KR100624471B1 - 세포 분해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동장치 및그를 이용하여 전기화학적으로 용해하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 분할 막을 포함하는 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동 장치로서, 상기 분할 막은 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버 사이에 설치되어 있고, 상기 애노드 챔버에는 상기 애노드 챔버 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버에는 상기 캐소드 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치 및 그를 이용하여 세포를 전기화학적으로 용해하는 방법을 제공한다.

전기분해, 세포 용해, 미세유동장치

Description

세포 분해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동장치 및 그를 이용하여 전기화학적으로 용해하는 방법{Microfluidic device comrprising electrolysis device for cell lysis and method for electrochemically lysing cells using the same}

도 1a는 캐소드 챔버, 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버와 애노드 챔버 사이에 설치되어 있는 분할 막을 갖는 전기분해 장치의 일 예를 나타내는 도면이다.

도 1b는 본 발명의 실시예1에서 대조군 전기분해장치로서 사용된 캐소드 챔버 및 애노드 챔버로 구성되어 있는 전기분해 장치를 나타내는 도면이다.

도 1c는 본 발명의 실시예1에서 대조군 전기분해장치로서 사용된 캐소드 챔버 및 애노드 챔버로 구성되어 있는 전기분해 장치로서 현미경 관찰이 가능하도록 슬라이드 글라스 상에 구현되어 있는 전기분해장치를 나타내는 도면이다.

도 1d는 전기분해장치가 포함되어 있는 본 발명의 미세유동장치의 일 예를 나타내는 도면이다.

도 1e 및 1f는 전기분해장치가 포함되어 있는 본 발명의 미세유동장치의 각각 또다른 일 예를 나타내는 것으로 2개의 펌프와 1개의 펌프가 설치되어 있는 미세유동장치를 나타내는 도면이다.

도 2는 전기분해로 얻어진 용액으로 처리된 세포를 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후 아가 플레이트를 나타내는 도면이다.

도 3은 전기분해로 얻어진 용액 세포를 처리하고 그로부터 얻어지는 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 얻어지는 실시간 PCR 곡선을 나타내는 도면이다.

도 4는 전기분해로 얻어진 용액 세포를 처리하고 그로부터 얻어지는 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 얻어지는 PCR 산물을 전기영동하고 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 도 4의 결과를 그래프로 나타낸 것으로 PCR 산물의 농도로 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6은 사용된 염농도, 전류 및 시간 조건 하에서 세포용액을 직접 전기 분해를 통하여 전기분해시켜서 용해된 세포 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR 증폭 결과를 나나태는 도면이다.

도 7은 다양한 조건하에서 세포용액을 직접 전기 분해를 통하여 전기분해시켜서 용해된 세포 용해액을 주형으로 하여 PCR하여 얻어진 최종 PCR 산물을 전기영동하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8은 도 6에서 전기분해로 얻어진 세포 용액을 처리하고, 그로부터 얻어지는 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 얻어지는 PCR 산물을 전기영동하고 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 9는 CHO 세포를 슬라이드 글라스 상의 웰에 올려놓고, DC 5 V 및 1mA 전류를 인가하고 시간에 따라 연속적으로 현미경에 부착된 디지털 카메라로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 10은 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 각각 10ml의 100 mM NaCl 수용액 (초기 pH =6.0)을 첨가하고, 5 V의 직류 전압을 가하고 시간에 따른 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 11은 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 각각 200ml의 100 mM MgSO₄ 수용액 (초기 pH =5.75)과 200ml의 100 mM NaCl 수용액 (초기 pH =5.75)을 첨가하고, 10 V의 직류 전압을 가하고 시간에 따른 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 12는 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 각각 200ml의 100 mM Na₂SO₄ 수용액 (초기 pH =5.82)과 200ml의 100 mM NaCl 수용액 (초기 pH =5.82)을 첨가하고, 10 V의 직류 전압을 가하고 시간에 따른 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 13은 애노드 챔버의 전해액을 달리하여 전기분해한 후 애노드 전기분해 용액과 캐소드 전기 분해용액을 혼합하여 실시간 PCR 한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 세포분해용 전기분해장치를 포함하는 미세유동장치 및 그를 이용한 세포 용해 방법에 관한 것이다.

