CN100475834C - 核酸回收方法及核酸回收装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及把生物试样中含有的脱氧核糖核酸和核糖核酸分子，从同一试样中简便且安全地分别分离及回收的方法及装置。本发明通过变更含有离液剂的核酸试样溶液的pH、温度、阳离子浓度的一种或其组合，从同一试样中分别分离及回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。从而，可以实现从同一试样中简便且安全地分别分离及回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。
Description
技术领域
本发明涉及使用核酸结合性载体从细胞及组织等生物试样将脱氧核糖核酸和核糖核酸各自分离、离析及回收的方法，以及装置。
背景技术
随着近年来的分子生物学解析技术的发展，能够通过解析携带遗传信息的核酸分子，获得在临床诊断或基因工学等领域中非常有益的信息。在解析这些核酸分子时，从生物体试样抽提和回收核酸分子是重要的步骤。通常，在生物体试样中核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)作为核酸分子存在，尤其当能够使用的生物体试样量被限定时，最好是能从同一生物体试样分别提取和回收核糖核酸和脱氧核糖核酸双方。
一般来说，为了抽提血液、细胞或组织等的生物试样中含有的核糖核酸和脱氧核糖核酸分子，需要首先通过搅拌或超声波或热等产生的物理性作用或者表面活性剂或蛋白酶处理等产生的化学性作用，破碎细胞使核酸游离。接着，为了回收游离的核酸分子，进行氯化铯密度梯度超速离心分离或苯酚抽提、或柱色谱分离等操作。这些方法根据目标核酸种类、使用的生物试样、以及需要抽提的核酸分子的用途等，可以单独或组合选择使用。
Boom等提出了一种简便的从生物试样抽提及回收核酸的方法，即在离液盐存在下使用二氧化硅粒子作为核酸结合载体(如J.Clin.Microbiol.28：495-503(1990))。根据该方法可同时分离生物试样中含有的单链核酸(单链DNA和RNA)、及双链核酸(双链DNA)。但是难以将分离的核糖核酸和脱氧核糖核酸分别回收。
还有从生物试样只选择性回收核糖核酸的方法(如特开平11-196869号公报)。根据该方法，在含有核糖核酸的试样中，混合含有离液剂的酸性溶液和水溶性有机溶剂及核酸结合载体，把吸附核糖核酸的该载体从液相分离，通过洗提操作可以从该核糖核酸-载体复合体只抽提和回收核糖核酸。但是，与从生物试样回收的核糖核酸共存的脱氧核糖核酸就无法回收。
另外，报道有从同一生物试样分别分离回收双链/单链核酸的方法(如特表2000-505295号公报)。该方法是，通过在离液剂、螯合剂、pH等适当的条件下，把试样溶液中的双链核酸吸附到二氧化硅粒子上，进一步变更去除了吸附双链核酸的二氧化硅粒子的上清的螯合剂浓度，把单链核酸吸附到二氧化硅粒子上，分离回收双链/单链核酸。但是，为了回收二氧化硅粒子需要进行离心分离操作，因此工序繁杂。
再者，还报道有双链/单链核酸的分离方法(如特开2002-187897号公报)。该方法是，通过在不含有具有醇基的物质的条件下，仅使双链核酸脱氧核糖核酸吸附在无机载体上，从而与单链核酸核糖核酸分离，或者把双链/单链核酸同时吸附到无机载体上后，通过分别洗脱来分离双链及单链核酸。但是，为了回收双链及单链核酸，需要使用含有高浓度的醇的溶液。存在操作安全性以及残存在回收产物中的醇引起的酶反应障碍等课题。
发明内容
通过密度梯度超速离心分离抽提核酸时，在核酸抽提处理中需要长时间。另外，在苯酚抽提时，因使用剧毒物苯酚，所以需要注意安全处理，并且不可避免地操作繁杂。
关于报道中的更简便的核酸抽提及回收法的技术，如上所述，难以使用简便的试样溶液，以及分离回收核糖核酸和脱氧核糖核酸。
