CN100462366C - 酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子、其合成方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够应用于杀灭细菌、治疗内毒素血症的酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子，其合成方法及用途。酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子是应用计算机分子模拟技术，以LALF功能区位点为模板基于PHD方法，设计出的下述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽：CRKPT FRRLK WK X¹ K X² KFKC-NH₂(X¹可以是Y或E或M或A或L或K或F或Q或W或I或V等；X²可以是G或F或M或I或L或V或N等；)。上述酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽可通过固相多肽合成法，采用多肽合成仪自动合成和/或手工合成相结合制备获得。它们具有杀菌和/或中和LPS活性的作用，可以辅以药用稀释剂、佐剂及载体制成药用组合物，与其他药物复合，用于治疗G-细菌感染和内毒素血症。

Description

酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子、其合成方法和用途

技术领域

本发明涉及能够应用于杀灭细菌、治疗内毒素血症的酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子，其合成方法及用途。

背景技术

革兰氏阴性(G^-)杆菌脓毒症和休克是导致临床病人死亡的主要原因之一，特别是伴有严重内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)血症的G^-杆菌的感染，病死率达50—80％[Crit.Care Med.2001，29(7)：1303-1310]。而针对内毒素血症的治疗，临床上由于缺乏特异性的治疗药物，目前尚无有效措施，仅限于对症处理和抗菌药物，从而导致感染性疾病的死亡率居高不下，因此研究其发病机理并寻找有效的治疗措施一直是临床医学关注的焦点。

随着对G^-杆菌感染研究的深入，存在于G^-杆菌外膜上LPS的作用日益受到重视。LPS被认为是引起脓毒症的主要启动子[Crit Care Med.2004；32(2)：502-508]，它由类脂A(lipidA)、O侧链抗原及核心多糖三部分组成，其中lipid A是LPS的活性中心。LPS通过血浆内毒素结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)转运，与单核吞噬细胞膜上的受体CD14结合，形成LPS-CD₁₄复合物后再与跨膜受体TLR_s结合，将外源信号转入胞内，导致单核/巨噬细胞活化，释放TNF-α、IL-6等细胞因子，介导脓毒症的发生[J Immunol.1999；162(7)：3749-3752]。实验证明单独CD14或TLR4基因敲除的小鼠对LPS攻击具有耐受作用。在脓毒症患者中，LPS的检出率、检出水平均与病情及预后密切相关[J.Exp.Med.1989，169：333-338]。因此，封闭LPS的活性是从源头上防治内毒素血症的关键。

国内外针对内毒素血症的防治策略目前主要有抑制LPS的合成、阻断LPS与其受体的结合、阻断LPS的胞内信号转导、抗细胞因子疗法、糖皮质激素治疗等措施，但均收效甚微。多粘菌素B(PMB)虽能有效中和LPS，但严重的毒副作用限制了其临床应用。重组活化蛋白C(recombinant activated protein C，rAPC)于2001年11月进入临床使用，经过2年多的临床实践，在国际范围的多中心评估中，其疗效受到质疑，并且由于具有导致出血的严重副作用，使rAPC的应用受到严格的限制[Clin Infec Disea.2002；34：1084-1093.]。因此，至今仍无有效低毒的药物应用于临床[Cell Mol Life Sci.2003；60(11)：2334-2346]，脓毒症的治疗仍然是临床医药学急待解决的问题之一。研制高亲和力、能中和细菌LPS，同时兼有杀菌活性的药物是当今世界医学领域研究的重点。

文献报道，美洲鲎和东方鲎的鲎抗内毒素因子(LALF及TALF)在体外和动物体内具有显著的抗G^-杆菌及中和LPS活性[J.Biol.Chem，1996，271(8)：28120-28127；J Infect Dis，1994，170(6)：1490-7]。小鼠腹腔内给予半数致死量的大肠杆菌LPS攻击，在攻击后4h、10h甚至24h后给予LALF，小鼠72h生存率得到显著改善，且在LPS攻击10h或24h后静脉给予LALF，血浆LPS水平明显下降[J Infect Dis，1998，177(2)：388-94；Infect Immun，1992，60(6)：2506-13]。用10％致死量(10mg/kg)的LPS在体外预先与LALF混合后处理的兔比单纯用LPS处理的兔具有较高水平的平均动脉压、动脉血Ph及重碳酸盐浓度，生存率前者为90％，后者为8％。采用铜绿假单孢菌和LPS诱导的TNF-α分泌方法体外测定LALF的杀菌和中和LPS能力，结果显示LALF具有与多粘菌素B相当的杀菌和LPS中和活性(P<0.01)[J EMBO，1993，12(9)：3351-3356]。LALF还可抑制脑膜炎双球菌LPS诱导的鲎变形细胞裂解物的凝胶化作用[J Infect Dis，1992，165(3)：494-500]。

鲎抗内毒素因子(LALF及TALF)是从鲎变形细胞大颗粒中提取的小分子蛋白质，分子量约11786。LALF来源于美洲鲎，由101个氨基酸构成。TALF来源于东方鲎，由102个氨基酸构成。尽管已通过基因工程获得了重组鲎抗内毒素因子(rLALF和rTALF)[J.Biol.Chem，1996，271(8)：28120-28127；Mol.biotech.，2002，21：1-7]，但是基因工程周期长，耗资大；虽然rLALF也具有良好中和LPS及抗G^-杆菌活性，但rLALF潜在的抗原性和毒性副作用，使它不适于人体治疗[J.Biol.Chem，1996，271(8)：28120-28127]。

在此情况下，国际上对鲎抗菌、抗内毒素大分子蛋白的研究逐渐深入到它们功能区的衍化肽。Hoess等认为LALF的抗菌抗内毒素活性功能区位于第31—52氨基酸残基之间[JEMBO，1993，12(9)：3351-3356]。据此，Maribel等合成了LALF衍化肽LALF31-52，通过内毒素刺激的腹膜巨噬细胞分析发现LALF31-52可降低TNF产物，但不影响氧化氮的产生，表明LALF修饰了LPS诱导的反应。在鼠暴发性腹膜脓毒症模型中，LALF31-52预防性给药或在全身性炎症反应开始后可明显降低脓毒症模型小鼠肝、脾组织细胞因子表达，改善全身性TNF-α反应，减少了器官损害，增加小鼠的生存率[Clin.Diag.LaboL Immun.，2000，7(4)：669-675；Int.Immunopharm.，2003，3：247-256.]。Ried等报道，LALF的中和LPS最小功能区则位于36—45氨基酸残基之间。他们合成了4种重叠的线性肽，每一种均有10个氨基酸长，且都含有这个位点的部分氨基酸。结果显示，所有LALF衍化的线状肽均能以较无阳性电荷的肽NEU-10高的亲和力与类脂A结合。