미세유동장치는 입구, 출구 및 반응 용기 등이 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 장치를 말한다. 이러한 장치는 당업계에 널리 알려져 있으며, 랩온어칩 (Lab-on-a-chip : LOC)과 같은 미세분석 장치에 널리 이용되고 있다. 이러한 미세유동장치에는 상기 마이크로채널이 형성되어 있는 외에 일반적으로 유체의 이송과 혼합을 위한 마이크로펌프, 마이크로믹서 및 이송되는 유체를 여과하기 위한 마이크로필터 등이 구비되어 있다. LOC와 같은 생물분석 장치로서 사용되는 미세유동장치는 일반적으로 세포 또는 바이러스를 용해하는 과정에 필요한 장비를 구비하거나, 외부에서 용해된 세포 용액 또는 이미 정제된 물질을 이용하여야 한다. 종래 세포 용해 방법으로써, 알칼리 법 등이 사용되었다. 그러나, 이들 방법에 의하는 경우, NaOH와 같은 화학물질을 첨가하여야 하고, 세포와 혼합하여 세포를 용해한 후, 첨가된 화학물질을 제거하는 과정에 필요한 설비가 구비되어 있어야 한다. 예를 들면, 상기 과정을 수행하기 위한 밸브, 펌프 및 필터 등을 구비하고 있어야 한다.

따라서, 상기한 종래의 미세유동장치에 의하더라도 세포 용해용 전기분해 장치가 구비되어 있는 미세유동장치는 알려진 바 없다.

또한, 세포 용해 방법으로서 다양한 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 끓임 법 (boiling method), 알칼리 법 및 효소를 이용하는 방법 등이 알려져 있다. 알칼리 법은 세포 또는 바이러스에 NaOH와 같은 물질을 첨가하여 높은 pH에 노출시켜 세포를 용해하는 방법이다. 그러나, 알칼리법과 같은 종래의 세포 또는 바이러스 용해 방법을 LOC와 같은 미세유동장치에 이용하는 데에는 많은 단점이 있었다. 예를 들면, NaOH와 같은 알칼리 용액을 첨가하거나 알칼리 용액을 이용하여 세포를 용해하고 얻어지는 알칼리성인 세포 용해액에 중화 용액을 첨가하여 중화하는 경우 에는 세포를 용해시키기 위한 알칼리 용액의 주입 단계 및 이를 위한 장치가 필요하며, 알칼리 용액 및 중화용액 첨가에 의한 샘플용액이 희석되는 문제점이 발생한다. 이러한 용액의 주입 단계 및 장치 문제는 미세 부피를 다루는 미세유동장치에 있어서는 심각한 문제가 될 수 있으며, 희석은 원하는 샘플을 채취하거나 증폭시킬 때 문제가 될 수 있다. 또한, NaOH와 같은 알칼리 용액은 추후 PCR과 같은 생물학적 분석 방법에 사용하기 위하여 제거되거나 중화되어야 한다.

따라서, 상기한 종래의 세포 용해 방법에 의하더라도 전기분해에 의하여 인시튜 (in situ)로 히드록사이드와 같은 세포를 용해시키는 물질을 생성하여 세포를 용해하면서, 추후의 생물학적 분석에 적합한 pH와 조건을 갖는 세포 용해액을 제공할 수 있는 세포 용해방법은 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 애노드 챔버에 물보다 표준산화전위가 낮은 이온 또는 높은 이온을 포함하는 전해용액을 포함하고, 캐소드 챔버에 물보다 표준환원전위가 낮은 이온을 포함하는 전해용액과 세포를 포함시키고, 전기분해를 실시함으로써 추후의 생물학적 분석에 적합한 pH와 조건을 갖는 세포 용해액을 제조할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 분해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 전기분해를 이용하여 세포를 용해하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 분할 막을 포함하는 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동 장치로서, 상기 분할 막은 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버 사이에 설치되어 있고, 상기 애노드 챔버에는 상기 애노드 챔버 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버에는 상기 캐소드 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치를 제공한다.

본 발명의 미세유동장치는 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 분할 막을 포함하는 세포 용해용 전기분해 장치를 포함한다. 상기 세포 용해용 전기분해 장치에 있어서, 분할 막은 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버 사이에 설치되어 있고, 상기 애노드 챔버에는 상기 애노드 챔버 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버에는 상기 캐소드 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있다. 상기 유입구와 유출구는 반드시 별개로 구비될 필요는 없고 하나의 포트가 유입구 및 유출구의 역할을 할 수도 있다.

