CN100473728C - 用于检测细菌群和细菌种系发育中单位的核酸分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定细菌或细菌群的核酸分子。本鉴定细菌的方法使用了细菌基因内的23S/5S rRNA序列中包含的目标序列。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴定细菌或细菌群的核酸分子。
背景技术
细菌在人类世界中普遍存在。由于其频繁引起食物腐败或诱发疾病，所以如何有效、快速并可靠地检测细菌具有重大的意义。
常导致食物腐败的微生物包括肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，肉毒致病菌，弯曲菌属(Campylobacter jejuni)，梭菌属(Clostridiumperfringens)，似隐孢菌属(Cryptosporidium parvum)，肠道致病埃希氏菌属(Escherichia-coli)，志贺菌属(Shigella)，李斯特菌属(Listeriamonocytogenes)，沙门氏菌(Salmonellen Spezies)，金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，弧菌(Vibrio vulnificus)，耶尔森氏菌(Yersiniaenterolytica)。美国统计总局(General Accounting Office)1996年的报告显示，美国每年发生650万到8100万起食物中毒事件。美国食品和药品管理局(FDA)估计，2-3％食物中毒事件会导致慢性疾病。另据估计，美国每年有200万到400万例疾病是由2000多种沙门氏菌种引起的。若将其它可导致食品腐败的病菌一并考虑在内，则此统计数据更令人触目惊心。食物中毒不仅会引起肉体的痛苦甚至导致死亡，还会造成巨大的经济损失。据估计，美国1991年因此遭受的损失高达56亿到94亿美元。众所周知，微生物作为传染病源所带来的危害是无法估量的。这在世界卫生组织的世界健康报告中得到了充分的反映。例如1998年传染病菌(包括寄生虫)导致980万人死亡(不包括出生前后由感染引起的死亡)，占因病死亡人数的18.2％。如此危险的传染病菌并不象导致食物腐败的细菌那样容易归类，因为它们是由分类学上的多种真细菌构成的。其中肠道菌群即具有特别强的“感染潜力”。
在与致病菌的斗争过程中，确定病原体是重要的一步。通常，只有在确定了病原体后方可采取相应的治疗措施。此外，有效的细菌鉴定方法同样也可作为保证食品质量的有效工具。
传统的细菌鉴定方法是微生物学的方法，即通常在选择性琼脂平皿上进行细菌分离。这种方法有两个明显的缺陷。一是其鉴定通常不可靠或不特异。二是许多细菌至少需要18个小时的成长期才能分离出单个菌落。而在很多情况下还需要进行二次分离或鉴定。总之，一周的鉴定时间并不鲜见。此外，很多病原体根本无法培养(J.J.Byrd etal.1991，Appl.Environ.Microbiol.57，875-878)。在交通快捷和商品流通全球化的今天，快速的鉴定方法最好不超过24小时，这对于防止病原体的扩散或食物中毒的蔓延至关重要。
为了满足当前的需要，近年来出现了许多可快速可靠地鉴别病原体的常规方法。例如免疫学的方法，即利用了单克隆或多克隆抗体与细菌表面抗原的特异性结合。这些方法尤其被用于例如对沙门氏菌的血清定型。一般来说，ELISA方法虽然比较快捷，但其对相关抗原进行处理和分离的要求可能会引起很多问题。而采用DNA探针的细菌鉴定方法便显得十分有效，因为其非常敏感，相对特异并可在2至3天内鉴定出微生物。
本发明包括提供特定的DNA序列和如何选择特别的DNA区域用于鉴别细菌。这种方法是以借助微生物的遗传信息对其进行鉴定为基础的。在特定DNA区域的核酸序列中，一个碱基上的差异就可用于区分细菌种类。
过去，核糖体RNA基因已经被用于细菌的种系分类。不同细菌的5S和16S核糖体基因序列比较分析已导致对种系分类进行了重大修正并可籍此发现新的古细菌门。由于其大小和过高的测序费用，23SRNA仅在近几年才被用于进行细菌的系统分类。
在实际使用中，直接分析基因序列来鉴别微生物的方法既昂贵又费时。因此在八十年代，人们使用核酸探针来鉴别细菌。此法虽具有高特异性，但其检测阈值时常太低。核酸探针技术与DNA扩增技术的结合使得人类鉴别细菌的能力有了大幅度的提高，因为后者可以增加需要检测的核酸序列数，并可由此显著提高鉴别的灵敏度。人们因此甚至可以鉴别从一个细胞中分离出的基因组。在实践中，在分离提取DNA过程中出现的损失可以使检测阈值提高到100到10,000。
在基础研究工作的基础上，5S-，16S-和23S-基因中的DNA探针被应用于实践中。例如Nietupski等人的用于检测沙门氏菌(Salmonella)的专利(US 5,147,778)，Mann & Wood的用于检测耶尔森氏菌(Yersinia)的专利(US 6,554,144)，Leong的用于检测各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的专利(EP 0479117 A1)，Carico等人的用于检测不同肠道细菌的专利(EP 133671 B1)，Shah等人的用于检测耶尔森氏肠道菌的专利(EP 0339783 B1)，Carrico用于检测埃希氏菌的专利(BP0163220 B 1)，Hogan等人的用于检测肠道细菌(Enterobakteria)，分枝杆菌(Mycobacteria)，支原体菌(Mycoplasma)和军团菌(Legionella)的专利(WO 88/03957)，Leiser等人的用于检测不同微生物的专利(WO97/41253)，Grosz & Jensen的用于检测沙门氏菌(Salmonelle)的专利(WO 95/33854)，Stackebrandt & Curiaie的用于检测李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的专利(EP 0314294 A2)，Wolffet等人(EP 0408077 A2)和Hogan&Hammond(US 5681698)用于检测分枝杆菌(Mycobacteria)的专利，Hogan等人用于检测不同细菌的专利(US 5,679,520)，Kohne特别用于检测细菌的mRNA的专利(US 5,567,587)，Kohne用于检测不同细菌的专利(US 5,714,324)，Pelletier用于检测军团菌(Legionella)的专利(WO 94/28174)Kohne用于检测不同细菌的专利(US5,601,984)。以上专利大多数是关于16S rDNA基因，一部分还是关于23S rDNA的。
但实践表明，以上基因由于其序列太保守而不适合用于很多细菌的鉴别，尤其不适于区分亲缘关系很近的微生物。另一方面，5S rDNA虽然由于其本身较小而最初被用于种系发育研究，但其在实际应用中序列变化太大，鉴别能力很低。
因为5S，16S和23SrDNA基因作为鉴别方法存在许多缺陷，人们正努力寻找可以鉴定所有真细菌的DNA序列。这样的DNA序列应该既具有易变性又具有很强的保守性。变化的范围应适合区分亲缘关系很近的菌种。而保守的序列则可用于鉴别亲缘关系比较远的细菌或分类学上关系较远的菌株。
在有关核糖体操纵子的研究中，最近的文献也讨论到了16S-23S转录间隔区，但对其在系统细菌学上的应用却提出了质疑。例如Nagpal等人(J.Microbiol.Meth.33，1998，第212页)即对这种转录间隔区的应用能力持强烈的怀疑态度：这个rDNA转录间隔区的主要问题在于经常有tRNA插入其中。这种插入可以引起转录间隔区内剧烈的序列偏差，但却与种系发育的距离没有必然的联系。过去，人们应用这些tRNA的插入以确定由其引起的长度多变性来作为种系特征。(Jensen et al.1993，Appl.Envir.Microb.59，945-952，Jensen，WO93/11264，Kur et al.1995，ActaMicrob.Pol.44，111-117)。
用于鉴别细菌的另一种目标序列是23S和5S rDNA之间的转录间隔区。例如Zhu等人(J.Appl.Bacteriol.80，1996，244-251)就用这一DNA区域鉴别出伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)。但是从以上工作并不能推断出这一转录间隔区能否用于鉴定其它细菌。非常多的例子表明一个DNA区域只适用于检测一种或少数几种细菌。个别的专利暗示了23S-5S转录DNA区域用于细菌鉴定的可能性，但其应用范围是有限的。它们的共性在于其可应用性只与一种细菌有关，而且是用于鉴定军团菌(Legionellen)(见Heidrich et al.EP 0739988 A1)，假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)(见Bergbof et al.，DE 19739611 A1)和金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(见Berghof et al.，WO 99/05159)。
发明内容
本发明旨在解答仅用一种实验材料即可鉴定任意一种细菌(特别是肠道菌群)所需的材料及方法的技术问题。
在本发明中，此问题通过使用核酸分子作为探针和/或引物来鉴别细菌而得到解决。作为探针和/或引物的核酸分子选自：
a)一个核酸分子，其至少包括带有从SEQ ID No.1到530的一个序列，和/或位于2667到2720，2727到2776，2777到2801，2801到2832，2857到2896，2907到2931，2983到2999位置之间的一个序列，和/或SEQ ID No.1中的3440到3032位置之间的序列，以及与上述核酸分子同源的核酸分子。；
b)一个与a)中核酸分子进行特异性杂交的核酸分子；
c)一个与a)或b)中的核酸分子具有70％，最好是90％相同性的核酸分子；
d)一个可与a)到c)项中的核酸分子互补的，和/或a)到d)项中定义的核酸分子的组合，但不包括SEQ ID No 1.。
其它的权利要求涉及本发明的优选的实施方法。
在本发明的优选实施方法中，可通过将分析样品与可鉴定肠道细菌23S/5S-rDNA基因片段中核酸的存在的探针接触，从而证明肠道细菌的存在。
权利要求1中所陈述的1号序列来自E.coli。与其同源的DNA序列源于与所描述的E.coli.序列不同的其它细菌，但是这些细菌的基因片段是与SEQ ID No.1序列的基因片段相对应的。具体细节可参考下文中同源DNA序列的定义。
本发明中涉及的核酸分子应优先包括至少10个核苷酸，最佳情况下至少14个核苷酸。此长度的核酸分子主要作为引物使用，而作为探针使用的核酸分子最好至少包括50个核苷酸。
在本发明其它优选的实施方案中，探针和引物的核苷酸可由其被修饰的核酸分子代替，例如其包含了用于鉴定反应的新增的基团。主要的衍生物参见权利要求4。
在本发明其它优选的实施方案中使用了上述的核酸分子的组合。核酸分子的组合方式使得人们可以判定鉴定反应的可选择性。人们可以通过选择引物组合和/或探针组合来确定鉴别反应的条件，从而鉴定样品中有无细菌的存在或鉴别何种细菌存在。
本发明中的试剂盒包括至少上述的一种核酸，连同其它核酸鉴定中常用的试剂。这些常用的试剂包括适合的缓冲剂和象酶这样的鉴定物质。人们可以使用它们鉴别生物素化的杂交分子。
在本发明另一种优选的实施方案，即Consensus PCR中，可按照权利要求8中规定的方法进行。在此先通过使用保守引物(其能与分类学上的多种细菌杂交)扩增一个核酸分子片段，然后通过使用其它特异性的核酸(其仅与少数分类学上单位或某个特定的菌种杂交)来鉴定特异性的核酸片段。后者可以反推出分析样品中含有特定的菌属、类和种。
在鉴定核酸的过程中可使用不同的方法，例如DNA印迹技术，PCR技术以及LCR技术等。
在一份全面的研究报告中，人们探讨了介于23S和5S-rDNA的转录间隔区作为鉴别目标分子的一般适用性。为此，人们对很多菌种的基因组DNA进行了分离，提纯，克隆，测序和广泛的序列比较分析。令人吃惊的是，这一序列片段几乎可用于鉴别所有的细菌种类。受此成果鼓舞，人们扩展分析了转录间隔区的相邻区域，并对所有的细菌类别或小的种系发育单位的DNA片段都进行了研究。这些DNA片段在400bp到750bp之间，并包括末端，即具有菌株特异性的23S-rDNA基因的最后的330-430个核苷酸、转录间隔区和完整的5SrDNA基因。该片段的大小总计为400-750bp。实验表明，几乎所有细菌种类的23S rDNA和5S rDNA基因都是相邻的。这一发现是应用本发明的一个重要先决条件。
本发明尤其要求所选择的用来鉴别微生物的DNA区域可包含至少两个相邻基因的主要部分。实践中，该区域的可使用性尤其取决于其种系发育的多样性。根据是否需要鉴别种系关系较远的细菌和分类学上单位或特定细菌的种类的不同，所要求的条件可能完全相反。如23S-5S-重复序列所示，该区域的易变性和保守性出现的频率，在两个基因的情况下比在单个基因的情况下大。使用两个相邻基因，包括可变的插入序列，体现出明显的优势。
此外，23S rDNA基因末端、5S rDNA基因和介于两者之间的转录间隔区都包含了涵盖从最多变到最保守的核酸序列。对这一区域的详细分析得出了有关不同种系发育菌体区分能力的非常有趣的启示(见图2，表6)。几乎所有的分类学上单位均可通过使用亚区域来加以鉴定和/或区分。图2中的片段1至9表示变化性大小不一的范围，而高保守区域则间或其中或与之相邻。后者特别适于鉴定分类学上较高的菌株，如所有的真细菌或其纲目。
图1中的种系发育系谱进一步说明了这一区域的实用性。从此图可看出，23S rDNA-5S rDNA区域非常适合用于细菌的粗略划分。因为蛋白细菌(Proteobacteria)被列成1-2组，而硬细菌(Firmicutes)则被从中划分出来。此外，近亲细菌因在系谱上的长度不同而相互间易于区分。在此，对系谱中的近亲细胞进行种系发育的系谱排列是不必要的。那样的话，它们就会被排在一个关系紧密的群体里，反而可能更难区分。
附图说明
图1：本发明鉴定的一些细菌的种系发育系谱。从图可知，蛋白细菌和硬细菌在系谱上构成了不同的分枝。
图2：本发明所描述的由23S rDNA末端、转录间隔区和5S rDNA构成的核糖体区域的图形表示。此区域及其部分用于细菌的鉴别。单个功能区域的详细描述见表6。
图3-7：用PCR方法鉴别肠道细菌。图中所示为经溴化乙锭染色的琼脂胶。图中显示的条带表明肠道细菌的存在。图的上半部为阳性对照，下半部是阴性对照。引物的应用见表7。由Bgl I和Hinf I酶切pBR328载体DNA(Boehringer Mannheim公司生产)形成的混合物作为DNA标准。DNA梯级包括酶切片段154，220，234，298，394，453，517，653，1033，1230，1766和2176bp。
