CN100471500C - 葛花苷的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种从葛花中提取的葛花苷，可用于制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物，在该药物组合物中含有葛花苷，以及药学上可接受的载体。葛花苷也可在制备治疗骨质疏松症药物中应用。在葛花苷的药物组合物中加入0-50%增溶剂，如羟丙基-β-环糊、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精等可以明显改善葛花苷的水溶性，从而提高其生物利用度。含有增溶剂的葛花苷药物组合物可直接制成用于治疗缺血性心、脑血管病和骨质疏松症的注射剂。

Description

葛花苷的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及中药领域，是关于植物提取物葛花苷在制备新药中的应用。

背景技术

葛花(Flos Puerariae)，又名葛条花，为豆科(Leguminosae)植物野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)的干燥花蕾。性凉，味甘，入归阳明经。《神农本草经》、《本草纲目》等记载其具有解酒醒脾之功效，主治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕逆吐酸、吐血、肠风下血等症。

文献报道，葛花提取物可显著升高乙醇处理的大鼠模型体内Gu/ZnSOD和CAI(过氧化氢酶)活性，降低G-SH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)活性，使这些抗氧化酶的NRNA水平以及肝GSH恢复正常，降低MAD水平，使肝脏得到保护，葛花亦具有胃粘膜保护作用以及消化管激活作用。

葛花的化学成分及其药理作用国内尚未见报道，国外研究报道其化学成分主要为异黄酮类和皂苷类化合物，其中葛花苷(kakkalide，5，7-dihydroxy-6，4′-dimethoxyisoflavone-7-O-β-D-xylopyranosyl-6-Oβ-D-glucopyranoside)是葛花中主要活性成分之一，文献报道表明，葛花苷可有效降低血清中AST和ALT的活性，保护肝细胞膜的完整性，Yamazaki T报道，200mg/kg葛花苷也显著抑制乙醇诱导的小鼠血糖水平的增加，防止乙醇引起的糖代谢的破坏。葛花苷对缓解酒精中毒和保护肝损伤有较好的疗效。

葛花在我国分布广泛，植物资源丰富，其中黄酮、皂苷等有效成分，有很强的药理活性，在国外得到了广泛的研究。但国内对其化学成分、药理作用和临床应用的研究还不够深入，目前在我国主要有葛花解醒汤用于临床，葛花茶、葛花露等保健品上市。主要局限于解酒、保肝药等。而葛花中药物活性成分葛花苷的其他药物活性，未有深入的研究，尤其是在治疗缺血性心脑血管疾病及骨质疏松等药物中的用途未见文献报道。葛花这一传统中药还有待进一步研究，以期开发出新的药物应用领域以及新剂型和保健品，使其在医疗、保健等方面开辟更广阔的用途。

葛花苷由于水溶性低在作为药用时，目前只能制成口服药制剂而不能制成注射药，由于它们的水溶性低，影响到药物利用度和显著时间，不便于临床上选择使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病新药中的新用途。

本发明的另一个目的是提供葛花苷在制备治疗骨质疏松病药物中的应用。

本发明的再一个目的是提供水溶性好、生物利用度高、显效快，可供注射用药治疗缺血性心、脑血管病及骨质疏松症的葛花苷新药制剂。

本发明的解决方案是由中药葛花等植物有效部位中提取的葛花苷，其结构式为：

其中R₁为Glc⁶-Xyl     R₂R₃为OCH₃

通用名：葛花苷。

中文化学名：5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮-7-O-β-D-吡喃木糖-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

英文名：kakkalide

英文化学名：5，7-dihydroxy-6，4′-dimethoxyi soflavone-7-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside。

葛花苷主要理化性质：葛花苷为无色针晶，分子式：C₂₈H₃₂O₁₅分子量608，mp.238～239℃，FeCl₃反应呈阳性，HCl-Mg粉反应呈阴性。IR(KBr)cm^-1：3500(OH)，3200，1651(C＝O)，1605，1580，1510。¹³CNMR(DMSO-d₆，150MHz)：180.9，159.4，156.7，155.1，153.0，152.7，132.7，130.3，123.0，121.9，113.9，106.7，104.3，100.3，94.4，76.8，76.7，76.0，73.6，73.2，69.9，69.6，68.6，65.8，60.5，55.3。