본 발명의 미세유동장치에 포함되어 있는 세포 용해용 전기분해 장치는 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액이 상기 캐소드 챔버에 제공되고, 상기 애노드 챔버에 적절한 전해용액이 포함되어 있는 경우, 상기 각 챔버에 구비되어 있는 전극을 통하여 전류를 인가함으로써 세포를 용해하는데 사용될 수 있다. 세포의 용해는 전류를 인가함으로써, 상기 캐소드 챔버에서 발생되는 히드록사이드 이온에 의하여 이루어지는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.

상기 세포 용해용 전기분해 장치는 미세유동장치의 일부분을 구성한다. 예를 들면, 상기 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 각 유입구 및 유출구는 미세유동장치의 마이크로채널을 구성하고, 상기 애노드 챔버 및 캐소드 챔버는 마이크로채널의 형태의 반응기를 구성하는 것이다. 본 발명의 미세유동장치에 있어서, 상기 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 각 유입구는 별개의 마이크로채널로 이루어지는 것이다. 또한, 상기 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 각 유출구는 별개의 마이크로채널 또는 서로 합류되어 있는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 각 유출구는 서로 합류되어 하나의 마이크로채널에서 상기 각 애노드 챔버와 캐소드의 챔버의 용액이 혼합되어 중화되도록 하는 것이다. 이와 같은 하나의 합류되는 채널을 형성함으로써 별도의 중화 용액을 도입할 필요없이 상기 캐소드 챔버의 세포 용해액을 중화할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 미세유동장치는 상기 애노드 챔버 용액은 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 화합물의 예는 NO₃ ^-, F^-, SO₄ ^{2 -},PO₄ ^{3 -}, 및 CO₃ ^{2 -} 등의 음이온이 포함되어진 하나 이상의 이온일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 애노드 챔버 용액이 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물인 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유동장치를 이용하여 전기분해를 수행하는 경우, 상기 애노드 챔버에서는 물이 전기분해되어 산소 기체와 H⁺이온이 발생한다.

다만, 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버의 용액이 혼합되어 중화하는 단계를 사용하지 아니하고, 세포 용해만을 필요로 할 경우에는 애노드 챔버 용액은 물보다 표준산화환원전위가 낮은 화합물 또는 높은 화합물 즉 전기분해되는 전해질이 포함될 수 있다. 상기 화합물의 예는 Cl^-, NO₃ ^-, F^-, SO₄ ^{2 -}, PO₄ ^{3 -} 및 CO₃ ^{2 -} 등의 음이온이 포함되어진 하나 이상의 이온일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 또다른 일 구체예에서, 본 발명의 미세유동장치는 상기 캐소드 챔버 용액이 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화합물의 예는 Na⁺, K⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, 및 Al^{3 +} 등의 양이온이 포함되어진 하나 이상의 이온일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 상기 일 구체예에 따른 미세유동장치를 이용하여 전기분해를 수행하는 경우, 상기 캐소드 챔버에서는 물이 전기분해되어 수소 기체와 OH^- 이온이 발생한다.

본 발명에 있어서, 상기 분할 막은 전류를 통과시키나 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 포함되어 있는 전해액의 전기분해로부터 발생하는 이온 및/또는 기체는 통과시키지 않는 특성을 갖는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 분할막은 전기는 통과시키나 수소 이온 및 히드록사이드 이온 및/또는 기체는 통과시키지 못하는 특성을 갖는 것이다. 이러한 분할 막의 예에는 Nafion^TM (Dupont 사), Dowex^TM (Aldrich), 및 Diaion^TM (Aldrich) 등 이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

세포 용해용 전기 분해장치의 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 구비되는 전극은 백금, 금, 구리 및 팔라듐 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 애노드 챔버에 백금으로 된 전극을 사용하는 경우, 단백질 및 DNA의 흡착을 방지할 수 있으며, 구리 전극을 사용하는 경우 애노드 챔버에 NaCl 등의 염소 이온이 포함된 경우에 CuCl₂를 형성함으로써 독가스인 염소 기체의 발생을 줄일 수 있다. 또한, 팔라듐 전극을 사용하는 경우, 캐소드 챔버에서 발생한 수소 기체를 흡수하므로 가스 제거 과정이 불필요하다.