另外，大多数抗菌肽C端多呈现酰胺化，它对杀菌活性至关重要。为了增强鲎抗内毒素因子线性模拟肽的抗菌、抗内毒素的生物活性，将其C端进行酰胺化处理。

本发明应用生物信息学分析LALF及其功能区的结构特性，应用计算机分子模拟技术，设计并合成了一系列C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽，通过鲎试验、生物传感器亲和力试验、体外抗菌试验及小鼠体内LPS中和试验和保护试验等多种实验手段，获得了多条具有较理想中和内毒素及抗菌活性的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽，显示了进一步开发成为新型抗菌、抗内毒素药物的潜力。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一系列杀灭细菌、治疗内毒素血症的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子。

本发明的另一个目的在于提供一种合成上述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子的方法。

本发明的再一个目的在于提供上述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子在制备治疗G^-细菌感染和内毒素血症的药物中的应用。

我们设计的目标分子是要与作为受体的LPS分子结合的配体。目前已经知道，受体与配体结合时必须满足相互匹配原则。受体与配体之间的化学和几何互补性决定着受体与配体之间结合的程度[大连大学学报，2002，23(6)：22-30]。文献报道，LALF是作用于LPS的理想配体，它的质子化可使分子表面带电和疏水化，造成分子两性化，疏水部分进入脂质双分子层，碱性侧链指向带负电荷的LPS头端[J Infect Dis，1994，170(6)：1490-7]。可见，分子的电势差和疏水性是LALF中和LPS的关键，这也是大多数抗菌肽的结构特征。

以上研究和对鲎抗内毒素因子及其功能区位点的大量分析结果为C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的模拟设计打下了坚实基础。在应用生物信息学分析LALF及其功能区的结构特性后，我们应用计算机分子模拟技术，以LALF功能区位点为模板基于PHD方法，设计了下述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽：

CRKPT FRRLK WK X¹ K X² KFKC—NH₂

X¹可以是Y或E或M或A或L或K或F或Q或W或I或V等；

X²可以是G或F或M或I或L或V或N等；

设计上述多肽的主要出发点是：①以各种鲎抗内毒素因子功能区位点比对得出的高度保守序列RLKWK为中心向两端扩展，保留残基数在16-20个范围。②尽量模拟LALF_31-52和LALF_36-45的二级结构特征、电荷分布、两亲性、等电点、结合能等各种理化特性进行变构设计。

用GOR4、Antheprot 5.0对这些模拟肽分子进行二级结构预测分析发现，这些分子与LALF鲎抗内毒素因子功能区位点结构相似，均以部分高度保守残基为中心形成扩展链结构，只是构成的残基数目和比例有所差异。

通过固相多肽合成法，采用多肽合成仪自动合成和手工合成相结合，成功合成了上述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽和对照肽。这些多肽转盐为其他盐类，并用于相应的生物活性研究。

上述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子可以表现为多肽的药学上可接受的各种无机酸、有机酸的盐类，诸如三氟醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、氨基酸盐等。

上述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子可以表现为多肽的链中环肽或端位非二硫键环肽。

上述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子可以表现为各种多肽的链中环肽或端位非二硫键环肽的药学上可接受的各种无机酸、有机酸的盐类，诸如三氟醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、氨基酸盐等。

再一方面，本发明涉及联合制剂，该联合制剂包括一种具有选择性地中和内毒素及抗菌活性尤其是中和内毒素功能的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽，或其药物学上可接受的盐，和一种在药物学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子的制法

C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子的肽树脂的合成，采用多肽合成仪自动合成和手工合成单独进行，也可互相结合实施。手工合成，可以按照通法进行：

称取适量Fmoc-AA-RinK amide树脂或其它适宜的多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂DCM溶胀，以10％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，用DCM、MeOH、DMF依次洗涤。按照本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的氨基酸序列依次称取适量的Fmoc-氨基酸于适宜的容器中，加入适量DMF溶解，然后加入偶联剂(如TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，DIC/HOBt，DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，etc)和适量氮甲基吗啉或二异丙基乙胺的DMF溶液。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF依次洗涤。按照多肽固相化学合成方法依照本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的氨基酸序列从C端开始依次进行后续偶联，如此循环完成整个C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽肽链的合成，得到母体肽树脂；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，取出合成的肽树脂，冻干备用。

取出合成的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子的肽树脂，加入适量裂解液，搅拌，反应2-5小时，无水乙醚沉降，离心；加入无水乙醚，搅匀，离心，重复6次。加水或醋酸水溶液，冻干。HPLC纯化，冻干或转盐后冻干，质谱仪测定分子量，HPLC检查纯度及离子含量。确证合格后装瓶。

本发明设计的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的生物活性研究

通过鲎试验、生物传感器亲和力试验、细胞因子刺激试验、细胞毒性试验、体外抗菌试验及小鼠体内LPS中和试验和保护试验等多种实验手段，以便探索既能杀菌又能中和内毒素的新药物。

鲎试验进行的初筛测定结果显示，REMP1、REMP2、LALF_31-52在10uM水平均有不同程度内毒素中和活性，活性强弱依次为LALF31-52>REMP2>REMP1；XS10无内毒素中和活性。线性模拟肽多浓度鲎试验进一步表明，上述各肽各浓度水平内毒素实测值与阳性对照组间比较，具有显著性差异；按80uM和10uM水平内毒素中和率计算，活性强弱依次为LALF_31-52(90％，65.7％)、REMP2(76.4％，57.2％)、REMP1(64.3％，37.37％)，将将REMP1、REMP2各肽的各浓度组内毒素实测值与LALF31-52各相应浓度组进行比较，所有P值均<0.05，具有统计学意义，说明REMP1、REMP2的内毒素中和活性低于LALF_31-52。

生物传感器检测结果显示，从每条肽最高浓度的反应速率看，与LPS的亲和反应速率高低依次为LALF_31-52(1864.82)>REMP2(1531.87)>REMP1(961.95)>XS10(823.75)，与鲎试验结果基本一致。按Kd值显示的亲和力高低依次为REMP2(19.798)>LALF_31-52(47.80)>REMP1(93.40)>XS10(164.03)，与鲎试验结果较为吻合。

