CN100444842C - N-芳基杂环族化合物的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式(I)化合物以及含有它们的药物组合物在制备抑制肿瘤转移药物中的新用途。

Description

N-芳基杂环族化合物的制药用途

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，特别是涉及N-芳基杂芳族化合物以及含有它们的药物组合物在抑制肿瘤转移中的新用途。

背景技术

恶性肿瘤是一类对人类健康威胁最大的疾病，尽管投入了大量的人力和物力，但肿瘤的发病率和死亡率仍呈不断上升趋势。肿瘤组织和细胞具有很多不同于正常组织和细胞的特性，其中转移(metastasis)是恶性肿瘤的最主要的生物学特征和标志，也是肿瘤患者治疗失败和死亡的根本原因。临床统计90％以上的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移的相关并发症。过去40年对肿瘤细胞生长调控机制的认识及取得的成就要远远大于对肿瘤细胞侵袭转移机制的认识。由于对肿瘤转移机制缺乏根本了解，目前已有的治疗药物和方法仍限于针对肿瘤本身，而缺乏针对肿瘤转移的药物和方法。肿瘤转移是极其复杂的多基因调控和多步骤发展过程，并涉及到肿瘤细胞、机体、靶组织的相互影响和作用；涉及到一系列肿瘤相关基因的激活或失活。粘附分子、移动因子、细胞骨架、基质降解酶及其抑制物、转移抑制基因、血管形成因子和细胞游走因子等都在肿瘤侵袭和转移中起重要作用。肿瘤的侵袭和转移机制中，肿瘤血管形成和细胞游走是最重要的因素，它们又受多种血管形成因子和细胞游走因子的调节。因此，抑制血管内皮细胞的分裂增殖和肿瘤细胞游走，是治疗和预防肿瘤生长和转移的重要靶点。

目前已开发的抗肿瘤药物，从其作用机制上可分为：①抑制或阻断肿瘤细胞与外界间的信号传导通路；②干扰肿瘤细胞骨架系统的合成；③破坏或抑制肿瘤细胞的代谢过程；④阻断或抑制由肿瘤细胞诱导的新生血管形成过程。从其来源上可分为：①人工合成化合物；②重组蛋白质；③天然提取物。

在专利WO/2004/078732和US2005/0130989A1中详细公开了包括本发明通式化合物在内的N-芳基杂芳族化合物的制备方法及其抑制肿瘤细胞生长的作用。

本发明所涉及的有关化合物由法国公司Aventis Pharma S.A.的Le-Brun，Alain等人于2004年化学合成并专利了其合成方法。目前已知的该化合物的用途仅限于对体外培养的细胞系的生长状态的影响：0.2M浓度时抑制HCT116内微管蛋白的聚合；0.002M浓度时抑制HCT116细胞的增殖；1M浓度时可抑制22％被处理的HDMEC细胞的附壁。而人们对该化合物对在体肿瘤生长状态的影响尤其是对肿瘤转移的影响则一无所知¹¹。

发明内容

本发明的一个目的在于提供下述式(I)化合物在制备治疗肿瘤转移药物中的应用，

其中，R₁为Cl、CH₃，R₂为Cl、CH₃、H。

优选的化合物是其中，R₁为Cl，R₂为H，具有如式(II)所示的结构：

分子式C₂₁H₂₁ClN₄O(下称：WCH44)

化学名称[4-(3-氯苯)哌嗪-1-基](5-甲基-2-苯基-2H-吡唑-3-基)-甲酮[4-(3-Chlorophenyl)piperazin-l-yl](5-methyl-2-phenyl-2H-pyrazol-3-yl)-methanone