本发明的目的是，把溶解了细胞或组织的生物试样中存在的脱氧核糖核酸和核糖核酸分子，从一个生物试样中简便并且安全地分别分离及回收。
本发明通过变更含有离液剂的核酸试样溶液的pH、温度、阳离子浓度的任一种或其组合，实现分别分离及回收一个生物试样中的双链及核糖核酸。
即，本发明是由如下工序构成。
1)调节含有由含有离液剂的溶液溶解的脱氧核糖核酸和核糖核酸的生物试样溶液的pH、温度、阳离子浓度的任一种或其组合至能够使脱氧核糖核酸选择性吸附在核酸吸附固相载体上的条件，通过接触固相载体，吸附脱氧核糖核酸。吸附的脱氧核糖核酸经任意洗净处理后，可以用水或任意缓冲液等洗提、回收。
2)调节含有没有吸附到固相载体上的核糖核酸的核酸试样溶液的pH、温度、阳离子浓度的任一种或其组合，使其成为核糖核酸能够吸附到固相载体上的条件，使核糖核酸吸附到重新准备的固相载体上或设置在与吸附脱氧核糖核酸的固相载体不同位置的固相载体上。吸附的核糖核酸经任意洗净处理后，用水或任意缓冲液等洗提、回收。
具体来说，本发明的特征在于，具有从含有脱氧核糖核酸和核糖核酸的试样溶液通过吸附选择性回收所述脱氧核糖核酸的第1工序，和在所述第1工序后，通过吸附回收所述核糖核酸的第2工序，所述第1工序和第2工序是通过变化所述试样溶液的pH、温度、二价阳离子浓度中的至少一种来进行。这里，吸附是指通过使试样溶液接触固相载体使吸附到固相载体上，可以使用一个固相载体在第1工序中洗提吸附的所述脱氧核糖核酸，在第2工序中选择性吸附核糖核酸，也可以在各工序中使用不同的固相载体。另外，可以使在所述第1工序中pH为6.0以上，在所述第2工序中所述pH为6.0以下。并且，也可以使在所述第1工序中二价阳离子浓度为100mM以上250mM以下，在所述第2工序中所述二价阳离子浓度为100mM以下。也可以使在所述第1工序中所述试样的温度为50℃以上100℃以下，在所述第1工序中所述试样的温度为50℃以下。
另外，本发明的另一发明是选择性分离脱氧核糖核酸和核糖核酸的核酸回收装置，其特征在于，其包括具有开口端的容器、装在所述容器中的固相载体、含有100mM以上250mM以下的二价阳离子且pH为6.0以上的第1溶液、和含有100mM以下所述二价阳离子且pH为6.0以下的第2溶液，所述第1溶液是用于主要回收所述脱氧核糖核酸，所述第2溶液是用于主要回收所述核糖核酸。
进一步，本发明的另一发明取代了上述第1溶液和第2溶液，其特征在于，其具有为使作为分离对象的试样溶液的二价阳离子为100mM以上250mM以下且pH为6.0以上的第1调节溶液、和为使所述试样溶液的所述二价阳离子为100mM以下且pH为6.0以下的第2调节溶液，所述第1调节溶液是用于主要回收所述脱氧核糖核酸，所述第2调节溶液是用于主要回收所述核糖核酸。
由此，实现了从一个生物试样分别分离和回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。
附图说明
图1是表示在同一容器内装有两个以上吸附脱氧核糖核酸和核糖核酸的固相载体的核酸回收用容器的结构的图；
图2是表示具备可以控制容器内固相载体设置位置温度的构件的容器及装置的结构的图；
图3是表示具备可控制容器内多个固相载体容器部分温度的构件的容器及装置的结构的图；
图4是表示脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体吸附的pH影响的图；
图5是表示脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体吸附的温度影响的图；
图6是表示脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体吸附中的核酸吸附的阳离子影响的图；
图7是表示装有用于吸附脱氧核糖核酸和核糖核酸的固相载体的核酸回收用容器的结构的图；