图8：Consensus-PCR的图示。保守程度高的引物位于图的外围，保守程度低的引物位于图的里面。Consensus-PCR可首先扩增分类学上较高的细菌的DNA，甚至所有细菌的DNA。此后还可以进行多次扩增，亦可在单独的反应管中使用对于分类学上较低的菌株具有特异性的引物。最后可使用探针。该探针同样有助于菌株特异性的鉴别，并通过使用例如染料等材料支持鉴别。在图8中使用的概念如下：
引物A＝鉴定系统中最保守的并位于外围的引物；
引物[A，B，C...]＝如上所示的连锁引物系列；
引物[大写字母]1＝正向引物
引物[大写字母]2＝反向引物
引物[大写字母][数字][小写字母]＝小写字母表示相似的引物或在一个目标DNA当中在同源位置或在可比性的位置上进行杂交的引物。在细菌的种属需要鉴定的情况下，应优先使用位于中心高变区域内的探针。
示例1
肠道细菌目的鉴定
用标准的方法从表1中列出的细菌纯培养物中分离基因组DNA。然后，从所制备的DNA当中取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
基因组DNA -1.00μl
水 -19，80μl
缓冲液(10x)*1 -2，50μl
dNTP(10mM)*2 -0，25μl
正向引物(10μM)*3 -0，20μl
反向引物(10μM)*3 -0，20μl
MgCl2 -0，75μl
Taq聚合酶(5U/μl)*1 -0，30μl
*1：缓冲液和酶可由Biomaster公司或其他供货商提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
起始变性 95℃ 5min
扩增(35个循环) 92℃ 1min
62℃ 1min
72℃ 30s
终合成 72℃ 5min
肠道细菌目的鉴别使用表1中所列细菌种类。所应用的引物组合和引物的特异性参数见表7。若表7中给出多个正向或反向引物，则使用其相应的混合物。
PCR的结果通过琼脂胶上电泳和溴化乙锭染色进行分析。PCR产物的存在即可证明肠道细菌的存在。
合成的PCR产物大小多位于400bp到750bp之间。此时有可能会出现多条色带，因为很多细菌的核糖体等位基因是杂合的。实验结果归纳为表1。其显示了肠道细菌完全区别于其它类别的代表物。
示例2
泛细菌(Pantoea dispersa)鉴定的示例
用标准的方法可从细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
基因组DNA -1.00μl
水 -19，80μl
缓冲液(10x)*1 -2，50μl
dNTP(10mM)*2 -0，25μl
正向引物A(10mM)*3 -0，20μl
反向引物(10mM)*3 -0，20μl
MgCl2 -0，75μl
Taq聚合酶(5U/μl)*1 -0，30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
为鉴定泛细菌(Pantoea dispersa)，可使用引物组合SEQ ID 2+引物x1，SEQ ID(3-6)+引物x1或引物x1的互补序列+SEQ ID 147的互补序列。此处，引物x1的对应序列为CGT TGC CCC GCT CGCGCC GCT CAG TCA C。引物1是SEQ ID 108的部分序列。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
起始变性 95℃ 5min
扩增(35个循环) 92℃ 1min
62℃ 1min
72℃ 20s
终合成 72℃ 5min
PCR的结果通过琼脂胶上电泳和溴化乙锭染色进行分析。合成的PCR产物大小为370bp，320bp和70bp。扩增产物的缺失即证明无弧细菌(Pantoea dispersa)的存在。用此方法可得出表2所示的结果。
示例3
Consensus-PCR在芯片技术上的应用
3a)Consensus-PCR的原理
图8所示的Consensus-PCR至少应用了两种可至少鉴定两个种系发育菌株同源区域的引物(A1，A2)。在此，可能涉及细菌的菌株和种，或如门、纲这样分类学上较高的单位。在鉴定体系中，至少需要进行第二步鉴定以区分扩增的分类学单位，为此，可能需要使用第二步PCR和/或探针。对第二步及以后的扩增步骤的PCR引物(B1，B2)的选择应使它们位于扩增产物当中，并具有鉴别分类学上特异菌株的能力。通过使用其它引物(C，D，E....)可同时区分许多分类学上单位的集合。此外，通过使用多种引物的混合物(如A1a，A1b，A1c，...)，可提高鉴别多种分类学上单位的能力。后者出现在一个引物中的单个核苷酸发生变化或引物完全不同的情况下。Consensus引物的概念也可参见图8。
扩增产物的鉴定可通过引物完成。当引物识别并成功扩增目标DNA就会产生阳性结果。此外，探针也可提供特殊的鉴定。它们与已扩增的DNA进行特异性杂交，通过直接或间接与染料偶合而证明特定的DNA序列的存在。总之，探针可用于专业人员熟知的多种实验，例如DNA印迹、使用荧光探针的lightcycler技术或将许多探针进行微排阵列(Microarray)的芯片技术。
Consensus-PCR的一个显著优点在于序列A，B，C...中引物的特异性递增。此优点可通过依图2选取DNA目标区域得以保证。
Consensus-PCR的另一优点在于它只需少量的核酸样品便可同时鉴别两个以上分类学上单位。可鉴别的微生物样品的数量可通过不同途径得以增加，例如，Consensus系统的鉴别能力可如图8所定义的那样，随引物类型A，B，C，...或者A1a，A1b，A1c...而提高。一个PCR反应混合物在与一引物对A1，A2反应后可被分离，并在分开的PCR反应混合物中与其它的引物对B1a+B2a及B1b+B2b进行扩增。最后，PCR扩增产物的特性可通过使用探针与其杂交确定。
3b)肠道细菌属鉴定的示例
用标准的方法可从细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
基因组DNA -1.00μl
水 -19，80μl
缓冲液(10x)*1 -2，50μl
dNTP(10mM)*2 -0，25μl
正向引物(10μM)*3 -0，20μl
反向引物(10μM)*3 -0，20μl
MgCl2 -0，75μl
Taq聚合酶(5U/μl)*1 -0，30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
鉴于在芯片技术领域通常反应用量很小，上述反应配方可相应减少。有时，也会需要调整PCR的循环时间。
对于Consensus-PCR，首先可扩增一核糖体片段。这一过程对分类学上较高的菌株具有特异性，并如例1所述，也应用了与例1中相同的引物。另一种可能是扩增所有细菌的核糖体片段。细菌的范围广阔的系谱中的核糖体DNA提供了诸如SEQ ID 211+SEQ ID 212的引物组合。
对扩增的DNA按标准方法进行变性，使其变成单链DNA。这种形式的单链DNA适合于与一个DNA、RNA或PNA探针结合。然后，根据芯片的制作，可判定扩增物与探针的杂交。另一种可能是根据ELISA进行判定。所需探针应具有所要求的特性。相应地，种、属或较高的分类学上单位均可鉴别。
表3是通过使用SEQ ID 164部分序列GTT CCG AGA TTG GTT作为探针识别肠道细菌属的范例。当多种细菌群的鉴别结果相互重叠时，这种对细菌群的鉴别在芯片技术领域就很有意义。通过相互重叠部分的数值，可鉴别出，如与食品检测有关的，一种或多种细菌。
3c)使用Consensus-PCR鉴别所有细菌
为鉴别所有细菌，人们在第一步扩增过程中使用高保守性的Consensus-引物。图2所示位于外围的核糖体片段适于被选作引物的序列。这个序列与起于2571、终于3112的SEQ ID 1序列同源。这一片段中最适合于一般扩增的引物为SEQ ID 211(例如作为引物A1a)和SEQ ID 212(例如作为引物A2a)。此外就很容易推出Multiplex-PCR中的其它引物(A1b，A1c，...及A2b，A2c，...)，这些引物包括真细菌的任意大小的分类学范围。在这个概念中，引物A1和引物A2组成了引物对，B和C......等连锁引物即A1a和A1b是同源的或者相似的。
第一步的区分可通过应用连锁引物(B，C，D，....)来实现。这一过程可通过将主PCR混合物分开，然后在分开后的每个PCR混合物中添加诸如B，C，D等的引物对。这些连锁引物之所以具有特别的优势，是因为如图8所示，核糖体区域从外到里可变性递增，也如表6所描述的那样。探针可优先用于菌种的最终的区别和鉴定。例如，如果需要鉴定菌的菌株或种，那么探针应在如图2所示的区域7中心杂交。
在表8中，许多多聚核苷酸被用于一个Consensus-PCR中以鉴别细菌的属和种或菌株。表8中1号引物的应用在实例1中已做了详细的说明。
多聚核苷酸的特性符合表6和图2中的描述。这意味着，引物A1可归入表6和图2中的1号区域，引物A2归入2号区域......引物B2归入8号区域，引物A2归入9号区域。与这一构想相应，表8中的引物A1-G1可用作正向引物，引物B2和A2可用作反向引物。上述后两种引物的序列为此而必须是反向的(表8中序列1例外)。引物H1特别适用于作为种属特异性的探针。
此处描述的Consensus-PCR并非鉴别细菌所必需。原则上，表8中所列的多聚核苷酸可用于任意组合。实践中，应首先明确何种细菌是鉴定过程中所不需要而应排除的。根据问题的不同，可不按图例所示而选择使用一个简单的PCR版本。最简单的Consensus-PCR仅由两个符合表8中序列及其相应互补序列的引物构成。
表8中所列出的许多保守引物均可被用于鉴别如门、纲、目那样的分类学上高的单位。由表6可知，这特别适用于外围引物A或与SEQ ID 211+SEQ ID 212同源的序列。对于一个或多个细菌属或细菌种，更广的鉴别能力在表8中特别通过序列的重复列举而显示出来。如果对于一个属只有一个序列被明确列举出来，则可从这个序列当中选出两个引物用于鉴别细菌。此外，也可为涉及的细菌纲选用一般的引物，如具有亲缘关系的菌属的引物A，并由一诸如引物H1的特异性的序列来设计一个探针。若序列很长，则可从中选用至少15个碱基长度的核酸片段。
3d)Consensus-PCR对于芯片技术的应用
Consensus-PCR的具体实施主要取决于待鉴定的分类学上单位的数目。由于Multiplex-PCR即为最复杂形式的Consensus-PCR，在一个反应当中仅能确定有限的细菌数目。按经验，此数目小于20。因此，在相同的样品中加入不同的引物A、B等(见图8中的概念)，实施不同的PCR反应可能效果较好。
首先，增加天然样品中的细菌数目或用标准的方法从中直接分离基因组DNA。从所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方相应如下：
基因组DNA -1.00μl
水 -19.80μl
缓冲液(10x)*1 -2.50μl
dNTP(10mM)*2 -0.25μl
正向引物(10mM)*3 -0，20μl
反向引物(10mM)*3 -0.20μl
MgCl2 -0.75μl
Taq聚合酶(5U/μl)*1 -0.30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其引物的浓度均为10μM。例如，引物可按3c的描述进行设计和组合。
鉴于在芯片技术领域反应用量通常很小，上述反应配方可相应减少。有时，也需要调整PCR的循环时间。
扩增完成后将DNA纯化。将探针固定在芯片上。在一特殊的实施方法中，上述探针可由表8“引物H1”列中选出。其技术过程为专业人员熟知。纯化的DNA与变性缓冲液(例4)按1:1稀释并在室温下培养一小时。然后加入十倍体积的杂交缓冲液并用此溶液在37-60℃间缓慢地覆盖芯片，即附着了探针的表面。将经处理的芯片表面用洗涤缓冲液(例4)在37-60℃间洗涤3次，每次至少2分钟。最后进行检测。为此，可使用与荧光染料偶连的引物。此荧光可通过诸如CCD相机的探测器检测。当然，也还有许多其它的检测方法，例如可通过表面质子共振(SPR)来检测和定量单链的扩增产物与探针的结合。此方法的优点是不需使用染料。在应用SPR时，可将实验过程设计成，其芯片表面含有相同探针的区域可同时进行探测。如果芯片上排列了100或1000个以上单独的检测区域，此方法就具特别的优势。这些区域上的核酸杂交引起的SPR信号增加即表示结果阳性。由此可通过表8所列出的引物对相应的细菌或原则上所有的细菌进行鉴别、甚至可能定量。
示例4
用探针鉴别微生物
作为诸如DNA、RNA和PNA或专业人员熟知的类似结构的多聚核苷酸探针，原则上可用于浓缩和鉴定DNA或RNA。它们以单链分子形式存在，或可通过类似加热或加碱的标准变性方法变为单链分子。
为鉴别微生物，必须从中分离出DNA或RNA并进行纯化。用以下不同方法可高效获得核酸：
1)可用物理方法，例如使用磁颗粒与抗体偶连的方法或离心，浓缩微生物
2)可通过一个PCR或类似的扩增反应来扩增微生物的DNA或RNA
3)使用市场上可购得的常用材料，在进行纯化的过程中，浓缩扩增的微生物的DNA或RNA
提高核酸分离的效率，特别是通过扩增方法，可大大有助于细菌鉴别的特异性。
下一步是培养细菌。在此，探针和待鉴别的核酸(如果待鉴定的微生物存在)构成杂交分子。杂交分子在一定的实验条件下形成。在允许核酸特异性杂交的特定条件下(pH，温度，离子浓度)用缓冲液洗涤的步骤同上。此时，特异性小的和不需要的杂交分子被洗脱掉了。
最后一步是检测杂交分子。对此有许多专业人员所熟知的方法。在这些方法中会用到染料，甚至可能是荧光染料。这些染料直接或间接地偶合或结合在探针或待鉴定的DNA上。在芯片技术或Lightcycler技术领域尤其如此。此外，还有一些物理学的方法，例如在界面上运用两个可适用于检测杂交分子的不同强度光波以增强光的总反射(attenuated total reflection)。
对鉴定的评估有很多方式。在只需判定“有或无”的情况下，只有在微生物存在时才可鉴别出杂交分子。若以上提到的微生物核酸的扩增反应并未导致核酸的增加，则检测不到杂交分子。若所不期望的核酸被扩增或已大量存在，这些核酸可通过杂交过程中的严格条件而被排除。此外，对杂交分子的定量分析，可通过确定一个阳性结果的阈值来精确确定鉴定结果的特异性。
---本专利中所有列出的核酸原则上均可作为探针。表3中特别列出了节选出的可能的探针。这些核酸用于鉴别表中列出的细菌属，并将它与真细菌的其它所有属区分开来。
下面举例说明，如何将此处的特异性DNA区域作为探针来鉴定微生物。在该例中使用ELISA方法。此时，可通过在微量滴定板上进行的酶联染色反应来鉴别核酸。
在下例中，DNA被首先通过PCR反应扩增。在此使用的是与Digoxygenin偶连的引物。然后，在一个涂有Streptavidin的微量滴定板内加入经生物素标记的探针，以使探针在微量滴定板的表面偶连。碱性变性的PCR扩增物与微量滴定板上的探针杂交30分钟。用5’-Digoxigenin标记的扩增物的末端作为抗原与过氧化物酶偶连的特异性抗体进行反应。在加入四甲基联苯胺后会出现蓝色。此蓝色反应可用0.5M的硫酸使其停止。同时，颜色由于ph值的变化会变为黄色。吸收光的强度可在波长450nm处用ELISA检测器进行测量。
在ELISA方法中使用下列试剂：
杂交缓冲液(2.5 x SSC)