另一优选的化合物是其中，R₁为CH₃，R₂为CH₃，具有如式(III)所示结构：

分子式：C₂₃H₂₆N₄O(下称：WCH57)。

体外细胞实验表明，式(II)化合物(下称WCH44)和式(III)化合物(下称WCH57)对体外培养的肠癌细胞HCT116和RAS基因恶性转化细胞C11-RAS具有显著的生长抑制作用，而对正常细胞NIH/3T3和C11则抑制作用较弱，WCH44和WCH57对肿瘤细胞的生长具有选择性抑制作用。体内动物实验显示，WCH44和WCH57能显著抑制人脑神经胶质瘤细胞(C6)和人非小细胞肺癌细胞系细胞(CCL-256)的裸鼠体内移植瘤的生长，更重要的是，WHC44能非常显著地抑制裸鼠移植瘤肺转移的发生。体外血管环生长试验和体内毛细血管侵入试验显示WCH44和WCH57可显著抑制由b-FGF诱导的体内外新生血管的形成；细胞周期分析显示WCH44和WCH57显著影响人前列腺癌细胞(Dul45)的细胞周期分布，使细胞周期阻断在G2/M期，和已知的血管形成抑制剂Combratastatin的作用完全相似，WCH44对小鼠血管内皮细胞(SEND)具有上述相似的作用，但WCH57对SEND细胞周期的影响不明显，而是具有显著的诱导细胞凋亡的作用。WCH44和WCH57能有效抑制bFGF诱导的参与调控新生血管形成的转录因子Net的磷酸化过程，而对MAP激酶信号通路的其他激酶分子p42/44、P-JNK、P-p38的磷酸化没有影响，net基因是一种与血管形成及细胞增殖相关的基因^2～9，并通过对PAI-1基因表达的调控调节细胞的游走¹⁰。基因芯片分析显示体内外实验中，WHC44和WCH57可使一系列基因的mRNA的表达发生改变：抑制癌基因的表达水平；抑制多种蛋白酶及蛋白激酶的表达水平，如MAPK13、MMP3从而降低细胞增殖活性和转移能力；增强多种蛋白酶及蛋白激酶抑制剂的表达水平；增加肿瘤细胞凋亡，提高Bcl2、BAD、BAX、及P53的表达水平；降低肿瘤细胞分泌VEGF和VEGFB的能力，抑制血管形成及肿瘤的生长的转移。因此本发明的化合物具有抑制肿瘤转移的作用。

附图简要说明

图1显示WCH44对转录因子Net磷酸化水平的影响；

其中，左图为肿瘤细胞，右图为在b-FGF诱导调件下的正常细胞；44代表WCH44；45代表WCH45；

图2显示WCH44和WCH57对转录因子Net磷酸化水平的影响(20nM)；

其中，左图为在b-FGF诱导调件下的正常成纤维细胞，右图为3T3细胞，44：WCH44、45：WCH45、58：WCH58、57；WCH57；

图3显示WCH44(50nM)对正常细胞、恶性转化细胞和肿瘤生长的不同作用效果；

图4显示WCH44和WCH57(50nM)对前列腺癌细胞系(Dul45)细胞周期的影响；

图5显示WCH44和WCH57(50nM)对小鼠血管内皮细胞(SEND)细胞周期的影响；

图6显示WCH44对肿瘤细胞(非小细胞肺癌CCL细胞系)多种基因表达的作用；

图7显示WCH44和WCH57对新生血管的生成的影响；

图8显示WCH44对新生血管形成的影响；

图9显示WCH44对裸鼠皮下种植肿瘤生长的影响；

图10显示WCH44和WCH57对裸鼠皮下种植肿瘤所致肺转移的影响(非小细胞肺癌CCL)；

图11显示WCH44对裸鼠皮下种植肿瘤所致肺转移的影响(神经胶质瘤C6)；

图12显示WCH44对肿瘤实体中多种基因表达水平的影响，其中肿瘤由非小细胞肺癌CCL细胞系在裸鼠体内生成。

具体实施方式

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

为了更好地说明本发明的效果，分别选择了式(II)化合物的无效同分异构体式(IV)化合物(以下简称WCH45)和式(III)化合物的无效同分异构体式(V)化合物(以下简称WCH58)作为药效实验的对照组，式(IV)和式(V)化合物的结构式如下：

WHC45(C₂₁H₂₁ClN₄O)

WHC58(C₂₃H₂₆N₄O)

以下实验中所使用的材料如无特别说明均为市售购买。

本发明化合物的制备：

式(II)化合物的制备方法：参见专利申请WO/2004/078732中“Schema1”，“Schema 2”，“Schema 3”，“Schema 4”，“Schema 5”，“Schema6”，“Schema 7”，“Schema 8”，“Schema 9”，“Schema 10”，“Schema11”，“Schema 12”，“Schema 13”，“Schema 14”，“Schema 15”，“Schema16”，“Schema 17”，“Schema 18”，“Schema 19”，以及“Exemple 1”，“Exemple E14”。

