CN100502913C - 蔓荆子提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是以中药蔓荆子为原料制备的两种提取物VT-1和VT-2。它是以乙醇-水或甲醇-水混合溶剂对蔓荆子渗漉或回流提取为基础，采用吸附性树脂进行分离去杂，以不同浓度的乙醇-水溶剂洗脱，可得到含30～80%黄酮类成分的VT-1或含有20～70%黄酮类成分及0.4～3.0%萜类成分的VT-2。经实验证明VT-1和VT-2具有治疗及与其密切相关病症如周期性乳房痛、痛经等作用，可用于制备防治经前期综合征及与其密切相关病症的药物及食品。

Description

蔓荆子提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，系以蔓荆子为原料制备的两种提取物，一种为富含黄酮类成分的VT-1，另一种为兼含黄酮类和萜类成分的VT-2，以及将VT-1和VT-2用于制备防治经前期综合征及与经前期综合征密切相关病症药物及食品中的应用。

背景技术

经前期综合征(Premenstrual Syndrome，PMS)及与其密切相关病症如周期性乳房痛、痛经等是女性的常见病和多发病，有调查表明约有90％以上的妇女于经前7～14天会出现不同程度的烦躁易怒、全身乏力、乳房胀痛、头痛、失眠多梦、小腹胀痛、钝性腰背痛及盆腔沉重感、浮肿、胃脘胀痛、恶心呕吐、记忆力下降、工作理家能力下降等感觉。目前，对于PMS及与其密切相关病症如周期性乳房痛、痛经等尚无有效的防治措施，包括避孕药、精神药物、孕激素、利尿剂等合成药物仅能起到部分对症治疗的作用，存在远期疗效欠佳，复发率高等缺点。近年来，德国学者以穗花牡荆提取物Ze440治疗PMS备受关注，但因其所含成分复杂，质量难于控制，加之我国无此资源，价格也较昂贵，制约了其广泛应用。

蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifoliaL.var.simplicifolia Cham.或蔓荆V.trifolia L.的干燥果实，具有疏风散热、清利头目的功效，历代本草典籍均有记载，临床应用较多的是单独或与其它中草药配伍水煎，治疗以头痛为主的多种疼痛病症。但迄今未见有关用其防治PMS的报道，更未见有关用其制备富含黄酮或同时富含黄酮和萜类成分提取物的报道。

发明内容

本发明以蔓荆子为原料，制备两种提取物，即富含黄酮类成分的VT-1及兼富含黄酮类和萜类成分的VT-2。经实验证明，它们均具有镇静、镇痛作用，能调节与PMS密切相关的血清激素至正常水平，因而可用于制备防治PMS及与PMS密切相关病症的药物或食品。本发明提取物有效成分含量高，质量易于控制，安全、无毒、高效、稳定、价廉。VT-1和VT-2的制备方法如下：

1、制备提取液：将蔓荆子粗粉浸泡于20～95％乙醇或甲醇水溶液中，放置过夜，按常规渗漉，适当控制渗漉速度(如3～5ml/分钟)，渗漉过程中随时添加提取溶剂，渗漉至近无色或黄酮类和二萜类成分检定反应呈阴性为止，收集渗漉液。本步骤也可采用5～10倍提取溶剂20～95％乙醇或甲醇水溶液回流提取一到多次，得提取液。

本步骤所用的提取溶剂优选50～70％乙醇或甲醇，特别优选60％乙醇。回流提取时提取溶剂优选7～9倍(提取溶剂体积与原药材重量比)，特别优选8倍溶剂，提取次数优选2～4次。

2、纯化：

(1)回收溶剂：将上述提取液减压回收溶剂至无醇味，过滤除去悬浮物和不溶性杂质，将滤液用蒸馏水调节相对密度至1.05左右；

(2)树脂分离：将上述滤液通过大孔吸附树脂，用水洗去滤液中水溶性糖类、可溶性半纤维素等非活性成分，用5～25％的乙醇洗去非黄酮可溶性物质，再以洗脱溶剂30～55％乙醇洗脱，收集洗脱液，即得到含有VT-1的洗脱液。若以5～25％乙醇洗去非黄酮可溶性物质后，再以洗脱溶剂60～95％乙醇洗脱，可得到含有VT-2的洗脱液。

本步骤所采用的大孔吸附树脂选自D₁₀₁，D₅₂₀，D₄₀₀₆，H₁₀₃，AB-8，也可为其它在性能上可以取代上述树脂的填料，优选D₁₀₁，D₅₂₀，D₄₀₀₆，特别优选D₁₀₁。

