CN100422318C - 一种植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明将公开一种植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其步骤如下：1)选取植物种子并进行除杂；2)对除杂后的植物种子进行消毒灭菌处理；3)将经过消毒灭菌处理的植物种子进行富氧预催化；4)预催化后对植物种子进行富氧催化；5)进行富氧催化后的植物种子进行均质处理，且在均质过程中，将其pH值控制在7～8，得到植物种子的料浆；6)均质后的植物种子的料浆进行脱水处理，收集料液；7)对料液进行过滤，干燥，得到超氧化物歧化酶产品。本发明方法大幅度提高了超氧化物歧化酶的产量，使超氧化物歧化酶的回收率与现有方法相比提高30～50%，且该生产方法工艺简便，成本低廉，原料适应性广，适宜于大规模生产超氧化物歧化酶。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及一种植物超氧化物歧化酶的生产方法，特别是超氧化物歧化酶的富氧催化大规模生产方法。
(二)背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD：Superoxide Dismutase)是生物体内催化氧自由基(O2 -·)发生歧化反应的重要酶，分子量约为3.4万道尔顿。它对超氧的催化速度是化学能的1万倍，能够清除氧自由基对人体的毒害，是国际上公认氧自由基的清除剂。自1969年McCord和Fridovich首次从牛血液中发现超氧化物岐化以来，引起了各国生化界和医学界的重视。自90年代，科学界已经认识到氧自由基是在人体疲劳、生病时产生的多余的自由基，它们会破坏人体的细胞核内DNA物质，促使人衰老，或细胞癌变。20世纪，科学家们提出了人体疾病衰老的几种学说，自由基学说是其中唯一被证实且最为可靠的一种学说，它比较清楚地阐述了机体疾病衰老的过程。由于呼吸，机体组织器官时刻都在进行氧代谢，在正常生理情况下，自由基的产生与清除处于动态平衡，当某种因素使氧自由基生成过多、或超出清除能力、或清除能力减弱时，过多的氧自由基通过损伤生命大分子，破坏细胞结构与功能，导致疾病的发生与发展，从而加速机体老化。现代医学已经证实：氧自由基引起的疾病，已超过一百多种，严重的威胁着我们的健康与长寿。导致氧自由基产生的因素很多，包括：(1)人体利用氧气的过程中每日约可产生大量的活性氧(自由基)；(2)衰老：25岁以后，人体内的超氧化物歧化酶随着人体组织的老化而逐渐降低；(3)体力透支；(4)精神压力：急躁、焦虑，郁闷；(5)过度饮酒；(6)疾病、手术；(7)辐射线：核能、日光照射、X光、复印机、计算机；(8)电磁波：微波炉、吹风机、手机；(9)污染：汽车排放的废气、工业废气废水，香烟、二手烟；(10)药物滥用、食品添加剂；(11)农药残留、杀虫剂。超氧化物歧化酶作为清除人体负氧自由基的清除剂，已成为二十世纪医药学最热门研究课题。很长一段时间内，超氧化物歧化酶主要从动物血液中提取，例如申请号为：02147888.0，名称为《超氧化物歧化酶的制备方法》的中国发明专利，它公开了一种从猪血中的超氧化物歧化酶进行提取的方法，其制备步骤如下：1)分离血球，2)洗涤血球，3)溶解破裂血球，4)去血红蛋白，得粗酶液，再将粗酶液在60-65℃条件下加热20分钟，得到高纯度的超氧化物歧化酶，该方法简单，成本低，效率高，极大地提高了酶的纯度。但由于动物血液中可能存在各种致病因子，因此从植物中提取的超氧化物歧化酶比较安全。例如申请号为：99112607.6，名称为《玉米超氧化物歧化酶(SOD)复合酶大规模制造方法》，公开了一种以玉米为原料提取超氧化物歧化酶的方法，其制备方法是将原料风选、消毒、发芽、加入磷酸盐缓冲液打浆、打粗浆后加入纤维素酶再打细浆，加入氯化钙、过滤，滤液加入糖化酶，以硅藻土助滤剂过滤，滤液10000转/分离心，过分子量为14万的膜，滤液再以4000-10000分子量超滤膜超滤，浓缩液按重量加入0.3-0.5％维生素C、0.1-0.2％维生素E和0.1-0.2％的山梨酸钾，然后冷冻、融解，再以10000转/分离心，装瓶，再用Co60照射杀菌，得成品。虽然用玉米等植物种子为原料，价廉易得、易贮存，安全无毒，但以各种植物种子为原料提取超氧化物歧化酶的主要缺点是产率过低，一般不超过1亿单位/吨原料。实际提取率则更低，往往只有几千万单位。因此植物超氧化物歧化酶的生产难以形成工业规模，不具备产业化的价值。且经检索，未发现以富氧方式催化即高氧浓度条件下提高超氧化物歧化酶生产量的相关报道和专利。
