CN100418543C - 双树脂法制备高质量的银杏叶活性成分提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种应用现代天然植物药用成分的提取纯化技术制备富含活性成分的银杏叶提取物的方法。其方法与现有的有机溶剂萃取和单树脂吸附技术相比，具有工艺路线合理，提取率高，有效成分含量高，并根据产品的不同要求，可按比例配制各种剂型的产品，不仅有效的控制质量波动问题，而且能配制成疗效更明确、服用更方便的银杏叶制剂，并易于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用现代天然植物药用成分的提取纯化技术制备富含活性成分的银杏叶提取物的方法。
背景技术
银杏叶提取物主要含有黄酮类化合物和银杏叶萜内酯等多种生理活性成分，对于人体具有比较好的保健和治疗功能，尤其是作为治疗心脑血管疾病和血小板活化因子拮抗剂，备受国内外患者欢迎。
我国是银杏叶的故乡，目前我国银杏叶资源占全世界的70％。欧美和东亚各国争先从我国进口银杏叶，用来提取分离其中有效成分，生产各种制剂。大量银杏叶资源的出口推动了国外制药企业的发展，而对于我国来说，银杏叶资源的大量出口只能赚取少量外汇，不能给银杏叶种植业带来更高的效益。这与我国是银杏叶主产国的地位极不相称，再加上我国现阶段的技术水平有限，导致了银杏叶产品的收率低、产品质量波动等问题，造成了国有资源的严重浪费。近年来，虽然有部分产品面世，但多属于初级产品。因此，制备富含有效成分的高质量银杏叶提取物，对于提高我国银杏叶产品竞争力和经济发展有着极其重要的意义。
银杏叶有效成分(黄酮类化合物和银杏叶内酯)的提取分离直接决定着银杏叶的药用价值。目前国际上公认的银杏叶制剂的含量标准为黄酮类化合物＝24％，银杏总内酯＝6％。从银杏叶浸取液中富集分离银杏叶中活性成分主要为有机溶剂萃取法(如中国专利文献公开的申请号为02808099.8的技术方案)和单树脂吸附法。前者残留溶剂和生产成本高，后者产物纯度高，收率高。但是后者因为受到银杏叶原料、采摘时间和富集分离过程等因素的影响，银杏叶提取物的质量出现严重的不稳定，直接影响到了银杏叶制剂的疗效。为此，寻找一种既能满足国际标准各种制剂要求，又能有效控制产品质量波动的富含有效成分的高质量银杏叶提取物已成必然。
发明内容
本发明的目的是提出一种富含活性成分的高质量银杏叶提取物的制备及制作工艺。
本发明的主旨是应用ADS-17和ADS-F8双树脂法制备富含活性成分的高质量银杏叶提取物，其包含以下连续的步骤：
(1)取一定量的ADS-17和ADS-F8树脂，用自来水瓢去悬浮于表面碎小的树脂，采用湿法装入层析柱(树脂中间不能有气泡)，用无水乙醇浸泡24h，使之充分溶胀，而后用无水乙醇冼至洗出液中加少量蒸馏水(1mL冼涤液中加入4mL蒸馏水)无白色浑浊为止，再用蒸馏水洗涤树脂至不含乙醇。然后进行盐酸转型，即用pH为3.5的蒸馏水过柱，至流出液的pH为3.5为止。
(2)采购的干绿色银杏叶在55～65℃下进一步烘干、去杂、粉碎，过20或40目筛，然后利用现有技术用50％或60％或70％乙醇在68～72℃分别回流搅拌提取2-3次，每次120～150分钟，合并提取液。
(3)提取液保温在38～42℃下，先后加入ZTC-II型天然澄清剂B和A(B是用1％醋酸溶液配制成的质量百分比为1％的溶液，A是用蒸馏水配制成的质量百分比为1％的溶液)。澄清剂B与提取液作用30～50分钟，再加入澄清剂A与提取液再作用30～50分钟。其中每升提取液加澄清剂B的量为1.2～1.6g，澄清剂A的量为B的一半。而后过滤或离心，除去沉降物，减压浓缩，回收乙醇。
(4)浓缩液加2～3倍体积的水，沉淀8～12小时，过滤或离心，得上柱液a。
(5)将上柱液a的pH值用盐酸调至3.5，而后上ADS-17树脂柱，树脂柱的高径比控制在15～30，流出液进行饱和检验(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亚铁一滴，如溶液为深蓝色或黑色，则柱已饱和，如不变色，则柱未饱和。)，如饱和则停止上样，用2～3倍柱床体积的水过柱冲洗，然后用pH为7.0的50％或60％或70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，回收乙醇，至无悬浊物出现，得上柱液b。
