CN100399018C - 土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其具有如下步骤：首先制备提取液，称取待测土样，加水振荡并静置一段时间后，先用定量滤纸过滤，滤液再用孔径为0.22um的滤膜过滤，接着进行超声波脱气，之后将提取液装入毛细管电泳仪样品瓶；然后配制缓冲液；接着进行测定，测定过程包括对提取液的测定，仪器将形成各离子的出峰时间和峰面积，离子的出峰时间是确定离子身份的依据，而其峰面积是确定其含量的依据；以及对离子身份的确定；测定过程还包括制作标准曲线；以及计算各离子在土壤中的含量。

Description

土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法

技术领域

本发明属于土壤营养元素测定技术领域，涉及一种土壤无机阴离子的测定方法，特别涉及一种土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法。

背景技术

土壤中的主要无机离子有氯、硫酸根、亚硝酸根、硝酸根、磷酸根、碳酸根、重碳酸根、钾、铵、钙等。其中亚硝酸根、硝酸根、磷酸根、铵、钾是植物营养三要素的在土壤中的主要速效形态。有效性较低的养分形态与速效态养分之间可相互转化，并存在动态平衡。有效性低于速效态的养分在植物吸收前必须首先转化为速效形态才能被植物吸收。因此，测定土壤中这些离子态养分的数量在一定程度上可反映土壤养分的供应能力，从而为变量施肥提供依据。

传统的土壤氮磷钾养分测定方法的一般步骤是：(1)田间采样；(2)样品室内风干，除去植物残体、侵入体等杂物，过筛；(3)土样加入提取剂，振荡，过滤，获得待测液；(3)加入其它测定辅助试剂，反应，测定。如果钾采用火焰光度法、硝酸根采用紫外比色法则不需要加入测定辅助试剂，离子色谱对以上离子可同时测定，也不需要加入测定辅助试剂。

同时对标准溶液进行测定。根据标准液与样品所得数据，计算出土壤中待测成分的含量。

这些测定方法的缺点是：(1)样品需要量大，通常需要的土壤样品重量在10g左右，提取液数量在10ml左右。(2)需要加入数量较多的其它试剂。以磷和硝态氮的比色测定加入的试剂数量较大，这两种离子的比色测定也是常用的测定方法。(3)传统方法的自动化方向以流动分析为主，现在氮和磷均已实现了流动分析，分析效率较高。在分析的自动化方面，以传统分析方法为基础的流动分析已经基本走到了尽头。(4)离子色谱测定离子态氮磷钾结果准确，每个样品的测定所需时间在8-12min左右。但是，离子色谱仪器价格昂贵，操作和维护复杂，测定费用高。

为了克服上述测定方法所存在的缺点，人们开始考虑采用毛细管电泳法测定土壤营养元素，

毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)是一种分离分析技术，所用的毛细管电泳仪的主要组成是一根内径在25-100um、长度在100cm以内的毛细管、一个高压电源(0-30kV)和位于毛细管末端的检测器。

请参照图1，其为毛细管电泳仪示意图。图中1为不同离子形成的区带，2为检测器，3为毛细管，4为电极，5为缓冲液，6为高压电源。

仪器分离前通过进样步骤，样品溶液进入毛细管远离检测器的一端。仪器运行时高压电源向毛细管两端施加高压电作为驱动力，样品中的带电组分在电场的作用下在毛细管内运动，各组分由于淌度(Mobility)和分配行为的差异到达毛细管末端检测器的时间不同，从而实现分离，组分经过位于毛细管末端的检测器时形成与组分浓度成比例的信号，从而实现定量测定。常用检测器有紫外检测器(UV)、二极管阵列检测器(DAD)、激光诱导荧光检测器(LIF)、电导检测器(CD)等。