(三)发明内容：
本发明将公开一种能大幅度提高产量、酶活性高的植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法。
本发明植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其步骤如下：
1)选取植物种子并进行除杂；所述的植物种子可以是任意的植物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、小米、大豆、绿豆等作物，当然也可以是其它作物的种子；为了保证植物种子的发芽率，最好使用低温干燥或自然风干的植物种子；可以采用常规方法进行除杂，如滚筒筛、风选、磁选等方式清理杂物，也可采用其它的方法对植物种子进行除杂；
2)对除杂后的植物种子进行消毒灭菌处理；所述消毒灭菌处理可以采用任意的不损害种子活性的消毒灭菌方法，例如可以将清理后的原料种子用臭氧浓度为1～5mg/L的臭氧溶液浸洗15～60分钟消毒灭菌，之后用清水漂洗干净；
3)将经过消毒灭菌处理的植物种子进行富氧预催化，使种子吸水膨胀；所述富氧预催化是将植物种子用14～36℃水喷淋24～48小时；也可以用循环流动的水进行喷淋；为达到更好的效果，也可将植物种子置于氧气含量为22～100％(重量百分比)环境中用水喷淋；所述水的优选温度为20～30℃；
4)预催化后对植物种子进行富氧催化，使其充分发芽；所述富氧催化是将植物种子置于氧气含量为22～100％(重量百分比)的环境中，用14～36℃水喷淋24～60小时；也可以用循环流动的水进行喷淋；为达到更好的催化效果，其氧气含量最好大于30％，优选的氧气含量是50～90％(重量百分比)；所述水的优选温度为20～30℃；
5)进行富氧催化后的植物种子进行均质处理，且在均质过程中，将其PH值控制在7～8，得到植物种子的料浆；所述均质处理可为常规的均质处理方法，例如可以将植物种子放入现有的均质机如大型均质机均质，一般来说，控制均质压力10～25Mpa，出料粒度≤1μm，当然也可以采用其它的均质处理方法对植物种子进行均质；在均质过程中，可以采用任意的方法对PH值进行调节，只要将其控制在7～8即可，控制PH值的目的是保护超氧化物歧化酶不失活不被破坏，并提高回收率；例如可在均质过程中加入磷酸盐缓冲液控制其PH值；磷酸盐缓冲液最好用等重量比的Na2HPO4+NaH2PO4或等重量比的K2HPO4+KH2PO4溶液构成，浓度为50～100mmol/L；也可以加入其它溶液将其PH值控制在7～8；
6)均质后的植物种子的料浆进行脱水处理，收集料液；所述脱水方法可为任意的脱水方法，例如可用高速离心机或自动板框脱水机进行脱水，也可采用其它方法进行脱水处理；所得的滤渣亦可作为工业原料或用于生产饲料；
7)对料液进行过滤，干燥，得到超氧化物歧化酶产品，该产品最好充氮包装，低温冷藏，以保证产品质量，所述干燥最好使用低温冷冻干燥，以提高超氧化物歧化酶的酶活率；还可以采用现有的膜分离技术、使用现有的过滤设备对料液进行多级过滤，以去除料液中的大分子物质及杂质、纯化SOD，得到含量不同的超氧化物歧化酶产品，例如将步骤7中过滤所得的料液A再进行微米级过滤，截留分子量为5万～10万，以去除分子大于SOD的颗粒及杂质，收集料液B，所得的料液B经冷冻干燥可制成中等含量超氧化物歧化酶产品；还可以将经过微米级过滤的料液B，再进行纳米级过滤，截留分子量约为1万以下，以达到进一步纯化SOD的目的，所得的料液C经冷冻干燥可制成高含量超氧化物歧化酶产品。所述的微米级过滤和纳米级过滤均可采用现有的可进行微米级或纳米级过滤的过滤设备进行操作，根据现有的膜分离技术按膜孔径或所分离的粒径划分，微米级过滤为5μm～100nm，纳米级过滤＜10nm。当然还可以在对料液进行过滤后，再对料液进行纯化处理，所述纯化处理可以采用任意的提纯处理方法，例如可以将料液上Sephadex G-100层析柱进行纯化，以得到高纯度的超氧化物歧化酶产品。
本发明方法是利用植物种子为原料提取超氧化物歧化酶的工艺中，采用富含氧气的催化方法，因而可以大大提高超氧化物歧化酶的生产率，缩短催化时间，节约浸泡用水，简化了生产设备，降低了生产成本，减少对环境的污染，使得利用植物种子大规模生产超氧化物歧化酶成为现实。本发明的优点是大幅度提高了超氧化物歧化酶的产量，弥补了现有提取工艺得率低的缺点，该工艺可以使超氧化物歧化酶的回收率与普通发芽方法相比，产量平均要高于常规方法30％～50％，且SOD的活性也相对较高。该生产方法工艺简便，成本低廉，原料适应性广，适宜于大规模生产超氧化物歧化酶。