2.5 x SSC 62.5ml 20 x SSC(见下文)
2 x Denhardts 20ml 50 x Denhardts(见下文)
10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038) 5ml 1MTris
1mMEDTA(Fluka，Nr.03699) 1ml 0.5M EDTA
加双蒸水至0.5升，并将pH值调为7.5。
清洗缓冲剂1
1 x SSC 50ml 20 x SSC(见下文)
2 x Denhardts 40ml 50 x Denhardts(见下文)
10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038) 10ml 1M Tris
1mM EDTA(Fluka，Nr.03699) 2ml 0，5M EDTA
加双蒸水至0，5升，并将pH值调为7，5。
清洗缓冲剂2
10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038) 12.15g
150mM NaCl(Merck，Nr.6404.5000) 8.78g
0.05％ Tween 20(Serva，Nr.37470) 0.50g
0.5％的阻断剂(Boehringer)5g在60℃的条件下溶于D1中，10μg/ml
Herring sperm，加入双蒸水至1升，并将pH值调为7.5。
变性缓冲剂
125mM NaOH(Fluka，Nr.71690) 0.500g
20mM EDTA(Fluka，Nr.03699) 0.745g
加双蒸水至0.1升。
偶合缓冲剂
10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038) 10ml 1M Tris
1mM EDTA(Fluka，Nr.03699) 2ml 0.5M EDTA
100mM NaCl(Merck，Nr.6404.5000) 5.88g
0.15％ Triton x 100(Chemikalienlager)15ml
加双蒸水至1升，并将ph值调为7.5。
终止试剂
95％ H2SO4 14ml
加双蒸水至0.5升。
50 x Denhardts
Ficoll 400(Pharmacia Biotech，Nr.17-0400-01) 5g
聚乙烯吡咯烷酮(Sigma，Nr.P-2307) 5g
牛血清蛋白 5g
加双蒸水至0.5升。
20 x SSC
NaCl(Merck，Nr.106404.1000) 350.36g
柠檬酸钠(二水化柠檬酸三钠，Fluka，Nr.71404) 176.29g
加双蒸水至2升，并将pH值调为7，0。
D1
100mM马来酸(Fluka，Nr.63190) 11.62g
150mM NaCl(Merck，Nr.106404.1000) 8.76g
NaOH(Fluka，Nr.71690) 约7.5g
加双蒸水至2升，并将pH值调为7.0。
ELISA方法的实施
在每孔中加入200μl结合缓冲液和1μl探针。用保鲜膜将微量滴定板封闭，在室温下放置两小时。将待检测的PCR扩增物在室温下解冻，按1:1的比例与变性缓冲液稀释并在室温下培养10分钟。将10μl试剂加入此前清空的孔中。然后，在每孔中再加入100μl的杂交缓冲液并在37-60℃的条件下培养30分钟。将孔清空清洗，然后用200μl预热至37-60℃的洗涤缓冲液1将其注满，并在同样温度下培养2分钟。将此洗涤步骤重复进行三次。
在仔细清除洗涤缓冲液后，将Anti-Dig-POD抗体(DAKO)按1:3000(1μl在3ml洗涤缓冲液)稀释并将100μl此试剂注满干的孔。将此板在37℃的恒温箱中培养30分钟。
然后，将微量滴定板用200μl清洗缓冲液2深度清洗三次。每孔加100μl BM blue(Boehringer)染料。15分钟后，用100μl 0.5M H2SO4使反应停止。在ELISA检测器中对此样品的消光进行定量。
在上述的方法中，可使用表4列出的探针鉴定所列举出的细菌种类。
示例5
本专利中DNA区域对细菌鉴定的普遍适用性
本专利中特指的核糖体DNA区域，特别是当其与23S-5S核糖体间隔区组合后，特别适于真细菌的鉴别。专业人员借助SEQ ID 1-530序列或在专注与上述核糖体DNA区域的情况下，可很快鉴别出其选择的细菌分类学菌株。下面示例展示本发明对所有真细菌种鉴别的普遍适用性。
这里所介绍的方法主要包括三步。第一步，扩增大约包括23S基因的330-430核苷酸、其后的转录间隔区和核糖体5S基因的核糖体区域。由于不同真细菌种的这一区域的长度不同，此区域大约包括400至约750个核苷酸的范围。若DNA序列不明，那么此法对于确定待鉴别的和其它一些待区分的亲缘关系近的菌种的DNA序列具有优势。由此序列比较分析，专业人员可轻易确定最佳的单聚核苷酸作为PCR引物或探针用于鉴别。在上例中，引物和探针都是以此方式选出的。此外，这里提及的序列也可直接用于多种细菌的鉴别，特别是在适当地选择PCR和/或杂交的严格条件的情况下。
A)核糖体DNA的扩增
所用的DNA片段由蛋白细菌和其它很多细菌种类的基因组DNA通过引物SEQ ID 211和212来扩增。若扩增其它细菌种类的DNA出现问题，则由与SEQ ID 211和212相应的DNA区域得出的引物也可用于进行扩增。
用标准方法从表5所列的细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
基因组DNA -1.00μl
水 -19.80μl
缓冲液(10x)*1 -2.50μl
dNTP(10mM)*2 -0.25μl
正向引物A(10μM)*3 -0.20μl
反向引物(10μM)*3 -0.20μl
MgCl2 -0.75μl
Taq聚合酶(5U/μl)*1 -0.30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司或其他供货商提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
起始变性 95℃ 5min
扩增(35个循环) 92℃ 1min
52℃ 1min
72℃ 30s
终合成 72℃ 5min
可用于扩增的基因组DNA见表5。
B)A)中产品的属种特异性扩增
A)中扩增得的DNA产品可直接用于鉴别细菌，尤其是在使用特异性探针的情况下。在应通过这一过程将鉴别的结果限制为较小的细菌的系统分类单位，如种、属、目时，对此序列的部分区域进行第一级扩增更为合适。扩增引物至少已经可以完成部分鉴别。A)中扩增的区域提供了很多具有特异性鉴别能力的亚区域。专业人员通过比较待鉴别的细菌和亲缘关系相近的细菌的序列，将会很容易识别出这些区域。
在本例中，23S-5S转录间隔区的首端和末端被选为特异性引物的区域。具体的序列及引物的来源见表5。通过对序列的比较可以看出，它们基本上都具有种特异性的鉴别能力。一个例外是弧细菌的引物。此引物也已经具有属特异性鉴别能力。尤其对肠道细菌而言，正向引物的序列CGAAG...TTTT和反向引物序列AACAGAATTT都是保守的。现在，有两种可能可将(如肠道细菌)引物的特异性扩展到属或属的群：一是将PCR的退火温度降低。二是将正向引物的序列朝23S基因方向和将反向引物的序列朝5S基因方向移动。其结果是出现序列种性变化较小的引物。具体操作可根据鉴别的要求相应变化。以下是用表5中的引物通过PCR扩增进行种特异性鉴别的示例。
用标准方法从表5所列的细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
基因组DNA -1.00μl
水 -19.80μl
缓冲液(10x)*1 -2.50μl
dNTP(10mM)*2 -0.25μl
正向引物A(10mM)*3 -0.20μl
反向引物(10mM)*3 -0.20μl
MgCl2 -0.75μl
Taq聚合酶(5U/ml)*1 -0.30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司或其他供货商提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：正向引物和反向引物见表5。引物的量应相同。若为混合引物，其引物的浓度均为10μM。反向引物具有表5中反向引物的互补序列。
PCR在Perkin Elmer9600热循环器中按如下说明进行：
起始变性 95℃ 5min
扩增(35个循环) 92℃ 1min
45-72℃ 1min
72℃ 30s
终合成 72℃ 5min
扩增的结果见表5，即用表5中的引物进行的细菌种特异性的鉴别，可确定其引物被排列在此表中的细菌。相反，使用其设计此前已提到的一般引物可确定所有肠道细菌的属或蛋白细菌γ-分支的所有属。
C)使用源于23S-5S核糖体转录间隔区的引物或探针
进行进一步区分
在经过A)和/或B)两步对分类学上较高菌株的DNA扩增后，可通过选择探针进行进一步的鉴别。可变性的DNA区域，例如23S-5S核糖体转录间隔区的中心区域可用于种特异性的鉴别。在此，探针可置入芯片中或用于Lightcycler技术或ELISA方法中。在后者中，可应用实例4中的ELISA方案。细菌种特异性鉴别的结果与23S-5S转录间隔区的选择有关，因为大部分23S-5S转录间隔区具有种特异性的序列范围。使用表5中的引物和相应的间隔区(表5中SEQ ID列)可鉴别此表中所列出的细菌种。
概念解释
DNA序列的衍推
为了发现和发展可用于分类学菌株鉴别的单聚或多聚核苷酸，可将其从一个或多个DNA序列中衍推出来。在多个序列的情况下进行序列比较就具有优势。所衍推出的单聚核苷酸可能与原序列相同。它也可能是一些可变性序列的共有区域。此时，多聚核苷酸由已分析序列上特定位置的最常见的或占优势的碱基选出。此外，也可以根据“核苷酸”的定义从一个待发展的序列中选出可变性序列。由此可变序列得出的DNA或RNA多聚物因此是一种分子混合物。它在所有可能的核苷酸可变序列的位置上显示出来。
类似的DNA序列
类似的DNA区域具有与给出的序列相同的功能或类似的位置，但却来源于不同的种系，例如与待比较的相同位置上的转录间隔区不具有相似性时的5S rDNA和23S rDNA之间的转录间隔区。这之所以可能，是因为其在远亲细菌中差异性巨大，以至于对其无法进行种演变的分类和同源性比较。然而，上述作为DNA序列的转录间隔区就其作为转录间隔区的功能或其位置而言是可明确定义的，因为其始于23S rDNA编码区域的末端，终于5S rDNA的起点。
相邻基因
相邻基因是指不为其它基因分割的或对大多数待检测的菌种而言两个确定的基因。分割是指另一个基因位于两个基因之间。
肠道细菌
肠道细菌是蛋白细菌γ分支的一个目。此概念包括了此目中的所有分类学单位，尤其包括以下的菌属：Alterococcus，Aquamonas，Aranicola，Arsenophonus，Brenneria，Budvicia，Cedecea，Calymmatobacterium，Citrobacter，Edwardsiella，Enterobacter，Erwinia，Escherichia，Ewingella，Hafnia，Klebsiella，Kluyvera，Koserella，Leclercia，Moellerella，Morganella，Pantoea，Phlomobacter，Photorhabdus，Plesiomonas，Proteus，Providencia，Rahnella，Salmonella，Serratia，Shigella，Wigglesworthia，Xenorhabdus，Yersinia，Yokenella。
真细菌
真细菌和古细菌共同构成原生动物门。此处，“细菌”和“真细菌”是同意语。真细菌指此门中的所有分类学单位。其包括die Aquificales，Aquificaceae，Desulfurobacterium-Gruppe，Chlamydiales，Verrumicrobia-Gruppe，Chlamydiaceae，Simkaniaceae，Waddliaceae，Verrumicrobia，Verrumicrobiales，Coprothermobacter-Gruppe，Cyanobacteria，Chroococcales，Nostocales，Oscillatoriales，Pleurocapsales，Prochlorophytes，Stigonematales，Cytophagales，Gruppe der grünen Schwefelbakterien，Bacteroidaceae，Cytophagaceae，Flavobacteriaceae，Flexibacter-Gruppe，Hymenobacter-Gruppe，Rhodothermus-Gruppe，Saprospira-Gruppe，Sphingobacteriaceae，Succinovibrionaceae，Grüne Schwefelbakterien，Fibrobacter，Acidobacterium-Gruppe，Fibrobacter-Gruppe，Firmicutes，Actinobacteria，Acidomicrobidae，Actinobacteridae，Coriobacteridae，Rubrobacteridae，Sphaerobacteridae，Bacillus-Gruppe，Clostridium-Gruppe，Lactobacillus-Gruppe，Streptococcus-Gruppe，Clostridiaceae，Haloanaerobiales，Heliobacterium-Gruppe，Mollicutes，Sporomusa-Zweig，Syntrophomonas-Gruppe，Thermoanaerobacter-Gruppe，Flexistipes-Gruppe，Fusobacteria，Grüne Nicht-Schwefelbakterien，Chloroflexaceae-Gruppe，Chloroflexaceae，photosynthetischeFlexibakterien，Holophaga-Gruppe，Nitrospira-Gruppe，Planctomycetales，Planctomycetaceae，Proteobacteria，Purpur-Nichtschwefelbakterien，Alpha-Unterabteilung der Proteobakterien，Beta-Unterabteilung der Proteobakterien，Gamma-Unterabteilung derProteobakterien，Delta/Epsilon-Unterabteilung der Proteobakterien，Spirochetales，Leptospiraceae，Spirochaetaceae，Synergistes-Gruppe，Thermodesulfobacterium-Gruppe，Thermotogales，Thermus-Gruppe oderDeinococcus-Gruppe.
