CN100513385C - 同位素标记15n-l-谷氨酰胺的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，该发明利用有机合成的方法，得到含有酰胺基标记¹⁵N的L-谷氨酰胺。该方法克服了常规化学合成¹⁵N-DL-谷氨酰胺，再经拆分得到双标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的缺陷，使得¹⁵N-无机原料和¹⁵N标记L-谷氨酸的利用率大幅提高；最终¹⁵N-无机原料的利用率在70%以上，提纯得到的产品纯度在99%以上，丰度在98%以上。本发明适用于γ-¹⁵N标记或α-、γ-双¹⁵N标记的L-谷氨酰胺的合成。

Description

同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法

技术领域

本发明涉及一种同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，具体涉及利用有机合成的方法，制备γ-¹⁵N和α-、γ-双¹⁵N标记L-谷氨酰胺。

背景技术

氮-15(简称¹⁵N，下同)是氮元素的稳定同位素，可以用作示踪剂，广泛应用于生物化学、医学、药物学、农业科学等领域，尤其对生命科学研究有极为重大的意义。特别是在蛋白质的人工合成方面，氮-15氨基酸起着独特的示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。

由于此类产品产量小，对纯度和丰度要求高。目前主要是通过化学合成法或生物发酵法生产。化学合成法设备要求简单，生产的氨基酸是DL型氨基酸，丰度高，但不具有光学活性，需要再经化学或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被废弃，导致氮-15原料利用率降低，增加了生产成本。生物发酵法具有反应步骤少，产品光学纯度高的优点。但需要较大的设备投入，对菌种的要求高，后提取步骤较多。

L-谷氨酰胺是构成蛋白质的主要成分之一，其酶法生产较为困难。目前国内外报导的方法以化学合成法为主。主要以L-谷氨酸同甲醇用盐酸或干燥的HCl气体为催化剂，生成中间体L-谷氨酸-γ-甲酯盐酸盐，再加入过量二硫化碳和氨水后氨解得到L-谷氨酰胺；或由L-谷氨酸-γ-甲酯与水合肼等反应得酰肼，再加氢还原后得到L-谷氨酰胺。以上方法消耗大量氨水或其它有机胺类物质，是常用的L-谷氨酰胺生成方法，不适用同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的合成。目前尚未看到由化学合成法生成同位素¹⁵N标记L-谷氨酰胺的方法。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种工艺简单、¹⁵N原料利用率高的同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：1.一种同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：

(1)酯化反应

将原料L-谷氨酸分散在醇类溶剂中，60℃～150℃回流温度下逐渐加入无机或有机酸催化剂，并在此温度下反应5～25小时；用乙醚重结晶得到L-谷氨酸二酯盐固体；L-谷氨酸、醇、催化剂的用量比为1:5～40:0.2～1.5；

(2)选择性裂解

将L-谷氨酸二酯盐分散在冰乙酸中，在30℃～90℃下，逐滴滴加恒沸HI酸，反应4～30小时，反应母液经减压脱除溶剂后，加入适量有机胺中和，放置后过滤得到L-谷氨酸-α-酯固体；L-谷氨酸二酯盐、乙酸、HI酸的用量比为1:5～100:1～5；

(3)酰氯化

将L-谷氨酸-α-酯固体、氯化亚砜于回流和搅拌下反应2～10小时，除去溶剂并蒸馏后得到产物α-酯-L-谷氨酰氯；

(4)酰胺化

将α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氢氧化钠水溶液混合后，加入非标记或¹⁵N标记无机氮源，在-10℃～20℃低温下条件下氨解1～10小时，冷却、提取和干燥后，蒸去溶剂得到α-酯-L-谷氨酰胺产品；

(5)解保护

将¹⁵N标记α-酯-L-谷氨酰胺通过皂化或加氢的方法脱除α-酯，得到同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺。

所述的醇类溶剂选择甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或苯甲醇中的一种或几种的混合物。

所述的无机或有机酸选择盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亚砜、三氯氧磷、对甲苯磺酸中的一种或几种。

