CN100371433C - 包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件及利用它电化学裂解细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件，及利用它电化学裂解细胞的方法，所述电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极。

Description

包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件及利用它电化学裂解细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种包括用于细胞裂解(cell lysis)的电解装置的微流体器件(microfluidic device)及利用它裂解细胞(lysing cell)的方法。
背景技术
微流体器件是指其中入口、出口、反应器等通过微通道连接的器件。该器件在本领域是公知的，并广泛用于微量分析仪器如芯片实验室(LOC)中。在微流体器件中，不但形成微通道，而且包括输送并混合流体的微泵，微混合器，及过滤输送中的流体的微过滤器。用作生物测定器件如LOC的微流体器件，通常应该包括在裂解细胞或病毒的过程中所需的装置或者利用外部裂解的细胞溶液或已经提纯的材料。碱性法等常用作细胞裂解方法。然而，当利用这些方法时，必须加入化学药品如NaOH且必须包括用于在裂解混有化学药品的细胞之后除去所加入的化学药品的装置。例如，必须包括用于完成上述过程的阀、泵、过滤器等。
因而，包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件仍然不是公知的。
另外，各种细胞裂解方法是公知的。例如，煮沸法、碱性法、利用酶的细胞裂解方法等都是公知的。碱性法是通过将细胞或病毒暴露于具有高pH的物质如NaOH来裂解细胞的方法。然而，常规的细胞或病毒裂解方法如碱性法用于微流体器件如LOC中，有许多缺点。例如，当通过利用碱性溶液如NaOH裂解细胞得到的碱性细胞裂解液(lysate)用中和溶液来中和时，需要用于细胞裂解的碱性溶液的注入步骤并且因此需要装置并且样品溶液由于碱性溶液和中和溶液的加入而被稀释。该溶液注入步骤和装置在处理微体积的微流体器件中可能带来严重的问题，并且当得到或扩增所需的样品时，稀释也可能带来问题。而且，必须除去或中和碱性溶液如NaOH以用于随后的生物分析方法如PCR中。
因而，、当通过电解在原位产生裂解细胞的物质如氢氧化物来裂解细胞时能够提供具有适于随后生物分析的pH和条件的细胞裂解液的细胞裂解方法，仍然不是公知的。
发明人发现，当电解是利用含有包含标准氧化电位比水低或高的离子的电解液的阳极室及含有包含标准还原电位比水低的离子和细胞的电解液的阴极室进行时，能够制备具有适于随后生物分析的pH和条件的细胞裂解液，从而导致本发明的完成。
发明内容
本发明提供一种包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件。
本发明还提供一种利用电解裂解细胞的方法。
根据本发明的一个方面，提供一种包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极。
根据本发明的另一方面，提供一种利用包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件裂解细胞或病毒的方法，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极，所述方法包括：
经过阳极室的入口，将包含标准氧化电位比水低或高的化合物的阳极室溶液引入到阳极室中；
经过阴极室的入口，将包含细胞或病毒和标准还原电位比水低的化合物的阴极室溶液引入到阴极室中；及
通过向包括在阳极室和阴极室中的电极施加电流，在阳极室和阴极室中引起电解而裂解细胞。
附图说明
通过参考附图详述其示例性实施方案，本发明的上述和其它特点和优点将变得更加显而易见，其中：
图1A为包括阴极室、阳极室和安装在阴极室与阳极室之间的隔板的电解装置图；
图1B为包括阴极室和阳极室的、用作本发明实施例1中的对照电解装置的电解装置图；
图1C为包括阴极室和阳极室的、置于载物玻片上用于显微观察的、用作本发明实施例1的对照电解装置的电解装置图；
图1D为根据本发明实施方案包括电解装置的微流体器件图；
图1E和1F为根据本发明另外的实施方案，其中分别安装了两个泵和一个泵的包括电解装置的微流体器件图；
图2图示在37℃下培养用通过电解得到的溶液处理过的细胞16小时后的琼脂平板；
图3图示利用通过用电解的溶液处理细胞得到的溶液作为模板，进行实时PCR得到的实时PCR曲线；
图4为在利用通过用电解的溶液处理细胞得到的溶液作为模板，进行实时PCR得到的PCR产物的电泳后，用Agilent 2100 Bioanalyzer分析结果图；