¹HNMR数据(DMSO-d₆，600MHz)：

申请人将本发明的有效成分葛花苷进行了急毒和药效试验，探讨了葛花苷在治疗缺血性心、脑血管疾病的作用机理。并用大鼠探讨了葛花苷对治疗骨质疏松病的作用。

一、葛花苷耐缺氧作用

昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为4组，即空白对照组、葛花苷大剂量组200mg/kg、小剂量组100mg/kg和阳性对照药葛根素注射液组150mg/kg，每组10只。尾静脉注射给药1次。给药体积为0.4ml/20g体重。空白对照组给予等容积的溶剂。于给药后30min开始耐缺氧实验。将小鼠放入密闭广口瓶内。记录小鼠自入瓶开始至死亡时的存活时间。

结果表明，葛花苷能明显延长小鼠耐缺氧的存活时间，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)，说明葛花苷能显著增强机体耐缺氧的能力。结果详见表1。

表1 葛花苷对小鼠耐缺氧作用的影响(x±s n＝10)

注：与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

二、葛花苷对大鼠急性不完全性脑缺血的保护作用

将50只Wistar大鼠(平均体重223.46±16.72g)，雌雄各半。随机分为5组，即假手术组、脑缺血模型组、葛花苷大剂量组100mg/kg、小剂量组50.0mg/kg、阳性对照药葛根素注射液组80.0mg/kg。每组10只。腹腔注射给药。每日1次，连续给药5天。给药体积为1.0ml/200g，假手术组和脑缺血模型组均给予等容积的溶剂。于末次给药后30min开始实验。大鼠在25％乌拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉下，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，双重结扎(假手术组仅穿双线但不结扎)，造成急性不完全性脑缺血。结扎后3h每组各取10只快速断头取脑，装入称量瓶称脑湿重，计算脑指数[脑指数＝脑湿重/体重×100％]，然后置于110℃烤箱中烘烤72小时至恒重，称脑干重，计算脑含水量。

结果表明脑缺血模型组的脑指数和脑含水量明显高于假手术组(P<0.05)，说明脑缺血模型建立成功。葛花苷大、小剂量组均明显降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑指数和脑含水量，表明葛花苷可明显减轻大鼠急性不完全性脑缺血所引起的脑水肿。结果详见表2。

表2.葛花苷对急性不完全性脑缺血大鼠脑指数和脑含水量的影响(X±s，n＝10)

注：与脑缺血模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

三、葛花苷对麻醉犬急性心肌缺血的影响

正常健康犬20只，体重11～15.5kg，雌雄兼有，随机分为4组，即葛花苷大剂量组50.0mg/kg，葛花苷小剂量组12.5mg/kg，阳性对照药葛根素注射液组40.0mg/kg及心肌缺血模型组。动物经2.5％戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉麻醉，分离气管并插管，备接电动呼吸器行人工呼吸。犬右侧卧位，于左侧第四肋间隙开胸，做心包床，分离冠状动脉左前降支近1/2处，引线备结扎用。将心外膜电极缝于心外膜上，经波段开关与BioPAC多导生理信号采集分析系统相连记录心外膜电图。术后缓慢恒速静脉滴注生理盐水，以补充体液。结扎冠状动脉后30min记录心外膜电图，计算30个导联ST段移位的总值(∑-ST)及ST段移位超过2mv的导联数(N-ST)作为药前值。静脉注射给药。给药体积为1.0ml/kg。心肌缺血模型组给予等体积的溶剂。分别记录给药开始后15min、30min、60min、90min、120min及180min的心外膜电图，计算∑-ST、N-ST及其变化率。给药后3h，经左心耳根部向左房注入碳素墨水1.0ml/kg，20-30秒内注完，迅速取下心脏，去除脂肪、心房及右室肌，于-20℃下冰冻30—40min，称重。在冠状动脉结扎点下平行冠状沟将左心室切成等厚的5片，分别称重，用求积仪测量每片心肌两面碳素墨水染色区(非缺血区)及未染色区(缺血区)面积，计算缺血区占左心室肌重量的百分率。然后将5片心肌置于37℃ N-BT染液中，振摇染色15min取出，如上测出梗塞区(浅红色)及非梗塞区(暗红色)面积，计算梗塞区占左心室肌重量的百分率，并计算出梗塞区占缺血区心肌重量的百分率。