图8是表示脱氧核糖核酸和核糖核酸的离析及回收方法的概略图。
具体实施方式
本发明中，含有脱氧核糖核酸和核糖核酸的生物体试样是如血液、骨髓液、精液、唾液、组织及细胞(如细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞)等含有核酸的生物材料。
图8表示了本发明中离析及回收核酸的顺序概略图。首先，在离液剂存在条件下溶解含有脱氧核糖核酸和核糖核酸的生物体试样，使核酸游离。含有离液剂的溶解液调制成pH为6以上且含有100mM以上的二价阳离子。因此，溶解液中优选含有缓冲剂。缓冲剂可以事先含在含有离液剂的溶解液中，也可以在生物体试样溶解后添加。缓冲剂可以使用通常使用的任意缓冲剂，特别优选在pH6以上具有缓冲能的。例如，可以举例MES缓冲剂，其使用浓度优选1～500mM。
含有离液剂的溶解液调制成pH为6以上且含有100mM以上的二价阳离子。因此，溶解液中优选含有缓冲剂。缓冲剂可以事先含在含有离液剂的溶解液中，也可以在生物体试样溶解后添加。缓冲剂可以使用通常使用的任意缓冲剂，特别优选在pH6以上具有缓冲能的。例如，可以举例MES缓冲剂，其使用浓度优选1～500mM。
含有离液剂的溶解液中的二价阳离子不做特别限定，可以是如镁离子、钙离子、锰离子，优选镁离子，其使用浓度为100mM以上250mM以下，尤其优选150mM以上。
本发明中使用的离液剂可以举出异硫氰酸胍/硫氰酸胍、盐酸胍、脲、碘化钠、碘化钾等，这些可以单独使用也可以组合使用。离液剂在溶解液中的浓度因使用的离液剂而异，如使用异硫氰酸胍/硫氰酸胍时，优选在1～6M范围的浓度使用。
本发明中，在pH条件且二价阳离子存在条件下使含有在离液剂存在下游离的脱氧核糖核酸和核糖核酸的生物体试样溶液接触具有核酸结合能的第1固相载体，使脱氧核糖核酸选择性吸附在第1固相载体上，与核糖核酸分离。在该脱氧核糖核酸吸附到固相载体过程中，把生物体试样溶液和第1固相载体的温度设定在50℃以上100℃以下来使生物体试样溶液和第1固相载体接触，适合脱氧核糖核酸吸附到第1固相载体上。吸附的脱氧核糖核酸经任意洗净处理后，可以用水或任意缓冲液等洗提、回收。
作为本发明中使用的具有核酸结合能的第1及第2固相载体，可以举出已公知的在离液剂存在下具有核酸结合能的含有二氧化硅的固体，如玻璃、硅藻土、或对其表面进行化学处理的物质。另外，对固相载体的形态不做特别限制，可以是粒子状、纤维状、过滤器状等的任意一种。
本发明中，在pH、二价阳离子浓度和吸附时的温度条件下没有吸附到第1固相载体上的核糖核酸，从脱氧核糖核酸被吸附到第1固相载体上后的生物体试样溶液中被回收。通过把生物体试样溶液调制成pH6以下且含有100mM以下的二价阳离子，优选50mM以下，该核糖核酸可以吸附到第2固相载体上。此时，把生物体试样溶液和第2固相载体的温度设定在50℃以下，优选30℃以下来使生物体试样溶液和第2固相载体接触，适合核糖核酸吸附到第2固相载体上。吸附的核糖核酸经任意洗净处理后，可以用水或任意缓冲液等洗提、回收。
本发明中，在固相载体上吸附脱氧核糖核酸的第1工序和在固相载体上吸附核糖核酸的第2工序中，需要把生物体试样溶液的pH从6以上变更至6以下。生物体试样溶液的pH通过1)添加通过混合调节pH使pH6以下的含有离液剂的溶液，或者2)添加通过混合调节pH使pH6以下的缓冲液或缓冲剂等，来变更至期望pH值。
本发明中，在固相载体上吸附脱氧核糖核酸的第1工序和在固相载体上吸附核糖核酸的第2工序中，需要在第1工序中把生物体试样溶液的二价阳离子浓度调制成含有100mM以上250mM以下，优选150mM以上250mM以下，在第2工序中调制成含有0mM以上100mM以下，优选0mM以上50mM以下。生物体试样溶液的二价阳离子浓度通过1)添加通过稀释调制成二价阳离子浓度100mM以下，优选50mM以下的含有离液剂的溶液，或者2)混合变更成二价阳离子浓度100mM以下，优选50mM以下。例如，通过添加二价阳离子的螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)溶液等可以变更成期望浓度。