图5为将图4的结果图解为PCR产物的浓度图；
图6图示利用通过在所使用的盐浓度、电流和时间条件下，直接电解细胞溶液得到的细胞裂解液作为模板，进行实时PCR扩增的结果；
图7图示通过利用在各种条件下直接电解细胞溶液得到的细胞裂解液作为模板，进行PCR得到的最终PCR产物的电泳结果；
图8图示在电泳后，利用Agilent 2100 Bioanalyzer，分析利用图6中通过电解得到的细胞裂解液作为模板，进行实时PCR得到的PCR产物；
图9图示用连在显微镜上的数字照相机，在施加5V的DC电压和1mA的电流后，连续观察载片上的加样孔(well)中的CHO细胞的结果；
图10图示在向阳极室和阴极室中均加入10ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝6.0)，并施加5V的DC电压后，观察pH随时间变化的结果；
图11图示在分别向阳极室和阴极室中加入200ml 100mM MgSO4水溶液(初始pH＝5.75)和200ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.75)，并施加10V的DC电压后，观察pH随时间变化的结果；
图12图示在分别向阳极室和阴极室中加入200ml 100mM Na2SO4水溶液(初始pH＝5.82)和200ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.82)，并施加10V的DC电压后，观察pH随时间变化的结果；及
图13图示利用阳极室中不同的电解质进行电解后，阳极电解的溶液和阴极电解的溶液混合物的实时PCR的结果。
具体实施方式
本发明提供一种包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极。
本实施方案的微流体器件包括用于细胞裂解的电解装置，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板。在用于细胞裂解的电解装置中，隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极。入口和出口不需要分离，一个口也可以既充当入口又充当出口。
当含有细胞或病毒的溶液被引入到阴极室中并且适当的电解质包括在阳极室中时，包括在本实施方案的微流体器件中的用于细胞裂解的电解装置，可以通过向包括在各室中的电极施加电流用于裂解细胞。推测细胞裂解是由于在阴极室中通过施加电流产生的氢氧离子而完成的，但本发明不限于具体的机理。
用于细胞裂解的电解装置构成微流体器件的一部分。例如，阳极室和阴极室的各个入口和出口构成微流体器件的微通道，并且阳极室和阴极室以微通道的形式构成反应器。在本实施方案的微流体器件中，阳极室和阴极室的各个入口由单独的微通道组成。另外，阳极室和阴极室的各个出口可以是单独的微通道或可以彼此连接/结合。阳极室和阴极室的各个出口优选被连接/结合，以便在一个微通道中混合并中和阳极室溶液和阴极室溶液。当形成一个连接的微通道时，阴极室的细胞裂解液可以被中和，而不加入单独的中和溶液。
在本发明的实施方案中，阳极室溶液可以包含标准氧化电位比水低的化合物。该化合物的实例包括阴离子如NO3 -、F-、SO4 2-、PO4 3-和CO3 2-，但不限于此。当阳极室溶液为具有标准氧化电位比水低的化合物时，当电解是利用本实施方案的微流体器件进行时，阳极室中的水被电解产生氧气和H+离子。
然而，当阳极室溶液和阴极室溶液混合并且仅需要细胞裂解而不需要中和时，阳极室溶液可以包含化合物，即标准氧化还原电位比水低或高的电解质。该化合物的实例包括阴离子如Cl-、NO3-、F-、SO4 2-、PO4 3-和CO3 2-，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，阴极室溶液可以包含标准还原电位比水低的化合物。该化合物的实例包括阳离子如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+，但不限于此。因而，当电解是利用本实施方案的微流体器件进行时，阴极室中的水被电解产生氢气和OH-离子。
在本实施方案中，隔板优选允许电流穿过，但是不允许由包含在阳极室和阴极室中的电解质电解产生的离子和/或气体穿过。隔板更优选允许电穿过，但是不允许氢离子和氢氧离子和/或气体穿过。隔板的实例包括NafionTM(Dupont)、DowexTM(Aldrich)和DiaionTM(Aldrich)，但不限于此。
包括在阳极室和阴极室中的电极可以选自Pt，Au，Cu，及Pd。当Pt电极用于阳极室中时，可以防止蛋白质和DNA的吸收。当使用Cu电极时，它在阳极室与氯化物如NaCl反应形成CuCl2，从而减少有毒的氯气的产生。当使用Pd电极时，它吸收在阴极室中产生的氢气，并因而不需要除气过程。
