CN100376597C - 一种降血压多肽与分离方法及其应用 - Google Patents

一种降血压多肽与分离方法及其应用 Download PDF

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一种降血压多肽与分离方法及其应用，涉及一种多肽及其制备，提供一种降血压多肽与分离方法以及用于制备降血压药物和食品的应用。降血压多肽其氨基酸序列为Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Ser-Pro-Ala，其分离方法为收集玉米蛋白粉粉碎后筛下的粉末作为酶解底物，加入碱性蛋白酶水解得水解液，水解液经离子交换层析得到高降血压肽活性组分，再经凝胶层析得高降血压肽活性组分，经两次反相高效液相色谱，筛选出具有高抑制活性的组分即为目标产物。具有高抑制血压活性，来源于食物蛋白，无副作用、易吸收、对正常血压无作用，可用于制备降血压药物和食品。

Description

一种降血压多肽与分离方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种多肽及其制备，尤其是涉及一种以玉米蛋白粉为原料，通过酶解法分离制备得到的具有高活性的降血压多肽，以及降血压多肽在制备降血压药物和食品中的应用。
背景技术
降血压肽(Angiotensin-converting Enzyme Inhibitory Peptides，ACEIP)是一类能够降低人体血压的小分子多肽，它是血管紧张素转化酶(Angiotensin-convertingEnzyme，ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素II的生成而达到降低血压的目的。1965年Ferreira(Ferreira，S.H.Abradykinin-potentitiating factor pressing the venom ofBothropsjiararaca，Brit.Pharmacol，1965，24：163-169)从南美洲蝮蛇的毒液中提取一种多肽物质，发现其具有降血压功能。对食物中降血压肽的研究开始于Oshima等(G.Oshima，H.Shimabukuro，K.Nagasawa.Peptide inhibitors of angiotensin-convertingenzyme in digests of gelatin by bacterial collagenase.Biochimaica et BiophysicaActa，1979，566：128-137)从明胶酶解液中提取的ACE抑制肽。由于降血压肽具有降血压效果明显，对正常血压无影响和无副作用等优点，已成为目前研究的热点。1982年Maruyamas等从牛酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离出12肽的ACEI，随后开始了从更多的蛋白质源中获得ACEI肽的研究，现已成功从鱼贝类、大豆、玉米和酒糟等众多食物蛋白中获得了ACE抑制肽。从新的原料中发现和分离鉴定新的降血压肽仍然是降血压肽研究的一个重要方向。授权公开号为CN1055479C的发明专利提供一种心血管活性多肽以及它们的合成和在医学中的应用，所说的多肽为AA-Arg-Pro-Ala-Lys-OH和AA-Arg-Pro-Ala-lys-Arg-Gly-Asp-AA-OH，其中AA和AA’为L构型的氨基酸，涉及它们在医学方面的应用，例如作为扩血管、降血压和抗血栓药物使用，以这类多肽作为活性成分的药物组合物。公开号为CN1552894A的发明专利申请公开一种低分子量的功能玉米短肽产品、利用酶法直接降解玉米蛋白粉中的玉米蛋白制备该短肽的方法及该短肽产品的应用。该玉米肽产品干粉是一种淡黄色的粉末，分子量分布主要在1000以下，是含2-9氨基酸残基的短肽混合物，用TNBS法测定平均链长4-5个氨基酸。制备方法涉及原料预处理、酶水解、酶灭活、精制和干燥制粉等步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降血压多肽；本发明的另一目的在于提供一种利用酶解法从玉米蛋白粉中分离降血压多肽的方法；本发明的另一目的在于将降血压多肽用于制备降血压药物和食品的应用。
本发明所述的降血压多肽其氨基酸序列为：
Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Ser-Pro-Ala，
其分子量为1057.6552，理论等电点为5.24，降血压活性IC50为15μmol/L，为白色粉末，易溶于水。
IC50的定义为在一定条件下抑制ACE酶活性一半时所需要的抑制剂浓度。所述的降血压多肽均不来自于玉米醇溶蛋白，而是来自于其它的蛋白。
本发明所述的降血压多肽的分离方法，其步骤为：
1)原料玉米蛋白粉经粉碎后，收集筛下的淡黄色粉末作为酶解底物；
2)在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶水解得水解液，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶(0.03～0.05AU)，pH为7～9，水解温度为50～70℃，水解时间为7～8h；
3)水解液经离子交换层析，分离得到高降血压肽活性组分；
4)将分离得到的高降血压肽活性组分经凝胶层析得高降血压肽活性组分；
5)将分离得到的高降血压肽活性组分经两次反相高效液相色谱，筛选出具有高抑制活性的组分，经过测定，其序列为Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Ser-Pro-Ala。
在步骤1)中，原料玉米蛋白粉经粉碎后最好过200目筛。
在步骤2)中，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH为8.0，水解温度为60℃，水解时间为6h，碱性蛋白酶选自Alacalase 2.4L。
本发明所述的降血压多肽具有高抑制血压活性，可用于制备降血压药物。
本发明所述的降血压多肽具有高抑制血压活性，可用于制备降血压食品。
通过对本发明获得的降血压多肽与已报道的玉米醇溶蛋白的氨基酸序列进行比对表明，本发明得到的多肽均不来自于玉米醇溶蛋白，而是来自于其它的蛋白，而且该多肽序列目前尚未见到报道。在一定剂量时能抑制ACE活性并降低原发性高血压老鼠的血压，其氨基酸序列与已报道的玉米来源的降血压肽序列不同，属于新发现的降血压肽。从以下实施例中所给出的体内外活性实验将表明本发明所述的降血压多肽具有明显的降血压作用。由于本发明所述的降血压多肽来源于食物蛋白，因此具有无副作用、易吸收、对正常血压无作用等特点，可开发为具有降血压作用的功能性药物和食品。
附图说明
图1给药后24小时内SHR收缩压的变化曲线。在图1中，横座标为灌喂后时间(h)，纵坐标为ΔSBP(mmHg)。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
1)以玉米蛋白为原料，其为较大的褐色片状颗粒，为了便于酶解反应时酶与底物能够充分接触，原料按如下方式进行预处理：将原料玉米蛋白粉经粉碎机粉碎后过200目筛，收集筛下的淡黄色粉末作为酶解底物。