基因
基因包括DNA的可读框或编码区。此区域只编码蛋白。顺反子也是一个基因，但它和其它顺反子一起位于一个mRNA上。调节基因转录的DNA区域，如启动子、终止子和增强子，同样属于基因。当本发明简化使用23S rDNA基因和5S rDNA基因时，其应与一般概念作相同理解。但根据我们的定义，23S rDNA基因或5S rDNA基因却不是基因，而是一个功能独立的DNA片段，因为它不编码一个蛋白，而且也不能被分成密码子。
转录间隔区
本发明中重点论述的转录间隔区位于23S r DNA基因编码区域和5S rDNA基因编码区之间。其在系统编排中占了一个特殊的位置。由于它经过转录，也就是说它是mRNA和生物学上不活跃的RNA前体的组成部分，所以不属于基因间的范围。此前体通过切除转录间隔区而被转化为核糖体意义上的、生物学上活跃的分子。另一方面，它在功能上或在种系发育上不能明确地归于23S基因或5S基因。因为基因概念在此明显不能用于进行分类，所以核糖体操纵子的“转录间隔区”与“基因”及“基因间区域”同等，是一个功能上独立的DNA-(RNA)级。
同源DNA序列
DNA或RNA序列只有在具有相同的种系发育上的来源时，它们才是同源的。这可以由一个DNA片段中至少40％的核苷酸是相同的这一现象而判断出。在一个较大的DNA片段中可能存在可变区域。此时，当种系发育的亲缘关系通过25个核苷酸长的序列的存在而表现出来就足够了。此25个核苷酸长的序列至少与一待比较的DNA的另一个25个核苷酸长的序列有60％是相同的。此外，通过与亲缘关系近的细菌进行比较，经常可很容易地识别出同源序列。为识别亲缘关系远的细菌的同源性，需与种的序列进行顺序上的比较。这些种在种系发育的意义上消除了亲缘关系远的细菌的差异
相同的DNA序列/相同性百份比
为确定DNA或RNA序列的相同性(若全部相同即为100％)，需观察一个较大的多聚核苷酸的部分序列。这些部分序列包括10个核苷酸。如果两个被比较序列的所有10个碱基都是相同的，这些部分序列就具有相同性。胸腺嘧啶和尿嘧啶是相同的。一个较大的多聚核苷酸的所有可能片段均可作为被观察的部分序列。
当两个被比较的序列在10个核苷酸中有9个相同，或在20个中有18个相同，即具有90％的相同性。
例如两个包括20个核苷酸并在第5个碱基不同的多聚核苷酸。在序列比较中可发现6个相同的10-er的核苷酸和5个只是在一个碱基上不同的10-er的核苷酸。
此外，相同性可通过将单位以百分比表示等级来逐级确定。为确定相同性的程度也可对部分序列进行观察，这些部分序列包括至少事实上被使用的序列(比如作为引物)的长度或20个核苷酸。
作为示例，将长度为100个核苷酸的A和长度为200个核苷酸的B进行比较。从多聚核苷酸B中可衍推出一长度为14个核苷酸的引物。为确定相同性的程度，将多聚核苷酸A和引物在它的整个长度上进行比较。若引物的序列在多聚核苷酸A中出现，但有一个碱基不同，即表示相同程度为13:14(即92.3％)。
在第二个示例中，将上述的多聚核苷酸A和B进行总体比较，此时，将所有比较窗口的长度设置为20个核苷酸并确定它们的相同程度。若多聚核苷酸A和B的50-69号核苷酸除了55号外完全相同，则此片段的相同程度为19:20(即95％)。
保守的和可变的引物
保守引物是指在保守的DNA或RNA区域杂交的核苷酸。保守这一概念描述了不同分类学菌株的核苷酸顺序在进化过程中的易变性。因此它是一个比较单位。由于用于比较的序列不同，一个区域和引物可能是保守的或可变的。借助就杂交目标而言相邻或重叠的、具有和引物相同长度的区域，可将引物定义为“保守的”和“可变的”。例如，在此可选择相同细菌的比较序列或其它细菌的同源的或类似的序列。在比较时，如一个序列与比较序列至少95％是相同的，则该序列是保守的；如两者的相同性小于95％，则该序列是可变的。
连锁引物
连锁引物尤其被用于Consensus-PCR。此处涉及扩增一已被扩增的多聚核苷酸的引物。连锁引物与一个已经扩增的DNA或RNA目标分子内的一个区域进行杂交。在此，与连锁引物的扩增可进行任意次，以使更小的扩增产品出现。
DNA或RNA的杂交
两个相同或相似的核苷酸片段可以相互杂交成为双链。此杂交不仅可发生在DNA、RNA或PNA单链之间，而且还可以在DNA与RNA、DNA与PNA以及RNA和PNA等等之间形成杂交分子。有许多因素影响到两个多聚核苷酸是否杂交。一种杂交可优先发生在37-60℃之间。另一种杂交可发生在严格的杂交和洗涤步骤下。确定特异性杂交条件的实验参数见例4。若使用的探针只与所希望的目标序列，而不与同样存在于样品中的其它DNA杂交，那么就是特异性杂交。
核酸利用的组合
引物、探针、DNA片段、多聚核苷酸的子区域或单聚核苷酸可用于多种组合。例如，引物群中的两种引物的任意组合、由序列群中任意选择一探针和由同样的序列群中选择引物。在后一种情况下，引物和探针可能相同，也可能不同。引物或探针也可由两个或多个DNA片段构成。在此，应将所有可能的构成形式考虑在内。组合也可能发生在使用各种引物和探针的PCR步骤中。
Consensus-PCR
Consensus-PCR用Consensus引物进行。Consensus引物可以扩增至少两个、在理想状况下甚至所有的分类学上单位的DNA。在下面的分析中将确定扩增的DNA的相同性。为此，需进行其它的PCR步骤。这些步骤可能通过使用可变的连锁引物区别出分类学上较小的单位。对分类学上单位的最终确定除了使用可变的引物外，也可通过特异性的探针完成。
核苷酸
核苷酸是DNA或RNA的碱基。在此适用下列缩写：
G＝Guanosine，A＝Adenosine，T＝Thymidine，C＝Cytidine，R＝G oder A，Y＝C oder T，K＝G oder T，W＝A oder T，S＝C oder G，M＝A oder C，B＝C，G oder T，D＝A，G oder T，H＝A，C oder T，V＝A，C oder G，N＝A，C，G oderT，I＝Inosine.