本发明中，用于第1和第2工序的固相载体可以使用为分别吸附脱氧核糖核酸和核糖核酸而另外准备的材料。在图7中表示了装有固相载体的容器的一例。图7表示了1个固相载体1通过核酸吸附用固相载体支撑部件10和11设置在容器3内的情况。连接到在容器3的开口部5的为吸引吐出的未图示的注射泵等上，从容器3的开口部4把调制成可使脱氧核糖核酸选择性吸附在固相载体1上的条件的生物试样溶液引入到容器3内，使其接触固相载体1。此时，把生物试样溶液和固相载体1的温度控制在60℃以上。引入到容器3内的生物试样溶液通过反复进行吸引吐出，提高脱氧核糖核酸和固相载体1的接触频率，可以增加吸附量。接着，回收通过与固相载体1接触而去除了脱氧核糖核酸的主要含有核糖核酸的生物试样溶液，添加试剂等使试样溶液的pH和二价阳离子浓度调节到适合于吸附核糖核酸的条件。使用装有重新准备的固相载体的容器，通过与第1工序相同的操作，进行把核糖核酸吸附到固相载体上的第2工序。但是，要把生物试样溶液和固相载体1的温度控制在30℃以下。对吸附在各个固相载体上的脱氧核糖核酸和核糖核酸根据情况分别进行洗净和洗提工序，分别回收。另外，也可以把固相载体1用于第1工序和第2工序双方。此时，在第1工序后，进行对应于脱氧核糖核酸的洗净和洗提工序，从固相载体1上回收脱氧核糖核酸，然后在第2工序中再次使用该固相载体1吸附核糖核酸，在第2工序后，进行对应于核糖核酸的洗净和洗提工序，从固相载体1上回收核糖核酸。
作为固相载体的不同形态，在第1和第2工序中使用的固相载体可以使用为了分别吸附脱氧核糖核酸和核糖核酸而另外准备的材料。作为固相载体的不同形态，存在在同一容器内装有两个以上在第1和第2工序中使用的用于吸附脱氧核糖核酸和核糖核酸的固相载体的核酸回收用容器。图1表示了其一例，说明了其操作。在图1中，用于第1工序的固相载体1和用于第2工序的固相载体2各自设置在如图所示的容器3内的相隔的位置。在容器3的开口部4连接到为吸引吐出的未图示的注射泵等上。从容器3的开口部4把调制成可使脱氧核糖核酸吸附在固相载体上的条件的生物试样溶液引入到容器3内，使其接触第1工序用固相载体1。生物试样溶液位于容器内空间6和固相载体1之间，使得与固相载体1接触，但不与固相载体2和试剂7接触。而且，通过在容器内位置的液体的振荡可以提高脱氧核糖核酸和固相载体的接触频率，从而有利于增加吸附量。把通过与固相载体1接触而去除了脱氧核糖核酸的主要含有核糖核酸的生物试样溶液接着放在容器3的空间6的位置。与设置在空间6内的试剂7接触、混合及溶解，将试样溶液的pH和二价阳离子浓度调节到可在固相载体上吸附核糖核酸的条件。接着，使生物试样溶液接触第2工序用固相载体2，振荡液体，使溶液内的核糖核酸吸附到固相载体2上。第2工序结束后，生物试样溶液从容器3的开口部4排出。容器3可分割成能够分别装有固相载体1和2。分割时各个固相载体通过进行对应于所吸附核酸的洗净和洗提工序，从同一试样分别回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。