由于毛细管电泳对离子的测定具有一定程度的普适性，一般常用毛细管区带电泳法测定溶液中的无机离子，因此与前述方法相比，毛细管电泳法测定土壤提取液中的无机离子有如下优点：(1)样品需要量小，样品消耗量可小到纳升级，测定需要量可小至1ml以下。这种小数量的样品需要量为直接测定田间土壤抽提液提供了可能。(2)辅助测定试剂都存在于缓冲液中，缓冲液的浓度在mmol.l-1数量级，试剂需要量较小，因此降低了测定费用。(3)毛细管电泳用于土壤养分测定自动化尚有一定的发展空间。由于这种测定方法一次可测定多种离子的浓度，因此单个养分测定所需的时间低于传统方法，此外，毛细管电泳可用于阴阳离子的同时测定，这一点又是离子色谱不能实现的。再加上毛细管电泳测定单个样品的所需时间在6-8min内，因此两个优点结合，对同一土壤提取液中的离子的测定所需时间与离子色谱相比将大大缩短。(4)仪器结构简单，操作方便，易于维护，样品测定费用低。

当然，毛细管电泳用于土壤无机离子的测定也并不是没有缺点。其缺点主要表现在以下几点：(1)测定的精确性低于离子色谱。(2)就目前研究水平来说，样品提取都是以纯水为提取剂，由于纯水的提取能力低，因此在大多数研究中，提取液中的磷不能达到仪器检测限，因此不能实现测定。(3)由于毛细管电泳法的待测液电解质浓度不能太高，因此常用纯水作为提取剂。纯水提取需要的时间多在10hr以上，因此样品提取液的获得需要较多时间，导致测定时间延长。

对于毛细管电泳法而言，测定之前的样品提取过程以及测定缓冲液的配置过程最为关键。

就样品提取而言，目前最常用的是静止提取法，即一定质量的土壤加入一定体积的水作为提取剂，静止放置较长时间后过滤获待测液。也有人用振荡2hr的提取方法和手摇5min的方法。

从传统土壤学的观点来看，手摇5min的提取方法显然缺乏依据，而振荡2hr后直接过滤则由于水聚沉胶体的能力远低于常用的电解质溶液(如0.5mol.l-1 NaHCO3或1mol.l-1 KCl)，因此振荡之间土水混合物中有很多土壤悬浮胶体，导致过滤速度慢并且滤液不清澈。长时间静止提取易获得较清的提取液并且提取液的离子浓度也较高，但较为费时。

也有人从田间直接抽取土壤溶液或用湿土高速离心获得土壤溶液测定。这些方法用于反映土壤溶液的离子含量状况比较有用，但对于土壤离子含量状况的表征能力仍值得商榷。

就测定缓冲液的配置而言，土壤中阴离子的测定常用间接紫外法，选择这一方法的原因是大多数无机离子在紫外区没有吸收或吸收很弱，不利于定量测定。间接紫外法进行检测即在电解质溶液中加入具有很强紫外吸收的物质，作为背景物质，背景物质的淌度应与被检测物质相近。当样品中的分析离子在电场作用下被分离形成区带时，不吸光的待测阴离子会部分或全部地取代了吸光的背景阴离子，形成负吸收峰，经过转换，负峰变成正峰，从而实现分析阴离子的紫外检测。

常用于土壤无机阴离子检测的背景电解质是铬酸根、安息香酸根和均苯四酸根，而以铬酸根最为常用。

此外溶液中还要含有电渗流改性剂。加入电渗流改性剂的目的是改变电渗流的方向。

分析无机离子常用的是不加修饰的熔融石英毛细管空管，熔融石英毛细管在碱性和微酸性(pH＞2.5)溶液中表面的硅羟基电离成SiO^-，因此表面带负电而形成双电层，溶液中出现大量带正电的阳离子，在电场的作用下，阳离子向负极运动，毛细管中的缓冲液分子在大量阳离子的推动下也向负极运动，这种运动称为电渗流。而阴离子在电场中朝向正极运动，因此电渗流的方向与阴离子的电泳方向相反。在中性和碱性条件下，电渗迁移率介于高迁移率阴离子如氯、硫酸根和低迁移率阴离子如乙酸根、丁酸根之间，造成迁移率大的阴离子向阳极移动，而迁移率小的阴离子随着电渗流向阴极移动，因此迁移率小的阴离子出峰时间长或无法出峰，在阳极端难以同时检测。因此，为了达到在阳极端可检测到迁移率不同的阴离子的目的，必须采取措施改变电渗流方向。改变电渗流方向的方法有多种，其中在无机离子分析中最常用的是在电解质溶液中加入电渗流改性剂。