分类学上的单位
细菌分类学上的单位指所有已知的分类学上的划分，例如门、纲、目、科、属、种、诸如亚纲、亚目、亚科等的分类学划分的亚单位或分类学单位的集合。
发明的具体描述
本发明主要包括5个部分。这5个部分反映了本发明的一般性和特殊性。
使用相邻基因时DNA目标区域的选择
本发明使用相邻基因的部分以鉴别细菌分类学上单位，如门、纲、目、科、属、种及其亚单位。其优点在于可发现一些DNA区域。这些区域在可变性方面介于两个基因之间。该优点可在核糖体操纵子，尤其是23S/5S rDNA片段上显现出来。通过很保守的和次保守的区域的存在，专业人员可以鉴别所有可能的亲缘关系近的和远的细菌菌株。
使用23S r DNA末端、转录间隔区和部分5S rDNA的核糖体DNA区域鉴别所有细菌的说明
为鉴别细菌，尤其可以使用大约包括400750个核苷酸的23S rDNA区域。后一个区域由大约330—430个23S r DNA末端的核苷酸、转录间隔区和部分5S rDNA基因构成。在具体情况下，一t-RNA基因被插入间隔区一同用于鉴别。因此，上述的区域相对于SEQ ID 1的2571—3112核苷酸。SEQ ID 1即大肠埃希氏菌的23S和5S rDNA基因。通过专业人员熟悉的序列比较，可确定同源的片段和其它细菌与其相应的片段。尤其对于相同科、目或亚纲的成员而言，上述起于23S rDNA基因终点的区域的起端和5S rDNA基因的末端，可通过对种A和B的核糖体DNA区域进行比较而轻易确定。若种A和与其关系较远的种C不易于比较的话，则可通过比较种系关系较近的种B和种C的序列得到所需的结果。通过一系列独立的序列比较，可由此确定与上述区域相应的所有真细菌的23S r DNA、转录间隔区和5SrDNA同源的核糖体区域。基于单个亚区域的可变性，在此完全可能出现多达几百个核苷酸的长度差异。此外，本发明还可使用上述区域的亚区域。这些区域的大部分见表6。
准备用于多种细菌的引物和探针
除了可适用的rDNA序列的一般描述外，也准备好可用于鉴别细菌的序列(SEQ ID 1-530)。在此，根据任务的不同，可能会使用SEQID 1-530中选出的全部多聚核苷酸或其中的一部。此时，SEQ ID 1-530中特异的序列来源于此前描述的23S rDNA基因、转录间隔区和5SrDNA基因的区域。
在技术实施过程中，细菌的鉴别可借助于此处选出的DNA区域和序列，通过探针和/或引物来完成。引物是用作扩增起始分子的核苷酸。在此，它们聚集在目标序列上，并借助聚合酶被重新合成。其特异性通过引物与目标序列的相同程度来调节。分类学的特异性可以通过从此处描述的核糖体区域中选出目标序列而决定(也见表6)。与此相应，引物可以各种形式使用：如可将整个区域根据图2扩增，或用SEQ ID 211和212的引物与SEQ ID 1(大肠埃希氏细菌)的2571-3112核苷酸进行同源扩增。为了完善扩增，也可使用两种以上引物构成的混合物。此外，也可通过引物只扩增特定细菌的DNA。此时，它们传递了两个信息：其一，它们表明了细菌的存在；其二，当扩增是阳性的情况下，它们表明待检细菌的种类。通过使用连锁引物的有序的扩增步骤，可在DNA合成物终止时根据需要调节所需的信息量。
在一个单独的步骤中，可将DNA与探针结合、浓缩和鉴别。对此DNA最好先进行预扩增。探针是可与单链DNA片段结合的单聚或多聚核苷酸。探针与目标序列的亲合性由其与目标序列的相同程度决定。此外，杂交条件也具有显著的影响，也就是说，缓冲液的盐浓度和培育的时间与温度必须调节得恰到好处。专业人士可用常用的方法迅速调节这些参数。示范性的杂交条件在示例中已给出。探针可以完全象引物一样有两方面的作用：一是可以显示细菌DNA或扩增产物的存在；二是可以检测特定细菌的DNA.。它们功能的二元性也与引物相同。因此，在鉴定微生物时可以在引物和探针之间进行分工合作。此外，探针可象引物一样来源于23S r DNA的末端区域、转录间隔区和5S rDNA三者的自由选择区域或全部的区域。
本发明的一个特别的优点在于，根据图2所选出的核糖体区域由非常可变和非常保守的、范围宽泛的区域异源构成。因为亚区域的使用如表6所示有很多组合，本发明为所有的细菌序列和分类学单位提供了鉴别的可能性。
鉴别肠道细菌目及其组成菌株
诸如肠道细菌科的细菌可借助于本发明中所描述的DNA目标区域进行鉴别(示例1)。肠道细菌是蛋白细菌(Proteobacteria)或紫细菌(Purpurbacteria)的γ分支的相同的分类学单位。该类细菌非常重要，因为它们包括很多致病菌，如大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌和耶尔森氏菌。它们适于作为检测食品卫生状况的标识细菌。在临床微生物学中，鉴别肠道细菌是界定致病体的第一步。在本发明所列出的引物中，如SEQ ID 2-25引物的各种组合适于鉴别肠道细菌科。此外，很多本发明所列出的序列可用于鉴别肠道细菌的菌株，如属、种。其它的序列也可用于鉴别硬细菌和蛋白细菌的其它分类学单位，特别是其全部的γ分支。图2中对核糖体区域的描述表明了专业人员如何轻易获得其它用于鉴别真细菌的序列的另一种方法。
使用Consensus-PCR鉴别所有的细菌
本发明的一个特别优点，正如图2所描述的那样，在于DNA目标区域的理想的鉴别方法是Consensus-PCR。本方法实验应用的一个主要前提是待扩增的目标区域内的序列的可变性递增。这一要求在我们所描述的核糖体操纵子的区域内，对于所有需鉴别的种类而言都得到了满足。
Consensus-PCR的图示详见图8。通常情况下，首先扩增“主片段”。此片段可等同于图2所表示的所有片段，或仅是其一部分。若在样品中存在各种需鉴别的菌体，则对所有的菌体都扩增此片段。最后，单个菌体用特异性的探针和/或另外的PCR步骤组合来鉴别。用探针进行的鉴别可小型化从而在芯片上进行。另外也可用传统ELISA的方法进行鉴别。细菌鉴别的配方可制成试剂盒。
荧光染色剂特别适用于鉴别，它可被偶合在引物或探针上。然而，在ELISA或DNA印迹法中，却经常使用非荧光染料。另一种检测的方法是Genetrak和Lightcycler技术。原则上，所有的这些方法均可用于定量鉴别。通过最后分析检测信号，可确定样品中存在的细菌数目。
用本发明所述方法鉴别细菌，可用专业人员所熟知的方法进行。例如可首先在适合的培养液中扩增细菌。在涉及食品的样品鉴定中可优先使用物理的分离方法，如离心沉淀。而且，也可通过特殊的扩增方法反推出样品中最初的细菌数。此外，可进行细菌数的阈值确定。总之，此时均可对细菌鉴别进行定量或半定量。
为了分离基因组DNA，须将扩增的细菌裂解。物理的(玻璃珠或加热)和化学的(NaOH)影响常常是以专业人员所熟知的细胞裂解方法为基础的。然而，也可将细菌直接用于检测DNA的PCR方法中。此外，纯化基因组DNA，特别是当它存在于食品母体中时，此法更具优势。这种方法也为专业人员熟知。所需的DNA纯化试剂盒可在市场上购得。
表1.肠道细菌的区分与鉴定(例1)
| 序号. | 种 | 菌株 | 鉴定结果 |
| 1 | Budvicia aquatilis | DSM 5025 | + |
| 2 | Buttiauxella agrestis | DSM 4586 | + |
| 3 | Cedecea davisae | DSM 4568 | + |
| 4 | Citrobacter koser | DSM 4595 | + |
| 5 | Erwinia carotovora | DSM 30168 | + |
| 6 | Erwinia chrysanthemi | DSM 4610 | + |
| 7 | Ewingella americana | DSM 4580 | + |
| 8 | Enterobacter agglomerans | B-5081-i | + |
| 39 | Enterobacter aerogenes | DSM 30053 | + |
| 10 | Enterobacter sakazakii | DSM 4485 | + |
| 11 | Enterobacter intermedius | DSM 4581 | + |
| 12 | Enterobacter cloacae | DSM 30054 | + |
| 13 | E.coli | BC 7883 | + |
| 14 | E.coli | H123 | + |
| 15 | E.coli | BC 7884 | + |
| 16 | E.coli | BC 7885 | + |
| 17 | E.hermanii | B-4943a | + |
| 18 | E.coli | ATCC 8739 | + |
| 19 | Hafnia alvei | DSM 30163 | + |
| 20 | Klebsiella pneumoniae | ATCC 13883 | + |
| 21 | Klebsiella pneumoniae | DSM 2026 | + |
| 22 | Klebsiella planticola | DSM 4617 | + |
| 23 | Klebsiella oxytoca | DSM 5175 | + |
| 24 | Kluyvera cryocrescens | DSM 4583 | + |
| 25 | Morganella morganii | DSM 30164 | + |
| 26 | Plesiomonas shigelloides | DSM 8224 | + |
| 27 | Pantoea ssp. | B-5200 | + |
| 28 | Pantoea dispersa | DSM 30073 | + |
| 29 | Proteus rettgeri | DSM 1131 | + |
| 30 | Proteus rettgeri | ATCC 14505 | + |
| 31 | Providencia stuartii | DSM 4539 | + |
| 32 | Rahnella aquatilis | DSM 4594 | + |
| 33 | Rahnella aquatilis | DSM 4594 | + |
| 34 | Serratia proteamaculans | DSM 4487 | + |
| 35 | Serratia ficaria | DSM 4509 | + |
表1.肠道细菌的区分与鉴定(例1)-续-
| 序号. | 种 | 菌株 | 鉴定结果 |
| 36 | Serratia plymutica | DSM 49 | + |
| 37 | Serratia rubidea | DSM 4480 | + |
| 38 | Serratia marcescens | DSM 1636 | + |
| 39 | Salmonella bongori | DSM 7952 | + |
| 40 | Yersinia pseudotuberculosis | DSM 8992 | + |
| 41 | Yersinia pseudotuberculosis | DSM 8992 | + |
| 42 | Yersinia enterolytica | DSM 4790 | + |
| 43 | Acinetobacter calcoaceticus | DSM 590 | - |
| 44 | Aeromonas hydrophila | DSM 6173 | - |
| 45 | Aeromonas enteropelogenes | DSM 6394 | - |
| 46 | Fransilla tularensis Isolat | F16 | - |
| 47 | Franzisella philomiragia | DSM 7535 | - |
| 48 | Moraxella catarrhalis | DSM 9143 | - |
| 49 | Pasteurella pneumotropica | B-2397 A 13 | - |
| 50 | Pseudomonas beyjerinkii | DSM 7218 | - |
| 51 | Vibrio fischeri | DSM 507 | - |
| 52 | Vibrio alginolyticus | DSM 2171 | - |
| 53 | Vibrio proteolyticus | DSM 30189 | - |
| 54 | Vibrio paramaemolytiucs | DSM 10027 | - |
| 55 | Vibrio harveyi | DSM 6104 | - |
| 56 | Xanthomonas maltophila | BC 4273 | - |
| 57 | Achromobacter xylosa | DSM 2402 | - |
| 58 | Alcaligenes spp | DSM 2625 | - |
| 59 | Alcaligenes latus | DSM 1122 | - |
| 60 | Brucella neotomae | ATCC 25840 | - |
| 61 | Brucella ovis | ATCC 23459 | - |
| 62 | Enterococcus casseliflavus | DSM 20680 | - |
| 63 | Flavobacterium sp. | ATCC 27551 | - |
| 64 | Flavobacterium resinovorum | DSM 7438 | - |
| 65 | Flavobacterium johnsonii | DSM 2064 | - |
| 66 | Flavobacterium flavense | DSM 1076 | - |
| 67 | Lactobacillus bifermentans | BC 8463 | - |
| 68 | Pseudomonas paucimobilis | DSM 1098 | - |
| 69 | Pseudomonas cepacia | DSM 3134 | - |
| 70 | Sphingobacterium multivorans | DSM 6175 | - |
表2.Pantoea dispersa细菌的区别鉴定(例.2)
| 序号. | 种 | 鉴定结果 |
| 1 | Pantoea dispersa | + |
| 2 | Budvicia aquatica | - |
| 3 | Buttiauxella agrestis | - |
| 4 | Enterobacter agglomerans | - |
| 5 | Erwinia carotovora | - |
| 6 | Erwinia crysanthemi | - |
| 7 | Escherichia coli | - |
| 8 | Escherichia vulneris | - |
| 9 | Escherichia hermannii | - |
| 10 | Hafnia alvei | - |
| 11 | Klebsiella oxytoca | - |
| 12 | Kluyvera cryoescens | - |
| 13 | Morganella morganii | - |
| 14 | Proteus mirabilis | - |
| 15 | Proteus rettgeri | - |
| 16 | Proteus stuartii | - |
| 17 | Providencia stuartii | - |
| 18 | Rahnella aquatilis | - |
| 19 | Serratia ficaria | - |
| 20 | Serratiafonticola | - |
| 21 | Serratia marcescens | - |
| 22 | Serratia plymuthica | - |
| 23 | Serratia proteamaculans | - |
| 24 | Serratia rubidea | - |
| 25 | Yersinia enterolytica | - |
| 26 | Yersinia peudotuberculosis | - |
| 27 | Acinetobacter calcoaceticus | - |
| 28 | Aeromonas enteropelogenes | - |
| 29 | Aeromonas hydrophila | - |
| 30 | Cedecea davisae | - |
| 31 | Haemophilus influenzae | - |
| 32 | Moraxella catarrhalis | - |
表2.Pantoea dispersa细菌的区别鉴定(例.2)
-续-
| 序号. | 种 | 鉴定结果 |
| 33 | Pasteurella pneumotropica | - |
| 34 | Stenotrophomonas multophila | - |
| 35 | Vibrio alginolyticus | - |
| 36 | Vibrio fisheri | - |
| 37 | Vibrio harveyi | - |
| 38 | Vibrio parahaemolyticus | - |
| 39 | Alcaligenes sp. | - |
| 40 | Bacillus subtilis | - |
| 41 | Brucella abortus | - |
| 42 | Brucella ovis | - |
| 43 | Flavobacterium resinovorum | - |
| 44 | Pseudomonas paucimobilis | - |
| 45 | Pseudomonas cepacia | - |
| 46 | Ralstonia pickettii | - |
| 47 | Sphingobacterium multivorum | - |
| 48 | Sphingomonas paucimobilis | - |
| 49 | Streptococcus faecalis | - |
表3：用探针GTTCCGAGATTGGTT鉴定多个菌属
| 序号. | 种 | 鉴定结果 |
| 1 | Rahnella aquatilis | + |
| 2 | Serratia ficaria | + |
| 3 | Serratia fonticola | + |
| 4 | Serratia marcescens | + |
| 5 | Serratia plymuthica | + |
| 6 | Serratia proteamaculans | + |
| 7 | Serratia rubidea | + |
| 8 | Yersinia enterolytica | + |
| 9 | Yersinia peudotuberculosis | + |
| 10 | Budvicia aquatica | - |
| 11 | Buttiauxella agrestis | - |
| 12 | Enterobacter agglomerans | - |
| 13 | Erwinia carotovora | - |
| 14 | Erwinia crysanthemi | - |
| 15 | Escherichia coli | - |
| 16 | Escherichia vulneris | - |
| 17 | Escherichia hermannii | - |
| 18 | Hafnia alvei | - |
| 19 | Klebsiella oxytoca | - |
| 20 | Kluyvera cryoescens | - |
| 21 | Morganella morganii | - |
| 22 | Pantoea dispersa | - |
| 23 | Proteus mirabilis | - |
| 24 | Proteus rettgeri | - |
| 25 | Proteus stuartii | - |
| 26 | Providencia stuartii | - |
| 27 | Acinetobacter calcoaceticus | - |
| 28 | Aeromonas enteropelogenes | - |
| 29 | Aeromonas hydrophila | - |
表3：用探针GTTCCGAGATTGGTT鉴定多个菌属
-续-
| 序号. | 种 | 鉴定结果 |
| 30 | Cedecea davisae | - |
| 31 | Haemophilus influenzae | - |
| 32 | Moraxella catarrhalis | - |
| 33 | Pasteurella pneumotropica | - |
| 34 | Stenotrophomonas multophila | - |
| 35 | Vibrio alginolyticus | - |
| 36 | Vibrio fisheri | - |
| 37 | Vibrio harveyi | - |
| 38 | Vibrio parahaemolyticus | - |
| 39 | Alcaligenes sp. | - |
| 40 | Bacillus subtilis | - |
| 41 | Brucella abortus | - |
| 42 | Brucella ovis | - |
| 43 | Flavobacterium resinovorum | - |
| 44 | Pseudomonas paucimobilis | - |
| 45 | Pseudomonas cepacia | - |
| 46 | Ralstonia pickettii | - |
| 47 | Sphingobacterium multivorum | - |
| 48 | Sphingomonas paucimobilis | - |
| 49 | Streptococcus faecalis | - |
表4：用于鉴别细菌属和种的特异性探针
| 序号. | 探针SEQ ID | 鉴定属/种 |
| 1 | 96 | Budvicia aquatica |
| 2 | 97 | Buttiauxella agrestis |
| 3 | 98 | Enterobacter agglomerans |
| 4 | 99 | Erwinia carotovora |
| 5 | 100 | Erwinia chrysanthemi |
| 6 | 101 | Escherichia coli |
| 7 | 102 | Escherichia hermannii |
| 8 | 103 | Escherichiavulneris |
| 9 | 104 | Hafnia alvei |
| 10 | 105 | Klebsiella oxytoca |
| 11 | 106 | Kluyvera cryoescens |
| 12 | 107 | Morganella morganii |
| 13 | 108，109 | Pantoea |
| 14 | 110 | Proteus mirabilis |
| 15 | 111 | Proteus rettgeri |
| 16 | 112 | Providencia stuartii |
| 17 | 113 | Rahnella aquatilis |
| 18 | 114 | Serratia ficaria |
| 19 | 115 | Serratia fonticola |
| 20 | 116 | Serratia marcescens |
| 21 | 117 | Serratia plymuthica |
| 22 | 118 | Serratia proteamaculans |
| 23 | 119 | Serratia rubidea |
| 24 | 120 | Yersinia enterolytica |
| 25 | 121 | Yersinia pseudotuberculosis |
| 26 | 122 | Acinetobacter calcoaceticus |
| 27 | 123 | Aeromonas enteropelogenes |
| 28 | 124 | Aeromonas hydrophila |
| 29 | 125 | Cedecea davisae |
| 30 | 126 | Haemophilus influenzae |
| 31 | 127 | Moraxella catharralis |
| 32 | 128 | Pasteurella pneumotropica |
| 33 | 129 | Stenotrophomonas multophila |
表4：用于鉴别细菌属和种的特异性探针
-续1/2-
| 序号. | 探针SEQ ID | 鉴定属/种 |
| 34 | 130 | Vibrio alginolyticus |
| 35 | 131 | Vibrio fisheri |
| 36 | 132 | Vibrio harveyi |