本发明中，通过把第1工序的核酸试样溶液和固相载体的温度控制在50℃以上100℃以下、优选在50℃以上70℃以下，把第2工序的核酸试样溶液和固相载体的温度控制在0℃以上60℃以下、优选在0℃以上30℃以下，可以从同一核酸试样溶液分别分离、回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。图2(A)中表示作为一例实施方案的具有能够控制容器内固相载体设置位置温度的构件的容器及装置的构成的平面图，(B)中表示A-A’剖面图。如图2(A)及(B)中所示，在容器3的各固相载体1和2的附近，接触容器3的侧面安装温度控制单元8和9。温度控制单元8和9可以分别独立进行温度控制。为了实施第1工序，控制安装在固相载体1附近的温度控制单元8，使得固相载体1的温度在50℃以上100℃以下、优选在70℃。另一方面，控制安装在固相载体2附近的温度控制单元9，使得固相载体2附近的温度在0℃以上60℃以下、优选在30℃。接着，使生物试样溶液位于容器内空间6和固相载体1中，使得虽然与固相载体1接触但不与固相载体2接触。而且，通过容器内位置的液体的振荡可以提高脱氧核糖核酸和固相载体1的接触频率，从而有利于增加吸附量。接着，使通过与固相载体1接触而去除了脱氧核糖核酸的主要含有核糖核酸的生物试样溶液从容器3的空间6接触控制成期望温度的固相载体2，吸附核糖核酸。第2工序结束后，生物试样溶液从容器3的开口部4排出。容器3可分割成能够分别装有固相载体1和2。分割时，把容器分割成能够各自装有固相载体，通过进行对应于所吸附核酸的洗净和洗提工序，从同一试样分别回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。
图3(A)表示代替图2的控制容器内固相载体设置位置温度的实施方案而具有能够控制容器内固相载体间的容器部分温度的构件的容器及装置的构成的平面图，(B)中表示A-A’剖面图。如图3(A)及(B)中所示，在容器3内的各个固相载体1和2的附近以及夹在固相载体间的空间6，接触容器3的侧面安装温度控制单元2。为了实施第1工序，事先把生物试样溶液的温度调节成50℃以上100℃以下、优选70℃。接着，从开口部4把该生物试样溶液引入到容器3内，使生物试样溶液位于容器内空间6和固相载体1之间，使得虽然与固相载体1接触但不与固相载体2接触。通过容器内位置的液体的振荡可以提高脱氧核糖核酸和固相载体1的接触频率，从而有利于增加吸附量。接着，把通过与固相载体1接触而去除了脱氧核糖核酸的主要含有核糖核酸的生物试样溶液装在容器3的空间6。控制安装在空间6附近的温度控制单元13，把装在空间6的主要含有核糖核酸的生物试样溶液的温度控制在0℃以上60℃以下、优选在30℃。接着，使控制成期望温度的生物试样溶液接触固相载体2，吸附核糖核酸。第2工序结束后，生物试样溶液从容器3的开口部4排出。容器3可分割成能够分别装有固相载体1和2，如在空间6。分割时，可以分割成各固相载体装在分别分割的容器中的状态，从装在这些分割的容器内的各个固相载体，通过进行对应于所吸附核酸的洗净和洗提工序，从同一试样分别回收脱氧核糖核酸和核糖核酸。
实施例
下面，通过例示本发明的实施例，说明本发明效果。
实施例1：脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体上吸附的pH的影响材料及方法如下。
1.核酸样品的调制
用液氮冻结播种Arabidopsis种子后一周时间的绿色植物体，然后在液氮存在下搅均成粉末状态。每0.5g冻结植物组织添加5ml的TRIZOL试剂(Invitrogen公司)，按照附加科学试验报告，调制全RNA。另外，作为DNA样品，是插入到大肠杆菌载体-pSPORT1(Invitrogen公司)的Arabidopsis cDNA，选择两个cDNA尺寸约2kb左右的片段，使用通过对该cDNA采用M13向前及反转引物的PCR放大得到的DNA片段。
2.固相载体
作为核酸吸附用载体，使用把5mg的Quartz Glass Wools；B grade(东芝セラミックス公司)配置在细管状小片的前端部后的材料。
3.核酸吸附溶液
在各种PH的100mM MES-KOH溶液中，溶解29.54g的异硫氰酸胍，形成50ml的溶液(最终浓度5mole/L)。另外，因根据异硫氰酸胍的溶解pH有变动，所以在异硫氰酸胍溶解后再次测定溶液的pH，将其作为溶液的最终pH。
