、1152、1068、838、746cm^–1；高分辨质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z260.1658[M+H]⁺（计算值260.1651），可推测其分子式为C₁₆H₂₁NO₂。其红外光谱显示化合物中有羟基(3312cm^-1)、羰基(1665cm^-1)，和芳环(1610、1547、1460cm^-1)信号，紫外光谱在210、260、298nm有最大吸收也证实化合物中存在芳环结构。化合物的¹H-和¹³C-NMR谱(表-1)显示其含有16个碳和21个氢，包括1个异吲哚-1-酮母核(C-1~C-7a，H-3、H-4和H-6)，一个异戊烯基(C-1'~C-5'，H-1'、H-2'、H-4'和H-5')，一个甲基(C-6'，H-6')，和一个N-羟乙基(C-7'和C-8'，H-7'和H-8')。化合物中H₂-3和C-1、C-3a、C-4、C-7a、C-7'，H-4和C-3，H-7和C-1，H₂-7'和C-1、C-3的HMBC(图3)进一步证实化合物中存在异吲哚-1-酮母核。化合物的骨架类型得到确认后，可进一步通过HMBC相关谱确定取代基位置；根据H₂-1′和C-5、C-6、C-7，H-2′和C-6的HMBC相关可确定异戊烯基取代在C-6位；甲基取代在C-5位可通过甲基氢(H₃-6′)和C-4、C-5、C-6的HMBC相关证实。羟乙基和氮原子相连和通过H₂-7′和C-1、C-3，以及H₂-3和C-7′的HMBC相关确认。至此化合物的结构得到确定，该化合物被命名为：2-(2-羟乙基)-5-甲基-6-异戊烯基-异吲哚-1-酮，英文名为：2-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6-prenylisoindolin-1-one。

实施例4

取实施例2制备的化合物，为浅黄色固体。测定与实施3相同，确认实施2制备的化合物为所述异吲哚生物碱类化合物。

实施例5

取实施例1和2所制备的任一异吲哚生物碱类化合物进行细胞毒活性检测试验，试验情况如下：

细胞株:白血病细胞(NB4)、肺癌细胞(A549)、人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)、前列腺癌细胞(PC3)、乳腺癌细胞(MCF7)均由中国科学院上海药物研究所提供。

实验设计:以上细胞与不同浓度化合物温育72小时,每株细胞的实验均重复一次,用两次实验的结果进行数据处理,采用改良MTT法及SRB法评价化合物对细胞增殖的抑制程度,计算抑制率,根据抑制率采用Logit方法计算IC₅₀,比较化合物的体外抗肿瘤活性。

细胞的增殖抑制率=(空白对照OD值-加药孔的OD值)/空白对照OD值×100%。

(a)改良MTT法

取处于对数生长期的悬浮细胞,将细胞浓度调整为4×10⁴/ml,加入96孔培养板,90μL/孔。阳性对照为顺铂,用生理盐水溶解。每孔分别加入10μl不同浓度的样品(1号试液-5号试液)。加样组及对照组均设4个复孔,加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。样品的终浓度分别为10^-2、10^-1、1、10及10²μg/mL,相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度10²μg/mL时,用0.1%DMSO作为溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10^-1、1、10μg/mL。细胞在37℃,5%CO₂培养箱中分别孵育48h后,加入MTT(5mg/ml,Sigma),10μL/孔。继续培养4h后,加入三联液[10%SDS–5%异丁醇–0.012mol/LHCL(w/v/v)],100μL/孔,放置过夜后用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各孔的OD值。

(b)SRB法

取处于对数生长期的贴壁细胞株,用25%胰酶常规消化后,再用15%小牛血清完全RPMI-1640培养基将细胞浓度调整为5×10⁴/mL,加入96孔培养板,90μL/孔。细胞在37℃,5%CO₂培养箱中分别孵育24h后加入阳性对照、阴性对照以及受试样品(各受试浓度同上MTT法，10μL/孔)，样品的终浓度分别为10^-2、10^-1、1、10、10²μg/mL,相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度10²μg/mL时用0.1%DMSO作为溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10^-1、1、10μg/mL,阴性对照为等体积的生理盐水。加样组及对照组均设4复孔,加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。将96孔培养板置于37℃,5%CO₂培养箱中孵育(细胞与样品作用)48h后,加入4℃、50%的TCA(三氯乙酸)50μL/孔。加完TCA后,将96孔培养板置于4℃孵育1小时,取出培养板,轻轻倾去板内液体。用自来水轻轻冲洗5遍(将自来水由烧杯中轻轻倒入板中,轻晃后再将水倒去),置于空气中风干至不见水痕。然后加入配制好的0.4%SRB(用1%乙酸稀释),50μL/孔,于室温下静置染色30分钟后倾去SRB溶液,用1%乙酸冲洗4遍,以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风干至无水痕后,加入10mM未缓冲Tris(缓血氨酸)溶液150μL/孔(PH10,用三蒸水配制),将染料溶解后,于振荡器上振荡5分钟,用酶标仪在570nm波长下读取各孔OD值。

(c)实验结果

实验结果表明：经对白血病急性早幼粒NB4细胞、肺腺癌A549细胞、人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒活性实验，腊肠树碱A对NB4,A549和PC3细胞株具有较好的细胞毒活性，IC₅₀值分别达8.2、5.6、和6.8μM。

表2化合物腊肠树碱A的细胞毒活性

Compounds	NB4	A549	SHSY5Y	PC3	MCF7
						腊肠树碱A	1.1	0.62	0.43	0.58	0.36
Taxol	0.01	0.01	0.5	0.5	0.02

Claims

1.一种异吲哚生物碱类化合物，其特征在于所述异吲哚生物碱类化合物是从豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的干燥树皮中分离得到，命名为：2-(2-羟乙基)-5-甲基-6-异戊烯基-异吲哚-1-酮，英文名为2-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6-prenylisoindolin-1-one，其分子式为C₁₆H₂₁NO₂，具有下述结构：

。

2.一种权利要求1所述异吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于以豆科植物腊肠树（Cassiafistula）的干燥树皮为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高效液相色谱制备分离步骤，具体为：

3.根据权利要求2所述的异吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤的有机溶剂为70~100%的丙酮、90~100%的乙醇或90~100%的甲醇。

4.根据权利要求2所述的异吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚。

5.根据权利要求2所述的异吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的丙酮或者甲醇溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。

6.根据权利要求2所述的异吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积配比为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1。

7.根据权利要求2所述的异吲哚生物碱类类化合物的制备方法，其特征在于所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以30~60%的甲醇为流动相，流速12~18ml/min，以21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为298nm，每次进样10~100μL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干。

8.一种权利要求1所述的异吲哚生物碱类化合物在制备抗癌药物中的应用。