| 37 | 133 | Vibrio parahaemolyticus |
| 38 | 134 | Vibrio proteolyticus |
| 39 | 432 | Salmonella typhi |
| 40 | 433 | Buchnera aphidocola |
| 41 | 434 | Pseudomonas stutzeri |
| 42 | 435 | Thiobacillus ferrooxidans |
| 43 | 436 | Agrobacterium vitis |
| 44 | 437 | Adalia bipunctata |
| 45 | 438 | Amycocalatopsis orientalis |
| 46 | 439 | Brucella |
| 47 | 440 | Bradyrhyzobium japonicum |
| 48 | 441 | Pseudomonas paucimobilis |
| 49 | 442 | Rhodobacter sphaeroides |
| 50 | 443 | Rickettsia prowazekii |
| 51 | 444 | Pseudomonas cepacia |
| 52 | 445 | Ralstonia pickettii |
| 53 | 446 | Campylobacter jejuni |
| 54 | 447 | Helicobacter pylori |
| 55 | 448 | Actinoplanes utahensis |
| 56 | 449 | Bacillus halodurans |
| 57 | 450 | Bacillus subtilis |
| 58 | 451 | Clostridium tyrobutyricum |
| 59 | 452 | Frankia |
| 60 | 453 | Microbispora bispora |
| 61 | 454 | Mycobacterium leprae |
| 62 | 455 | Mycobacterium smegmatis |
| 63 | 456 | Mycobacterium tuberculosis |
| 64 | 457 | Mycoplasma gallisepticum |
表4：用于鉴别细菌属和种的特异性探针
-续2/2-
| 序号. | 探针SEQID | 鉴定属/种 |
| 65 | 458 | Propionibacterium freudenreichii |
| 66 | 459 | Rhodococcus erythropolis |
| 67 | 460 | Rhodococcus fascians |
| 68 | 461 | Staphylococcus aureus |
| 69 | 462 | Streptococcus faeecalis |
| 70 | 463 | Streptomyces ambifaciens |
| 71 | 464 | Streptomyces galbus |
| 72 | 465 | Streptomyces griseus |
| 73 | 466 | Streptomyces lividans |
| 74 | 467 | Streptomyces mashuensis |
| 75 | 468 | Flavobacterium resinovorum |
| 76 | 469 | Sphingobacterium multivorans |
| 77 | 470 | Synechococcus |
| 78 | 471 | Synechocystis |
| 79 | 472 | Borrelia burgdorferi |
| 80 | 473 | Chlamydia trachomatis |
| 81 | 474 | Azotobacter vinelandii |
| 82 | 475 | Cowdria ruminantium |
| 83 | 476 | Mycobacterium intracellulare |
| 84 | 477 | Mycobacterium lufu |
| 85 | 478 | Mycobacterium simiae |
| 86 | 479 | Mycobacterium smegmatis |
| 87 | 480 | Saccharomonospora azurca |
| 88 | 481 | Saccharomonospora caesia |
| 89 | 482 | Saccharomonospora cyanea |
| 90 | 483 | Saccharomonospora glauca |
| 91 | 484 | Saccharomonospora viridis |
| 92 | 485 | Wolbachia pipientis |
| 93 | 525 | Sphingomonas paucimobilis |
| 94 | 526 | Zymomonas mobilis |
| 95 | 527 | Alcaligenes |
| 96 | 528 | Borrelia burgdorferi |
| 97 | 529 | Xanthomonas campestris |
| 98 | 530 | Cowduria ruminantium |
序列表
<110>BioteCon Diagnostics GmbH
<120>用于检测细菌群和细菌种系发育中单位的核酸分子
<130>PCT1217-066
<140>1
<141>1999-08-15
<160>530
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>3118
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>2
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>3
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>4
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>5
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>6
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>7
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>8
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>9
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>10
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>11
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>12
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>13
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>14
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>15
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>16
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<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>18
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<212>DNA
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<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>19
<210>20
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<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>20
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<210>23
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<212>DNA
<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<212>DNA
<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<211>18
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由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出
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由肠道细菌属Vibrio种衍推出
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<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<212>DNA
<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出
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<223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出
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<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：
由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出
<400>40
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<211>42
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：
由肠道细菌属Vibrio种衍推出
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<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出
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<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出
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<212>DNA
<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出
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<212>DNA
<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出
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<212>DNA
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<223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出
<400>47
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<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：
由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出
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<212>DNA
<213>Vibrio alginolyticus
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<212>DNA
<213>Vibrio fisheri
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<213>Vibrio parahaemolyticus
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<213>Vibrio proteolyticus
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<212>DNA
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<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
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<210>55
<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出
<400>55
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<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出
<400>56
<210>57
<211>31
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出
<400>57
<210>58
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出
<400>58
<210>59
<211>31
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出
<400>59
<210>60
<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：
由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出
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<211>32
<212>DNA
<213>Vibrio alginolyticus
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<212>DNA
<213>Vibrio fisheri
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<212>DNA
<213>Vibrio harbeyi
<400>63
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<211>33
<212>DNA
<213>Vibrio parahaemolyticus
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<210>65
<211>33
<212>DNA
<213>Vibrio proteolyticus
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<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>66
<210>67
<211>40
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出
<400>67
<210>68
<211>40
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出
<400>68
<210>69
<211>40
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出
<400>69
<210>70
<211>40
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出
<400>70
<210>71
<211>47
<212>DNA
<213>Pasteurella pneumotropica
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<210>72
<211>40
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：
由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出
<400>72
<210>73
<211>40
<212>DNA
<213>Vibrio alginolyticus
<400>73
<210>74
<211>40
<212>DNA
<213>Vibrio fisheri
<400>74
<210>75
<211>40
<212>DNA
<213>Vibrio harveyi
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<211>40
<212>DNA
<213>Vibrio paramaemolyticus
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<211>40
<212>DNA
<213>Vibrio proteolyticus
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<210>78
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>78
<210>79
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出
<400>79
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<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出
<400>80
<210>81
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出
<400>81
<210>82
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出
<400>82
<210>83
<211>33
<212>DNA
<213>Pasteurella pneumotropica
<400>83
<210>84
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Stenotrophomonas细菌属衍推出
<400>84
<210>85
<211>27
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>85
<210>86
<211>27
<212>DNA
<213>Acinetobacter calcoaceticus
<400>86
<210>87
<211>27
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出
<400>87
<210>88
<211>27
<212>DNA
<213>Haemophilus influenzae
<400>88
<210>89
<211>27
<212>DNA
<213>Moraxella catarrhalis
<400>89
<210>90
<211>27
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：
由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出
<400>90
<210>91
<211>27
<212>DNA
<213>Vibrio alginolyticus
<400>91
<210>92
<211>27
<212>DNA
<213>Vibrio fisheri
<400>92
<210>93
<211>27
<212>DNA
<213>Vibrio harveyi
<400>93
<210>94
<211>27
<212>DNA
<213>Vibrio paramaemolyticus
<400>94
<210>95
<211>36
<212>DNA
<213>Vibrio proteolyticus
<400>95
<210>96
<211>118
<212>DNA
<213>Budvicia aquatica
<400>96
<210>97
<211>111
<212>DNA
<213>Buttiauxella agrestis
<400>97
<210>98
<211>193
<212>DNA
<213>Enterobacter aglomerans
<400>98
<210>99
<211>123
<212>DNA
<213>Erwinia carotovora
<400>99
<210>100
<211>101
<212>DNA
<213>Erwinia chrysanthemi
<400>100
<210>101
<211>92
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>101
<210>102
<211>104
<212>DNA
<213>Escherichia hermannii
<400>102
<210>103
<211>92
<212>DNA
<213>Escherichia vulneris
<400>103
<210>104
<211>119
<212>DNA
<213>Hafnia alvei
<400>104
<210>105
<211>195
<212>DNA
<213>Klebsiella oxytoca
<400>105
<210>106
<211>90
<212>DNA
<213>Kluyvera cryoescens
<400>106
<210>107
<211>105
<212>DNA
<213>Morganella morganii
<400>107
<210>108
<211>192
<212>DNA
<213>Pantoea dispersa
<400>108
<210>109
<211>190
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Pantoea细菌属衍推出
<400>109
<210>110
<211>111
<212>DNA
<213>Proteus mirabilis
<400>110
<210>111
<211>139
<212>DNA
<213>Proteusrettgeri
<400>111
<210>112
<211>137
<212>DNA
<213>Providencia stuartii
<400>112
<210>113
<211>135
<212>DNA
<213>Rahnella aquatilis
<400>113
<210>114
<211>100
<212>DNA
<213>Serratia ficaria
<400>114
<210>115
<211>106
<212>DNA
<213>Serratia fonticola
<400>115
<210>116
<211>97
<212>DNA
<213>Serratia marcescens
<400>116
<210>117
<211>99
<212>DNA
<213>Serratia plymuthica
<400>117
<210>118
<211>100
<212>DNA
<213>Serratia proteamaculans
<400>118
<210>119