本实施方案的微流体器件还可以包括向阳极室引入或从阳极室排出溶液的泵，及向阴极室引入或从阴极室排出溶液的泵。或者，微流体器件还可以包括向阳极室和阴极室引入或从阳极室和阴极室排出溶液的泵。在此情况下，阳极室和阴极室的溶液利用一个泵注入并混合。
在本发明的实施方案中，微流体器件可以包括具有上述用于细胞裂解的电解装置的细胞裂解室(compartment)、核酸分离室、核酸扩增室和检测室。本实施方案的微流体器件可以充当LOC。可用于核酸分离室、核酸扩增室和检测室的元件可以是任何本领域公知的装置。
本发明还提供一种裂解细胞或病毒的方法，该方法通过利用包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件的电解完成，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极，该方法包括：经过阳极室的入口，将包含标准氧化电位比水低或高的化合物的阳极室溶液引入到阳极室中；经过阴极室的入口，将包含细胞或病毒和标准还原电位比水低的化合物的阴极室溶液引入到阴极室中；及通过向包括在阳极室和阴极室中的电极施加电流，在阳极室和阴极室中引起电解而裂解细胞。
本实施方案的细胞或病毒裂解方法包括：经过阳极室的入口，将包含标准氧化电位比水低或高的化合物的阳极室溶液引入到阳极室中；及经过阴极室的入口，将包含细胞或病毒和标准还原电位比水低的化合物的阴极室溶液引入到阴极室中。
在本发明的实施方案中，所述标准氧化电位比水低的化合物可以包括下列NO3 -、F-、SO4 2-、PO4 3-和CO3 2-中的至少一种阴离子，并且所述标准氧化电位比水高的化合物可以包括Cl-离子，但不限于此。标准还原电位比水低的化合物可以包括下列Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+中的至少一种阳离子，但不限于此。该两个步骤可以同时或连续进行。
当电解是在将包含最常包含在生物样品溶液中的NaCl的样品溶液，引入到阳极室和阴极室中之后完成的时，阳极室中的氯化物而不是水被电解产生氯气，因而产生了比阴极室中产生的氢氧离子的量少的氢离子。氢离子是由于氯气和水之间的反应而产生的并且它的量随着溶解氯气的条件变化，这使得pH控制困难。为了解决该问题，在本发明的实施方案中，标准氧化电位比水低的化合物和标准还原电位比水低的化合物分别用于阳极室和阴极室中。
本实施方案的细胞或病毒裂解方法包括通过向包括在阳极室和阴极室中的电极施加电流，在阳极室和阴极室中引起电解而裂解细胞。在本实施方案的方法中，因为阴极室含有包含标准还原电位比水低的化合物的阴极室溶液，所以水被电解产生氢气和OH-离子。因而，阴极室中的细胞或病毒能够被氢氧离子裂解。另外，在本发明的实施方案中，因为阳极室含有包含标准氧化电位比水低的化合物的阳极室溶液，所以水被电解产生氧气和氢离子。因此，阴极室溶液变为碱性，而阳极室溶液变为酸性。
通常，细胞裂解液经历各种附加的生物分析过程，如PCR、核酸分离或蛋白质分离。因为生物分子如核酸或蛋白质在中性状态下一般是稳定的，该生物分析过程在中性状态下进行。具体地，细胞裂解、核酸分离、核酸扩增、蛋白质分离和检测可以接连进行。在此情况下，在相对早期进行的细胞裂解不应该包括能够影响随后步骤中经历的反应的物质。例如，当核酸在细胞裂解后利用PCR扩增时，能够抑制PCR的物质不应被包括。
因而，本实施方案的方法还包括，在电解后，经过出口从阳极室中排出酸性溶液；经过出口从阴极室中排出碱性细胞或病毒裂解液；及混合所述酸性溶液和碱性细胞或病毒裂解液以便中和细胞或病毒裂解液。
而且，在本发明的实施方案中，从阳极室中排出的酸性溶液和从阴极室中排出的碱性细胞或病毒裂解液通过按照1∶1体积比混合而被中和。在本实施方案的方法中，因为在阴极室溶液和阳极室溶液中分别产生相同当量比的氢氧离子和氢离子，所以即使当细胞裂解后阴极室溶液和阳极室溶液按照1∶1的比例混合时，也能得到中性pH或近似中性pH。
用于本实施方案的方法的微流体器件，还可以包括向阳极室引入或从阳极室排出溶液的泵，及向阴极室引入或从阴极室排出溶液的泵。或者，所述微流体器件还可以包括向阳极室和阴极室引入或从阳极室和阴极室排出溶液的泵。在此情况下，阳极室和阴极室的溶液利用一个泵注入并混合。
另外，包括在用于本实施方案方法的微流体器件的用于细胞裂解的电解装置中的隔板，优选允许电流穿过，但是不允许由包含在阳极室和阴极室中电解质电解产生的离子和/或气体穿过。隔板更优选允许电穿过，但是不允许氢离子和氢氧离子和/或气体穿过。隔板的实例包括NafionTM(Dupont)、DowexTM(Aldrich)和DiaionTM(Aldrich)，但不限于此。
包括在用于细胞裂解的电解装置的阳极室和阴极室中的电极，可以选自Pt、Au、Cu和Pd。当Pt电极用于阳极室时，能够防止蛋白质和DNA的吸收。当使用Cu电极时，它在阳极室中与氯化物如NaCl发生反应形成CuCl2，从而减少有毒的氯气的产生。当使用Pd电极时，它吸收在阴极室中产生的氢气，因而不需要除气过程。