2)在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶水解，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH为8.0，水解温度为60℃，水解时间为6h，碱性蛋白酶选自Alacalase 2.4L。
3)水解液经离子交换层析，离子交换填料为QAE-A25，工艺步骤为：填料预处理→装柱→上样→梯度洗脱，工艺条件为：(1)填料预处理：称取7g QAE-A25阴离子交换树脂粉末于烧杯中，加入一定体积的洗脱液A，于沸水浴中溶胀2h，冷却后倒掉液面上漂浮的细小颗粒，用洗脱液A反复清洗几次，配成75％的悬浮液，然后在真空箱中抽真空赶掉悬浮液中的气泡备用。(2)装柱：将层析柱(C16/40，内径16mm，长40cm)用去离子水清洗干净后垂直放于铁架台上，加入一定量的洗脱液A，打开出水口以赶走底部的气泡，当柱底部的缓冲液约有2cm高时关闭层析柱底部出水口。将溶胀好的、搅拌均匀的凝胶悬浮液一次性的倒入层析柱中，然后迅速的接上蠕动泵，打开出水口，以2mL/min的流速将洗脱液A泵入层析柱中使填料迅速沉降，待填料全部沉降完全后再用5mL/min的流速挤压填料，待柱床高度不再变化后停泵，迅速将Adaptor接上并适当压紧，使床表面无多余空间和洗脱液，此时床体积高度约为13cm。用洗脱液A平衡2个床体积后即可使用。(3)上样：蠕动泵上样，上样量为300mg，上样速度为0.5mL/min。(4)梯度洗脱：洗脱液A为30mmol/LpH8.0Tris-HCl，洗脱液B的离子强度为2mol/L NaCl，离子强度梯度(NaCl)为0.024mol/L.min、洗脱流速为0.9mL/min、。
4)由步骤3)分离得到的高降血压肽活性组分经凝胶层析，填料为Superdex 30p.g.。工艺步骤为填料预处理→装柱→上样→洗脱。工艺条件为(1)填料预处理：填料已经在20％乙醇中预溶胀好，因此在使用时只需要先将乙醇除去即可使用。用经0.45μm滤膜滤过的去离子水反复清洗填料，直至将乙醇完全除去，然后放入真空干燥箱中抽真空即可装柱。(2)装柱：将水去离子水清洗干净的层析柱(XK16/70，内径16mm，长70cm)垂直放置于铁架台上。先向柱内加入洗脱液，将柱底端的气泡排出，关闭柱出口，并在柱的顶端接上Revisior。将已经处理好的填料用去离子水调至体积约475mL的均匀的悬浊液，然后沿玻璃棒一次性倒入层析柱中，迅速将蠕动泵连上，用洗脱液以1mL/min的速度冲洗柱子2h，以加速填料的沉降并使填料均匀沉降。待填料沉降完全后小心取下Revisior，接上Adaptor，再以4mL/min的速度冲压柱子，待柱高不再发生变化时即可停泵。将Adaptor向下稍微用力压紧，使之与床表面紧密接触不留空隙。再用缓冲液平衡两个床体积即可使用。用该法装柱有很好的重复性。(3)上样：蠕动泵上样，上样量为床体积的2％，上样速度为0.5mL/min。(4)洗脱：洗脱液为pH6.050mol/Lm乙酸-乙酸铵缓冲溶液，洗脱流速为0.9mL/min。
5)由步骤4)所分离得到的高降血压肽活性组分经两次反相高效液相色谱，色谱柱为Everest C18反相柱(4.6mm×250mm，238TP54)，采用梯度洗脱，流动相A为为5％乙腈+0.1％三氟乙酸，B相为纯乙腈+0.1％三氟乙酸。色谱分离条件为见表1。筛选出具有高抑制活性的组分，经过测定，其序列为Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Ser-Pro-Ala。
表1色谱分离条件
  时间(min)   A(％)   B(％)   流速(mL/min)   温度(℃)
  0.002.0035.00   75.070.055.0   25.030.045.0   0.8000.8000.800   303030
以下给出降血压多肽体外降血压活性检测的原理及结果。
测定原理：血管紧张素转化酶(ACE)在37℃pH8.3下能够水解马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)生成马尿酸(Hippuric acid)，降血压肽通过抑制ACE酶活性降低马尿酸的产量，马尿酸在228nm处有最大吸收，反应生成的马尿酸可用乙酸乙酯特异性的提取出来。通过检测在一定时间内生成的马尿酸的量就可以计算出降血压肽对ACE酶活性抑制率。
抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(Ec-Es)/(Ec-Eb)×100％，其中，Ec为不加入抑制剂条件下得到的光密度值；Es为加入抑制剂后测得的光密度值；Eb为反应发生前加入HCl阻止反应发生最后测得的光密度值。
降血压肽的活性用IC50来表示，IC50的定义为在一定条件下抑制ACE酶活性一半时所需要的抑制剂浓度。
按上述方法测得降血压多肽的IC50为15μmol/L。
以下给出降血压多肽体内降血压活性检测的原理及结果。
实验动物为原发性高血压大鼠(SHR)，将40只SHR按体重随机分为对照组、卡托普利组(目前临床用药)和降血压肽组，降血压肽组包括高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组8只。其中高、中、低剂量组给予降血压肽1000、500、100mg/kg bw，卡托普利组给予卡托普利10mg/kg bw，对照组给予蒸馏水5mL，另取8只WKY给予玉米降血压肽1000mg/kgbw，给药方式为灌喂，降血压肽和卡托普利均溶于5mL蒸馏水中。所有大鼠均于实验前驯化一周后开始正式实验。所有大鼠分笼饲养，每笼2只，均自由饮水进食，活动不限。温度为23±1℃，湿度为55±5％，光照和黑暗各12h。采用尾动脉容积法测定大鼠的收缩压(SBP)。研究了给药后24内降血压肽降血压效果，结果见图1。
如图1所示，SHR灌喂玉米降血压肽后，收缩压下降，而且降压效果与灌喂剂量呈对应关系。与对照组相比，多肽组SHR在灌喂玉米降血压肽2h后收缩压开始下降，高剂量组SHR在第10h收缩压达到最低点，SBP降低了22mmHg，中、低剂量组SHR分别在第6、12h收缩压达到最低点，SBP分别降低了12、13mmHg。多肽组的降压持续时间长达12h以上。高剂量组的最大降压效果(ΔMaxSBP＝22mmHg)与卡托普利组的最大降压效果(ΔMaxSBP＝17mmHg)要高30％，在第2-8h内两者降压效果没有统计学意义上的差异(P＞0.05)，在第8小时以后，高剂量组的降压效果优于卡托普利组(P＜0.05)。此外，它的降压持续时间要比卡托普利的降压持续时间长。虽然中、低剂量组的最大降压效果(ΔMaxSBP＝12、13mmHg)要比卡托普利组低30％和25％，但是它们的降压持续时间(＞12h)却长于卡托普利组。将降血压多肽分别以120mg/kg、150mg/kg和100mg/kg bw剂量灌喂SHR大鼠，2h后血压降低，最大降压效果分别为13mmHg，降压持续时间达12h以上。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.05AU，pH为7～9，水解温度为50℃，水解时间为8h，碱性蛋白酶选自Alacalase2.4L。
实施例3
与实施例1类似，其区别在于玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.03AU，pH为7～9，水解温度为70℃，水解时间为7h，碱性蛋白酶选自Alacalase2.4L。