<211>101
<212>DNA
<213>Serratia rubidea
<400>119
<210>120
<211>116
<212>DNA
<213>Yersinia enterolytica
<400>120
<210>121
<211>104
<212>DNA
<213>Yersinia pseudotuberculosis
<400>121
<210>122
<211>179
<212>DNA
<213>Acinetobacter calcoaceticus
<400>122
<210>123
<211>118
<212>DNA
<213>Aeromonas enteropelogenes
<400>123
<210>124
<211>81
<212>DNA
<213>Aeromonas hydrophila
<400>124
<210>125
<211>96
<212>DNA
<213>Cedecea davisae
<400>125
<210>126
<211>217
<212>DNA
<213>Haemophilus influenzae
<400>126
<210>127
<211>90
<212>DNA
<213>Moraxella catarrhalis
<400>127
<210>128
<211>134
<212>DNA
<213>Pasteurella pneumotropica
<400>128
<210>129
<211>141
<212>DNA
<213>Stenotrophomonas multophila
<400>129
<210>130
<211>100
<212>DNA
<213>Vibrio alginolyticus
<400>130
<210>131
<211>122
<212>DNA
<213>Vibrio fisheri
<400>131
<210>132
<211>122
<212>DNA
<213>Vibrio harveyi
<400>132
<210>133
<211>89
<212>DNA
<213>Vibrio paramaemolyticus
<400>133
<210>134
<211>169
<212>DNA
<213>Vibrio proteolyticus
<400>134
<210>135
<211>33
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出
<400>135
<210>136
<211>33
<212>DNA
<213>Buttiauxella agrestis
<400>136
<210>137
<211>33
<212>DNA
<213>Enterobacter agglomerans
<400>137
<210>138
<211>33
<212>DNA
<213>Erwinia carotovora
<400>138
<210>139
<211>33
<212>DNA
<213>Erwinia chrysanthemi
<400>139
<210>140
<211>33
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>140
<210>141
<211>33
<212>DNA
<213>Escherichia hermannii
<400>141
<210>142
<211>33
<212>DNA
<213>Escherichia vulneris
<400>142
<210>143
<211>33
<212>DNA
<213>Hafnia alvei
<400>143
<210>144
<211>32
<212>DNA
<213>Klebsiella oxytoca
<400>144
<210>145
<211>33
<212>DNA
<213>Kluyvera cryoescens
<400>145
<210>146
<211>33
<212>DNA
<213>Morganella morganii
<400>146
<210>147
<211>31
<212>DNA
<213>Pantoea dispersa
<400>147
<210>148
<211>33
<212>DNA
<213>Proteus mirabilis
<400>148
<210>149
<211>33
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Proteus，Providencia细菌属衍推出
<400>149
<210>150
<211>33
<212>DNA
<213>Rahnella aquatilis
<400>150
<210>151
<211>33
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Serratia细菌属衍推出
<400>151
<210>152
<211>33
<212>DNA
<213>Yersinia enterolytica
<400>152
<210>153
<211>33
<212>DNA
<213>Yersinia pseudotuberculosis
<400>153
<210>154
<211>51
<212>DNA
<213>Acinetobacter calcoaceticus
<400>154
<210>155
<211>33
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出
<400>155
<210>156
<211>51
<212>DNA
<213>Haemophilus influenzae
<400>156
<210>157
<211>54
<212>DNA
<213>Moraxella catarrhalis
<400>157
<210>158
<211>43
<212>DNA
<213>Pasteurella pneumotropica
<400>158
<210>159
<211>54
<212>DNA
<213>Stenotrophomonas multophila
<400>159
<210>160
<211>33
<212>DNA
<213>Vibrio alginolyticus
<400>160
<210>161
<211>51
<212>DNA
<213>Vibrio fisheri
<400>161
<210>162
<211>45
<212>DNA
<213>Vibrio harveyi
<400>162
<210>163
<211>33
<212>DNA
<213>Vibrio proteolyticus
<400>163
<210>164
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Rahnella，Serratia，
Yersinia细菌属衍推出
<400>164
<210>165
<211>21
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<221>修饰碱基
<222>(14)...(16)
<223>a is inosine
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属，Escherichia，
Klebsiella，Pantoea衍推出
<400>165
<210>166
<211>32
<212>DNA
<213>Budvicia aquatica
<400>166
<210>167
<211>32
<212>DNA
<213>Buttiauxella agrestis
<400>167
<210>168
<211>32
<212>DNA
<213>Enterobacter agglomerans
<400>168
<210>169
<211>32
<212>DNA
<213>Erwinia carotovora
<400>169
<210>170
<211>32
<212>DNA
<213>Erwinia chrysanthemi
<400>170
<210>171
<211>29
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>171
<210>172
<211>32
<212>DNA
<213>Escherichia hermannii
<400>172
<210>173
<211>32
<212>DNA
<213>Escherichia vulneris
<400>173
<210>174
<211>32
<212>DNA
<213>Hafnia alvei
<400>174
<210>175
<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Klebsiella，Kuyvera细菌属衍推出
<400>175
<210>176
<211>32
<212>DNA
<213>Morganella morganii
<400>176
<210>177
<211>32
<212>DNA
<213>Pantoea dispersa
<400>177
<210>178
<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Pantoea细菌属衍推出
<400>178
<210>179
<211>32
<212>DNA
<213>Proteus mirabilis
<400>179
<210>180
<211>32
<212>DNA
<213>Proteus rettgeri
<400>180
<210>181
<211>32
<212>DNA
<213>Providencia stuartii
<400>181
<210>182
<211>32
<212>DNA
<213>Rahnella aquatilis
<400>182
<210>183
<211>32
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Serratia细菌属衍推出
<400>183
<210>184
<211>32
<212>DNA
<213>Yersinia enterolytica
<400>184
<210>185
<211>32
<212>DNA
<213>Yersinia pseudotuberculosis
<400>185
<210>186
<211>32
<212>DNA
<213>Cedecea davisae
<400>186
<210>187
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Buttiauxella，Escherichia，
Klebsiella，Kluyvera，Pantoea细菌属衍推出
<400>187
<210>188
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由肠道细菌属和Pantoea细菌属衍推出
<400>188
<210>189
<211>24
<212>DNA
<213>Erwinia carotovora
<400>189
<210>190
<211>24
<212>DNA
<213>Erwinia chrysanthemi
<400>190
<210>191
<211>24
<212>DNA
<213>Escherichia hermannii
<400>191
<210>192
<211>24
<212>DNA
<213>Escherichia vulneris
<400>192
<210>193
<211>24
<212>DNA
<213>Hafnia alvei
<400>193
<210>194
<211>24
<212>DNA
<213>Morganella morganii
<400>194
<210>195
<211>24
<212>DNA
<213>Proteus mirabilis
<400>195
<210>196
<211>24
<212>DNA
<213>Proteusrettgeri
<400>196
<210>197
<211>24
<212>DNA
<213>Providencia stuartii
<400>197
<210>198
<211>24
<212>DNA
<213>Rahnella aquatilis
<400>198
<210>199
<211>24
<212>DNA
<213>Yersinia enterolytica
<400>199
<210>200
<211>24
<212>DNA
<213>Yersinia pseudotuberculosis
<400>200
<210>201
<211>24
<212>DNA
<213>Cedecea davisae
<400>201
<210>202
<211>199
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Citrobacter细菌属衍推出
<400>202
<210>203
<211>199
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Citrobacter细菌属衍推出
<400>203
<210>204
<211>199
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>204
<210>205
<211>201
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>205
<210>206
<211>193
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>206
<210>207
<211>199
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>207
<210>208
<211>189
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>208
<210>209
<211>196
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>209
<210>210
<211>77
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出
<400>210
<210>211
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Eubakterien细菌属衍推出
<400>211
<210>212
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Eubakterien细菌属衍推出
<400>212
<210>213
<211>54
<212>DNA
<213>Pseudomonas stutzeri
<400>213
<210>214
<211>53
<212>DNA
<213>Thiobacillucferrooxidans
<400>214
<210>215
<211>54
<212>DNA
<213>Agrobacterium vitis
<400>215
<210>216
<211>54
<212>DNA
<213>Adalia bipunctata
<400>216
<210>217
<211>54
<212>DNA
<213>Amycolatopsis orientalis
<400>217
<210>218
<211>54
<212>DNA
<213>Brucella ovis
<400>218
<210>219
<211>54
<212>DNA
<213>Bradyrhizobium japonicum
<400>219
<210>220
<211>54
<212>DNA
<213>Pseudomonas paucimobilis
<400>220
<210>221
<211>54
<212>DNA
<213>Rhodobactersphaeroides
<400>221
<210>222
<211>57
<212>DNA
<213>Rickettsia prowazekii
<400>222
<210>223
<211>54
<212>DNA
<213>Sphingomonas paucimobilis
<400>223
<210>224
<211>54
<212>DNA
<213>Zymomonas mobilis
<400>224
<210>225
<211>54
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属衍推出
<400>225
<210>226
<211>53
<212>DNA
<213>Pseudomonas cepacia
<400>226
<210>227
<211>54
<212>DNA
<213>Ralstonia pickettii
<400>227
<210>228
<211>54
<212>DNA
<213>Campylobacter jejuni
<400>228
<210>229
<211>53
<212>DNA
<213>Helicobacter pylori
<400>229
<210>230
<211>53
<212>DNA
<213>Actinoplanes utahensis
<400>230
<210>231
<211>54
<212>DNA
<213>Bacillus halodurans
<400>231
<210>232
<211>54
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>232
<210>233
<211>54
<212>DNA
<213>Clostridium tyrobutyricum
<400>233
<210>234
<211>54
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Frankia细菌属衍推出
<400>234
<210>235
<211>54
<212>DNA
<213>Microbispora bispora
<400>235
<210>236
<211>54
<212>DNA
<213>Mycobacterium leprae
<400>236
<210>237
<211>54
<212>DNA
<213>Mycobacterium smegmatis
<400>237
<210>238
<211>54
<212>DNA
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>238
<210>239
<211>54
<212>DNA
<213>Mycobacterium gallisepticum
<400>239
<210>240
<211>58
<212>DNA
<213>Propionibacterium freudenreichii
<400>240
<210>241
<211>54
<212>DNA
<213>Rhodococcus erythropolis
<400>241
<210>242
<211>57
<212>DNA
<213>Rhodococcus fascians
<400>242
<210>243
<211>58
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>243
<210>244
<211>54
<212>DNA
<213>Streptococcus faecalis
<400>244
<210>245
<211>54
<212>DNA
<213>Streptomyces ambifaciens
<400>245
<210>246
<211>54
<212>DNA
<213>Flavobacterium resinovorum
<400>246
<210>247
<211>54
<212>DNA
<213>Sphingobacterium multivorans
<400>247
<210>248
<211>54
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属衍推出
<400>248
<210>249
<211>55
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属衍推出
<400>249
<210>250
<211>59
<212>DNA
<213>Borrelia burgdorferi
<400>250
<210>251
<211>58
<212>DNA
<213>Chlamydia trachomatis
<400>251
<210>252
<211>42
<212>DNA
<213>Pseudomonas stutzeri
<400>252
<210>253
<211>41
<212>DNA
<213>Thiobacilluc ferrooxidans
<400>253
<210>254
<211>41
<212>DNA
<213>Agrobacterium vitis
<400>254
<210>255
<211>41
<212>DNA
<213>Adalia bipunctata
<400>255
<210>256
<211>41
<212>DNA
<213>Amycolatopsis orientalis
<400>256
<210>257
<211>42
<212>DNA
<213>Brucella ovis
<400>257
<210>258
<211>41
<212>DNA
<213>Bradyrhizobium japonicum
<400>258
<210>259
<211>41
<212>DNA
<213>Pseudomonas paucimobilis
<400>259
<210>260
<211>41
<212>DNA
<213>Rhodobacter sphaeroides
<400>260
<210>261
<211>40
<212>DNA
<213>Rickettsia prowazekii
<400>261
<210>262
<211>41
<212>DNA
<213>Sphingomonas paucimobilis
<400>262
<210>263
<211>41
<212>DNA
<213>Zymomonas mobilis
<400>263
<210>264
<211>41
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属衍推出
<400>264
<210>265
<211>41
<212>DNA
<213>Pseudomonas cepacia
<400>265
<210>266
<211>41
<212>DNA
<213>Ralstonia pickettii
<400>266
<210>267
<211>41
<212>DNA
<213>Campylobacter jejuni
<400>267
<210>268
<211>42
<212>DNA
<213>Helicobacter pylori
<400>268
<210>269
<211>41
<212>DNA
<213>Actinoplanes utahensis
<400>269
<210>270
<211>41
<212>DNA
<213>Bacillus halodurans
<400>270
<210>271
<211>40
<212>DNA
<213>Clostridium tyrobutyricum
<400>271
<210>272
<211>41
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Frankia细菌属衍推出
<400>272
<210>273
<211>41
<212>DNA
<213>Microbispora bispora
<400>273
<210>274
<211>41
<212>DNA
<213>Mycobacterium leprae
<400>274
<210>275
<211>41
<212>DNA
<213>Mycobacterium smegmatis
<400>275
<210>276
<211>41
<212>DNA
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>276
<210>277
<211>41
<212>DNA
<213>Mycobacterium gallisepticum
<400>277
<210>278
<211>43
<212>DNA
<213>Propionibacteri umfreudenreichii
<400>278
<210>279
<211>41
<212>DNA
<213>Rhodococcus erythropolis
<400>279
<210>280
<211>41
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>280