用于本实施方案的方法的微流体器件可以包括具有上述用于细胞裂解的电解装置的细胞裂解室、核酸分离室、核酸扩增室和检测室。该微流体器件可以充当LOC。可用于核酸分离室、核酸扩增室和检测室的元件可以是任何本领域公知的装置。
图1A为用于根据本发明实施方案的微流体器件的电解装置示意图。参考图1A，阴极室10和阳极室30被隔板20分隔。电极40和电极50安装在各室中，因而可以通过向各电极施加电压在各室中引起电解。在图1A中，室溶液的入口和出口合并为一体，并且可以通过打开和关闭上盖来实施。
图1D为根据本发明实施方案包括电解装置的微流体器件的示意图。参考图1D，阴极室10和阳极室30被隔板20分隔。电极40和电极50安装在各室中，因而可以通过向各电极施加电压在各室中引起电解。入口和出口形成在各室中并且出口被连接起来以便混合在阳极室和阴极室中电解的溶液。
图1E和1F为根据本发明实施方案另一种包括电解装置的微流体器件的示意图。图1E和1F所示的微流体器件与图1D所示的微流体器件相同，除了它们还分别包括两个微泵和一个微泵。在如图1F图解的具有微泵的微流体器件中，阳极室和阴极室的电解的溶液按照相同的量注入以混合，因而只有当通过电解在阳极室中产生的氢离子的当量与在阴极室中产生的氢氧离子的当量彼此相似时，本实施方案才是可能的。
现在将参考下面的实施例更详细地描述本发明。下面的实施例仅仅是为了说明性目的，而不意味着限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过阴极室和阳极室的电解的溶液的细胞裂解
在本实施例中，细胞裂解是利用采用电解装置进行电解之后得到的阴极室溶液和阳极室溶液引起的，该电解装置包括阴极室，阳极室，及安装在阴极室和阳极室之间的隔板，并且观察了结果。
用于本实施例的电解装置示于图1A中。参考图1A，该电解装置包括阴极室，阳极室，及安装在阴极室和阳极室之间的隔板。Au电极和Pt电极分别包括在阴极室和阳极室中，并且阴极室和阳极室被NafionTM膜(Dupont，USA)分隔。
(1)电解的溶液的制备
在室温下，通过向阴极室和阳极室中加入300ml 100mM NaCl水溶液，并施加10V的DC电压，引起电解5分钟。因此，从阳极室中得到电解的酸性溶液(EAS)，从阴极室中得到电解的碱性溶液(EBS)，并且通过以等体积混合EAS和EBS得到电解的总溶液(ETS)。这些溶液用于进行细胞裂解。利用pH传感器(AR15，Fisher scientific，USA)测量各溶液的pH。
(2)利用电解的溶液的细胞裂解
在烧瓶里的100ml LB培养基中培养大肠杆菌(E.coli)(ATCC#45020)，同时在37℃和250rpm下搅拌6～8小时。在4℃和6000g下，利用Eppendorf5810R离心机收集细胞10分钟。该大肠杆菌被悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，大肠杆菌细胞的浓度达到相应于OD600值为0.8。在室温下，细胞悬浮液分别用电解的溶液即EAS、EBS和ETS处理5分钟。反应后，在4℃和10000g下，利用Eppendorf 5810R离心机(Eppendorf AG，Germany)使样品稍离心(spin down)10分钟。结果，将所得到样品的上清液和下清液用于分析。
(3)通过实时PCR鉴定细胞裂解
为了鉴定细胞裂解的发生，利用样品的上清液和下清液作为模板，进行实时PCR。细胞裂解的发生从结果间接地推测。PCR目标序列是重组到大肠杆菌基因组的HBV基因组的一部分核心区(core domain)。
利用上清液和下清液作为模板，及SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的寡核苷酸作为引物，并利用反应体积为20μl的LightCycler仪器(RocheDiagnosticsm，Germany)，进行PCR。对于LightCycler PCR反应来说，按照所示的最终浓度制得下面的反应组分的反应通用试剂(mastermix)：2μlLightCycler master(Fast start DNA master SYBR Green I；Roche Diagnostics)，3.2μl MgCl2(5mM)，1.0μl正向-反向引物混合物(1.0mM)，4.0μl UNG(Uracil-N-Glycosylase，0.2单位)，及4.8μl PCR-等级的水。向该混合液中加入5μl被测的样品。使用两种不同的Taq DNA聚合酶(Roche Hot-start TaqDNA聚合酶和Solgent Taq DNA聚合酶)来制备该LightCycler master。