式(III)化合物的制备方法：参见专利申请WO/2004/078732中“Schema 1”，“Schema 2”，“Schema 3”，“Schema 4”，“Schema 5”，“Schema 6”，“Schema 7”，“Schema 8”，“Schema 9”，“Schema 10”，“Schema 11”，“Schema 12”，“Schema 13”，“Schema 14”，“Schema 15”，“Schema16”，“Schema 17”，“Schema 18”，“Schema 19”，和“Exemple 2”。

式(IV)及式(V)化合物的制备方法：参见专利申请WO/2004/078732：“Schema 1”，“Schema 2”，“Schema 3”，“Schema 4”，“Schema 5”，“Schema 6”，“Schema 7”，“Schema 8”，“Schema 9”，“Schema 10”，“Schema 11”，“Schema 12”，“Schema 13”，“Schema 14”，“Schema15”，“Schema 16”，“Schema 17”，“Schema 18”，“Schema 19”。

【实施例1】本发明化合物选择性抑制net基因所编码蛋白的磷酸化

已知Net的磷酸化状态对肿瘤的发生，肿瘤的血管生成过程和细胞游走都有极为重要的作用^2～10，降低Net的磷酸化水平对肿瘤生长的抑制效果明显⁹。

方法：对Net磷酸化本底水平极低的NIH3T3小鼠成纤维细胞，分别用WCH44及其无效同分异构体WCH45进行处理，10nM处理3小时及20小时；处理后的细胞再接受40ng/ml bFGF(R&D Systems)的处理15分钟，收获细胞后将其裂解物作免疫印记(Western blotting)分析。结果见图1、图2。

结果显示：WCH44能有效抑制b-FGF诱导的Net磷酸化过程，而对MAP激酶信号通路的其他激酶分子p42/44、P-JNK、P-p38的磷酸化没有影响。

类似地，对Net磷酸化本底水平较高的人脑神经胶质瘤细胞C6、人非小细胞肺癌细胞系CCL细胞，分别用WCH44，WCH57及其无效同分异构体WCH45，WCH58进行处理。结果显示：WCH44及WCH57能有效抑制肿瘤细胞内本底较高的Net磷酸化水平。结果见图1。

【实施例2】本发明化合物选择性抑制恶性转化细胞和肿瘤细胞的生长

将细胞周期阻断于G2/M期，不能进入下一周期，并增加单个细胞中染色质的含量，最终导致细胞死亡；并使细胞增殖相关基因mRNA的表达发生改变：①抑制一系列癌基因的表达水平；②抑制多种蛋白酶及蛋白激酶的表达水平，从而降低细胞增殖活性；③增强多种蛋白酶及蛋白激酶抑制剂的表达水平；④增加肿瘤细胞凋亡，提高Bcl₂、BAD、BAX、及P₅₃的表达水平；⑤降低肿瘤细胞分泌VEGF和VEGFB的能力(见表1)。

表1：

化合物名称	分子式及分子量	IC50Net	IC50VEGF	IC50细胞毒性
					WHC44	C<sub>21</sub>H<sub>21</sub>ClN<sub>4</sub>O；380.88	1194nM	7nM	229nM
WHC45	C<sub>21</sub>H<sub>21</sub>ClN<sub>4</sub>O；380.88	670.5nM	442nM	1404nM
					WHC57	C<sub>23</sub>H<sub>26</sub>N<sub>4</sub>O；374.49	22.4nM	72nM	＞1111nM
WHC58	C<sub>23</sub>H<sub>26</sub>N<sub>4</sub>O；374.49	600.99nM	1499nM	＞3333nM

方法：

A.生长曲线：正常小鼠成纤维细胞NIH3T3(3T3ATCC)，由pRas CTBX2(Ras-V₁₂)(或其对照pΔRas空载体转染)(Wasylyk et al 1987)，然后由750μg/mlG418筛选出稳定表达Ras-V₁₂的NIH3T3克隆细胞系C11-Ras，转染对照pΔRas空载体的NIH3T3克隆细胞系(C11)(Institute de Genetique et deBiologie Moleculaire et Cellulaire，France)，人结肠癌细胞系HCT116(ATCC)，共同组成一组(四个)生长曲线基本一致的实验组。在各自相应的培养条件下，以相同的细胞数量开始培养及实验(起始细胞浓度为20％铺满状态)。然后每组细胞系分别培养于含10～100nm浓度的WCH44的培养基中，并于第1-5天收获细胞，进行MTT分析，以测算相同WCH44培养条件下各细胞系从第1天至第5天的细胞数量。结果见图3。结果显示，100nM的WCH44能显著抑制结肠癌细胞HCT116和RAS基因恶性转化细胞C11-RAS的生长，而对正常细胞NIH/3T3和C11则抑制作用较弱，肿瘤细胞较正常细胞对WCH44的生长抑制作用更敏感，说明WCH44对肿瘤细胞的生长具有选择性抑制作用。