常用的电渗流改性剂是阳离子表面活性剂，一般为长链季铵盐。电渗流改性剂可与管壁的负电荷结合，使管壁形成不带电荷的状态，从而使电渗流逆向，使迁移率小的阴离子可在较短时间内到达检测器，使阴离子得到快速分离。根据对标样中无机离子分析的研究表明，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的最佳浓度为0.05mmol.l^-1，在土壤无机阴离子测定中，已有研究选用的浓度为0.41mmol.l^-1或0.1mmol.l^-1、0.5mmol.l^-1。

此外，为了改善分离效果，常在缓冲液中加入酸或碱溶液改变缓冲液的pH值，有时也加入有机溶剂，如乙醇、乙腈等。

综上所述，由于人们尚未对样品提取以及测定缓冲液的配置等诸多技术问题进行深入研究，因此毛细管电泳法还没有真正被用于土壤无机离子的测定。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其对样品提取以及测定缓冲液的配置等进行了改进，以克服现有技术中存在的不足。

本发明的上述目的是这样实现的：一种土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其具有如下步骤：

首先制备提取液：称取待测土样，加水振荡并静置一段时间后，先用定量滤纸过滤，滤液再用孔径为0.22um的滤膜过滤，接着进行超声波脱气，之后将提取液装入毛细管电泳仪样品瓶；

然后配制缓冲液；

接着进行测定：测定过程包括对提取液的测定，仪器将形成各离子的出峰时间和峰面积，离子的出峰时间是确定离子身份的依据，而其峰面积是确定其含量的依据；以及对离子身份的确定；测定过程还包括制作标准曲线；以及计算各离子在土壤中的含量。

本发明所述的土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其中制备提取液的具体过程可以是：

称取过2mm筛的风干土样10.00g，加＞18.6MΩ.cm的水(除非特别说明，以下所用水的纯度均与此相同)50.00ml，振荡30min，静置90min，定量滤纸过滤，滤液再用孔径为0.22um的滤膜过滤，超声波脱气10min，之后将提取液装入毛细管电泳仪样品瓶。

本发明所述的土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其中配制缓冲液的具体过程可以是：

100mmol.l^-1H₂SO₄溶液的配制(以下称试剂1)：吸取13.90ml分析纯浓，缓慢加入约100ml水；搅拌、冷却、加水至250ml，冷却、定容；取此溶液25ml，定容至250ml，摇匀，此即为100mmol.l^-1H₂SO₄溶液；

0.02mol.l^-1NaOH溶液的配制(以下称试剂2)：称取0.25g分析纯NaOH溶液、定容至250ml；之后吸取此溶液50ml定容至250ml，摇匀，此即为0.02mol.l^-1NaOH溶液；

分析纯无水乙醇的配制(以下称试剂3)；

100mmol.l^-1CrO₄ ^2-溶液的配制(以下称试剂4)：称取分析纯Na₂CrO₄.4H₂O5.8505g，加入17.20ml试剂1，加水溶解，定容至250ml，摇匀；

1mmol.l^-1CTAB(十六烷基三四基溴化铵)溶液的配制(以下称试剂5)：称取分析纯CTAB0.0911g，加入20ml试剂3，定容至250ml，摇匀；

工作缓冲液的配制(以下称试剂6)：吸取5.00ml试剂4，加水约50ml(防止CTAB析出)，加入10.00ml试剂5，6.00ml试剂2，定容，摇匀，超声波脱气10min。

本发明所述的土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其中测定的具体过程可以是：

①样品测定：

①-1在毛细管卡盒内装入内径为50um，长为57cm的聚酰亚胺涂层石英毛细管；新装入的毛细管先用0.1mol.l^-1HCl溶液洗涤30min，再用0.1mol.l^-1NaOH溶液洗涤30min，之后用纯水洗涤10min；

①-2在3个毛细管电泳仪专用瓶中装入上述试剂6，这3个瓶分别标记为b、c和d；在毛细管电泳仪自动进样盘上放置5个毛细管电泳仪专用瓶，其中一个为装入提取液的毛细管电泳仪样品瓶(记为a)，另外一个为空瓶(记为e)，其余3个为装入试剂6的b、c和d瓶；