然后，将20μl的反应混合物分配在lightCycler毛细管中。该毛细管被关闭且定位于lightCycler转子上。下面的两种LightCycler方案用于两种不同的酶：(1)对于Hot-start Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics)，UNG效果步骤(在50℃，10分钟)，初始变性(在95℃，10分钟)，35个扩增和定量循环(在95℃，5秒；在62℃，15秒，及一次荧光检测)，解链曲线步骤(连续的荧光检测，在62-95℃的变温速度(ramping rate)为1℃/秒)，及最终冷却到40℃；及(2)对于Taq DNA聚合酶(Solgent)，UNG效果步骤(在50℃，10分钟)，初始变性(在95℃，1分钟)，35个扩增和定量循环(在95℃，5秒；在62℃，15秒，以及一次荧光检测)，解链曲线步骤(连续的荧光检测，在62～95℃的变温速度为1℃/秒)，及最终冷却到40℃。
(4)扩增产物的分析
具体地，用Agilent 2100 Bioanalyzer系统测定1μl扩增的产物。使用DNA 500实验室芯片(Agilent Technologies，USA)检测PCR产物和二聚体的百分率。简要地说，将9μl的凝胶-染料混合物吸取到适当的加样孔(well)中，然后该加样孔通过1ml注射器加压1分钟，以用混合物填充微通道。然后，用5μl DNA大小标记混合物+1μl分子大小梯带(ladder)或样品加载梯带加样孔和样品加样孔。通过涡流混合之后，立即将芯片插入到生物分析系统中并根据生产商的指导进行处理。PCR产物的量由二聚体和野生型(wild)DNA片段的两个峰的相对面积比来确定。
(5)结果
研究了电解的溶液对于大肠杆菌细胞裂解的效果。作为对照组，使用煮沸的样品和未经处理的样品。煮沸处理在95℃下进行5分钟，未经处理的样品悬浮在PBS(pH7)中。细胞悬浮液用上面制得的三种类型电解的溶液处理。收集所处理的细胞并在LB琼脂平板上培养过夜。接着，观察到细胞裂解的发生。
图2图示了在37℃下培养细胞16小时后的琼脂平板。参考图2，尽管分别在培养皿(a)、(b)、(c)和(d)中的EAS、EBS、ETS和煮沸的样品没有生长，但是在培养皿(e)中的未经处理的样品(对照)却生长了。在电解的溶液和煮沸的细胞中没有观察到菌落，表明大肠杆菌由于所有电解的溶液和煮沸而失去活性。然而，不确定是否所有细胞都被分裂，其通过下面的实时PCR来鉴定。
为了鉴定细胞是否被分裂，进行实时PCR。如果细胞膜被裂解，那么源于细胞的基因可以被实时PCR分析。为了保证实时PCR的准确性和再现，分析偏差由在LightCycler development内的三次重复来确定。实时PCR曲线用于量化源于分裂的细胞的基因。图3为当其中用电解的溶液处理细胞所得到的溶液用作模板进行实时PCR时，所得到的实时PCR曲线。通过测量扩增的DNA的量，这些曲线图示了标绘在纵轴的初始模板拷贝数和标绘在横轴的交点中的循环数。如图3所示，DNA的量相对于循环数具有对数(log)形式。阈循环数Ct为对数线相交于横向阈线的点。所有样品中目标的量在交叉点的Ct是相等的。即，如果其中目标量达到某水平的循环数小，那么表明初始DNA的量大，并且如果循环数大，那么表明初始DNA的量小。对数期(log phase)的扩增过程由下面的方程式表示：
Ct＝-(1/logE)logT0+(logK/logE)。
在该方程式中，T0为目标的初始量，K为交叉点，E为扩增的效率。Ct为测量值，T0为由实验者确定的标准初始浓度。发明人用Ct值推测源于分裂的细胞的核酸浓度。比较五种细胞裂解方法的结果，观察到显著性差异。基于Ct曲线，核酸的量按照下面的顺序增加：EBS处理的细胞＞煮沸的细胞＞ETS处理的细胞＞对照＞EAS处理的细胞(见表1)。
表1在PBS中未稀释的样品和1/10稀释的悬浮液的Ct值
  处理   未稀释的悬浮液   1/10稀释的悬浮液
  EAS   -   -
  EBS   20.21±0.10   26.19±0.05
  ETS   25.18±0.16   -
  煮沸   22.79±0.25   26.78±0.48
  对照   25.68±0.27   -
在表1中，“-”表示没有Ct值并且对照表示未经处理的样品。
如表1所示，用EBS处理的未稀释样品的核酸初始浓度比煮沸的样品高。这些数据表明在所试验的方法中，EBS处理是最有效的细胞裂解方法。
而且，实验室芯片证明了扩增的PCR产物的特异性。另外，EBS处理的样品的PCR产物浓度高于其它样品，这也表明EBS处理比常用的煮沸处理更有效。
图4图示了在电泳后利用Agilent 2100 Bioanalyzer，分析通过进行实时PCR得到的PCR产物的结果，该PCR中用电解的溶液处理细胞得到的溶液用作模板。在图4中，煮沸处理在95℃进行5分钟。参考图4，从EAS处理的细胞的PCR产物均为二聚体，表明PCR没有很好地进行。尽管在所有EAS处理的样品中都没有观察到PCR产物，但是在作为对照样品的未稀释的样品和1/10稀释的样品中观察到PCR产物。假定因为EAS包括PCR抑制剂，所以在EAS处理的样品中没有观察到PCR产物。因而，用含有EAS的ETS处理的样品的PCR产物的浓度低于EBS处理的样品(见图5)。图5为将图4的结果图解为PCR产物的浓度图。