Claims (10)

1.一种降血压多肽，其特征在于其氨基酸序列为：
Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Ser-Pro-Ala，
其分子量为1057.6552，理论等电点为5.24，降血压活性IC50为15μmol/L，为白色粉末，易溶于水。
2.一种分离如权利要求1所述的一种降血压多肽的方法，其特征在于其步骤为：
1)原料玉米蛋白粉经粉碎后，收集筛下的淡黄色粉末作为酶解底物；
2)在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶水解得水解液；
3)水解液经离子交换层析，分离得到高降血压肽活性组分；
4)将分离得到的高降血压肽活性组分经凝胶层析得高降血压肽活性组分；
5)将分离得到的高降血压肽活性组分经两次反相高效液相色谱，筛选出具有高抑制活性的组分，经过测定，其序列为Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Ser-Pro-Ala。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤1)中，原料玉米蛋白粉经粉碎后过200目筛。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤2)中，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.03～0.05AU，pH为7～9。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.042 AU，pH为8.0。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤2)中，在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶水解，水解温度为50～70℃，水解时间为7～8h。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于水解温度为60℃，水解时间为6h。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于碱性蛋白酶选自Alacalase 2.4L。
9.如权利要求1所述的一种降血压多肽用于制备降血压药物的应用。
10.如权利要求1所述的一种降血压多肽用于制备降血压食品的应用。
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