模拟肽体外抗菌活性研究发现，LALF_31-52对大肠杆菌ATCC25922的MIC为32μg/ml，对两株洛菲氏不动杆菌的MIC为64μg/ml，对4株临床大肠杆菌的MIC为32μg/ml，对鲍曼不动杆菌、阴沟杆菌、金葡菌、绿脓杆菌无效。XS10对标准金葡菌ATCC25923有微弱作用，MIC为128μg/ml；对1株临床大肠杆菌和3株洛菲氏不动杆菌的MIC为16μg/ml；对1株鲍曼不动杆菌的MIC为64μg/ml，1株临床金葡菌的MIC为64μg/ml。REMP1对大肠杆菌ATCC25922的最低抑菌浓度为16ug/ml，对3株洛菲氏不动杆菌的MIC为32ug/ml，对4株临床大肠杆菌的MIC与LALF_31-52相同，均为32ug/ml，对阴沟杆菌、金葡菌MIC分别为16和32ug/ml。REMP2对大肠杆菌ATCC25922 MIC为128；对金葡菌ATCC25923为64；对洛菲氏不动杆菌为64和32；对临床大肠杆菌为128和64；对临床金葡菌、鲍曼不动杆菌为128ug/ml。

鲎试验测定模拟肽在小鼠体内中和LPS的结果显示，LPS中和率按高低排序依次为LALF31-52(94.54％)>REMP2(90.45％)>REMP1(59％)>XS10(3.7％)。模拟肽中和LPS小鼠血清诱导释放TNF-a的结果显示，模拟肽自身组小鼠血清处理RAW264.7细胞后的TNF-a水平与本底水平相似(P>0.05)，提示模拟肽在小鼠体内无刺激诱导TNF-a释放的作用；除XS10外，REMP2、和REMP1均呈现明显的LPS中和活性，中和LPS活性强弱依次为LALF_31-52(87.36％)>REMP2(73.34％)>REMP1(56.3％)>XS10(0.6％)。

模拟肽对LPS攻击小鼠具有保护作用。20mg/kg的LPS攻击小鼠后，LPS组小鼠在8小时即开始出现死亡，8～18h为死亡高峰期，24h内动物全部死亡；模拟肽组动物在8～16h也出现部分死亡，死亡时间明显延迟，7日生存率显著提高。LALF_31-52的剂量效应明显，在80、40、20、10、5μM水平时小鼠的7日生存率分别为80、70、70、60、50％。REMP2组的小鼠7日生存率均在30—60％之间，REMP1组的小鼠7日生存率均在20—30％之间，与LPS组相比，对小鼠的死亡时间有一定延长作用，REMP2的体内保护作用较REMP1强。

本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽可以辅以药用稀释剂、佐剂及载体制成药用组合物，如片剂、粉剂、丸剂、溶液或悬浮剂，通过口含、注射或其他方式给药，用于治疗G-细菌感染和内毒素血症；本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽还可与其他药物复合，用于治疗G-细菌感染和内毒素血症。

本发明所述C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽在于制备杀灭细菌药物和治疗内毒素血症的药物。

本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽作为稀释剂、佐剂及载体用于制备治疗G-细菌感染和人内毒素血症的药物。

至少两个相同或不同的本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽相连成一个肽，用于制备治疗G^-细菌感染和内毒素血症的药物。

另外，至少两个相同或不同的本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽相连成一个肽，可以作为稀释剂、佐剂及载体作为治疗G^-细菌感染以及防治脓毒症的药物。

附图说明

图1-1  LPS 055：B5在疏水样品池的包被的表征图。

图1-2  不同浓度本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽REMP1与LPS亲和力作用图。

图1-3  本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽REMP1的平衡解离常数(Kd)测定图。

图1-4  不同浓度本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽REMP2与LPS亲和力作用图。

图1-5  本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽REMP2的平衡解离常数(Kd)测定图。

图1-6  不同浓度LALF_31-52与LPS亲和力作用图。

图1-7  LALF_31-52的平衡解离常数(Kd)测定图。

图1-8  不同浓度本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽XS10与LPS亲和力作用图。

图1-9  本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽XS10的平衡解离常数(Kd)测定图。

图2-1  模拟肽小鼠体内LPS中和率

图2-2  小鼠TNF-a标准曲线

图3-1  REMP1-cp HPLC图谱

图3-2、REMP1-pp HPLC图谱

图3-3  REMP2-cp HPLC图谱

图3-4  REMP2-pp HPLC图谱

图3-5  LALF_31-52-cp HPLC图谱

图3-6  LALF_31-52-pp HPLC图谱

图3-7  XS10-cp HPLC图谱

图3-8  XS10-pp HPLC图谱

图3-9  REMP1-pp MALDI-TOF图谱

图3-10 REMP2-pp MALDI-TOF图谱

图3-11 XS10-pp MALDI-TOF图谱

图3-12 LALF_31-52-pp MALD1-TOF图谱

具体实施方式

除非另有定义，本发明所用的技术和科学上的术语，与本发明所属领域的通用技术的一般理解具有相同意义。这里使用的任何保护性基团，氨基酸和其他化合物的缩写，与它们通用的、公认的缩写或IUPAC-IUB委员会颁布生化命名一致，除非特别说明。

下面是本发明的具体实施例，所述的优选实施例是用于描述本发明而不是限制本发明。

实施例1

合成所需主要试剂与仪器如下。其后的合成实施例所用的主要试剂和仪器与此相同，不再说明。需要说明的是，所设计的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽多数采用手工合成方法。

本实施例涉及REMP1-041104的合成，用以说明本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的一种手工合成方法(TBTU激活法)与纯化方法。

1.REMP1-041104肽树脂的合成

REMP1的肽序是：CRKPTFRRLKWKYKGKFKC—NH₂。

称取1.571g(0.5mmol)Fmoc-Cys(Trt)-RinkAmide Resin-041104倒入合成柱中，加入30mL DCM-DMF(1：2，v/v)溶胀。30min后抽出溶剂，以13mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，15min后用DCM、MeOH、DMF依次洗涤。称取0.938g Fmoc-Lys(Boc)-OH于100mL锥形瓶中，加入10mL DMF溶解，分批加入0.783gTBTU、0.301g HOBt和35mL 25％二异丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮检测反应过程。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂，得到二肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF依次洗涤。按照类似的方法，投入后续Fmoc保护的氨基酸、对应的TBTU及HOBt(见表1)，继续偶联。反应完成后得到三肽树脂，脱除Fmoc，洗涤，依照本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽母体的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽肽链的合成，得到母体肽树脂；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，取出合成的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽树脂，置冻干机中冻干，得肽树脂2.869g，增重62.3％。