4.在固相载体吸附核酸的方法
使在480μl上述异硫氰酸胍溶液中加入混合10μl全RNA样品(相当于3μg)和110μl灭菌水的溶液接触配置在细管状小片的前端部的Quartz Glass Wools上。用注射器把核酸溶液在细管状小片内进行20次往复振荡，把核酸吸附到载体上。在DNA的情况，使用10μl的DNA样品(相当于0.5μg)，进行同样吸附。
5.向固相载体的核酸吸附的测定
对载体的吸附通过测定接触载体后残留在核酸溶液中的未吸附核酸来进行判断。在600μl未吸附部分中添加60μl的5mole/L醋酸钠溶液，并添加混合1.2ml乙醇后，在-80℃静置30分钟。接着，进行离心操作，沉淀核酸。用80％乙醇洗净沉淀后干燥。在干燥的沉淀中加入10μl灭菌水，溶解沉淀后，加入电泳用样品填充液，在70℃进行10分钟热变性。在冰上冷却样品后，使用含有甲醛的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳后，用溴酚蓝染色核酸并检验。对检验的光谱的荧光强度使用影像分析仪FMBIO(TAKARA公司)进行定量。
基于以上的材料及方法，使用通过100mM的MES-KOH缓冲液把pH调节至5.1、5.8、6.4、6.9的5M异硫氰酸胍溶液，研究在最终浓度4M条件下pH对脱氧核糖核酸和核糖核酸的载体吸附的影响。求出吸附到载体的核酸量对用作样品的核酸量之比作为核酸回收率(％)。将其结果示于图4。根据图4，相对于脱氧核糖核酸(DNA)对研究的所有pH显示几乎100％回收率的情况，核糖核酸(RNA)显示出在pH 6.4以下时回收量低，在pH6.9时回收率几乎为一半。从这里可以知道在pH6以上时核糖核酸吸附低，脱氧核糖核酸优先吸附到固相载体上。
实施例2：脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体上吸附的温度的影响
研究在最终浓度4M的异硫氰酸胍条件(pH5.8)下脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体上吸附的温度的影响。材料和方法与实施例1相同。如图5所示，相对于脱氧核糖核酸(DNA)的吸附在研究的任何温度都显示出98％以上的回收率的情况，核糖核酸(RNA)的回收率在60℃以下时表现低下，约为74％，在70℃时约为65％。从这里可以知道在温度60℃以下的条件时核糖核酸吸附低下，脱氧核糖核酸优先吸附到固相载体上。
实施例3：脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体上吸附的阳离子对核酸吸附的影响
研究在最终浓度4M的异硫氰酸胍条件(pH5.8)下二价阳离子对脱氧核糖核酸和核糖核酸在固相载体上吸附的影响。材料和方法与实施例1相同。这里作为一例表示对Mg离子进行研究的结果(图6)。如图6所示，相对于脱氧核糖核酸(DNA)对研究的任何Mg离子浓度都显示出几乎100％的回收率的情况，核糖核酸(RNA)的回收率在Mg离子浓度100mM以上时表现低下，在150mM时降低到约为65％。从这里可以知道Mg离子会阻碍核糖核酸在载体上的吸附。根据此，可以知道在Mg离子浓度100mM以上的条件时核糖核酸吸附低下，脱氧核糖核酸优先吸附到固相载体上。
从以上结果，在pH6以上、温度60℃以上和阳离子浓度100mM以上的条件时，核糖核酸吸附低下，脱氧核糖核酸优先吸附到固相载体上，并且在pH6以下、温度60℃以下和阳离子浓度100mM以下的条件时，可实现良好的核糖核酸吸附。