본 발명의 미세유동장치는, 상기 애노드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것일 수 있다. 또는, 본 발명의 미세유동장치는, 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것일 수 있다. 이 경우 하나의 펌프로서 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버의 용액을 유입시켜 혼합하게 된다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 미세유동장치는 상기한 바와 같은 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 세포 용해 구획 (cell lysis compartment), 핵산 분리 구획, 핵산 증폭 구획, 및 검출 구획을 포함하는 미세유동장치일 수 있다. 이 경우 본 발명의 미세유동장치는 소위 랩온어칩 (LOC)의 기능을 수행할 수 있다. 상기 미세유동장치에 사용될 수 있는 핵산 분리, 핵산 증폭 및 검출 구획에 사용되는 요소는 당업계에 알려진 임의의 수단이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 분할 막을 포함하는 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동 장치로서, 상기 분할 막은 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버 사이에 설치되어 있고, 상기 애노드 챔버에는 상기 애노드 챔버 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버에는 상기 캐소드 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치를 이용하여 전기분해를 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해하는 방법으로서,

(a) 상기 애노드 챔버의 유입구를 통하여 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물 또는 높은 화합물이 포함되어 있는 애노드 챔버 용액을 상기 애노드 챔버로 유입시키는 단계; (b) 상기 캐소드 챔버의 유입구를 통하여 세포 또는 바이러스를 포함하고 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 캐소드 챔버 용액을 상기 캐소드 챔버로 유입시키는 단계; 및 (c) 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 구비되어 있는 상기 전극을 통하여 전류를 인가하여 상기 애노드 챔버와 상기 캐소드 챔버에서 전기분해를 일으켜 세포를 용해하는 단계를 포함하는, 전기분해를 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 또는 바이러스 용해 방법은 (a) 상기 애노드 챔버의 유입구를 통하여 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물 또는 높은 화합물이 포함되어 있는 애노드 챔버 용액을 상기 애노드 챔버로 유입시키는 단계; (b) 상기 캐소드 챔버의 유입구를 통하여 세포 또는 바이러스를 포함하고 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 캐소드 챔버 용액을 상기 캐소드 챔버로 유입시키는 단계를 포 함한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물은 NO₃ ^-, F^-, SO₄ ^{2 -},PO₄ ^{3 -} 및 CO₃ ^{2 -} 등의 음이온이 포함되어진 하나 이상의 이온일 수 있고, 상기 물보다 표준산화전위가 높은 화합물에는 Cl^- 이온이 포함되어진 전해질일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물은 Na⁺, K⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +} 및 Al^{3 +} 등의 양이온이 포함되어진 하나 이상의 이온일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 (a) 및 (b) 단계는 동시 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

바이오 샘플용액에 가장 많이 들어 있는 NaCl이 포함된 샘플용액을 애노드와 캐소드에 유입 후 전기분해를 하면 애노드 챔버에서 물이 아닌 염소 이온이 전기분해 되어 염소가스가 발생하여 캐소드 챔버에 발생한 히드록사이드 이온보다 적은 양의 수소 이온이 발생하며 이 양은 염소가스와 물이 반응하여 발생한 것으로 염소가스의 용해조건에 따라 달라지게 되어 pH 조절이 어렵다. 본 발명의 바람직한 일 구체예는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에서 각 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물 및 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물을 사용한다.

본 발명의 세포 또는 바이러스 용해 방법은 또한, (c) 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 구비되어 있는 상기 전극을 통하여 전류를 인가하여 상기 애노 드 챔버와 상기 캐소드 챔버에서 전기분해를 일으켜 세포를 용해하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 캐소드 챔버에서는 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 캐소드 챔버 용액이 포함되어 있기 때문에 물이 전기분해되어 수소 기체와 OH^-이온이 발생한다. 따라서, 상기 캐소드 챔버에 포함되어 있는 세포 또는 바이러스는 히드록사이드 이온에 의하여 용해될 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 애노드 챔버에서는 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 애노드 챔버 용액이 포함되어 있기 때문에 물이 전기분해되어 산소 기체와 수소 이온이 발생한다. 결과적으로 상기 캐소드 챔버 용액은 염기성 pH 쪽으로 변화하고, 상기 애노드 챔버 용액은 산성 pH 쪽으로 변화한다.