                     表1 REMP1肽树脂合成的投料表

2.REMP1-041104-S-R肽树脂裂解

先进行预裂解。取出502mg肽树脂，加入20mL DCM，溶胀，30min后抽干，加入15mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除肽树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干。常规裂解(裂解剂：TFA∶Phenol∶Water∶TIS＝88∶5∶5∶2，v/v，15mL；室温，3小时)，无水乙醚多次沉降得粗肽REMP1-CP-041104-S-R 250mg，粗肽收率115.6％，白色固体；MALDI-TOF-MS 2471.9；证明母体合成成功。

在余下的1.633g REMP1-041104-S-R肽树脂中，加入20mL裂解剂(同上)，搅拌，室温反应3.5小时，350mL无水乙醚沉降，离心；加入150mL无水乙醚，搅匀，离心，重复4次。加50％醋酸水溶液75mL，冷冻干燥得REMP1-CP-041104-S-R878mg，收率124.9％，HPLC纯度81.2％，MALDI-TOF-MS 2471.9。证明合成成功，得到具有下列肽序的产物：CRKPTFRRLKWKYKGKFKC—NH₂。

3.REMP1-CP-041104-S-R粗肽纯化

REMP1-CP-041104-S-R粗肽，加少量无热原纯水使粗肽充分溶解，得到0.5mg/mL浓度的样品溶液，经针式滤器过滤(0.45μm有机滤膜)，收集滤液，按下述色谱条件纯化。

仪器：     Dionex P680

分析柱：   Vydac  反相C18 10mmx150mm

流动相：   A：H₂O+0.1％TFA  B：ACN

流速：     5mL/min     检测波长：214nm

洗脱梯度：

HPLC纯化，得精肽REMP1-PP-041104-S-R 520.2mg，收率42.1％。

CRKPTFRRRLKWKkKGKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKEKGKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKMKGKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKFKGKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKQKGKFKC—NH₂，等均能按此法合成。

实施例2

本实施例涉及REMP2的合成，用以说明本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的另一合成方法(TBTU/DIC激活法)。

1.REMP2-041104肽树脂的合成

REMP2的肽序是：CRKPTFRRLKWKIKGKFKC—NH₂。

称取1.569g(0.5mmol)Fmoc-Cys(Trt)-Rink Amide Resin-041104倒入合成柱中，加入25mL DMF溶胀。30min后抽出溶剂，以15mL 25％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，10min后用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤。称取0.938gFmoc-Lys(Boc)-OH于100mL锥形瓶中，加入10mL DMF溶解，分批加入0.51mL DIC、0.310gHOBt和35mL 25％二异丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮检测反应过程。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂，得到二肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF依次洗涤。按照类似的方法，投入后续Fmoc保护的氨基酸、相应的DIC或TBTU及HOBt(见表2)，继续偶联。反应完成后得到三肽树脂，脱除Fmoc，洗涤，依照本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽母体的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成整个C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的肽链，得到母体肽树脂；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，取出合成的肽树脂，冻干，得肽树脂2.475g，肽树脂增重0.906g，肽树脂收率74.8％，相当于每步偶联率98.5％。

                     表2 REMP2-041104肽树脂合成的投料表

^*激活剂是DIC，用量为0.51mL.

2.REMP2-041104肽树脂裂解

2.475g肽树脂，加入50mL DCM，溶胀，30min后抽干，加入40mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除肽树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干。常规裂解(裂解剂：TFA：Thioanisole：EDT：Anisole＝90∶5∶3∶2，v/v，15mL；室温，3.5小时)，450mL无水乙醚沉降，离心；加入150mL无水乙醚，搅匀，离心，重复4次。加50％醋酸水溶液80mL，冷冻干燥得REMP2-CP-041104-S-R 1373mg，粗肽收率113.4％，HPLC纯度63.4％，MALDI-TOF-MS 2422.8。证明合成成功，得到具有下列肽序的产物：CRKPTFRRLKWKIKGKFKC—NH₂。

3.REMP2-CP-041104-S-R粗肽纯化

REMP2-CP-041104-S-R粗肽，加少量无热原纯水使粗肽充分溶解，得到0.5mg/mL浓度的样品溶液，经针式滤器过滤(0.45μm有机滤膜)，收集滤液，按下述色谱条件纯化。

仪器：     Dionex P680

分析柱：   Vydac  反相C18    4.6mmx150mm

流动相：   A：H₂O+0.1％TFA      B：ACN

流速：     5mL/min         检测波长：214nm

洗脱梯度：

HPLC纯化，得精肽REMP2-PP-041104-S-R528mg，收率43.6％。

此外，CRKPTFRRLKWKIKFKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKYKFKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKYKIKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKYKLKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKYKVKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKYKNKFKC—NH₂，等都可按此法合成.

实施例3

本实施例涉及XS10的合成，用以进一步说明本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽第二种手工合成方法(TBTU/DIC激活法)。

1.XS10-041104肽树脂的合成

XS10的肽序是：CKIN PTVKR IKFRY KGKFC-NH₂。

称取1.566g(0.5mmol)Fmoc-Cys(Trt)-RinkAmide Resin-041104倒入合成柱中，加入28mL DMF溶胀。35min后抽出溶剂，以20mL 25％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，10min后用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤。称取0.787gFmoc-Phe-OH于50mL锥形瓶中，加入10mL DMF溶解，分批加入0.739g TBTU、0.295gHOBt和35mL 25％二异丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮检测反应过程。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂，得到二肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF依次洗涤。按照类似的方法，投入后续Fmoc保护的氨基酸、相应的DIC或TBTU及HOBt(见表3)，继续偶联。反应完成后得到三肽树脂，脱除Fmoc，洗涤，依照本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽母体的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成整个肽链的连接，得到母体肽树脂；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，取出合成的肽树脂，冻干，得肽树脂2.42g，肽树脂增重0.854g，肽树脂收率73.4％。

                     表3 XS10-041104肽树脂合成的投料表

^＊激活剂是DIC，用量为0.51mL.