本步骤洗脱非黄酮可溶性物质的溶剂，优选10～20％乙醇，特别优选15％乙醇。洗脱VT-1的洗脱溶剂优选35～45％乙醇，特别优选40％乙醇。洗脱VT-2的洗脱溶剂优选65～75％乙醇，特别优选70％乙醇。

3、浓缩干燥：将含VT-1或VT-2的洗脱液减压回收溶剂至无醇味，并将其浓缩至原药材投料量的1/4左右，再行干燥粉碎后，即得VT-1和VT-2粉末。干燥方法可采用常规的热烘干，也可采用冷冻干燥、喷雾干燥、微波干燥等方法。经紫外分光光度法和HPLC法分析，所得VT-1中蔓荆子黄素、3，6，7-三甲基槲皮万寿菊素及蔓荆子蒿素等黄酮类成分总含量达30～80％，而VT-2中含蔓荆子黄素、3，6，7-三甲基槲皮万寿菊素及蔓荆子蒿素等黄酮类成分20～70％，还含蔓荆呋喃及Vitexilactone等萜类成分0.4～3.0％。

由上述可以看出，本发明设计的蔓荆子提取物VT-1和VT-2的制备方法具有以下特点：

①本发明制备方法以稀乙醇(或甲醇)渗漉(或回流)提取为基础，采用大孔吸附树脂进行分离去除杂质，两种方法有机地结合起来，相互弥补，相辅为用，可以得到有效成分含量高的提取物；

②本发明应用大孔吸附树脂除杂，采用不同浓度乙醇-水混合溶剂洗脱，具有安全、无毒、简便、成本低等优点；

本方法因选用蔓荆子原药材的质量差异，其得率也有所不同，VT-1得率0.5～4.0％，VT-2得率0.6～7.0％，但用同批蔓荆子原料制备时，得率是稳定的。

二、药理实验

1 实验材料

1.1 动物

昆明种小鼠，SD大鼠，Wistar大鼠(♀)，由第二军医大学实验动物中心提供。

1.2 药品

戊巴比妥钠     江苏金坛制药厂    批号960420

安络血     江苏金坛制药厂    批号941103

己烯雌酚注射液     上海生化制药厂   批号961016

缩宫素注射液    上海明兴制药厂   批号970405

冰醋酸    分析纯     中国医药(集团)上海化学试剂公司   批号20000319

哌替啶注射液    沈阳第一制药厂    批号010524

放射免疫试剂盒   天津九鼎       批号991020

CMC     上海化学试剂公司        批号990515

Ze440片    Healthspan    英国      20010212用0.5％CMC配成2mg/ml混悬液

VT-1、VT-2用0.5％CMC配成相当于原药材2g/ml混悬液

1.3 仪器

NSA-III医学信号处理系统      南京隆海科技实业公司

毛细管电泳仪    美国惠普

LD24-0.8自动平衡离心机      北京医用离心机厂

2 方法与结果

2.1 VT-1、VT-2对小鼠自主活动次数的影响

选取体重18～22g健康昆明种小鼠，雌雄不拘，随机分5组，每组10只，生理盐水组作为空白对照组，戊巴比妥组和Ze440组作为阳性对照组。除戊巴比妥组仅于测定前30分钟给药1次外，其余各组按表1中给药剂量和给药途径连续给药3天，于末次给药后30分钟测定，记录小鼠2分钟内自主活动次数，结果见表1。

表1  VT-1、VT-2对小鼠自主活动次数的影响(X±S，n＝10)

由表1可见，与对照组相比，VT-1、VT-2明显减少小鼠自发活动次数，对小鼠自发活动呈显著抑制作用，表明VT-1、和VT-2有较强的镇静作用。

2.2 镇痛试验

2.2.1 VT-1、VT-2对小鼠醋酸致痛扭体次数的影响

选取昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，生理盐水组作为空白对照组，哌替啶组和Ze440组作为阳性对照组。除哌替啶组仅于测定前30分钟给药1次外，其余各组分别按表2中给药剂量和给药途径连续给药3天，于末次给药后30分钟腹腔注射0.6％冰醋酸溶液0.2ml/只，观察每只小鼠5分钟内扭体次数，结果见表2。

表2  VT-1、VT-2对小鼠醋酸致痛扭体反应的影响(X±S，n＝10)

由表2可见，与空白对照组相比，VT-1、VT-2减少小鼠醋酸致痛扭体次数，证明其有较强的镇痛作用。

2.2.2 VT-1、VT-2对小鼠热板痛阈值影响

取雌性小鼠置恒温(55±0.5℃)热板上记录出现舔足所需的时间，作为痛阈值，筛选合格小鼠。随机分为5组，每组10只。生理盐水组作为空白对照组，哌替啶组和Ze440组作为阳性对照组。除哌替啶组仅于测定前45分钟给药1次外，其余各组按表3中给药剂量和给药途径连续给药3天，于末次结药后45分钟测定各小鼠的痛阈值，结果见表3。