일반적으로 세포 용해액은 예를 들면, PCR, 핵산 분리과정 또는 단백질 분리 과정 등과 같은 다양한 추가의 생물학적 분석 과정을 거친다. 이러한 생물학적 분석 과정은 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 분자가 일반적으로 중성에서 안정하기 때문에 대부분 중성에서 이루어진다. 특히, 미세유동장치 내에서 세포의 용해, 핵산의 분리, 핵산의 증폭, 단백질의 분리 및 검출 과정 등이 연속적인 계열로 수행될 수 있다. 이 경우 비교적 초기 단계에서 이루어지는 세포 용해 단계는 추후의 단계에서 일어나는 반응에 영향을 줄 수 있는 물질이 포함되어 있지 않아야 한다. 예를 들면, 세포 용해 단계 후 PCR에 의하여 핵산을 증폭하는 경우, PCR을 저해할 수 있는 물질이 포함되어 있지 않아야 한다.

따라서, 본 발명의 방법의 일 구체예는 전기분해 단계 후에 상기 애노드 챔 버로부터 유래하는 산성 용액을 상기 유출구를 통하여 상기 애노드 챔버로부터 유출시키고, 상기 캐소드 챔버로부터 유래하는 염기성의 세포 또는 바이러스의 용해액을 상기 유출구를 통하여 상기 캐소드 챔버로부터 유출시키고 서로 혼합하여 상기 세포 또는 바이러스 용해액을 중화하는 단계를 더 포함하는 것이다.

또한, 본 발명의 방법의 일 구체예는 상기 상기 애노드 챔버로부터 유래하는 산성 용액과 상기 캐소드 챔버로부터 유래하는 염기성의 세포 또는 바이러스의 용해액은 1:1의 부피 비율로 혼합하여 중화하는 것이다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 캐소드 챔버 용액과 애노드 용액에는 각각 히드록사이드 이온과 수소 이온이 동일한 당량비로 발생하기 때문에 전기 분해 후에 상기 상기 캐소드 챔버 용액과 상기 애노드 챔버 용액을 1:1로 혼합하여도 중성 또는 그에 근접한 pH를 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 상기 미세유동장치는, 상기 애노드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 미세유동장치는 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것일 수 있다. 이 경우 하나의 펌프로서 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버의 용액을 유입시켜 혼합하게 된다.

또한, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 미세유동장치의 세포 용해용 전기분해 장치에 포함되는 상기 분할 막은 전류를 통과시키나 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 포함되어 있는 전해액의 전기분해로부터 발생하는 이온 및/또는 기 체는 통과시키지 않는 특성을 갖는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 분할막은 전기는 통과시키나 수소 이온 및 히드록사이드 이온 및/또는 기체는 통과시키지 못하는 특성을 갖는 것이다. 이러한 분할 막의 예에는 Nafion^TM (Dupont 사), Dowex^TM (Aldrich), 및 Diaion^TM (Aldrich)이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

세포 용해용 전기 분해장치의 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 구비되는 전극은 백금, 금, 구리 및 팔라듐 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 애노드 챔버에 백금으로 된 전극을 사용하는 경우, 단백질 및 DNA의 흡착을 방지할 수 있으며, 구리 전극을 사용하는 경우 애노드 챔버에 NaCl 등의 염소 이온이 포함된 경우에 CuCl₂를 형성함으로써 독가스인 염소 기체의 발생을 줄일 수 있다. 또한, 팔라듐 전극을 사용하는 경우, 캐소드 챔버에서 발생한 수소 기체를 흡수하므로 가스 제거 과정이 불필요하다.

본 발명의 방법에 사용되는 미세유동장치는 상기한 바와 같은 본 발명의 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 세포 용해 구획 (cell lysis compartment), 핵산 분리 구획, 핵산 증폭 구획, 및 검출 구획을 포함하는 포함하는 미세유동장치일 수 있다. 이 경우 본 발명의 미세유동장치는 소위 랩온어칩 (LOC)의 기능을 수행할 수 있다. 상기 미세유동장치에 사용될 수 있는 핵산 분리, 핵산 증폭 및 검출 구획에 사용되는 요소는 당업계에 알려진 임의의 수단이 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 미세유동장치에 사용되는 전기분해 장치의 일 예를 나타 내는 도면이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 캐소드 챔버 (10)와 애노드 챔버 (30)는 분할 막 (20)에 의하여 분리되어 있고, 각 챔버에는 전극 (40, 50)이 설치되어 있어 전극을 통하여 전압을 인가함으로써 각 챔버에서 전기분해 반응을 일으킬 수 있다. 도 1a에서 챔버 용액의 유입구와 유출구는 통합되어 있는 것으로, 상단의 두껑을 개폐함으로써 형성될 수 있다.