2.XS10-041104肽树脂裂解

2.42g肽树脂，加入40mL DCM，溶胀，30min后抽干，加入40mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除肽树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽千。常规裂解(裂解剂：TFA：Thioanisole：EDT：Anisole＝90∶5∶3∶2，v/v，15mL；室温，3小时)，400mL无水乙醚沉降，离心；加入150mL无水乙醚，搅匀，离心，重复4次。加20％醋酸水溶液100mL，冷冻干燥得XS10-CP-041104-S-R 1249mg，粗肽收率107.4％，HPLC纯度61.3％，MALDI-TOF-MS 2327.4。证明合成成功，得到具有下列肽序的产物：CKINPTVKR IKFRY KGKFC-NH₂。

3.XS10-CP-041104-S-R粗肽纯化

XS10-CP-041104-S-R粗肽，加少量无热原纯水使粗肽充分溶解，得到0.5mg/mL浓度的样品溶液，经针式滤器过滤(0.45μm有机滤膜)，收集滤液，按下述色谱条件纯化。

仪器：    Dionex P680

分析柱：  Vydac   反相C18 4.6mmx150mm

流动相：  A：H₂O+0.1％TFA   B：ACN

流速：    5mL/min        检测波长：214nm

洗脱梯度：

HPLC纯化，得精肽XS10-PP-041104-S-R 458.6mg，收率39.4％。

实施例4

本实施例涉及LALF_31-52的合成，用以说明本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽第三种手工合成方法(DIC激活法)。

1.LALF_31-52-041130肽树脂的合成

LALF_31-52的肽序是：CHYRIKPTFRRLKWKYKGKFWC

称取1.60g(0.5mmol)Fmoc-Cys(Trt)-2-chlorotrityl Resin倒入合成柱中，加入30mLDCM-DMF(1：2，v/v)溶胀。30min后抽出溶剂，以20mL 30％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，30min后用DCM、MeOH、DMF依次洗涤。称取1.056gFmoc-Trp(Boc)-OH于50mL锥形瓶中，加入10mL DMF溶解，依次加入0.5mL DIC、0.328gHOBt和30mL 25％二异丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮检测反应过程。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂，得到二肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF依次洗涤。按照类似的方法，投入后续Fmoc保护的氨基酸、对应的DIC及HOBt(见表4)，继续偶联。反应完成后得到三肽树脂，脱除Fmoc，洗涤，依照本发明的C端酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽母体的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成其肽链的合成，得到母体肽树脂；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，取出肽树脂，冻干，得肽树脂5.299g，增重3.699g，增重率149.7％。

                 表4 LALF_31-52肽树脂合成的投料表

2.LALF_31-52-041104肽树脂裂解

先进行预裂解。取出514mg LALF_31-52-041130-S-CT肽树脂，常规裂解(裂解剂：TFA∶Thioanisole∶EDT∶Anisole＝90∶5∶3∶2，v/v，10mL；室温，3小时)，无水乙醚多次沉降得粗肽LALF_31-52-CP-041130-S-R 296mg，粗肽收率207.3％，白色固体；MALDI-TOF-MS2944.6；证明母体合成成功。

在余下的4.772g肽树脂中，加入50mL裂解剂(同上)，搅拌，室温反应3.5小时，600mL无水乙醚沉降，离心；加入300mL无水乙醚，搅匀，离心，重复4次。加45％醋酸水溶液400mL，冷冻干燥得LALF_31-52-CP-041130-S-R 3.046mg，收率229.8％，HPLC纯度75.2％，MALDI-TOF-MS 2944.6。证明合成成功，得到具有下列肽序的产物：CHYRIKPTFRRLKWKYKGKFWC。

3.LALF_31-52-CP-041130-S-R粗肽纯化

LALF_31-52-CP-041130-S-CT粗肽，加少量无热原纯水使粗肽充分溶解，得到0.5mg/mL浓度的样品溶液，经针式滤器过滤(0.45μm有机滤膜)，收集滤液，按下述色谱条件纯化。

仪器：    Dionex P680

分析柱：  Vydac  反相 C18 10mmx150mm

流动相：  A：H₂O+0.1％TFA   B：ACN

流速：5mL/min      检测波长：214nm

洗脱梯度：

HPLC纯化，得精肽LALF_31-52-PP-041130-S-CT 726mg，收率49.3％。

此外，CRKPTFRRLKWKFKNKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKYKMKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKQKVKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKWKGKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKMKFKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKAKNKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKFKFKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKWKVKFKC—NH₂，CRKPTFRRLKWKVKGKWKC—NH₂，等都可按此法合成.

实施例5

本实施例取C端酰氨化鲎抗内毒素因子线性模拟肽REMP1、REMP2、XS10与对照线性肽LALF_31-52进行鲎试验初筛。

1、材料

鲎试剂：湛江安度斯公司生产，批号0310310，灵敏度：0.03EU/ml。

模拟肽：REMP1、REMP2、LALF_31-52、XS10(深圳翰宇生物工程有限公司合成，批号分别为041104、041104、041130)。

内毒素检测专用水，湛江安度斯公司生产，批号0210290。

内毒素标准品E.coli 011：B4，湛江安度斯公司生产，批号0307150，10EU/支。

EDS99-内毒素定量检测仪，湛江正杰科学仪器有限公司生产。

2、方法

1)用生理盐水将上述各肽配制成80uM液各0.5ml，用EP管将各肽分装并用生理盐水稀释为20uM液各2管，100ul/管，其余存放—80□冰箱保存备用。配制方法见表5。

2)取内毒素检测系统标准曲线近中点浓度0.5EU/ml，用生理盐水将内毒素标准品配制为0.5EU和1EU/ml液(配制前充分震荡半小时，每稀释一步前再震荡15秒)。

3)于上述样品组盛有模拟肽稀释液的EP管中按编号加入1EU/ml内毒素标准品各100ul，使各肽的反应终浓度为10uM，内毒素为0.5EU/ml，混合后置37□孵箱孵育15min。

4)取12支内毒素检测专用玻璃管，于每管中各加入鲎试剂100ul(加入时用毛细管直插管底缓缓加入，勿产生气泡)。

5)取出孵育的内毒素/肽混合液，于上述盛有鲎试剂的内毒素检测专用管中按编号加入各肽/内毒素混合液各100ul；于标准对照和空白对照管中分别加入0.5EU/ml内毒素标准品和生理盐水各100ul，立即上机检测。

6)内毒素中和率计算：内毒素中和率＝(标准对照LPS实测值一样品组LPS实测值)/标准对照LPS实测值×100％。

                        表5 模拟肽样品配制

          表6 模拟肽中和LPS鲎试验结果

实验结果分析：

(1)REMP1、REMP2、LALF_31-52在10uM水平均有不同程度内毒素中和活性，按内毒素中和率计算，活性强弱依次为LALF31-52(62.2％)、REMP2(58.5％)、REMP1(36.3％)。