表3 VT-1、VT-2对小鼠热板痛阈值的影响(X±S，n＝10)

由表3可见，与空白对照组相比，VT-1、VT-2可提高小鼠热板痛阈值，且VT-2的作用强于Ze440，证明其具有较强镇痛作用。

2.3 VT-1、VT-2对大鼠子宫平滑肌收缩的影响

2.3.1 VT-1、VT-2对正常大鼠子宫平滑肌收缩功能的影响

取雌性未孕SD大鼠40只，随机分为5组，每组8只，生理盐水组作为空白对照组，缩宫素组和Ze440组作为阳性对照组。实验前24～48小时按0.2mg/kg体重皮下注射己烯雌酚。颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹取出子宫，立即置于盛有洛氏液的玻璃平皿中。取离体子宫约长2cm，阴道结扎并固定于盛有洛氏液小槽的L型小钩上，另一端与肌张力换能器相连。恒温水浴保持37±0.5℃，并不断向营养液中通入95％O₂和5％CO₂的混合气体，60～80个气泡/分钟，以NSA-III医学信号处理软件，描记一段正常子官平滑肌张力曲线后，按表4中剂量加入实验药品，观察给药前后子宫的收缩频率、幅度和子宫活动力，结果见表4。(详见徐叔云主编《药理实验方法学》第三版，人民卫生出版社，1584～1585页)

表4 VT-1、VT-2对正常子宫平滑肌收缩的影响(X±S，n＝8)

由表4可见，VT-1、VT-2组给药前后子宫平滑肌收缩频率、幅度和活动力差别无统计学意义，证明其对正常大鼠子宫平滑肌收缩功能的影响轻微。

2.3.2 VT-1、VT-2对缩宫素所致子宫平滑肌收缩的影响

实验选择2mu/ml缩宫素作用10分钟后，按表4中剂量加入实验药品，其余同实验2.3.1，结果见表5。

表5 VT-1、VT-2对缩宫素致正常子宫平滑肌收缩的时效关系(X±S，n＝8)

由表5可见，与缩宫素组比较，VT-1、VT-2组子宫平滑肌的活动频率及活动力差别有统计学意义，证明其对缩宫素引起的子官平滑肌痉孪有明显的松弛作用。

2.4 VT-1、VT-2对肝气逆证PMS模型大鼠血清激素水平的影响

选择孕后造模肝气逆证PMS模型Wistar大鼠50只(造模方法参见《中成药》2002.24(2)：118-119《大鼠模拟经前期综合征肝气逆证血清激素与行为变化》)，随机分为5组，每组10只。生理盐水组作为空白对照组，Ze440组作为阳性对照组。按表6中给药剂量和给药途径连续给药5天，第6天摘眼球取血各1ml，离心(3000转/分钟)。取血清以放射免疫法测定泌乳素(PRL)、雌二醇(E₂)、孕酮(P)的含量，结果见表6。

表6 VT-1、VT-2对肝气逆证模型大鼠血清激素水平的影响(X±S n＝10)

由表6可见，与空白对照组比较，VT-1、VT-2可显著下调模型大鼠血清PRL水平，上调血清P、E₂水平，使与PMS密切相关的血清激素含量接近正常水平，证明其对与PMS密切相关的血清激素水平具有较强调解作用。

上述实验表明VT-1、VT-2具有较好的镇静、镇痛作用，对子宫平滑肌具有双向调节作用，对与PMS密切相关的血清激素水平具有较强调解作用。因而用于制备防治PMS及与PMS密切相关病症的药物或食品。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明提取物制备作详细描述。

实施例1蔓荆子粗粉1kg，浸泡于2000ml提取溶剂60％乙醇中，放置过夜，按常规渗漉，控制渗漉速度3～5ml/分钟，渗漉过程中随时添加提取溶剂，渗漉至黄酮类成分和萜类成分检定反应呈阴性为止，收集渗漉液。上述渗漉液减压回收溶剂至无乙醇味，蒸馏水稀释至1000ml，过滤除去悬浮物和不溶性杂质，以蒸馏水调整相对密度1.05。将上述滤液通过D₁₀₁大孔吸附树脂，用水洗去滤液中水溶性糖类、可溶性半纤维素等非活性成分，用15％乙醇洗去非黄酮可溶性物质，再以洗脱溶剂40％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至250ml，喷雾干燥，得VT-1 19.90g，紫外分光光度法检测黄酮类成分含量68.22％。