<210>281
<211>41
<212>DNA
<213>Streptococcus faecalis
<400>281
<210>282
<211>41
<212>DNA
<213>Streptomyces ambifaciens
<400>282
<210>283
<211>41
<212>DNA
<213>Flavobacterium resinovorum
<400>283
<210>284
<211>41
<212>DNA
<213>Sphingobacterium multivorans
<400>284
<210>285
<211>43
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属衍推出
<400>285
<210>286
<211>43
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属衍推出
<400>286
<210>287
<211>41
<212>DNA
<213>Borrelia burgdorferi
<400>287
<210>288
<211>41
<212>DNA
<213>Chlamydia trachomatis
<400>288
<210>289
<211>24
<212>DNA
<213>Pseudomonas stutzeri
<400>289
<210>290
<211>19
<212>DNA
<213>Thiobacillus ferrooxidans
<400>290
<210>291
<211>18
<212>DNA
<213>Agrobacterium vitis
<400>291
<210>292
<211>18
<212>DNA
<213>Adalia bipunctata
<400>292
<210>293
<211>23
<212>DNA
<213>Amycolatopsis orientalis
<400>293
<210>294
<211>18
<212>DNA
<213>Brucella ovis
<400>294
<210>295
<211>17
<212>DNA
<213>Bradyrhizobium japonicum
<400>295
<210>296
<211>22
<212>DNA
<213>Pseudomonas paucimobilis
<400>296
<210>297
<211>22
<212>DNA
<213>Rhodobacter sphaeroides
<400>297
<210>298
<211>18
<212>DNA
<213>Rickettsia prowazekii
<400>298
<210>299
<211>23
<212>DNA
<213>Sphingomonas paucimobilis
<400>299
<210>300
<211>14
<212>DNA
<213>Zymomonas mobilis
<400>300
<210>301
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属衍推出
<400>301
<210>302
<211>23
<212>DNA
<213>Pseudomonas cepacia
<400>302
<210>303
<211>24
<212>DNA
<213>Ralstonia pickettii
<400>303
<210>304
<211>24
<212>DNA
<213>Campylobacterj ejuni
<400>304
<210>305
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<213>Helicobacter pylori
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<213>Actinoplanes utahensis
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<212>DNA
<213>Bacillus halodurans
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<211>22
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属衍推出
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属衍推出
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Brucella，Bradyrhizobium细菌属衍推出
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<213>人造序列
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<213>Clostridium tyrobutyricum
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<213>人造序列
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<213>Mycobacterium smegmatis
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属衍推出
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<213>Zymomonas mobilis
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属衍推出
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<213>Ralstonia pickettii
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<213>campylobacter jejuni
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<213>Helicobacter pylori
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Frankia细菌属衍推出
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<213>Microbispora bispora
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<213>Mycobacterium leprae
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<213>Mycobacterium smegmatis
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<213>Streptococcus faecalis
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<213>Sphingobacterium multivorans
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<213>人造序列
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<223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属衍推出
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<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推出
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<213>Rhodococcus fascians
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<213>Streptomyces mashuensis
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<213>人造序列
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<213>Chlamyia trachomatis
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<213>Buchnera aphidocola
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<213>Clostridium tyrobutyricum
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<213>人造序列
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<213>Rhodococcus erythropolis
<400>459
<210>460
<211>168
<212>DNA
<213>Rhodococcus fascians
<400>460
<210>461
<211>64
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>461
<210>462
<211>87
<212>DNA
<213>Streptococcus faecalis
<400>462
<210>463
<211>123
<212>DNA
<213>Streptomyces ambifaciens
<400>463
<210>464
<211>134
<212>DNA
<213>Streptomyces galbus
<400>464
<210>465
<211>143
<212>DNA
<213>Streptomyces griseus
<400>465
<210>466
<211>137
<212>DNA
<213>Streptomyces lividans
<400>466
<210>467
<211>135
<212>DNA
<213>Streptomyces mashuensis
<400>467
<210>468
<211>114
<212>DNA
<213>Flavobacterium resinovorum
<400>468
<210>469
<211>126
<212>DNA
<213>Sphingobacterium multivorans
<400>469
<210>470
<211>63
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属的种衍推出
<400>470
<210>471
<211>67
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推出
<400>471
<210>472
<211>17
<212>DNA
<213>Borrelia burgdorferi
<400>472
<210>473
<211>111
<212>DNA
<213>Chlamydia trachomatis
<400>473
<210>474
<211>148
<212>DNA
<213>Azotobacter vinelandii
<400>474
<210>475
<211>229
<212>DNA
<213>Cowduria ruminantium
<400>475
<210>476
<211>110
<212>DNA
<213>Mycobacterium intracellulare
<400>476
<210>477
<211>107
<212>DNA
<213>Mycobacterium lufu
<400>477
<210>478
<211>120
<212>DNA
<213>Mycobacterium simiae
<400>478
<210>479
<211>149
<212>DNA
<213>Mycobacterium smegmatis
<400>479
<210>480
<211>75
<212>DNA
<213>Saccharomonospora azurea
<400>480
<210>481
<211>73
<212>DNA
<213>Saccharomonospora caesia
<400>481
<210>482
<211>75
<212>DNA
<213>Saccharomonospora cyanea
<400>482
<210>483
<211>69
<212>DNA
<213>Saccharomonospora glauca
<400>483
<210>484
<211>74
<212>DNA
<213>Saccharomonospora viridis
<400>484
<210>485
<211>304
<212>DNA
<213>Wolbachia pipientis
<400>485
<210>486
<211>34
<212>DNA
<213>Salmonella typhi
<400>486
<210>487
<211>22
<212>DNA
<213>Buchnera aphidocola
<400>487
<210>488
<211>53
<212>DNA
<213>Pseudomonasstut zeri
<400>488
<210>489
<211>35
<212>DNA
<213>Thiobacillus ferrooxidans
<400>489
<210>490
<211>52
<212>DNA
<213>Agrobacterium vitis
<400>490
<210>491
<211>38
<212>DNA
<213>Adalia bipunctata
<400>491
<210>492
<211>52
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Brucella细菌属的种衍推出
<400>492
<210>493
<211>40
<212>DNA
<213>Bradyrhizobium japonicum
<400>493
<210>494
<211>36
<212>DNA
<213>Pseudomonas paucimobilis
<400>494
<210>495
<211>40
<212>DNA
<213>Rhodobacter sphaeroides
<400>495
<210>496
<211>53
<212>DNA
<213>Rickettsia prowazekii
<400>496
<210>497
<211>51
<212>DNA
<213>Rickettsia bellii
<400>497
<210>498
<211>53
<212>DNA
<213>Rickettsia rickettsii
<400>498
<210>499
<211>47
<212>DNA
<213>Sphingomonas paucimobilis
<400>499
<210>500
<211>33
<212>DNA
<213>Zymomonas mobilis
<400>500
<210>501
<211>53
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属的种衍推出
<400>501
<210>502
<211>51
<212>DNA
<213>Pseudomonas cepacia
<400>502
<210>503
<211>48
<212>DNA
<213>Ralstonia pickettii
<400>503
<210>504
<211>51
<212>DNA
<213>Helicobacter pylori
<400>504
<210>505
<211>52
<212>DNA
<213>Bacillus halodurans
<400>505
<210>506
<211>52
<212>DNA
<213>Bacillus halodurans
<400>506
<210>507
<211>52
<212>DNA
<213>Clostridium tyrobutyricum
<400>507
<210>508
<211>51
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Frankia细菌属的种衍推出
<400>508
<210>509
<211>50
<212>DNA
<213>Microbispora bispora
<400>509
<210>510
<211>45
<212>DNA
<213>Mycobacteri umleprae
<400>510
<210>511
<211>52
<212>DNA
<213>Mycobacterium smegmatis
<400>511
<210>512
<211>49
<212>DNA
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>512
<210>513
<211>51
<212>DNA
<213>Rhodococcus erythropolis
<400>513
<210>514
<211>52
<212>DNA
<213>Rhodococcus fascians
<400>514
<210>515
<211>53
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>515
<210>516
<211>50
<212>DNA
<213>Streptococcus faecalis
<400>516
<210>517
<211>47
<212>DNA
<213>Streptomyces ambifaciens
<400>517
<210>518
<211>53
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Streptomyces细菌属的种衍推出
<400>518
<210>519
<211>47
<212>DNA
<213>F1avobacterium resinovorum
<400>519
<210>520
<211>52
<212>DNA
<213>Spingobacterium multivorans
<400>520
<210>521
<211>53
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属的种衍推出
<400>521
<210>522
<211>60
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推出
<400>522
<210>523
<211>53
<212>DNA
<213>Borrelia burgdorferi
<400>523
<210>524
<211>51
<212>DNA
<213>Chlamydia trachomatis
<400>524
<210>525
<211>138
<212>DNA
<213>Sphingomonas paucimobilis
<400>525
<210>526
<211>107
<212>DNA
<213>Zymomonas mobilis
<400>526
<210>527
<211>167
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属的种衍推出
<400>527
<210>528
<211>225
<212>DNA
<213>Borrelia burgdorferi
<400>528
<210>529
<211>681
<212>DNA
<213>Xanthomonas campestris
<400>529
<210>530
<211>229
<212>DNA
<213>Cowduria ruminantium
<400>530
Claims (24)
1.作为探针和/或引物检测肠道细菌的核酸分子，选择如下：
a)包含至少一个具有SEQ ID No.2--25之一的序列，和/或依SEQID No.1由2667到2720，2727到2776，2777到2800，2801到2838，2857到2896，2897到2938，2939到2983，2984到2999和/或3000到3032位置选出的序列，以及与此同源的、类似的或至少具有70％相同性的核酸分子；
b)与按a)中方法选出的核酸分子特异性杂交的核酸分子；
c)与按a)或b)中方法选出的核酸分子具有70％，相同性的核酸分子；
d)与按a)到c)中方法选出的核酸分子互补的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于与按a)或b)中方法选出的核酸分子具有90％相同性的核酸分子。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于是至少长为10个，核苷酸的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于至少长14个核苷酸的核酸分子。
5.根据上述权利要求1、2、3、4之一所述的核酸分子，其特征在于，对核酸分子进行修饰，此修饰是将10个相连的核苷酸中的至多20％，通过细菌中非天然存在的核苷酸替代。
6.根据上述权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，对核酸分子进行修饰，此修饰是将10个相连的核苷酸中1或2个核苷酸，通过细菌中非天然存在的核苷酸替代。
7.根据上述权利要求1、2、3、4之一所述的核酸分子，其特征在于是通过修饰和标记而得出核酸分子，此修饰和标记能在常见的分析鉴别过程中产生一个信号；所说修饰可选用以下物质完成：(i)放射性物质，(ii)染料，(iii)荧光物质，(iv)可固定在固定项的基团和(v)可以与核苷酸分子直接或间接地，借助抗体、抗原、酶和/或与酶亲和的物质或酶合物进行反应的物质。
8.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于是通过修饰和标记而得出核酸分子，此修饰和标记能在常见的分析鉴别过程中产生一个信号；所说修饰可选用以下物质完成：(i)放射性物质，(ii)染料，(iii)荧光物质，(iv)可固定在固定项的基团和(v)可以与核苷酸分子直接或间接地，借助抗体、抗原、酶和/或与酶亲和的物质或酶合物进行反应的物质。
9.至少包括两个核酸分子的组合，为权利要求1中核酸分子的组合；在此，该组合是可用于鉴别肠道细菌的至少具有15bp的DNA分子。
10.含有上述权利要求之一的一个核酸分子或核酸分子组合的试剂盒。
11.鉴别分析样品中的肠道细菌的方法，包括将分析样品与上述权利要求1到9之一所述核酸分子或核酸分子组合接触，和检测包含被应用的核酸和细菌的核酸的杂交核酸分子。
12.扩增多种不同的分类学单位的细菌
DNA的方法，该法中使用上述权利要求1到9中所述的引物；其中，在第一步中，用保守引物扩增较高的分类学单位的DNA。
13.根据上述权利要求12所述的方法，其特征在于，使用上述权利要求1到9中所述的引物扩增不同的属和种分类学单位的细菌DNA；其中，在第一步中，用保守引物扩增纲、亚纲或科的分类学单位的DNA。
14.根据上述权利要求12所述的方法，其特征在于进行一步以上的扩增步骤，使用连锁的、可变性递增的引物扩增从第一步获得的，对属、种具有特异性的部分片段。
15.根据上述权利要求14所述的方法，其特征在于进一步借助探针来鉴定通过扩增所获得的对属、种具有特异性的DNA片段。
16.根据上述权利要求11、12、13、14、15之一所述的方法，其特征在于包括对待鉴别核酸的PCR扩增步骤的方法。
17.根据上述权利要求11、12、13、14、15之一所述的方法，其特征在于包括DNA印迹杂交步骤的方法。
18.应用上述权利要求1到9中所述的核酸分子鉴别肠道细菌或细菌的核酸的方法。
19.根据上述权利要求18所述的方法，其特征在于是包括PCR步骤的方法。
20.根据上述权利要求18所述的方法，其特征在于是包括连接酶链反应的方法。
21.根据上述权利要求18所述的方法，其特征在于是包括等温核酸扩增的方法。
22.应用上述权利要求1到9中所述的核酸分子鉴别细菌和/或对细菌进行定性的方法。
23.应用上述权利要求1到9中所述的核酸分子检测肠道菌科细菌的方法。
24.应用上述权利要求1到9中所述的核酸分子检测任何肠道菌科细菌的方法。
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