(2)XS10中和内毒素后内毒素实测值高于标准对照值，说明该肽无内毒素中和活性或对鲎试剂有干扰作用。

实施例6

本实施例涉及C端酰氨化鲎抗内毒素因子线性模拟肽多浓度鲎试验。

1、材料

模拟肽：REMP1、REMP2、LALF_31-52(深圳翰宇生物工程有限公司合成，批号分别为041104、041104、041130)。

其余材料与实施例5相同。

2、方法

1)用生理盐水将上述各肽配制成160uM液各1ml，从中取出0.5ml倍比稀释为80、40、20uM液各500ul；取160uM液100ul×3管。其余存放4□冰箱保存备用。配制方法见表7。

                     表7 各模拟肽取样量及配制

2)取内毒素检测系统标准曲线近中点浓度0.5EU/ml，用生理盐水将内毒素标准品配制为0.5EU和1EU/ml液(配制前充分震荡半小时，每稀释一步前再震荡15秒)。

3)于上述样品组盛有160、80、40、20uM模拟肽液的EP管中按编号加入1EU/ml内毒素标准品各100ul，使各肽的反应终浓度为80、40、20、10uM，内毒素为0.5EU/ml，混合后置37□孵箱孵育15分钟。

4)取鲎试剂2支，无菌开启后各加入生理盐水1.25ml，混匀后取15支内毒素检测专用玻璃管，于每管中各加入鲎试剂100ul(加入时用毛细管直插管底缓缓加入，勿产生气泡)。

5)取出孵育的内毒素/肽混合液，于上述盛有鲎试剂的内毒素检测专用管中按编号加入各肽/内毒素混合液各100ul；于标准对照和空白对照管中分别加入0.5EU/ml内毒素标准品和生理盐水各100ul，立即上机检测。

6)内毒素中和率计算：内毒素中和率＝(标准对照LPS实测值一样品组LPS实测值)/标准对照LPS实测值×100％。

                          表8 各肽内毒素中和率

P^**均<0.01。

注：P^*：各肽各浓度组与LALF31-52各相应浓度组间比较；P^**：各肽各浓度组与阳性对照组间比较。

实验结果分析：

上述各肽各浓度水平内毒素实测值与阳性对照组间比较，P值均<0.01，具有显著性差异，说明各肽在各浓度水平均有不同程度内毒素中和活性，按80uM和10uM水平内毒素中和率计算，活性强弱依次为LALF_31-52(90％，65.7％)、REMP2(76.4％，57.2％)、REMP1(64.3％，37.37％)。实验中LALF_31-52作为对照肽，将REMP1、REMP2各肽的各浓度组内毒素实测值与LALF31-52各相应浓度组进行比较，所有P值均<0.05，具有统计学意义，说明这2种肽的内毒素中和活性低于LALF_31-52。

实施例7

本实施例涉及生物传感器检测C端酰氨化鲎抗内毒素因子线性模拟肽的情况。

1.材料

C端酰氨化线性鲎抗内毒素因子模拟肽REMP1、REMP2、XS10及对照肽LALF_31-52，深圳翰宇生物工程有限公司合成，批号分别为041104、041104、041130；

LPS055：B5，美国Sigma公司；

无热原磷酸缓冲液(PBS)，按照无菌技术称取磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水100ml，用0.1mol/L NaOH调pH为7.0，再经滤器过滤除热原；

生理盐水(NS)，pH5.8，西南医院药理基地生产；

漩涡震荡仪，XW-80A，上海医科大学仪器厂生产；

生物传感器及其疏水样品池，美国Thermo公司；

YJ-875SA型超净工作台，上海复星高科技有限公司。

2.方法

2.1 生物传感器检测REMP1、REMP2、XS10及对照肽LALF_31-52与LPS的亲和力

2.1.1 生物传感器疏水样品池LPS的包被

根据Thermo公司疏水样品池的包被流程^[66]，将LPS包被在疏水样品池中，并计算包被的LPS量。具体步骤如下：根据包被的要求，仪器包被温度设定为22℃，搅拌速率设定为85次/sec，数据采集设定为2次/sec；放入疏水样品池，异丙醇清洗50μl×5，收集数据曲线1min；PBS/AE清洗60μl×7，采集数据10min；异丙醇清洗50μl×7，采集数据曲线1min；加入2mg/ml的LPS氯仿溶液20μl(用前超声10sec)，留置1min：PBS/AE清洗50μl×7，采集数据5min；1M HCl清洗50μl×5，留置1min；PBS/AE清洗60μl×7，采集数据5min；10mM NaOH清洗50μl×5，留置1min；PBS/AE清洗60μl×7，采集数据5min，计算包被值；5mg/ml BSA 90μl，保留5min；PBS/AE清洗60μl×5，保留1min；检查包被后的共

图形。

2.1.2 REMP1、REMP2、XS10及对照肽LALF_31-52与LPS的亲和力测定

用PBS(pH7.0)配制模拟肽进行生物传感器检测。以不同的模拟肽溶液为流动相，分别与疏水样品池中的LPS进行结合、解离、再生反应。具体步骤如下：用PBS(pH7.0)分别将模拟肽配制和倍比稀释为80、40、20、10μM浓度液进行试验，生物传感器搅拌速率设定为98次/sec，数据采集设定为3次/sec，温度设定为25℃；包被LPS的疏水样品池加入50μl的pH 6.0、0.02M PBS，冲洗五次，保留至基线平衡后吸出；结合反应：加入PBS 45μl，再加入5μl待测样品，结合反应平衡后吸出待测样品：解离反应：PBS冲洗50μl×3，解离反应平衡后吸出；再生反应：0.1N的HCl 50μl×3，再生反应平衡后吸出；PBS冲洗50×3，曲线回至基线后加入45μl PBS，开始新的循环；储存实验数据；通过FASTplot和FASTfit作图或计算平衡解离常数Kd值；Kd值计算：Kd＝Intercept/Gradient。

3.结果

3.1生物传感器疏水样品池的包被LPS O55∶B5在疏水样品池中的包被量为183.2arcsecond(A、B两点间差的绝对值)，为脂类物质在疏水样品池中包被量的理想范围。根据厂商提供的检测方法，包被后的基线为锐利对称的单峰图形，证明所包被的LPS在疏水样品池中形成均匀的单层脂膜，见图1-1。

3.2 从每条肽最高浓度的反应速率看，与LPS的亲和反应速率高低依次为LALF_31.52(1864.82)>REMP2(1531.87)>REMP1(961.95)>XS10(823.75)，与鲎试验结果基本一致。

3.3 由于生物传感器检测的Kd值最能反应某两种物质之间的亲和力高低，它与亲和力的高低成反比，Kd值越低，表明两种物质之间的亲和力越高。按Kd值显示的亲和力高低依次为REMP2(19.798)>LALF_31-52(47.80)>REMP1(93.40)>XS10(164.03)与鲎试验结果较为吻合，见图1-2～1-9，表9。