①-3开紫外检测灯、选择254nm波长；

①-4用仪器自带软件设定测定步骤，即先用b号瓶中的试剂冲洗毛细管3min，废液进入空瓶e；之后毛细管一端插入样品瓶a，另一端插入空瓶e，压力进样10s，之后毛细管两端插入瓶c和d，选择分离电压25kV，电流方向选择反向(即毛细管进样端为阴极，检测器端为阳极)；选择分离时间为5-6min；重复本段各步骤，可测定多个样品；每次开机后由于仪器本身未达到稳定，因此前4个样品的测定值应弃去不用；每测定8个样品后应更新b、c和d瓶中的缓冲液；

仪器将形成各离子的出峰时间和峰面积，离子的出峰时间是确定离子身份的依据，而其峰面积是确定其含量的依据；

②离子身份确定：

②-1分别配以下溶液：

标样1：20mg.l^-1Cl^-

标样2：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-

标样3：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-

标样4：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-

标样5：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

②-2以上标样作为样品，按标样1到标样5的顺序，分别将各标样装入a瓶，按①-4中的步骤，测定各离子的出峰时间，根据得出的各离子的出峰时间，以样品5中各离子的出峰时间作为土壤提取液测定时确定各离子身份的校准；①结果中各离子的出峰时间与标样出峰时间相同或相差绝对值小于0.01min者即为同一离子；

③标准曲线制作：

③-1配以下溶液：

标样1：0mg.^1-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样2：5mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样3：10mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样4：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样5：40mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样6：60mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

以上标样作为样品，按标样1到标样6的顺序，分别将各标样装入a瓶，按①-4中的步骤，测定各离子的峰面积，根据②中得出的各离子的身份，及③中各离子在不同浓度下的峰面积，用离子浓度(C_离子浓度)和峰面积(A_峰面积)进行线性回归：即可得到形式如下的回归方程：

A_峰面积＝a+bC_离子浓度

④各离子在土壤中的含量计算：

各用①-4中得出的各离子的峰面积，代入③中得到的相应离子的回归方程，即可求出该离子在提取液中的浓度C_离子浓度(单位：mg.l^-1)。

土壤中各离子的含量(S_离子含量)用以下公式计算：

S_离子含量(mg.kg^-1)＝C_离子浓度×50/5

式中：50表示加入提取剂数量为50.00ml；5表示称取土壤样品质量为5.00g。

下面，结合具体实施例及其附图，对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为毛细管电泳仪示意图；

图2a和图2b分别为典型无机阴离子的毛细管电泳图谱。

具体实施方式

本发明所述的土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，可以用一个具体的例子加以详细说明，其具体步骤如下：

A提取液制备：

称取过2mm筛的风干土样10.00g，加＞18.6MΩ.cm的水50.00ml，振荡30min，静置90min，定量滤纸过滤，滤液再用孔径为0.22um的滤膜过滤，超声波脱气10min，之后装入毛细管电泳仪样品瓶，此瓶记为a。

B缓冲液配制：

试剂1、100mmol.l^-1H₂SO₄溶液：吸取13.90ml分析纯浓，缓慢加入约100ml水。搅拌、冷却、加水至250ml，冷却、定容。取此溶液25ml，定容至250ml，摇匀，此即为100mmol.l^-1H₂SO₄溶液。

试剂2、0.02mol.l^-1NaOH溶液：称取0.25g分析纯NaOH溶液、定容至250ml。之后吸取此溶液50ml定容至250ml，摇匀，此即为0.02mol.l^-1NaOH溶液。

试剂3、分析纯无水乙醇。

试剂4、100mmol.l^-1CrO₄ ^2-溶液：称取分析纯Na₂CrO₄.4H₂O 5.8505g，加入17.20ml试剂1，加水溶解，定容至250ml，摇匀。

试剂5、1mmol.l^-1CTAB(十六烷基三四基溴化铵)溶液：称取分析纯CTAB0.0911g，加入20ml试剂3，定容至250ml，摇匀。

试剂6、工作缓冲液：吸取5.00ml试剂4，加水约50ml(防止CTAB析出)，加入10.00ml试剂5，6.00ml试剂2，定容，摇匀，超声波脱气10min。

C测定：

C-1样品测定：

C-1.1在毛细管卡盒内装入内径为50um，长为57cm的聚酰亚胺涂层石英毛细管。新装入的毛细管先用0.1mol.l^-1HCl溶液洗涤30min，再用0.1mol.l^-1NaOH溶液洗涤30min，之后用纯水洗涤10min。