(6)在上柱液b中加入其1～2信体积的10％或15％的乙醇溶液稀释后，用盐酸调其pH为3.5，而后再上ADS-F8树脂柱，树脂柱的高径比控制在10～20，收集流出液，流出液进行饱和检验(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法进行黄酮饱和吸附检测)，如有黄酮检出，则停止上样，用10％～20％的乙醇过柱冲洗，并收集洗涤液；而后再用pH为9.0左右的70％或80％或90％的乙醇洗脱柱子，收集洗脱液；合并流出液和洗涤液，减压浓缩，回收乙醇后喷雾干燥或冷冻干燥得银杏内酯产品。减压浓缩洗脱液，喷雾干燥或冷冻干燥得银杏黄酮产品。其中银杏内酯产品中含35％～45％的银杏总内酯，银杏黄酮产品中含70％～85％的银杏总黄酮。
(7)银杏内酯产品和银杏黄酮产品中的银杏酸经高效液相色谱检测，其含量均低于5ug/g。
(8)银杏内酯产品和银杏黄酮产品可根据成品的不同要求，可按比例配制各种口服或外用剂型的药品和保健品；也可以进一步的分离纯化出单组分产品，制作成注射用针剂。
本发明与现有的有机溶剂萃取和单树脂吸附技术相比，具有工艺路线合理，提取率高，有效成分含量高，并根据产品的不同要求，可按比例配制各种剂型的产品，不仅有效的控制质量波动问题，而且能配制成疗效更明确、服用更方便的银杏叶制剂，并易于实现工业化生产。使我国银杏叶资源能得到更充分的利用，在国际上使中药树立起不败的地位。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明也不仅限于实施例的内容。
实施例一：
取ADS-17和ADS-F8树脂各50kg，分别加水浸泡12小时，瓢去悬浮于表面碎小的树脂，采用湿法装入层析柱(树脂中间不能有气泡)，用无水乙醇浸泡24h，使之充分溶胀，而后用无水乙醇洗至洗出液中加少量蒸馏水(1mL洗涤液中加入4mL蒸馏水)无白色浑浊为止，再用蒸馏水洗涤树脂至不含乙醇。然后进行盐酸转型，即用pH为3.5的蒸馏水过柱，至流出液的pH为3.5为止。
采购的干绿色银杏叶在55～65℃下进一步烘干、去杂、粉碎，过20目筛，称取100kg，置于提取罐中，加入1000L50％乙醇溶液，在68～72℃下回流搅拌提取150分钟，停止搅拌，过滤，再重复提取一次，两次提取液合并。直接加入已经配制好的ZTC-II型天然澄清剂B组分(其用量为1.2g/L)，在40℃下保温40分钟，再加入配制好的A组分(其用量为0.6g/L)在40℃下继续保温40分钟。然后以3500r/min离心15分钟，倒出上清液，减压回收乙醇至无味。在浓缩液中加入其2倍体积的水静置8小时，过滤，适度浓缩即得上柱液a。
将上柱液a的pH值用3mol/L盐酸调至3.5，而后上ADS-17树脂层析柱，树脂柱的高径比为15，上柱流速为3BV/小时，流出液进行饱和检验(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亚铁一滴，如溶液为深蓝色或黑色，则柱已饱和，如不变色，则柱未饱和。)，如饱和则停止上样，用3倍柱床体积的水过柱冲洗，水洗流速为5BV/小时，然后用pH为7.0的50％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为1.5BV/小时，收集洗脱液，减压浓缩，回收乙醇，至无悬浊物出现，得上柱液b。
在上柱液b中加入其2倍体积的10％的乙醇溶液稀释后，用盐酸调其pH为3.5，而后再上ADS-F8树脂层析柱，树脂柱的高径比为10，收集流出液，上柱流速为3BV/小时，流出液进行饱和检验(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法进行黄酮饱和吸附检测)，如有黄酮检出，则停止上样，用pH为3.5的20％乙醇溶液过柱冲洗，洗涤流速为4BV/小时，并收集冼涤液；而后再用pH为9.0左右的70％乙醇溶液洗脱层析柱，冼脱流速为1.5BV/小时，收集洗脱液；合并流出液和洗涤液，减压浓缩，回收乙醇后喷雾干燥得银杏内酯产品。减压浓缩洗脱液，喷雾干燥得银杏黄酮产品。其中银杏内酯产品中含35.8％的银杏总内酯，银杏黄酮产品中含72.3％的银杏总黄酮。
银杏内酯产品和银杏黄酮产品中的银杏酸经高效液相色谱检测，其含量分别为：4.2ug/g和4.8ug/g。
实施例二：
取ADS-17和ADS-F8树脂各50kg，分别加水浸泡12小时，瓢去悬浮于表面碎小的树脂，采用湿法装入层析柱(树脂中间不能有气泡)，用无水乙醇浸泡24h，使之充分溶胀，而后用无水乙醇冼至洗出液中加少量蒸馏水(1mL洗涤液中加入4mL蒸馏水)无白色浑浊为止，再用蒸馏水洗涤树脂至不含乙醇。然后进行盐酸转型，即用pH为3.5的蒸馏水过柱，至流出液的pH为3.5为止。