从上述结果中可以确定，对于生物分析如PCR，用阴极室中产生的EBS处理对裂解细胞是最有效率的，并且能够有效地完成生物分析如PCR。
实施例2：在电解室中直接细胞裂解
在本实施例中，细胞被注入到电解室中，并在原位产生电解的溶液，随后确定细胞裂解效率。
(1)电解装置
使用图1A、1B和1C所示的电解装置。图1A的电解装置如实施例1所述。为了生产用于细胞裂解的氢氧离子，在室温下用5V的DC电压电解包含大肠杆菌的12ml的10mM或100mM NaCl溶液1或3分钟。
图1B的电解装置与图1A的电解装置相同，除了没有包括分隔阳极室和阴极室的隔板。电极间距为2cm。图1C的电解装置与图1B的电解装置相同，除了它被放置于载物玻片(Corning，USA)上，以便可能通过固定于显微镜的数字照相机观察。电极安装在壁的边缘，电极间距为4cm。利用这些装置，通过施加5V的DC电压电解包含100mM NaCl的500μl CHO细胞悬浮液30秒。
(2)分析方法
如实施例1中所述，通过实时PCR和扩增产物的分析，观察在电解后马上收集到的细胞裂解液。显微分析利用装有数字照相机(Photometrics Inc.，USA)的Nikon Eclipse TE 300荧光显微镜(Nikon，Japan)摄取图像。
(3)结果
图6图示了利用通过在所使用的盐浓度、电流和时间条件下电解得到的细胞裂解液作为模板，进行的实时PCR扩增的结果。在图6中，[1]～[4]为利用具有NafionTM膜的电解装置得到的结果，[5]～[8]为利用没有膜的电解装置得到的结果。[1]为100mM NaCl溶液电解1分钟，[2]为100mM NaCl溶液电解3分钟，[3]为10mM NaCl溶液电解1分钟，[4]为10mM NaCl溶液电解3分钟，[5]为100mM NaCl溶液电解1分钟，[6]为100mM NaCl溶液电解3分钟，[7]为10mM NaCl溶液电解1分钟，[8]为10mM NaCl溶液电解3分钟，[9]为对照。
表2表示源于利用通过在所使用的盐浓度、电流和时间条件下电解得到的细胞裂解液作为模板，得到的实时PCR扩增曲线的Ct值。
表2  在各种条件下的Ct值
No.   膜   盐浓度(mM)   时间     Ct
  [1]   ○   100   1   16.43±0.11
  [2]   ○   100   3   16.62±0.12
  [3]   ○   10   1   16.70±0.01
  [4]   ○   10   3   15.30±0.01
  [5]   ×   100   1   19.74±0.01
  [6]   ×   100   3   18.11±0.02
  [7]   ×   10   1   21.45±0.47
  [8]   ×   10   3   21.29±0.40
  [9]   对照   22.86±0.48
如表2所示，[4](含有膜，10mM NaCl，施加电流3分钟)表示最强的信号和最低的Ct值，表明细胞在[4]的条件下被最有效地裂解。该结果表明，在中心具有膜的装置内，EBS中的细胞裂解比EBS和EAS的混合物中的细胞裂解更有效。因为NafionTM膜防止从阳极和阴极电解的溶液混合，EAS和EBS在电解装置中是分隔的。
图7图示了通过电泳分析最终PCR产物的结果，该PCR产物是利用通过在各种条件下电解得到的细胞裂解液作为模板，进行PCR得到的。如图7所示，仅得到扩增产物，而没有得到引物二聚体。图8为在电泳后利用Agilent2100 Bioanalyzer，分析PCR产物图，该PCR产物是利用图6中通过电解得到的细胞裂解液作为模板，进行实时PCR得到的。
图9图示了利用固定于显微镜上的数字照相机，通过施加5V的DC电压和1mA的电流，连续观察载物玻片的加样孔上的CHO细胞的结果。如图9所示，细胞在非常短的时间内变形并最后分裂。图9的结果证明，用电化学方法产生的氢氧离子快速地裂解细胞。细胞裂解发生在产生氢氧离子的阴极附近。
实施例3：通过电解得到的细胞裂解液的中和
在本实施例中，使用了如图1A所示具有阳极室、阴极室和安装在阳极室和阴极室之间的隔板的电解装置，并在阳极室和阴极室中电解各种溶液，然后观察所得到的溶液的pH变化。
图10图示了当向阳极室和阴极室分别加入10ml的100mM NaCl水溶液(初始pH＝6.0)，并施加5V的DC电压时，观察pH随时间变化的结果。在60秒后，阳极室溶液和阴极室溶液的1∶1混合物的pH为9.49。因而，可以看出，当阳极室溶液和阴极室溶液按照1∶1的比例混合时，该混合物没有中和到初始pH，而是变为碱性。