所述的原料L-谷氨酸包括非标记或¹⁵N标记的L-谷氨酸。

所述的用量比为摩尔比。

所述的解保护工艺得到的产品为γ-¹⁵N标记或α-、γ-双¹⁵N标记的L-谷氨酰胺。

本发明提供了一套¹⁵N标记L-谷氨酰胺的制备方法，该方法在现有的有机合成L-谷氨酰胺技术的基础上，结合¹⁵N原料昂贵的特点，对了工艺条件进行改变，使之具有良好的经济性和使用价值。该方法适用于合成γ-和α、γ双¹⁵N标记L-谷氨酰胺。本方法过程简单，¹⁵N原料利用率高，得到的L-谷氨酰胺产品纯度在99％以上，丰度在98％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，该方法包括以下工艺步骤：

(1)酯化反应

将14.7g(0.1mol)L-谷氨酸、19克一水对甲苯磺酸和30ml苯悬浮分散在80ml苯甲醇中，配备油水分离器，于110℃回流24小时，加入过量乙醚沉淀、重结晶后得到L-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸32.4g(单程收率65％)，熔点139.5～141.1℃。

反应母液经减压脱除乙醚后，补加适量酸和苯甲醇，回流下继续反应5～20小时，至薄层层析显示无L-谷氨酸存在。参照以上步骤处理仍可得到10.2gL-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸，合并后酯化总收率85.3％。

(2)选择性裂解反应

将10g(0.02mol)L-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸溶解于100ml冰乙酸中，加入10ml脱色恒沸HI酸，50℃下反应8小时。母液脱除溶剂后加适量三正丁胺中和后，放置冰箱过夜。析出的晶体经过滤、洗涤后得3.2g α-苄酯L-谷氨酸(收率67％)，熔点145～147℃，[α]²⁵ _D＝+12.3°(c＝2.9 0.1N HCl)。

(3)酰氯化反应

将2.4g(0.01mol)α-苄酯L-谷氨酸悬浮在200ml无水乙醚中，0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应2.5小时，除去溶剂并蒸馏后得到2.2g α-酯-L-谷氨酰氯固体(收率87％)。

(4)氨解反应

取含1.09g¹⁵NH₄Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1g α-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液处理。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到4.5g α-苄酯-L-谷氨酰胺(¹⁵N收率95％)。

(5)解保护

将4.5g α-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应5小时，母液经浓缩、提取后得到2.42gγ-¹⁵N标记L-谷氨酰胺(收率87％)，熔点183～185℃，[α]²⁰ _D＝+32.3°(c＝10 2N HCl)。

实施例2

一种同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，该方法包括以下工艺步骤：

(1)酯化反应

将14.7g(0.1mol)L-谷氨酸和30ml苯悬浮分散在80ml苯甲醇中，配备油水分离器，向其中通入过量无水氯化氢气体，于60℃回流12小时，加入过量乙醚沉淀、重结晶后得到L-谷氨酸二苄酯盐酸盐20.7g(单程收率57％)，熔点99.5～101.1℃。

反应母液经减压脱除乙醚后，补加适量酸和苯甲醇，回流下继续反应5～10小时，至薄层层析显示无L-谷氨酸存在。参照以上步骤处理仍可得到7.1gL-谷氨酸二苄酯盐酸盐，合并后酯化总收率76.4％。

(2)选择性裂解反应

将7.3g(0.02mol)L-谷氨酸二苄酯盐酸盐溶解于80ml冰乙酸中，加入10ml脱色恒沸HI酸，50℃下反应12小时。母液脱除溶剂后加适量三正丁胺中和后，放置冰箱过夜。析出的晶体经过滤、洗涤后得2.7g α-苄酯L-谷氨酸(收率57％)，熔点144～146℃，[α]²⁵ _D＝+12.3°(c＝2.9 0.1N HCl)。

(3)酰氯化反应

将2.4g(0.01mol)α-苄酯L-谷氨酸悬浮在200ml无水乙醚中，0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应2.5小时，除去溶剂并蒸馏后得到2.2g α-酯-L-谷氨酰氯固体(收率87％)。

(4)氨解反应

取含1.09g¹⁵NH₄Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1gα-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液处理。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到4.5gα-苄酯-L-谷氨酰胺(¹⁵N收率95％)。