实施例2  提取溶剂选用20％甲醇，其余同实施例1，得VT-1 6.07g，黄酮类成分含量31.20％。

实施例3  提取溶剂选用95％乙醇，其余同实施例1，得VT-1 9.07g，黄酮类成分含量74.54％。

实施例4  洗脱溶剂选用70％乙醇，其余同实施例1，得VT-2 31.55g，紫外分光光度法检测黄酮类成分含量53.04％，HPLC法检测萜类成分含量1.32％。

实施例5  提取溶剂选用20％乙醇，其余同实施例4，得VT-2 7.07g，黄酮类成分含量22.40％，萜类成分含量0.46％。

实施例6  提取溶剂选用95％甲醇，其余同实施例4，得VT-2 11.08g，黄酮类成分含量68.10％，萜类成分含量2.55％。

实施例7  大孔吸附树脂选用D₅₂₀，洗脱溶剂选用55％乙醇，其余同实施例1，得VT-1 21.07g，黄酮类成分含量66.20％。

实施例8  洗脱溶剂选用30％乙醇，其余同实施例1，得VT-1 14.20g，黄酮类成分含量39.25％。

实施例9  用5％乙醇洗去非黄酮可溶性物质，其余同实施例1，得VT-1 31.90g，黄酮类成分含量50.40％。

实施例10  大孔吸附树脂选用H₁₀₃，用25％乙醇洗去非黄酮可溶性物质，其余同实施例1，得VT-1 10.29g，黄酮类成分含量74.40％。

实施例11  大孔吸附树脂选用D₄₀₀₆，洗脱溶剂选用60％乙醇，其余同实施例4，得VT-2 25.48g，黄酮类成分含量63.04％，萜类成分含量0.77％。

实施例12  洗脱溶剂选用95％乙醇，其余同实施例4，得VT-2 49.65g，黄酮类成分含量31.90％，萜类成分含量1.63％。

实施例13  用5％乙醇洗去非黄酮可溶性物质，其余同实施例4，得VT-2 38.45g，黄酮类成分含量40.27％，萜类成分含量0.78％。

实施例14  用25％乙醇洗去非黄酮可溶性物质，其余同实施例4，得VT-2 22.09g，黄酮类成分含量42.27％，萜类成分含量1.54％。

实施例15  8倍量提取溶剂60％乙醇回流提取3次，其余同实施例1，得VT-1 18.24g，黄酮类成分含量70.28％。

实施例16  8倍量提取溶剂60％乙醇回流提取3次，其余同实施例4，得VT-2 30.55g，黄酮类成分含量51.77％，萜类成分含量1.74％

实施例17  提取溶剂选用60％甲醇，大孔吸附树脂选用H₁₀₃，其余同实施例1，得VT-1 17.24g，紫外分光光度法检测黄酮类成分含量66.41％。

实施例18  提取溶剂选用60％甲醇，大孔吸附树脂选用AB-8，其余同实施例4，得VT-2 33.20g，黄酮类成分含量45.77％，萜类成分含量1.20％。

Claims (5)

1、蔓荆子提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备提取液

将蔓荆子粗粉用各种浓度的20～95％乙醇或甲醇水溶液作为提取溶剂渗漉或回流，得提取液；

(2)纯化

将上述提取液减压回收至无醇味，过滤得滤液，将滤液用蒸馏水调至相对密度1.05左右，上大孔吸附树脂D₁₀₁或D₄₀₀₆或D₅₂₀或H₁₀₃或AB-8分离，先用水洗去滤液中水溶性糖类、可溶性半纤维素非活性成分，再用5～25％乙醇洗去非黄酮可溶性杂质，最后用洗脱剂洗脱，用30～55％乙醇洗脱得富含黄酮类成分的VT-1洗脱液，或用60～95％乙醇洗脱得兼含黄酮类和萜类成分的VT-2洗脱液；

(3)浓缩干燥

将上述含VT-1或VT-2的洗脱液减压回收溶剂进行浓缩，再将其干燥粉碎，得蔓荆子提取物VT-1或VT-2粉末。

2、按权利要求1所述的制备方法，其特征在于所选用的提取溶剂为50～70％乙醇或甲醇水溶液，VT-1洗脱溶剂为35～45％乙醇，VT-2洗脱溶剂为65～75％乙醇。

3、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于所选用的提取溶剂为60％乙醇，VT-1洗脱溶剂为40％乙醇，VT-2洗脱溶剂为70％乙醇。

4、权利要求1或2或3所述方法制备的蔓荆子提取物VT-1或VT-2。

5、权利要求4所述蔓荆子提取物VT-1或VT-2在制备防治经前期综合征或与经前期综合征密切相关病症药物或食品中的应用。