B.细胞周期分析：人前列腺癌细胞系(Dul45(ATCC))和小鼠血管内皮细胞系(SEND(Institute de Genetique et de Biologie Moleculaire etCellulaire，France))。用WCH44，WCH57及其无效同分异构体WCH45，WCH58分别对其进行处理(相同浓度50μM和时间24h)。处理后的细胞进行固定和PI染色，进入流式细胞仪进行细胞染色质含量与细胞周期的分析。结果见图4，5。结果显示WCH44和WCH57显著影响二种细胞的细胞周期分布，可使人前列腺癌细胞系(Dul45)的细胞周期阻断在G2/M期，而且G0/G1期细胞明显减少，这与已知的血管形成抑制剂Combratastatin的作用完全相似；WCH44对小鼠血管内皮细胞(SEND)具有上述相似的作用，但化合物WCH57对SEND细胞对G2/M期的阻断不明显，而主要诱导细胞凋亡。

C.基因芯片分析：选择人非小细胞肺癌细胞系CCL-256(ATCC)。培养至80％铺满时，换成含5uM WCH44的培养基培养30分钟后，收获细胞，提取RNA，与以下Chip杂交并分析结果：“Atlas Mouse Cancer 1，2Array”和“Atlas Mouse cDNA Expression Array”(Clontech)。结果见图6，表达上调的基因包括：蛋白激酶或蛋白酶抑制剂(蛋白C抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂3、细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制剂1)；细胞周期和凋亡相关基因(Bcl-x、bcl-2相关死亡蛋白、BAX-α、TP53；其他基因(淋巴毒受体、内质网分子伴侣ERp72、DNA双链断裂修复基因RAD2同原序列、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C3、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B)。表达下调的基因包括：蛋白酶和蛋白激酶(MAPKK1、MAPKK5、MAPK14、丝氨酸/苏氨酸激酶5、丝氨酸/苏氨酸激酶6、蛋白质酪氨酸激酶9、EGF受体底物、蛋白酶B、MAP激酶p38、p44-MAPK(ERK1)、整合素结合蛋白激酶、细胞周期素依赖的蛋白激酶7、蛋白激酶C底物、IL-1受体激酶相关受体、MAPKAPK2)，整合素基因(β1整合素、β7整合素、α3整合素)；癌基因和转化相关基因(fyn原癌基因、SHC转化蛋白、c-myc原癌基因、禽肉瘤病毒CT10癌基因同原序列、ski原癌基因、ab1原癌基因)；生长因子基因(VEGF、VEGF-B)；磷酸化酶基因(蛋白质酪氨酸磷酸化酶)；层粘蛋白β1亚单位1、层粘蛋白B2亚单位、层粘蛋白α5亚单位前体。

【实施例3】本发明化合物抑制新生毛细血管的生长

A.小鼠主动脉环毛细血管生成实验

小鼠胸主动脉全段分离后切为1mm长的小段，每小段置于400μl“Matrigel”中(R&D System)，先在EGM-2培养液(Clontech)中培养24小时，然后再在EBM培养液(Clontech)中培养3天。然后分别于EBM培养液中加入5nM，50nM WCH44或其无效同分异构体WCH45；1uM，10uMWCH57或其无效同分异构体WCH58。于第5天用相差显微镜观察毛细血管生长状态。然后彻底洗去该培养液，换入新的EBM培养液培养2天，继续观察毛细血管生长状态。结果见图7，结果显示，WCH44对小鼠主动脉环新生毛细血管的生长具有显著的抑制作用，可完全抑制新生毛细血管的生长，并且这种生长抑制作用在去药两天后，也不可逆。

B.毛细血管侵入试验

将20ng b-FGF与200ul“Matrigel

”混合，然后分别加入WCH44(200nM)及其无效同分异构体WCH45(2μM)。注入正常小鼠皮下，形成半固体的球形体。4天后取出球形体，固定，石蜡包埋切片，作免疫组化分析：用抗CD31抗体标记血管内皮细胞，VECTASTAIN Elite ABC Kit呈深灰色染色。结果见图8，分别为球体的纵横切面，图中箭头所指为免疫组化染色阳性的血管内皮细胞。结果显示200μM的WHC44可显著抑制由b-FGF诱导的体内“Matrigel