(5)解保护

将4.5g α-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应5小时，母液经浓缩、提取后得到2.42gγ-¹⁵N标记L-谷氨酰胺(收率87％)，熔点183～185℃，[α]²⁰ _D＝+32.3°(c＝10 2N HCl)。

实施例3

一种同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，该方法包括以下工艺步骤：

(1)酯化反应

将14.7g(0.1mol)L-谷氨酸、15ml氯化亚砜和30ml苯悬浮分散在80ml苯甲醇中，配备油水分离器，于150℃回流6小时，加入过量乙醚沉淀、重结晶后得到L-谷氨酸二苄酯盐酸盐15.5g(单程收率42.6％)，熔点99.1～101.3℃。

反应母液经减压脱除乙醚后，补加适量氯化亚砜和苯甲醇，回流下继续反应2～5小时，至薄层层析显示无L-谷氨酸存在。参照以上步骤处理仍可得到4.1gL-谷氨酸二苄酯盐酸盐，合并后酯化总收率53.6％。

(2)选择性裂解反应

将7.3g(0.02mol)L-谷氨酸二苄酯盐酸盐溶解于80ml冰乙酸中，加入10ml脱色恒沸HI酸，50℃下反应24小时。母液脱除溶剂后加适量三正丁胺中和后，放置冰箱过夜。析出的晶体经过滤、洗涤后得2.9g α-苄酯L-谷氨酸(收率61.1％)，熔点144～146℃，[α]²⁵ _D＝+12.3°(c＝2.9 0.1N HCl)。

(3)酰氯化反应

将2.4g(0.01mol)α-苄酯L-谷氨酸悬浮在200ml无水乙醚中，0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应2.5小时，除去溶剂并蒸馏后得到2.2g α-酯-L-谷氨酰氯固体(收率87％)。

(4)氨解反应

取含1.09g¹⁵NH₄Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1g α-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液处理。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到4.5g α-苄酯-L-谷氨酰胺(¹⁵N收率95％)。

(5)解保护

将4.5g α-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml乙醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应8小时，母液经浓缩、提取后得到2.3gγ-¹⁵N标记L-谷氨酰胺(收率82.7％)，熔点184～185℃，[α]²⁰ _D＝+32.4°(c＝10 2N HCl)。

Claims (5)

1.一种同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：

(1)酯化反应

将原料L-谷氨酸分散在醇类溶剂中，60℃～150℃回流温度下逐渐加入无机或有机酸催化剂，并在此温度下反应5～25小时；用乙醚重结晶得到L-谷氨酸二酯盐固体；L-谷氨酸、醇、催化剂的用量比为1:5～40:0.2～1.5；

(2)选择性裂解

将L-谷氨酸二酯盐分散在冰乙酸中，在30℃～90℃下，逐滴滴加恒沸HI酸，反应4～30小时，反应母液经减压脱除溶剂后，加入适量有机胺中和，放置后过滤得到L-谷氨酸-α-酯固体；L-谷氨酸二酯盐、冰乙酸、HI酸的用量比为1:5～100:1～5；

(3)酰氯化

将L-谷氨酸-α-酯固体、氯化亚砜于回流和搅拌下反应2～10小时，除去溶剂并蒸馏后得到产物α-酯-L-谷氨酰氯；

(4)酰胺化

将α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氢氧化钠水溶液混合后，加入¹⁵N标记无机氮源，在-10℃～20℃低温下条件下氨解1～10小时，冷却、提取和干燥后，蒸去溶剂得到α-酯-L-谷氨酰胺产品；

(5)解保护

将¹⁵N标记α-酯-L-谷氨酰胺通过皂化或加氢的方法脱除α-酯，得到同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺；

所述的用量比为摩尔比。

2.根据权利要求1所述的同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，所述的醇类溶剂选择甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或苯甲醇中的一种或几种的混合物。

3.根据权利要求1所述的同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，所述的无机或有机酸选择盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亚砜、三氯氧磷、对甲苯磺酸中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，所述的原料L-谷氨酸包括非标记或¹⁵N标记的L-谷氨酸。

5.根据权利要求1所述的同位素标记¹⁵N-L-谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，所述的解保护工艺得到的产品为γ-¹⁵N标记或α-、γ-双¹⁵N标记的L-谷氨酰胺。