根据该结果可以确认，为了在固相载体上优选吸附脱氧核糖核酸的生物试样溶液的pH应在pH6以上的范围，为了优选吸附核糖核酸的生物试样溶液的pH应在pH6以下的范围。还有，为了在固相载体上优选吸附脱氧核糖核酸的温度应在50℃以上100℃以下范围，优选50℃以上70℃以下范围，为了优选吸附核糖核酸的温度应在0℃以上60℃以下，优选0℃以上30℃以下范围。进一步，为了在固相载体上优选吸附脱氧核糖核酸的生物试样溶液的二价阳离子的浓度应在100mM以上250mM以下范围，优选150mM以上250mM以下范围，为了优选吸附核糖核酸的该浓度应在0mM以上100mM以下范围，优选0mM以上50mM以下范围。
实施例4：使用脱氧核糖核酸和核糖核酸混合物的各核酸对固相载体的分别吸附
使用脱氧核糖核酸和核糖核酸混合物，通过变化异硫氰酸胍溶液的pH、Mg2+离子浓度及温度进行吸附回收脱氧核糖核酸的第1工序和吸附回收核糖核酸的第2工序，研究各核酸的回收率。调制含有脱氧核糖核酸(DNA：约2kb的PCR片段，相当于0.3μg)和核糖核酸(全RNA：相当于0.3μg)的4M异硫氰酸胍溶液(pH6.5、Mg2+浓度150mM)，接着把该溶液的温度加热至60℃，并保持。使该溶液接触载体，实施吸附核酸的第1工序。对于第1工序后的未吸附部分(1)通过添加适当量的4M异硫氰酸胍溶液(pH5.0)，把未吸附部分调制成pH6以下，Mg2+浓度50mM以下。接着，把该调制的未吸附部分(1)的温度冷却至30℃以下。当溶液温度达到30℃后，把溶液接触到不同于在第1工序中使用的载体上，实施第2工序。从第1工序的未吸附部分溶液(1)和第2工序的未吸附部分溶液(2)，根据乙醇沉淀法回收残留的核酸。对回收核酸进行电泳分析，计算各工序的核酸回收率(表1)。
表1第1和第2工序中的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的回收率
| 第1工序 | 第2工序 | |
| DNA回收率RNA回收率 | 99％以上5～10％ | 不足1％75～80％ |
如表1所示，第1工序中，脱氧核糖核酸(DNA)几乎全部被载体吸收回收。另一方面，核糖核酸(RNA)虽然被吸附但其量只是所使用核糖核酸量的约10％以下。根据此，可以知道在设定成pH6以上、Mg2+离子浓度100mM以上、温度60℃以上的第1工序中，脱氧核糖核酸选择性吸附到载体上。还有，在第2工序中吸附了开始使用的核糖核酸量的约75～80％(残留在未吸附部分(1)的核糖核酸的约90％)。
从以上结果可以知道，脱氧核糖核酸和核糖核酸混合物分别吸附各核酸时，在pH 6以上、温度60℃以上和阳离子浓度100mM以上的条件下，核糖核酸吸附低下，脱氧核糖核酸优先吸附到固相载体上，并且在pH6以下、温度60℃以下和阳离子浓度100mM以下的条件下，可实现良好的核糖核酸吸附。
根据本实施例的方法，可从极其微量的试样分离出脱氧核糖核酸和核糖核酸双方。例如，可以从根据激光微模片段法等从组织切片切出的1的特定部位抽提回收DNA和RNA双方，发现该特定部位的染色体DNA上的基因变异和mRNA。
发明的效果
根据本发明，可以把溶解了细胞或组织的生物试样中的脱氧核糖核酸和核糖核酸分子，从一个生物试样中简便且安全地分别分离及回收。还有，在从一个生物试样中分别抽提回收DNA和RNA时，可以不调制大量试样，从极其微量的试样实现抽提回收。
Claims (17)
1.一种核酸回收方法，其特征在于：具有从含有脱氧核糖核酸和核糖核酸的试样溶液通过吸附选择性回收所述脱氧核糖核酸的第1工序，和在所述第1工序后、通过吸附回收所述核糖核酸的第2工序，所述第1工序和第2工序是通过变化所述试样溶液的pH、温度、二价阳离子浓度中的至少一种来进行，其中在所述第1工序中所述试样的温度为50℃以上100℃以下，在所述第2工序中所述试样的温度为50℃以下。