도 1d는 본 발명의 전기 분해장치를 포함하는 미세유동장치의 일 예를 나타내는 도면이다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, 캐소드 챔버 (10)와 애노드 챔버 (30)는 분할 막 (20)에 의하여 분리되어 있고, 각 챔버에는 전극 (40, 50)이 설치되어 있어 전극을 통하여 전압을 인가함으로써 각 챔버에서 전기분해 반응을 일으킬 수 있다. 상기 각 챔버 (10,30)에는 각각 유입구와 유출구가 설치되어 있고, 상기 각 유출구는 합류되어 애노드 및 캐소드의 전기분해 용액이 혼합되어질 수 있도록 되어 있다.

도 1e와 1f는 각각 본 발명의 전기 분해장치를 포함하는 미세유동장치의 또다른 일 예를 나타내는 도면이다. 도 1e와 1f에 나타낸 미세유동장치는 도 1d에 나타낸 미세유동장치에 각각 2개 및 1개의 마이크로펌프가 더 구비되어 있는 것이다. 도 1f에 나타낸 바와 같은 하나의 마이크로펌프가 구비되어 있는 미세유동장치는 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 전기분해 용액이 동일한 양으로 유입되어 혼합되도록 하는 것이기 때문에, 전기분해에 의하여 애노드 챔버에서 생성된 수소 이온의 당량과 캐소드 챔버에서 생성된 히드록사이드 이온의 당량이 서로 유사한 경우에만 가능하다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 캐소드 챔버 및 애노드 챔버의 전기분해액을 통한 세포의 용해

본 실시예에서는 캐소드 챔버, 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버와 애노드 챔버 사이에 설치되어 있는 분할 막을 갖는 전기분해 장치를 이용하여 전기분해를 수행한 후 얻어지는 캐소드 챔버 용액 및 애노드 챔버 용액을 이용하여 각각 세포를 용해시키고, 그 결과를 관찰하였다.

본 실시예에 사용되는 전기 분해 장치는 도 1a에 나타내었다. 도 1a는 캐소드 챔버, 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버와 애노드 챔버 사이에 설치되어 있는 분할 막을 갖는 전기분해 장치를 나타내는 도면이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 캐소드 챔버와 애노드 챔버에 각각 금 및 백금 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버와 애노드 챔버는 Nafion^TM 막 (Dupont, 미국)에 의하여 분리되어 있다.

(1) 전기분해 용액의 제조

전기 분해는 상기 캐소드 챔버와 애노드 챔버에 100 mM NaCl 수용액 300 ml를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 10 V의 직류 전압을 인가함으로써 이루어졌다. 그 결과, 애노드 챔버에서 얻어지는 전기분해된 산성 용액 (EAS) (electrolyzed acid solution), 캐소드 챔버에서 얻어지는 전기분해된 염기성 용액 (EBS) (electrolyzed alkaline solution) 및 상기 EAS 및 EBS를 동일한 부피로 혼합하여 전기분해된 총 용액 (ETS) (electrolyzed total solution)을 얻고, 이들 용액을 사용하여 세포 용해 실험을 수행하였다. 각 용액의 pH는 pH 센서 (AR15, Fisher scientific, 미국)를 사용하여 측정하였다.

(2) 전기분해 용액을 이용한 세포 용해 실험

대장균 (ATCC #45020)을 100ml LB 배지 중에서 37 ℃ 및 250 rpm으로 교반하면서 6 내지 8시간 동안 플라스크에서 배양하였다. 4 ℃에서 세포를 6,000 g에서 10 분 동안 에펜도르프 5810R 원심분리기 (Eppendorf AG, 독일)를 이용하여 회수하였다. 상기 대장균을 PBS 중에 현탁하여 대장균 세포 농도 OD₆₀₀ 값이 0.8이 되도록 하였다. 상기 세포 현탁액을 실온에서 5 분 동안 상기 전기분해 용액 즉, EAS, EBS 및 ETS로 각각 처리하였다. 반응 후 시료를 4 ℃에서 10,000 g에서 10 분 동안 에펜도르프 5810R 원심분리기 (Eppendorf AG, 독일)를 이용하여 스핀다운하였다. 그 결과 얻어지는 시료의 상등액과 하층액을 각각 분석에 이용하였다.