结果表明，葛花苷大、小剂量组分别于给药后30min～60min和60min明显减轻麻醉犬急性心肌缺血程度(∑-ST)，其它时间点虽无统计学意义，但其药效作用仍可持续至给药后180min。葛花苷大剂量组180min明显缩小麻醉犬急性心肌缺血范围(N-ST)(P<0.05)，小剂量组虽无明显影响，但有缩小趋势。用N-BT染色显示的心肌梗塞面积与心外膜电图所测定的结果一致。葛花苷大、小剂量组均具有明显减轻心肌缺血的损伤性作用，使麻醉犬急性心肌梗塞面积明显缩小，分别与心肌缺血模型组比较均有明显差异(P<0.05)。结果详见表3、4、5。

表5.葛花苷对犬急性心肌缺血面积及梗塞面积的影响(n＝5，X±SD)

注：与缺血模型组比较^*P<0.05

四、葛花苷对去势大鼠骨质疏松模型的治疗作用

将50只雄性大鼠(体重170-200g)随机分为5组，分别为空白对照组、骨质疏松模型组、葛花苷大剂量组100mg/kg、小剂量组50.0mg/kg，阳性对照药钙尔奇D组500mg/kg。每组10只。除空白对照组外，其余五组均行双侧睾丸摘除术，制成去势大鼠骨质疏松模型。术后3天开始腹腔注射给药，每日一次，连续60天。于停药后次日颈静脉取血检测血清钙(s-Ca)、血清磷(s-P)、碱性磷酸酶(ALP)，取双侧股骨进行骨钙含量测定。

结果表明，骨质疏松模型组动物股骨骨钙含量与正常对照组比较明显降低，连续给药60天，在50～100mg/kg剂量下能够明显增加股骨骨钙的沉积，使骨钙水平明显升高(P<0.01)。但葛花苷对去势大鼠的血钙、血磷、碱性磷酸酶无明显影响(表6、7)。

表6.葛花苷对去势大鼠致骨质疏松模型血清学指标的影响(n＝10，X±SD)

注：与模型对照组比较，P>0.05

表7.葛花苷对去势大鼠骨钙沉积的影响(n＝10，X±SD)

注：与模型对照组比较，^**P<0.01

五、葛花苷口服给药对小鼠耐缺氧的影响

昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为4组，即空白对照组、葛花苷大剂量组400mg/kg、小剂量组200mg/kg和阳性对照药葛根素注射液组150mg/kg，每组10只。灌胃给药。连续给药5天，每天1次。给药体积为0.4ml/20g体重。空白对照组给予等容积的溶剂。于末次给药后1h开始耐缺氧实验。将小鼠放入密闭广口瓶内。记录小鼠自入瓶开始至死亡时的存活时间。

结果表明，葛花苷能明显延长小鼠耐缺氧的存活时间，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)，说明葛花苷能显著增强机体耐缺氧的能力。结果详见表8。

表8 葛花苷对小鼠耐缺氧作用的影响(x±s n＝10)

注：与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

六、葛花苷口服给药对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血的影响

将Wistar大鼠40只，体重223±17g，雌雄各半。随机分为4组，即葛花苷大剂量组200mg/kg、小剂量组100.0mg/kg、阳性对照药葛根素注射液组80.0mg/kg和空白对照组。每组10只。灌胃给药。给药体积为2.0ml/200g。连续给药5天，每天1次。空白对照组给予等体积的溶剂。于末次给药1h后开始检测心电图。大鼠用2.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉，仰卧固定。用针电极刺入四肢皮下，记录II导联心电图，作为基础心电图对照。然后尾静脉注射垂体后叶素0.8U/kg，于10s内注射完毕。立即记录注射垂体后叶素后5s、10s、15s、30s、1min、2min、3min的心电图，观察T波、ST段和心率的变化。以心电图出现下列指标一项者即为阳性心肌缺血：J点升高1.5mv以上，T波低平(降低原T波高度50％以上)、双向、倒置，ST段水平下移0.5mv，心律不齐。