图11图示了当向阳极室和阴极室分别加入200ml的100mM MgSO4水溶液(初始pH＝5.75)和200ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.75)，并施加10V的DC电压时，观察pH随时间变化的结果。在300秒后，阳极室溶液和阴极室溶液的1∶1混合物pH为5.75，其与初始pH相同。
图12图示了当向阳极室和阴极室分别加入200ml的100mM Na2SO4水溶液(初始pH＝5.82)和200ml的100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.82)，并施加10V的DC电压时，观察pH随时间变化的结果。在300秒后，阳极室溶液和阴极室溶液的1∶1混合物pH为5.82，其与初始pH相同。
图10的结果可以由如下所述的反应原理解释，但是本发明不束缚于具体的原理。
如下面的反应图解所示，在电解含有NaCl的溶液过程中，阳极室中的水被还原产生氯，阴极室中的水被还原产生氢气和氢氧离子。
阳极反应：
2Na+(aq)+2Cl-(aq)+2H2O(l)→Cl2(g)+2Na+(aq)(1)
2Cl-→Cl2+2e-
Cl2(aq)+H2O→HOCl(aq)+H++Cl-
HOCl(aq)→H++OCl-
阴极反应：
2Na+(aq)+2Cl-(aq)+2H2O(l)→H2(g)+2Na+(aq)+2OH-(aq)(2)
2H2O+2e-→H2+2OH-(aq)
阳极室中产生的氯适当地溶解在水中，并与水发生反应产生HOCl和HCl。阳极室中产生的HOCl消毒，而阴极室中产生的氢氧离子象碱性细胞裂解中的氢氧化钠一样有效地使细胞分裂。即，HOCl没有使细菌分裂而是杀死它们，而氢氧化物使细胞分裂。
另外，如上面的反应图解所示，阳极室中产生的H+离子由于溶解在水中的Cl2气而产生，而氢氧化物由于水的还原而产生。因此，产生了比H+离子多的氢氧离子。因而，当通过电解得到的阳极室溶液和阴极室溶液按照1∶1的比例混合时，该混合物变得比初始溶液具有更强的碱性。
同时，如图11和图12所示，当阳极室包含标准氧化电位比水低的离子如MgSO4或Na2SO4时，则在其中产生氧气和2H+离子。并且，当包含标准还原电位比水低的离子如Na+离子的溶液用于阴极室时，则水被电解产生氢气和2OH-离子。因而，阳极室和阴极室中产生相同当量的2H+离子和2OH-离子，通过按照1∶1的比例混合各室的电解的溶液，可以得到中性溶液。
因为许多生物分析过程在中性pH下具有高效率，所以具体优选包含标准氧化电位比水低的离子的溶液用于阳极室，包含标准还原电位比水低的离子的溶液用于阴极室。在此情况下，从上述实施例中显而易见，能够减少可能潜在地抑制生物过程如PCR的物质如HOCl或Cl-的产生。而且，虽然为了通过分别控制阴极室溶液和阳极室溶液的流速得到中性溶液，在电解装置中常需要两个泵，但是在本发明中可以仅使用一个流速控制泵，因为仅仅通过混合阴极室中电解的溶液和阳极室中电解的溶液，就可以获得中性溶液(见图1F)。
实施例4：包括在阳极室中的电解质对于细胞裂解和/或PCR的影响
在本实施例中，在图1A所示的电解装置中，将在100mM NaCl溶液中含有108细胞/ml的大肠杆菌细胞的溶液放入到阴极室中，并将各10ml 100mM NaCl溶液和100mM Na2SO4溶液放入到阳极室中，然后通过施加5V的DC电压进行电解3分钟。在电解后，从阳极室和阴极室中取出等量的样品并混合。利用该混合物作为模板进行PCR。根据实施例1的(3)中所述的方法进行PCR，并且使用Hot-start Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics)作为聚合酶。
图13图示了在阳极室中利用各种电解质引起电解，及混合阳极电解的溶液和阴极电解的溶液之后，进行实时PCR的结果。如图13所示，当阳极室包含Na2SO4溶液时，与当阳极室包含NaCl时相比，核酸的初始浓度和最终扩增的核酸的浓度更高。结果表明，当阳极室包含标准氧化电位比水低的物质时，在随后的生物分析和电解的溶液的中和过程中，它更有利。
根据本发明的微流体器件，可以通过施加电流，同时将细胞迁移到微通道中进行电解，从而容易裂解细胞，而不利用单独的细胞裂解溶液。因而，当使用微流体器件时，因为不需要引入细胞溶液的装置，所以它结构简单并且在装置小型化中是有利的。而且，微流体器件可以用于容易地裂解细胞。
根据裂解细胞或病毒的方法，本发明的细胞或病毒可以被容易并有效地裂解，并且可以制得具有适于随后的生物分析的pH和电解质的细胞裂解液。
尽管己经参考其示例性的实施方案具体地说明和描述了本发明，但是本领域的普通技术人员应该理解可以进行不背离如权利要求所界定的本发明的实质和范围的各种形式和细节上的变化。
序列表
<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.Ltd.)