              表9 肽不同浓度与LPS的亲和力及Kd值

实施例8

本实施例涉及C端酰氨化鲎抗内毒素因子线性模拟肽体外抗菌活性研究。

1、材料

1.1 主要仪器：BP211D型微量天平(法国Sartorious公司生产，测量范围0.1mg-210g，精度为0.01mg)；DNP-9162电热恒温培养箱；漩涡震荡仪(XW-80A，上海医科大学仪器厂生产)；多点接种仪，日本仓光株式会社生产。

1.2 主要试剂和药品：

鲎抗内毒素因子线性模拟肽REMP1、REMP2、XS10及对照肽LALF_31-52，深圳翰宇生物工程有限公司合成，批号分别为041104、041104、041130；

Mueller-Hinton培养基，中国药品生物制品检定所，批号010925。

水解酪蛋白琼脂，杭州微生物试剂厂生产。

标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿色假单孢菌27853由西南医院国家药理基地提供；临床分离病菌大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿色假单孢菌、由西南医院检验科分离鉴定。

无热原磷酸缓冲液(PBS)：按照无菌技术称取磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水100ml，用0.1mol/L NaOH调pH为7.0，再经滤器过滤除热原。

2 方法

2.1 用生理盐水将肽配制为256、128、64、32、16mg/L五个浓度进行初筛实验。样品量计算和配制见表10。

                        表10 样品量计算

2.2 实验菌液制备实验前，从保存菌种的半固体培养基斜面上取适量菌苔，接种在MH培养基上，于37□培养16—18h，再挑取新鲜的菌落接种在MH肉汤培养基中，于37□增菌培养16—18h，取出后每管菌液用MH肉汤培养基分别稀释为10⁷—10⁸CFU/ml，保持菌液终接种量为每点10⁴—10⁵CFU。

2.3 最低抑菌浓度(MIC)测定采用琼脂二倍稀释法，将各样品含量为640、320、160、80、40ng/100μl的溶液分别取100μl放入直径30mm的平皿中，再加入2.4ml MH培养基，即得样品含量分别为256、128、64、32、16ug/ml的琼脂平皿，待琼脂凝固后，用多点接种观察结果，未见细菌生长平皿的最低样品浓度为MIC。实验结果按2000年NCCLS标准判断。

3.结果

3.1.LALF_31-52对大肠杆菌ATCC25922的MIC为32μg/ml，对两株洛菲氏不动杆菌的MIC为64μg/ml，对4株临床大肠杆菌的MIC为32μg/ml。对鲍曼不动杆菌、阴沟杆菌、金葡菌、绿脓杆菌无效，见表11。

         表11 LALF_31-52抗菌结果

注：+为细菌生长；—为无菌生长

3.2 XS10对标准金葡菌ATCC25923有微弱作用，MIC为128μg/ml。对1株临床大肠杆菌和3株洛菲氏不动杆菌的MIC为16μg/ml。对1株鲍曼不动杆菌的MIC为64μg/ml，1株临床金葡菌的MIC为64μg/ml，见表12。

              表12 XS10的抗菌结果

注：+为细菌生长；—为无菌生长

3.3 REMP1对大肠杆菌25922的最低抑菌浓度为16ug/ml，对3株洛菲氏不动杆菌的MIC为32ug/ml，对4株临床大肠杆菌的MIC与ALF31-52相同，均为32ug/ml，对阴沟杆菌、金葡菌MIC分别为16和32ug/ml。见表13。

               表13 REMP1抗菌结果

注：+为细菌生长；—为无菌生长

3.4 REMP2对大肠杆菌25922MIC为128；对金葡25923为64；对洛菲氏不动杆菌为64和32；对临床大肠杆菌为128和64；对临床金葡、鲍曼不动杆菌为128ug/ml。见表14。

   表14 REMP1抗菌结果

注：+为细菌生长；—为无菌生长

实施例9

本实施例涉及C端酰氨化鲎抗内毒素因子线性模拟肽小鼠体内活性研究。

1 材料

1.1 主要试剂和仪器

LPS标准品E.coli 011：B4                 湛江安度斯公司生产，批号0307150，10EU/支。

LPSO 111：B4                             Sigma公司，批号69H4157

鲎试剂                                   湛江安度斯公司生产，批号0310310，灵敏度

                                         0.03EU/ml

鲎抗内毒素因子模拟肽：REMP1、            深圳市翰宇生物工程有限公司合成，批号分别为

REMP2、XS10及对照肽LALF_31-52              041105、041108、041130

内毒素检测专用水                         湛江安度斯公司生产，pH7.0，批号0210290

含10％胎牛血清DMEM培养基                 Gibico公司，本校药理教研室提供

小鼠TNF-α96孔标准试剂盒                  北京晶美生物工程公司生产

生理盐水(NS)                             pH5.8，西南医院药理基地生产

漩涡震荡仪                               XW-80A，上海医科大学仪器厂生产

电热恒温水浴箱                           上海医疗器械七厂生产

EDS-99细菌LPS测定系统                    湛江正杰科学仪器有限公司生产

XSZ-H生物显微镜                          重庆光学仪器厂生产

BP211D型微量天平                         法国Sartorious公司生产

酶标仪                                   BIO-RAD Mode13350，日本

YJ-875SA型超净工作台                     上海复星高科技有限公司

1.2 实验细胞RAW264.7细胞，由本校药理教研室提供。

1.3 实验动物清洁级昆明系小鼠，体重18—22g，雌雄各半，重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(渝)20020001。

2 方法

2.1 模拟肽小鼠体内中和LPS的实验研究

2.1.1 实验分组及动物处理

每条肽均设肽自身组、LPS组和肽/LPS混合组3组，每组小鼠4只，雌雄各半。另设一生理盐水组作空白对照。LPS攻击量定为2mg/kg，肽给药剂量为2mM/kg(约相当于5mg/kg或100μg/鼠)，均采用腹腔内注射给药，每只动物腹腔内注射液体总量为0.2ml/20g体重。实验前分别以生理盐水将LPS和模拟肽稀释为400μg/ml和400μM液浓度，并各取0.5ml混合(LPS 2mg/kg/肽2mM/kg)用于肽/LPS混合组。给药60min后颈椎脱臼处死动物，心脏取血10μl，生理盐水1：40稀释(为使测定结果在仪器设定的线性范围)后存放于—80℃备检。