(四)具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1：
将风干的玉米籽粒1吨以滚筒筛、磁选器除杂，用臭氧含量2mg/L的水溶液浸泡60分钟消毒灭菌，然后用清水漂洗干净；
将原料放入含氧量为70％(重量百分比)的密闭环境中，用25℃循环流动的水喷淋48小时进行预催化，使其吸水膨胀，预催化后即开始进行富氧催化，即将其放入含氧量为70％(重量百分比)的密闭环境中，用30℃循环流动的水喷淋60小时使其发芽；
富氧催化后的原料上现有的大型均质机均质，控制均质压力20Mpa，出料粒度≤1μm，在均质过程中加入磷酸盐缓冲液，维持PH值在7.6，磷酸盐缓冲液是由等重量的K2HPO4+KH2PO4溶液构成，浓度为100mmol/L，均质后的料浆上现有的高速离心机脱水，收集料液A，滤渣可作为工业原料或用于生产饲料；
料液A经过滤，冷冻干燥制成低含量超氧化物歧化酶产品9840g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为16.2U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.59亿U/吨原料玉米。
实施例2：将实施例1中的料液A用现有的微米级过滤机过滤，截留分子量为5万，收集料液B，料液B经冷冻干燥可制成中等含量超氧化物歧化酶产品825g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为177.2U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.46亿U/吨原料玉米。
实施例3：将实施例2中的料液B用现有的纳米级过滤机过滤，截留分子量约为1万，收集料液C，料液C经冷冻干燥可制成高含量超氧化物歧化酶产品105g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为1320U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.39亿U/吨原料玉米。
实施例4：将实施例3中的超氧化物歧化酶含量为1320U/mg的产品上Sephadex G-100层析柱进一步纯化，制成高纯度的超氧化物歧化酶产品20.3g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为6035U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.23亿U/吨原料玉米。
实施例5：
将风干大豆1吨以滚筒筛、磁选器除杂，用臭氧含量4mg/L的水溶液浸泡30分钟消毒灭菌，然后用清水漂洗干净；
将原料放入含氧量为80％(重量百分比)的密闭环境中，用20℃循环流动的水喷淋24小时进行预催化，使其吸水膨胀，预催化后即开始进行富氧催化，即在含氧量为80％的密闭环境中，用20℃循环流动的水喷淋24小时使其发芽；
富氧催化后的原料上现有的大型均质机均质，控制均质压力25Mpa，出料粒度≤1μm，在均质过程中加入磷酸盐缓冲液，维持PH值在7.2，磷酸盐缓冲液是由等重量的K2HPO4+KH2PO4溶液构成，浓度为50mmol/L，均质后的料浆上现有的高速离心机脱水，收集料液A，滤渣可作为工业原料或用于生产饲料；
料液A经过滤，冷冻干燥制成低含量超氧化物歧化酶产品22560g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为7.8U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.76亿U/吨原料大豆。
实施例6：
将实施例5中的料液A先用现有的微米级过滤机过滤，得料液B；料液B再用现有的纳米级过滤机过滤，截留分子量约为1万，得料液C，料液C经冷冻干燥可制成高含量超氧化物歧化酶产品256g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为588U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.51亿U/吨原料大豆。
实施例7：
将绿豆1吨以滚筒筛、磁选器除杂，以常规方法消毒灭菌，然后用清水漂洗干净；
将原料放入含氧量为100％(重量百分比)的密闭环境中，用30℃循环流动的清水喷淋24小时进行预催化，使其吸水膨胀，预催化后即开始进行富氧催化，即在含氧量为100％的密闭环境中，用25℃循环流动的清水喷淋48小时使其发芽；