2.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：在所述第1工序中，通过使所述试样溶液接触固相载体，使所述脱氧核糖核酸选择性地吸附在所述固相载体上，在所述第2工序中，通过使用洗提了在所述第1工序中吸附的所述脱氧核糖核酸的所述固相载体，并使所述试样溶液接触所述固相载体，使所述核糖核酸选择性地吸附在所述固相载体上。
3.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：在所述第1工序中，通过使所述试样溶液接触第1固相载体，使所述脱氧核糖核酸选择性地吸附在所述第1固相载体上，在所述第2工序中，通过使所述试样溶液接触到第2固相载体，使所述核糖核酸选择性地吸附在所述第2固相载体上。
4.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：在所述第1工序中pH为6.0以上，在所述第2工序中所述pH为6.0以下。
5.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：在所述第1工序中二价阳离子浓度为100mM以上250mM以下，在所述第2工序中所述二价阳离子浓度为100mM以下。
6.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：所述pH是通过在所述第1工序后添加通过混合预先调节成降低pH的溶液来降低。
7.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：所述二价阳离子浓度是通过在所述第1工序后稀释所述试样溶液来降低。
8.如权利要求1记载的核酸回收方法，其特征在于：所述二价阳离子浓度是通过在所述第1工序后在所述试样溶液中添加二价阳离子的螯合剂来降低。
9.如权利要求3记载的核酸回收方法，其特征在于：所述温度的变化是所述第1工序后所述第1固相载体、和/或所述第2固相载体、和/或所述试样溶液的温度的变化。
10.如权利要求3记载的核酸回收方法，其特征在于：所述温度的变化是通过控制所述第1固相载体的设置位置和/或所述第2固相载体的设置位置的温度。
11.如权利要求3记载的核酸回收方法，其特征在于：所述温度的变化是通过控制设置有所述第1固相载体和所述第2固相载体的容器中的，所述第1固相载体和所述第2固相载体之间部位的温度。
12.一种核酸回收装置，其特征在于：其是选择性分离脱氧核糖核酸和核糖核酸的核酸回收装置，包括具有开口端的容器、装在所述容器中的固相载体、含有100mM以上250mM以下的二价阳离子且pH为6.0以上的第1溶液、和含有100mM以下所述二价阳离子且pH为6.0以下的第2溶液。
13.一种核酸回收装置，其特征在于：其是选择性分离脱氧核糖核酸和核糖核酸的核酸回收装置，包括具有开口端的容器、装在所述容器中的固相载体、用于使作为分离对象的试样溶液的二价阳离子为100mM以上250mM以下且pH为6.0以上的第1调节溶液、和用于使所述试样溶液的所述二价阳离子为100mM以下且pH为6.0以下的第2调节溶液。
14.如权利要求12或权利要求13记载的核酸回收装置，其特征在于：所述二价阳离子为镁离子、钙离子、锰离子中的任意一种。
15.如权利要求12或权利要求13记载的核酸回收装置，其特征在于：所述固相载体含有二氧化硅，是玻璃、硅藻土、对玻璃或硅藻土表面进行化学处理所得到的物质的任意一种。
16.如权利要求12或权利要求13记载的核酸回收装置，其特征在于：所述固相载体是设置在所述容器内部的两处，所述固相载体的一处是用于分离所述脱氧核糖核酸，另一处的所述固相载体是用于分离所述核糖核酸。
17.如权利要求12或权利要求13记载的核酸回收装置，其特征在于：所述固相载体是设置在所述容器内部的两处，所述容器是能够分割成分别装有各个所述固相载体的容器。
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