2.1.2 鲎试验动态浊度法测定中和LPS活性测定

血清再稀释10倍，70℃水浴灭活10分钟，方法同体外活性检测的实验一。

2.1.3 中和LPS后小鼠血清TNF-a水平测定

2.1.3.1 收集对数生长期(细胞贴满培养瓶底90％以上时)RAW 264.7细胞，用PBS洗涤后将其悬浮于加10％胎牛血清的无内毒素DMEM培养基，细胞按1×10⁶个/ml(0.4ml)接种于96孔培养板。置37□、5％CO₂温箱孵育于2h。

2.1.3.2 编号并按10％体积加入相应样品组小鼠血清，即20μl。

加样后将培养板置37□温箱孵育于4h。

2.1.3.3 4h后取出培养板，将各孔上清收集350ul分别编号置于经钴Co⁶⁰辐照EP管中。提前20分钟从冰箱中取出TNFα试剂盒以平衡至室温。打开平衡至室温的TNFα试剂盒，将浓缩洗涤液用双蒸水按说明和需要量稀释。未用完的放回4□保存。

2.1.3.4 制作标准曲线：加入标准品/标本稀释液(1b)1.0ml至冻干标准品中(浓度为2000pg/ml)，按2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0八个浓度选择8孔制作标准曲线。

2.1.3.5 从已平衡至室温的密封袋中取出板条，其余密封放回4□保存。

2.1.3.6 除空白孔外，分别将标本及标准品(100ul/孔)加入相应孔中；用封板胶纸封住反应孔，37□孵箱孵育90分钟。孵育结束，洗板4次。

2.1.3.7 除空白孔外，加生物素化抗体工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37□孵箱孵育60分钟。孵育结束，洗板4次。

2.1.3.8 除空白孔外，加酶结合物工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37□孵箱孵育30分钟。同时开启酶标仪预热30分钟。孵育结束，洗板4次。

2.1.3.9 加入显色剂100ul/孔，37□，避光孵育15—20分钟。

2.1.3.10 加入终止液100ul/孔，混匀后即刻上机检测OD₄₅₀值。

2.2 模拟肽小鼠体内保护试验

取REMP1、REMP2及对照肽LALF_31-52进行小鼠体内保护实验。每条肽设80、40、20、10、5μM 5个浓度组，每组小鼠10只，雌雄各半，另设LPS阳性对照组10只和生理盐水组空白对照组。模拟肽均按4、2、1、0.5、0.25mM/kg腹腔内注射^[10]，使每鼠接受剂量大约为80、40、20、10、5μM。LPS按1个LD₁₀₀(经急性毒性试验得出为20mg/kg)给药。注射总容积为200μl。各组均于腹腔注射LPS 20秒内给予模拟肽，阳性对照组仅分别注射LPS或生理盐水，观察7日内小鼠的死亡情况。

3.结果

3.1 鲎试验测定模拟肽在小鼠体内中和LPS的结果LPS中和率按高低依次为LALF_31-52(94.54％)>REMP2(90.45％)>REMP1(59％)>XS10(3.7％)，见表15，图5-1。

               表15 鲎试验测定模拟肽在小鼠体内中和LPS的结果

注：表中“—”代表样品自身的阴性组；“+”仅注射LPS的阳性组；“0”代表注射LPS/样品混合液。

3.2 模拟肽中和LPS小鼠血清诱导释放TNF-a的结果模拟肽自身组小鼠血清处理RAW264.7细胞后的TNF-a水平与本底水平相似(P>0.05)，提示模拟肽在小鼠体内无刺激诱导TNF-a释放的作用。除XS10外，REMP2、和REMP1均呈现明显的LPS中和活性，中和LPS活性强弱依次为LALF_31-52(87.36％)>REMP2(73.34％)>REMP1(56.3％)>XS10(0.6％)，见表16。

         表16 模拟肽中和LPS小鼠血清诱导释放TNF-a结果

注：“—”为肽自身组；“+”为LPS组；“0”为LPS/肽混合组。P^*：各肽自身组与本底比较，均>0.05；P^**：肽/LPS混合组与LPS组比较，均<0.01；P^***：肽几PS混合组与LPS组比较，均>0.05。

3.3 模拟肽对LPS攻击小鼠的保护作用20mg/kg的LPS攻击小鼠后，LPS组小鼠在8小时即开始出现死亡，8～18h为死亡高峰时间，24h内LPS组动物全部死亡；模拟肽组动物在8～16h也出现部分死亡，死亡时间明显延迟，7日生存率显著提高。LALF31-52的剂量效应明显，在80、40、20、10、5μM水平时小鼠的7日生存率分别为80、70、70、60、50％。REMP2组的小鼠7日生存率均在30—60％之间，REMP1组的小鼠7日生存率均在20—30％之间，与LPS组相比，对小鼠的死亡时间有一定延长作用，REMP2的体内保护作用较REMP1强。见表17、18。、

              表17 7日内不同时段小鼠生存数

                  表18 第7日各肽各浓度保护下小鼠生存率

Claims (4)

1.一种酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子，其序列为：

CRKPT FRRLK WK X¹ K X² KFKC-NH₂

其中，X¹为Y或I；X²为G。

2.一种用于治疗内毒素的药物组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1所述的酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽或其药用盐，以及药物学上可接受的载体或赋形剂。

3.权利要求1所述的酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽在制备治疗G^-细菌感染药物和治疗内毒素血症药物中的应用。

4.一种制备权利要求1中所述线性模拟肽分子的方法，其特征在于：

(1)肽树脂的合成

称取适量Fmoc-AA-Rink amide树脂或其它多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，以10％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，用DCM、MeOH、DMF依次洗涤；按照权利要求1所述酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子的氨基酸序列依次称取Fmoc-氨基酸于容器中，加入DMF溶解，然后加入偶联剂TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，DIC/HOBt，DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOSu，PyBOP/HOBt，或BOP/HOBt和氮甲基吗啉或二异丙基乙胺的DMF溶液；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF依次洗涤；通过多肽固相化学合成方法，依照权利要求1所述酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽母体的氨基酸序列从C端开始依次进行后续偶联，得到肽树脂；充分洗涤，MeOH收缩，抽干，取出合成的酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽树脂，冻干，备用；

(2)肽树脂的裂解

取出合成的酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子的肽树脂，加入裂解液，搅拌，反应2-5小时，无水乙醚沉降，离心；加入无水乙醚，搅匀，离心，重复6次，加水或醋酸水溶液，冻干；

(3)粗肽的纯化

HPLC纯化，冻干或转盐后冻干，质谱仪测定分子量，HPLC检查纯度及离子含量。

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