结果表明，葛花苷大、小剂量组均可明显减少由垂体后叶素所致的急性心肌缺血阳性率，与空白对照组比较有明显差异(P<0.05)表9。

表9 葛花苷对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血的拮抗作用

七、葛花苷口服给药对大鼠急性不完全性脑缺血的保护作用

将50只Wistar大鼠(平均体重202.32±21.40g)，雌雄各半。随机分为5组，即假手术组、脑缺血模型组、葛花苷大剂量组200mg/kg、小剂量组100mg/kg、阳性对照药葛根素注射液组80.0mg/kg。每组10只。灌胃给药。每日1次，连续给药5天。给药体积为1.0ml/200g，假手术组和脑缺血模型组均给予等容积的溶剂。于末次给药后1h开始实验。大鼠在25％乌拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉下，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，双重结扎(假手术组仅穿双线但不结扎)，造成急性不完全性脑缺血。结扎后3h每组各取10只快速断头取脑，装入称量瓶称脑湿重，计算脑指数[脑指数＝脑湿重/体重×100％]，然后置于110℃烤箱中烘烤72小时至恒重，称脑干重，计算脑含水量。

结果表明脑缺血模型组的脑指数和脑含水量明显高于假手术组(P<0.05)，说明脑缺血模型建立成功。葛花苷大、小剂量组均明显降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑指数和脑含水量，表明葛花苷可明显减轻大鼠急性不完全性脑缺血所引起的脑水肿。结果详见表10。

表10.葛花苷口服给药对急性不完全性脑缺血大鼠脑指数和脑含水量的影响(X±s，n＝10)

注：与脑缺血模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

八、葛花苷口服给药对去势大鼠骨质疏松模型的治疗作用

将50只雄性大鼠(平均体重197.84±14.62g)随机分为5组，分别为空白对照组、骨质疏松模型组、葛花苷大剂量组200mg/kg、小剂量组100mg/kg，阳性对照药钙尔奇D组500mg/kg。每组10只。除空白对照组外，其余五组均行双侧睾丸摘除术，制成去势大鼠骨质疏松模型。术后3天开始腹腔注射给药，每日一次，连续60天。于停药后次日颈静脉取血检测血清钙(s-Ca)、血清磷(s-P)、碱性磷酸酶(ALP)，取双侧股骨进行骨钙含量测定。

结果表明，骨质疏松模型组动物股骨骨钙含量与正常对照组比较明显降低，连续给药60天，200mg/kg能够明显增加股骨骨钙的沉积，使骨钙水平明显升高(P<0.01)，100mg/kg有增加趋势。结果详见表11。

表11 葛花苷口服给药对去势大鼠骨钙沉积的影响(X±s，n＝10)

注：与模型对照组比较，^**P<0.01

葛花苷最大耐受量试验

选健康昆明种小鼠20只，体重18～20g，雌雄各半。尾静脉注射给予3％葛花苷。给药体积为0.5ml/20g体重。每2h给药1次，共4次。给药后即刻皆未见动物出现明显毒性反应，无小鼠死亡。继续观察14天，小鼠生长良好。综合上述实验结果表明：

1、葛花苷能明显延长小鼠耐缺氧的存活时间，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)，说明葛花苷能显著增强机体耐缺氧的能力。

2、葛花苷大、小剂量组均明显降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑指数和脑含水量，表明葛花苷可明显减轻大鼠急性不完全性脑缺血所引起的脑水肿。

3、葛花苷大、小剂量组均具有明显减轻心肌缺血的损伤性作用，使麻醉犬急性心肌梗塞面积明显缩小，分别与心肌缺血模型组比较均有明显差异(P<0.05)。

4、葛花苷对去势大鼠骨质疏松模型组动物股骨骨钙含量与正常对照组比较明显降低，连续给药60天，在50-100mg/kg剂量下能够明显增股骨骨钙的沉积，使骨钙水平明显升高(P<0.01)。但葛花苷对去势大鼠的血钙、血磷、碱性磷酸酶无明显影响。

通过以上实验证明了葛花苷的药理活性，从而确认葛花苷可以用于制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物，在所述的药物组合物中含有葛花苷，以及药学上可以接受的载体，实验还证明了葛花苷也可以用于制备治疗骨质疏松症的药物组合物。