(3) 실시간 PCR을 통한 세포 용해의 확인

세포가 용해되었는지를 확인하기 위하여 시료의 상등액과 하층액를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과로부터 간접적으로 세포 용해 여부를 추정하였다. PCR 표적 서열은 대장균 게놈에 재조합되어 있는 HBV 게놈의 코어 영역의 일부분이다.

PCR은 상기 상등액과 하층액를 주형으로 하고 서열번호 1과 2의 올리고뉴클 레오티드를 프라이머로 하여 LightCycler instrument (Roche Diagnostics, 독일)를 사용하여 20㎕ 부피 중에서 수행되었다. LightCycler PCR 반응을 위하여 아래의 반응 성분의 반응 마스터믹스를 표시된 최종 농도로 제조하였다: 2 ㎕ LightCycler 마스터 (Fast start DNA master SYBR Green I; Roche Diagnostics), 3.2 ㎕ MgCl₂ (5 mM), 1.0 ㎕ 포워드-리버스 프라이머 믹스 (1.0 mM), 4.0 ㎕ UNG (Uracil-N-Glycosylase, 0.2 unit) 및 4.8 ㎕ PCR 급 물. 5 ㎕ 시험될 시료를 상기 마스터믹스에 첨가하였다. LightCycler 마스터를 제조하는 데에 2개의 다른 Taq DNA 폴리머라제 (Roche Hot-start Taq DNA polymerase 및 Solgent Taq DNA polymerase)가 사용되었다.

다음으로, 20 ㎕ 반응 혼합물을 lightCycler 모세관에 분배하였다. 모세관을 폐쇄하고 lightCycler 로터에 위치시켰다. 2개의 다른 효소에 대하여 다음의 두가지 LightCycler 프로토콜이 사용되었다: (1) Hot-start Taq DNA polymerase(Roche Diagnostics)에 대하여, UNG 작용 프로그램 (50℃에서 10 min); 초기 변성 (95 ℃에서 10 min); 증폭 및 정량화 35 회 반복 (95 ℃에서 5 sec; 62 ℃에서 15 sec과 한번의 형광측정); 융해곡선 프로그램 (연속적 형관 측정과 램핑 속도 1℃/sec로 62-95 ℃); 및 최종 40 ℃로의 냉각 단계 및 (2) Taq DNA polymerase (Solgent)에 대하여, UNG 작용 프로그램 (50℃에서 10 min); 초기 변성(95 ℃에서 1 min); 증폭 및 정량화 35 회 반복 (한번의 형광 측정과 함께 95 ℃에서 5 sec; 62 ℃에서 15 sec); 융해곡석 프로그램 (연속적 형광 측정과 함께 램핑 속도 1 ℃/sec로 62-95 ℃); 및 최종 40 ℃로의 냉각 단계.

(4) 증폭 산물의 분석

가시화를 우하여, 1 ㎕의 증폭산물을 Agilent 2100 Bioanalyzer system으로 분석하였다. PCR 산물의 비율 및 다이머(dimer)를 각각 검출하기 위하여 DNA 500 Labchips (Agilent Technologies, USA)을 사용하였다. 간단하게 설명하면, 9 ㎕의 겔-염료 혼합물을 적당한 웰에 피펫한 다음 상기 혼합물을 1 ml 바늘 (syringe)를 통하여 1 분 동안 상기 웰에 압력을 가함으로써 마이크로채널 내로 들어가게 하여 마이크로채널을 채웠다. 다음으로, 래더 웰 및 시료 웰은 5 ㎕의 DNA 크기 마커 혼합물 + 1 ㎕ 분자 크기 래더 또는 시료와 함께 로딩되었다. 보텍싱 (vortexing)에 의하여 혼합한 후, 상기 칩을 즉시 상기 생물분석기에 삽입하고 제조사의 지침서에 따라 처리하였다. PCR 산물의 양은 다이머와 야생형 DNA 단편의 2개의 피크의 상대적 면적 비율에 의하여 결정되었다.