<120>包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件及
利用它电化学裂解细胞的方法
<130>PN057612
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>1
agtgtggatt cggcactcct                                 20
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>2
gagttcttct tctaggggac ctg                             23

Claims (26)

1.一种包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，并且阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极。
2.根据权利要求1的微流体器件，其中所述阳极室的出口和阴极室的出口接在一个通道上。
3.根据权利要求2的微流体器件，其中所述阳极室溶液包含标准氧化电位比水低的化合物。
4.根据权利要求3的微流体器件，其中所述化合物包括至少一种选自NO3 -、F-、SO4 2-、PO4 3-和CO3 2-的离子。
5.根据权利要求1的微流体器件，其中所述阳极室的出口和阴极室的出口是分隔的。
6.根据权利要求5的微流体器件，其中所述阳极室溶液包含标准氧化还原电位比水低或高的化合物。
7.根据权利要求6的微流体器件，其中所述阳极室溶液包括至少一种选自Cl-、NO3 -、F-、SO4 2-、PO4 3-和CO3 2-的离子。
8.根据权利要求1的微流体器件，其中所述阴极室溶液包含细胞或病毒。
9.根据权利要求1的微流体器件，其中所述阴极室溶液包含标准还原电位比水低的化合物。
10.根据权利要求8的微流体器件，其中所述溶液包括至少一种选自Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+的离子。
11.根据权利要求1的微流体器件，其中所述隔板允许电流穿过并隔离由于电解在各室中产生的离子和气体。
12.根据权利要求1的微流体器件，其中所述电极选自Pt、Au、Cu和Pd。
13.根据权利要求1的微流体器件，还包括向所述阳极室引入和从阳极室排出溶液的泵，及向阴极室引入和从阴极室排出溶液的泵。
14.根据权利要求1的微流体器件，还包括向所述阳极室和阴极室引入及从阳极室和阴极室排出溶液的泵。
15.根据权利要求1的微流体器件，包括包含所述电解装置的细胞裂解室、核酸分离室、核酸扩增室和检测室。
16.一种利用包括用于细胞裂解的电解装置的微流体器件裂解细胞或病毒的方法，该电解装置包括阳极室、阴极室和隔板，其中该隔板安装在阳极室和阴极室之间，阳极室包括阳极室溶液的入口和出口及电极，阴极室包括阴极室溶液的入口和出口及电极，所述方法包括：
经过阳极室的入口，将包含标准氧化电位比水低或高的化合物的阳极室溶液引入到阳极室中；
经过阴极室的入口，将包含细胞或病毒和标准还原电位比水低的化合物的阴极室溶液引入到阴极室中；及
通过向包括在阳极室和阴极室中的电极施加电流，在阳极室和阴极室中引起电解而裂解细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中所述标准氧化电位比水低的化合物包括至少一种选自NO3 -、F-、SO4 2-、PO4 3-和CO3 2-的离子。
18.根据权利要求16的方法，其中所述标准氧化电位比水高的化合物包含Cl-。
19.根据权利要求16的方法，其中所述标准还原电位比水低的化合物包括至少一种选自Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+的离子。
20.根据权利要求16的方法，其中所述隔板允许电流穿过并分隔由于电解在各室中产生的离子。
21.根据权利要求16的方法，其中所述电极选自Pt、Au、Cu和Pd。
22.根据权利要求16的方法，还包括，在所述电解之后，
经过出口从阳极室中排出酸性溶液；
经过出口从阴极室中排出碱性细胞或病毒裂解液；及
通过混合酸性溶液和碱性细胞或病毒裂解液中和细胞或病毒裂解液。
23.根据权利要求22的方法，其中从所述阳极室排出的酸性溶液和从阴极室排出的碱性细胞或病毒裂解液按照1∶1体积比混合。
24.根据权利要求16的方法，其中所述微流体器件还包括向阳极室引入和从阳极室排出溶液的泵，及向阴极室引入和从阴极室排出溶液的泵。
25.根据权利要求16的方法，其中所述微流体器件还包括向阳极室和阴极室引入及从阳极室和阴极室排出溶液的泵。
26.根据权利要求16的方法，其中所述微流体器件包括含有电解装置的细胞裂解室、核酸分离室、核酸扩增室和检测室。
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