C-1.2在3个毛细管电泳仪专用瓶中装入B中的试剂6，这3个瓶分别标记为b、c和d。在毛细管电泳仪自动进样盘上放置5个毛细管电泳仪专用瓶，其中一个为瓶a，另外一个为空瓶(记为e)，其余3个为装入试剂6的b、c和d瓶。

C-1.3开紫外检测灯、选择254nm波长。

C-1.4用仪器自带软件设定测定步骤，先用b号瓶中的试剂冲洗毛细管3min，废液进入空瓶e。之后毛细管一端插入样品瓶a，另一端插入空瓶e，压力进样10s，之后毛细管两端插入瓶c和d，选择分离电压25kV，电流方向选择反向(即毛细管进样端为阴极，检测器端为阳极)。选择分离时间为5-6min。重复本段各步骤，可测定多个样品。每次开机后由于仪器本身未达到稳定，因此前4个样品的测定值应弃去不用。每测定8个样品后应更新b、c和d瓶中的缓冲液。

仪器将形成各离子的出峰时间和峰面积，离子的出峰时间是确定离子身份的依据，而其峰面积是确定其含量的依据。

C-2离子身份确定：

C-2.1分别配以下溶液：

标样1：20mg.l^-1Cl^-

标样2：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-

标样3：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-

标样4：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-

标样5：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

C-2.2以上标样作为样品，按标样1到标样5的顺序，分别将各标样装入a瓶，按C-1.4中的步骤，测定各离子的出峰时间，根据得出的各离子的出峰时间，以样品5中各离子的出峰时间作为土壤提取液测定时确定各离子身份的校准。C-1结果中各离子的出峰时间与标样出峰时间相同或相差绝对值小于0.01min者即为同一离子。

C-3标准曲线制作：

C-3.1配以下溶液：

标样1：0mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样2：5mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样3：10mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样4：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样5：40mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样6：60mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

以上标样作为样品，按标样1到标样6的顺序，分别将各标样装入a瓶，按C-1.4中的步骤，测定各离子的峰面积，根据C-2中得出的各离子的身份，及C-3中各离子在不同浓度下的峰面积，用离子浓度(C_离子浓度)和峰面积(A_峰面积)进行线性回归：即可得到形式如下的回归方程：

A_峰面积＝a+bC_离子浓度

C-4各离子在土壤中的含量计算：

各用C-1.4中得出的各离子的峰面积，代入C-3中得到的相应离子的回归方程，即可求出该离子在提取液中的浓度C_离子浓度(单位：mg.l^-1)。

土壤中各离子的含量(S_离子含量)用以下公式计算：

S_离子含量(mg.kg^-1)＝C_离子浓度×50/5

式中：50表示加入提取剂数量为50.00ml；5表示称取土壤样品质量为5.00g。

图2a和图2b分别为采用本发明所述土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法测得的典型无机阴离子的毛细管电泳图谱。其中：1为Cl^-，2为SO₄ ^2-，3为NO₃ ^-，4为PO₄ ^3-，5为CO₃ ^2-，各离子浓度均为3mg.L^-1。

本发明对土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法中的样品提取以及测定缓冲液的配置等进行了改进，克服了现有技术中存在的不足，使毛细管电泳法能够真正被用于土壤无机离子的测定。

Claims (2)

1.一种土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其特征在于具有如下步骤：a.制备提取液：称取过2mm筛的风干土样10.00g，加＞18.6MΩ.cm的水50.00ml，振荡30min，静置90min，定量滤纸过滤，滤液再用孔径为0.22um的滤膜过滤，超声波脱气10min，之后将提取液装入毛细管电泳仪样品瓶；