葛花苷由于水溶性低在作为药用时，目前只能制成口服药制剂，而不能制成注射药，也影响到药物利用度和显著时间。特别是作为治疗缺血性心、脑血管病的药物，更不便于临床上选择使用。所以本发明的一个重要特点是在本发明的葛花苷药物组合物中添加有增溶剂，从而改善了葛花苷的水溶性。表12列举了部分溶剂对葛花苷增溶作用的数据。

表12 葛花苷在部分溶剂中的溶解度

 

溶剂浓度	1％	3％	5％	10％	20％	50％	100％
								水							不溶
β-环糊精	0.05％	0.1％	0.2％	0.8％	1.2％	2％
								羟丙基-β-环糊精	0.2％	0.5％	1％	1.5％	3％	7％
羟乙基-β-环糊精	0.15％	0.4％	0.8％	1.2％	2％	4％

通过实验选择，本发明所说的葛花苷药物组合物中所含的增溶剂，它选自羟丙基-β-环糊精、丙二醇、乙醇、吐温80、葡萄糖、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或几种。其中优选的是β-环糊精、羟乙基-β-环糊精和羟丙基-β-环糊精。葛花苷药物组合物增溶剂的含量以重量百分数计为0-50wt％，鉴于增溶剂小于5wt％溶解度降低，高于50wt％黏度高流动性差，不利于制造注射剂，故其优选含量为5-20wt％。以羟丙基-β-环糊精为增溶剂时，其优选含量为5-15wt％。

通过以上改进，如此构成的葛花苷药物组合物，提高了葛花苷的水溶性和生物利用度。既可以用常规方法将葛花苷制备成治疗缺血性心、脑血管病及治疗骨质疏松症的各种口服制剂，更主要的是可以制成注射剂，为临床上选择使用提供了方便。

下面再以实验例子对本发明作进一步说明：

实施例1.葛花苷的制备

在本实施例中，将10kg干野葛花粉碎，用90％乙醇溶液回流提取2次，每次3小时，过滤，收集滤液，回收乙醇至无醇味，加溶液6倍量水，放置过夜，取上清液。过大孔树脂，用60％乙醇洗脱，洗脱液回收，放置析出结晶，过滤、干燥，再用丙酮重结晶，过滤得葛花苷。

实例2.

以制备葛花苷注射液1000支为例所用的原料和辅料配比如下：

葛花苷                              100g

羟丙基-β-环糊精                     500g

依地酸钠钙                          1g

亚硫酸氢钠                          10g

注射用水                           加至10L

采用常规注射液的制备工艺制成，每瓶重10命令10ml，每瓶含葛花苷100mg。用法：成人一日一次，每次6瓶静脉注射，儿童酌情减量。

实例3.

以制备葛花苷注射液100ml，1000瓶为例所用的原料和辅料配比如下：

葛花苷             1000g

羟丙基β环糊精      3000g

依地酸钠钙         1g

亚硫酸氢钠         10g

注射用水          加至10L

采用常规注射液的制备工艺制成，每瓶100ml，每瓶含葛花苷1mg。用法：成人一日1次，每次1瓶静脉注射，儿童酌情减量。

Claims (6)

1.葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物中的应用，其中所述的药物组合物中含葛花苷，以及药学上可以接受的载体。

2.依照权利要求1所述的葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物中的应用，所制备的药物组合物中含葛花苷和药学上可以接受的载体，其特征在于组合物中含有增溶剂。

3.依照权利要求2所述的葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物中的应用，所制备的药物组合物中含有葛花苷和药学上可以接受的载体，所说的组合物中含有增溶剂，其特征在于所说增溶剂的含量以重量百分数计为5～20wt％。

4.依照权利要求2所述的葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物中的应用，所制备的药物组合物中含葛花苷和药学上可以接受的载体，所说的组合物中含有增溶剂，其特征在于所说的增溶剂选自羟丙基-β-环糊精、丙二醇、乙醇、吐温-80、葡萄糖、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或几种。

5.依照权利要求2所述的葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物中的应用，所制备的药物组合物中含葛花苷和药学上可以接受的载体，所说的组合物中含有增溶剂，其特征在于所说的增溶剂为羟丙基-β-环糊精，其含量为5～15wt％。

6、依照权利要求1所述的葛花苷在制备治疗缺血性心、脑血管病的药物组合物中的应用，其特征在于所说的葛花苷制备成治疗缺血性心、脑血管病药物组合物的注射剂。