富氧催化后的原料上现有的大型均质机均质，控制均质压力25Mpa，出料粒度≤1μm，在均质过程中加入磷酸盐缓冲液，维持PH值在8，磷酸盐缓冲液是由等重量的K2HPO4+KH2PO4溶液构成，浓度为50mmol/L。均质后的料浆上现有的高速离心机脱水，收集料液A，滤渣可作为工业原料或用于生产饲料；
料液A经过滤，冷冻干燥制成超氧化物歧化酶产品23270g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为5.2U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.21亿U/吨原料绿豆。
实施例8：
将风干的黄豆1吨以滚筒筛、磁选器除杂，用臭氧含量4mg/L的水溶液浸泡40分钟消毒灭菌，然后用清水漂洗干净；
将原料用36℃循环流动的清水喷淋30小时进行预催化，使其吸水膨胀，预催化后即开始进行富氧催化，即在含氧量为22％的密闭环境中，用20℃循环流动的清水喷淋50小时使其发芽；
富氧催化后的原料上现有的大型均质机均质，控制均质压力25Mpa，出料粒度≤1μm，在均质过程中加入磷酸盐缓冲液，维持PH值在7，磷酸盐缓冲液是由等重量的K2HPO4+KH2PO4溶液构成，浓度为50mmol/L，均质后的料浆上现有的高速离心机脱水，收集料液A，滤渣可作为工业原料或用于生产饲料；
料液A经过滤，冷冻干燥制成超氧化物歧化酶产品21270g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为5.5U/mg，超氧化物歧化酶得率为1.17亿U/吨原料黄豆。
实施例9：
将小米1吨除杂，并用臭氧含量3mg/L的水溶液浸泡30分钟消毒灭菌，然后用清水漂洗干净；
将原料放入含氧量为22％(重量百分比)的密闭环境中，用14℃循环流动的清水喷淋35小时进行预催化，使其吸水膨胀，预催化后即开始进行富氧催化，即在含氧量为50％的密闭环境中，用36℃循环流动的清水喷淋40小时使其发芽；
富氧催化后的原料上现有的大型均质机均质，控制均质压力25Mpa，出料粒度≤1μm。在均质过程中加入磷酸盐缓冲液，维持PH值在7.5，磷酸盐缓冲液是由等重量的K2HPO4+KH2PO4溶液构成，浓度为50mmol/L，均质后的料浆上现有的高速离心机脱水，收集料液A，滤渣可作为工业原料或用于生产饲料；
料液A经过滤，冷冻干燥制成超氧化物歧化酶产品22050g，经连苯三酚自氧化法检测，超氧化物歧化酶含量为4.4U/mg，超氧化物歧化酶得率为0.97亿U/吨原料小米。
Claims (5)
1. 一种植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其步骤如下：
1)选取植物种子并进行除杂；
2)对除杂后的植物种子进行消毒灭菌处理；
3)将经过消毒灭菌处理的植物种子进行富氧预催化；所述富氧预催化是将植物种子用14～36℃水喷淋24～48小时；
4)预催化后对植物种子进行富氧催化；所述富氧催化是将植物种子置于氧气含量以重量百分比计为22～100％的环境中，用14～36℃水喷淋24～60小时；
5)进行富氧催化后的植物种子进行均质处理，且在均质过程中，将其PH值控制在7～8，得到植物种子的料浆；
6)均质后的植物种子的料浆进行脱水处理，收集料液；
7)对料液进行过滤，干燥，得到超氧化物歧化酶产品。
2. 根据权利要求1所述的植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其特征在于：步骤7)中，对料液进行多级过滤，制成含量不同的超氧化物歧化酶产品。
3. 根据权利要求1或2所述的植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其特征在于：步骤7)中，在对料液进行过滤后，再对料液进行纯化处理，得到高纯度的超氧化物歧化酶产品。
4. 根据权利要求1或2所述的植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其特征在于：所述植物种子为玉米或小麦或大麦或水稻或高粱或小米或大豆或绿豆。
5. 根据权利要求1或2所述的植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法，其特征在于：步骤3)中，所述富氧预催化是将植物种子置于氧气含量以重量百分比计为22～100％的环境中，用水喷淋。
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