”中的新生血管的形成，使新生毛细血管的生长阻断于“Matrige

”球体的外周区域，而不继续向内部侵入，而其无效同分异构体WCH45作为则缺乏此作用，新生血管在“Matrigel

”球体内部和中心大量生长。

【实施例4】本发明化合物抑制小鼠肿瘤生长

人非小细胞肺癌细胞系CCL-256(ATCC)和人脑神经胶质瘤细胞C6细胞系(ATCC)。使用Bulb C nu/nu小鼠，体重20-20g雌性。每组动物将最终肿瘤最大与最小的小鼠排除在统计之外，取所剩下的动物进入统计。用10％DMSO/PBS分别溶解WCH44，WCH45；和WCH57，WCH58至所需浓度。无菌操作，腹腔内注射200μg/kg体重，每日一次，持续4周。

A.CCL256细胞系：4只实验鼠，1×10⁶细胞分别皮下注射(100μl)。20天后处死动物，剥离肿瘤，在PBS溶液中制成细胞匀浆，再将1×10⁶/100μl上述制备的细胞匀浆分别接种至60只实验鼠背部皮下，细胞接种后当天开始分实验组和对照组(各12只鼠)分别行腹腔内注射WCH44，WCH45；和WCH57，WCH58。

B.C6细胞系：1×10⁶细胞皮下注射(100μl)。20天后处死动物，剥离肿瘤，在PBS溶液中制成细胞匀浆，再将1×10⁶/100μl细胞匀浆分别接种至14只实验鼠皮下，细胞接种后第8-10天，当肿瘤直径平均达到0.5cm。此时，再开始分别向实验组和对照组(各7只鼠)腹腔内注射WCH44及WCH45。

肿瘤细胞接种四周后停药，处死动物，解剖剥离肿瘤。称瘤重，取双侧肺，及全肝。将双肺，全肝及80％体积肿瘤用10％PFA固定，石蜡包埋切片(全器官每隔30μm制10μm切片一张，HE染色，10倍光镜观察计数双肺及全肝镜下转移灶数量。结果见图9，10，11。结果显示，WCH44能显著抑制CCL256细胞和C6细胞裸鼠移植瘤的体内生长(图9)；更重要的是，WCH44和WCH57能显著抑制CCL256细胞和C6细胞裸鼠移植瘤的肺转移的发生；在C6细胞裸鼠移植瘤中，对照的无效同分异构体WCH45处理组的平均肺转移数为23个，而WCH44处理组仅为2个(图11)；在CCL细胞裸鼠移植瘤中，WCH45处理组的平均肺转移数为18个，而WCH44处理组仅为2个。

另20％体积肿瘤，置入“Trizol

”溶液，机械匀浆提取RNA，与“AtlasMouse Cancer 1.2Array”和“Atlas Mouse cDNA Expression Array”杂交，结果见图12。结果发现经WCH44处理的CCL移植瘤中的一些蛋白酶和蛋白激酶、生长增殖相关因子等基因表达下调，包括MAPK13、MMP3、丝氨酸/苏氨酸激酶25、MAPKAPK2、蛋白质酪氨酸磷酸化酶、巨噬细胞刺激因子1受体、克隆形成因子1受体、酪氨酸激酶受体1、PI3激酶、FGFR1、IGFBP1等；而另一些可能抑制细胞增殖和生长有关的基因表达上调，包括：ephrinB1、Tolloid-like 1、细胞周期素E2、抑瘤素M(oncostatin M)、卵泡抑素、INFγ受体2。

参考文献：

1.Patent：WO2004/078732.

2.Patent：US2005/0130989A1

3.Patent：EP1332372

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11.“Preparation of N-arylheteroaryls，in particular N-phenylpiperazinyl methanones，asinhibitors of tubulin polymerization and their compositions for treatment of cancer.”

Claims (3)

1、具有下述式(II)结构的化合物在制备抑制肿瘤转移的药物中的应用

2、具有下述式(III)结构的化合物在制备抑制肿瘤转移的药物中的应用

3、含有权利要求1或2所述的式(II)或式(III)所示结构化合物的药物组合物在制备抑制肿瘤转移的药物中的应用。

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