b.配制缓冲液：100mmol.l^-1H₂SO₄溶液的配制，以下称试剂1：吸取13.90ml分析纯浓，缓慢加入约100ml水；搅拌、冷却、加水至250ml，冷却、定容；取此溶液25ml，定容至250ml，摇匀，此即为100mmol.l^-1H₂SO₄溶液；0.02mol.l^-1NaOH溶液的配制，以下称试剂2：称取0.25g分析纯NaOH溶液、定容至250ml；之后吸取此溶液50ml定容至250ml，摇匀，此即为0.02mol.l^-1NaOH溶液；分析纯无水乙醇的配制，以下称试剂3；100mmol.l^-1CrO₄ ^2-溶液的配制，以下称试剂4：称取分析纯Na₂CrO₄.4H₂O5.8505g，加入17.20ml试剂1，加水溶解，定容至250ml，摇匀；1mml.l^-1CTAB溶液的配制，以下称试剂5：称取分析纯CTAB0.0911g，加入20ml试剂3，定容至250ml，摇匀；工作缓冲液的配制，以下称试剂6：吸取5.00ml试剂4，加水约50ml，注意防止CTAB析出，加入10.00ml试剂5，6.00ml试剂2，定容，摇匀，超声波脱气10min；

c.进行测定：测定过程包括对提取液的测定，仪器将形成各离子的出峰时间和峰面积，离子的出峰时间是确定离子身份的依据，而其峰面积是确定其含量的依据；以及对离子身份的确定；测定过程还包括制作标准曲线；以及计算各离子在土壤中的含量。

2.如权利要求1所述的土壤无机阴离子的毛细管电泳测定方法，其特征在于测定的具体过程是：

①样品测定：

①-1在毛细管卡盒内装入内径为50um，长为57cm的聚酰亚胺涂层石英毛细管；新装入的毛细管先用0.1mol.l^-1HCl溶液洗涤30min，再用0.1mol.l^-1NaOH溶液洗涤30min，之后用纯水洗涤10min；

①-2在3个毛细管电泳仪专用瓶中装入上述试剂6，这3个瓶分别标记为b、c和d；在毛细管电泳仪自动进样盘上放置5个毛细管电泳仪专用瓶，其中一个为装入提取液的毛细管电泳仪样品瓶，将该瓶记为a，另外一个为空瓶，将该瓶记为e，其余3个为装入试剂6的b、c和d瓶；①-3开紫外检测灯、选择254nm波长；

①-4用仪器自带软件设定测定步骤，即先用b号瓶中的试剂冲洗毛细管3 min，废液进入空瓶e；之后毛细管一端插入样品瓶a，另一端插入空瓶e，压力进样10s，之后毛细管两端插入瓶c和d，选择分离电压25kV，电流方向选择反向，即：毛细管进样端为阴极，检测器端为阳极；选择分离时间为5-6min；重复本段各步骤，可测定多个样品；每次开机后由于仪器本身未达到稳定，因此前4个样品的测定值应弃去不用；每测定8个样品后应更新b、c和d瓶中的缓冲液；

仪器将形成各离子的出峰时间和峰面积，离子的出峰时间是确定离子身份的依据，而其峰面积是确定其含量的依据；

②离子身份确定：

②-1分别配以下溶液：

标样1：20mg.l^-1Cl^-

标样2：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-

标样3：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-

标样4：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-

标样5：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

②-2以上标样作为样品，按标样1到标样5的顺序，分别将各标样装入a瓶，按①-4中的步骤，测定各离子的出峰时间，根据得出的各离子的出峰时间，以样品5中各离子的出峰时间作为土壤提取液测定时确定各离子身份的校准；①结果中各离子的出峰时间与标样出峰时间相同或相差绝对值小于0.01min者即为同一离子；

③标准曲线制作：

③-1配以下溶液：

标样1：0mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样2：5mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样3：1 0mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样4：20mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样5：40mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

标样6：60mg.l^-1Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-

以上标样作为样品，按标样1到标样6的顺序，分别将各标样装入a瓶，按①-4中的步骤，测定各离子的峰面积，根据②中得出的各离子的身份，及③中各离子在不同浓度下的峰面积，用离子浓度：C_离子浓度，和峰面积：A_峰面积，进行线性回归：即可得到形式如下的回归方程：

A_峰面积＝a+bC_离子浓度

④各离子在土壤中的含量计算：

各用①-4中得出的各离子的峰面积，代入③中得到的相应离子的回归方程，即可求出该离子在提取液中的浓度C_离子浓度，C_离子浓度的单位：mg.l^-1；土壤中各离子的含量：S_离子含量，用以下公式计算：

S_离子含量(mg.kg^-1)＝C_离子浓度×50/5

式中：50表示加入提取剂数量为50.00ml；5表示称取土壤样品质量为5.00g。

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