采购的干绿色银杏叶在55～65℃下进一步烘干、去杂、粉碎，过20目筛，称取100kg，置于提取罐中，加入900L60％乙醇溶液，在68～72℃下回流搅拌提取140分钟，停止搅拌，过滤，再重复提取一次，两次提取液合并。直接加入已经配制好的ZTC-II型天然澄清剂B组分(其用量为1.4g/L)，在40℃下保温50分钟，再加入配制好的A组分(其用量为0.7g/L)在40℃下继续保温50分钟。然后以3500r/min离心15分钟，倒出上清液，减压回收乙醇至无味。在浓缩液中加入其3倍体积的蒸馏水静置8小时，过滤，适度浓缩即得上柱液a。
将上柱液a的pH值用3mol/L盐酸调至3.5，而后上ADS-17树脂层析柱，树脂柱的高径比为25，上柱流速为3BV/小时，流出液进行饱和检验(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亚铁一滴，如溶液为深蓝色或黑色，则柱已饱和，如不变色，则柱未饱和。)，如饱和则停止上样，用3倍柱床体积的水过柱冲洗，水洗流速为5BV/小时，然后用pH为7.0的60％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为1.5BV/小时，收集洗脱液，减压浓缩，回收乙醇，至无悬浊物出现，得上柱液b。
在上柱液b中加入其2倍体积的10％的乙醇溶液稀释后，用盐酸调其pH为3.5，而后再上ADS-F8树脂层析柱，树脂柱的高径比为15，上柱流速为3BV/小时，收集流出液，流出液进行饱和检验(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法进行黄酮饱和吸附检测)，如有黄酮检出，则停止上样，用pH为3.5的20％乙醇溶液过柱冲洗，洗涤流速为4BV/小时，并收集洗涤液；而后再用pH为9.0左右的80％乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱流速为1.5BV/小时，收集洗脱液；合并流出液和冼涤液，减压浓缩，回收乙醇后喷雾干燥得银杏内酯产品。减压浓缩洗脱液，喷雾干燥得银杏黄酮产品。其中银杏内酯产品中含40.4％的银杏总内酯，银杏黄酮产品中含78.7％的银杏总黄酮。
银杏内酯产品和银杏黄酮产品中的银杏酸经高效液相色谱检测，其含量分别为：4.5ug/g和4.6ug/g。
实施例三：
取ADS-17和ADS-F8树脂各50kg，分别加水浸泡12小时，瓢去悬浮于表面碎小的树脂，采用湿法装入层析柱(树脂中间不能有气泡)，用无水乙醇浸泡24h，使之充分溶胀，而后用无水乙醇冼至冼出液中加少量蒸馏水(1mL洗涤液中加入4mL蒸馏水)无白色浑浊为止，再用蒸馏水洗涤树脂至不含乙醇。然后进行盐酸转型，即用pH为3.5的蒸馏水过柱，至流出液的pH为3.5为止。
采购的干绿色银杏叶在55～65℃下进一步烘干、去杂、粉碎，过20目筛，称取100kg，置于提取罐中，加入800L70％乙醇溶液，在68～72℃下回流搅拌提取120分钟，停止搅拌，过滤，再重复提取一次，两次提取液合并。直接加入已经配制好的ZTC II型天然澄清剂B组分(其用量为1.6g/L)，在40℃下保温30分钟，再加入配制好的A组分(其用量为0.8g/L)在40℃下继续保温30分钟。然后以3500r/min离心15分钟，倒出上清液，减压回收乙醇至无味。在浓缩液中加入其2倍体积的水静置8小时，过滤，适度浓缩即得上柱液a。
将上柱液a的pH值用3mol/L盐酸调至3.5，而后上ADS-17树脂层析柱，树脂柱的高径比控制在30，上柱流速为3BV/小时，流出液进行饱和检验(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亚铁一滴，如溶液为深蓝色或黑色，则柱已饱和，如不变色，则柱未饱和。)，如饱和则停止上样，用3倍柱床体积的水过柱冲洗，水洗流速为5BV/小时，然后用3倍柱床体积的pH为7.0的70％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为1.5BV/小时，收集洗脱液，减压浓缩，回收乙醇，至无悬浊物出现，得上柱液b。
在上柱液b中加入其一倍体积的15％的乙醇溶液稀释后，用盐酸调其pH为3.5，而后再上ADS-F8树脂层析柱，树脂柱的高径比为20，收集流出液，上柱流速为3BV/小时，流出液进行饱和检验(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法进行黄酮饱和吸附检测)，如有黄酮检出，则停止上样，用pH为3.5的20％乙醇溶液过柱冲洗，洗涤流速为4BV/小时，并收集洗涤液；而后再用pH为9.0左右的70％乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱流速为1.5BV/小时，收集洗脱液；合并流出液和洗涤液，减压浓缩，回收乙醇后喷雾干燥得银杏内酯产品。减压浓缩洗脱液，喷雾干燥得银杏黄酮产品。其中银杏内酯产品中含43.6％的银杏总内酯，银杏黄酮产品中含84.9％的银杏总黄酮。
银杏内酯产品和银杏黄酮产品中的银杏酸经高效液相色谱检测，其含量分别为：4.1ug/g和4.9ug/g。
Claims (5)
1. 一种双树脂制备银杏叶活性成分提取物的方法，其特征在于包含以下连续步骤：
(1)分别将ADS-17和ADS-F8两种大孔吸附树脂，用水浸泡12小时，除去悬浮于表面碎小的树脂，湿法装入不同的层析柱，用无水乙醇浸泡24小时使之充分溶胀后，而后用无水乙醇洗至1mL洗出液中加入4mL蒸馏水无白色混浊为止，再用蒸馏水洗涤树脂至不含乙醇，然后用pH为3.5的盐酸蒸馏水溶液过柱，直到流出液的pH为3.5为止，转型上述层析柱中的树脂；
(2)将干绿色的银杏叶按1kg加入10L 50％乙醇或9L 60％乙醇或8L 70％乙醇的比例投入提取罐中，在68～72℃范围内回流搅拌提取2-3次，每次120～150分钟，合并提取液；
(3)将步骤(2)所述提取液用ZTC-II型天然澄清剂B和天然澄清剂A进行除杂处理，之后离心分离除去沉降物，所得上清液再进行减压浓缩，回收乙醇至无味，得浓缩液；
(4)将步骤(3)所述浓缩液加水2-3倍体积的水，沉淀8-12小时，过滤得滤液，即为上柱液a；
(5)将上柱液a的pH值用盐酸调至3.5，上ADS-17树脂柱进行除杂处理，先用2-3倍柱床体积的水过柱冲洗，之后用pH为7.0的50％或60％或70％乙醇溶液洗脱树脂柱，洗脱流速为1.5倍柱床体积/小时，收集洗脱液，减压浓缩洗脱液，得上柱液b；
(6)在上柱液b中加入1-2倍体积的10％或15％的乙醇溶液稀释后，用盐酸调其pH值为3.5，然后上ADS-F8树脂柱，收集流出液；用10％～20％的乙醇过柱冲洗，收集洗涤液；而后再用pH值为9.0的70％或80％或90％的乙醇洗脱柱子，收集洗脱液；合并流出液和洗涤液，减压浓缩，回收乙醇后喷雾干燥或冷冻干燥得银杏内酯产品；减压浓缩洗脱液，喷雾干燥或冷冻干燥得银杏黄酮产品。
2. 根据权利要求1所述的双树脂制备银杏叶活性成分提取物的方法，其特征在于：步骤(3)中具体澄清方法是：按每升提取液加入澄清剂B的量为1.2～1.6g的比例加入澄清剂B，在38～42℃温度范围内使澄清剂B与提取液作用30～50分钟；然后按每升提取液所加澄清剂B量的一半的比例加入澄清剂A，使澄清剂A与提取液继续作用30～50分钟。
3. 根据权利要求1所述的双树脂制备银杏叶活性成分提取物的方法，其特征在于：步骤(5)中所述使用ADS-17树脂柱进行除杂处理方法是，将上柱液a过ADS-17树脂柱，其树脂柱的高径比控制在15～30，上柱流速为3倍柱床体积/小时；待ADS-17树脂柱饱和吸附后，停止过柱上样。用3倍柱床体积的水冲洗该树脂柱，水洗流速为5倍柱床体积/小时。
4. 根据权利要求1所述的双树脂制备银杏叶活性成分提取物的方法，其特征在于：步骤(6)中所述用ADS-F8树脂柱进行银杏黄酮和银杏内酯的分离处理方法是，将上柱液b过ADS-F8树脂柱，树脂柱的高径比控制在10～20，上柱流速为3倍柱床体积/小时，待ADS-F8树脂柱饱和吸附黄酮后，停止上样。用pH值3.5的20％乙醇溶液冲洗树脂柱，洗涤流速为4倍柱床体积/小时；用pH为9.0的70％或80％或90％乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱流速为1.5倍柱床体积/小时。
5. 根据权利要求1所述的双树脂制备银杏叶活性成分提取物的方法，其特征在于：所得银杏内酯和银杏黄酮提取物中的银杏酸的含量均低于5μg/g。
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