(5) 실험 결과

전기분해된 용액이 대장균 세포의 용해에 미치는 영향을 조사하였다. 대조군으로서, 끓인 시료 (boiled sample) 및 처리되지 않은 시료를 사용하였다. 끓인 시료는 95℃에서 5 분 동안 가열였고, 무처리 시료는 PBS 버퍼 pH7에 세포를 현탁하였다. 상기와 같이 제조된 3가지 타입의 전기분해된 용액으로 세포 현탁액을 각각 처리한 후, 처리된 세포를 회수하고 LB 아가 플레이트 상에서 밤새 배양한 후, 세포가 용해되었는지를 관찰하였다.

도 2는 세포를 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후 아가 플레이트를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 전기분해된 산성 용액 (EAS), 전기분해된 염기성 용액(EBS), 전기분해된 총 용액 (ETS) 및 끓인 시료는 페트리디쉬 (a), (b), (c), 및 (d)에서 성장하지 않았으나, 아무것도 처리하지 않은 대조군 페트리디쉬 (e)에서는 성장하였다. 전기분해 용액 및 끓임 처리된 세포에서는 콜로니를 관찰할 수 없었다. 이는 대장균 세포가 모든 전기분해 용액 및 끓임 처리에 의하여 생존력 (viability)이 상실되었다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 세포가 모두 파쇄되었는지 여부는 확실하지 않으며, 이는 하기와 같은 PCR을 통하여 확인하였다.

세포가 파쇄되었는지를 확인하기 위하여 실시간 PCR (realtime PCR)을 수행하였다. 만약 세포벽이 용해되었다면 세포로부터 유래한 유전자는 실시간 PCR에 의하여 분석될 수 있을 것이다. 실시간 PCR의 정확성 및 재현성을 확보하기 위하여, 분석 내 변이는 LightCycler 전개 내에서 3회 반복으로 결정하였다. 파괴된 세포로부터 유래한 유전자를 정량하기 위하여 실시간 PCR 곡선을 이용하였다. 도 3은 전기분해 용액으로 세포를 처리하고 그로부터 얻어지는 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 얻어지는 실시간 PCR 곡선을 나타내는 도면이다. 상기 곡선은 횡축에 플롯팅된 초기 주형 카피 수와 종축에 플로팅된 교차점에서의 사이클 수를 증폭된 DNA의 양을 측정하여 도시화 하였다. 사이클 수에 따른 DNA 양은 도면과 같이 로그 모양이 된다. 임계 사이클 값 (threshold cycle number) Ct는 상기 로그 선이 수평 임계 선을 자르는 점이다. 표적의 양은 교차점의 Ct에서는 모든 시료에서 동일하다. 즉, 일정양에 도달하는 사이클 수를 측정하여 사이클 수가 작으면 초기 DNA 양이 많은 것이고 크면 초기 DNA양이 적은 것이 되는 것이다. 로그 기의 증폭 과정은 아래의 방적식에 의하여 기술된다.

Ct=-(1/ logE ) log T0 + ( logK / logE )

식 중 T0는 표적의 초기 양이고, K는 교차점 (crossing point)이고, E는 증폭의 효율이다. Ct는 측정된 값이고 T0는 실험자에 의하여 결정된 표준의 초기 농도이다. 본 발명자들은 파괴된 세포로부터 유래하는 핵산의 농도를 Ct 값으로 추정하였다. 5가지 세포 용해 방법의 결과를 비교한 결과, 상당한 차이를 발견하였다. Ct 값에 의하면, 아래와 같은 순서로 핵산의 양이 풍부하였다: EBS-처리된 세포 > 끓임 처리된 세포 > ETS 처리된 세포 > 대조군 > EAS 처리된 세포 (표 1 참조).

표 1. 희석되지 않은 시료 및 PBS 중의 1/10 희석 현탁액의 Ct 값

처리액	무희석 현탁액	1/10 희석
EAS	-	-
EBS	20.21±0.10	26.19±0.05
ETS	25.18±0.16	-
끓임	22.79±0.25	26.78±0.48
대조군	25.68±0.27	-

표 중 Ct 값이 없는 것은 "-"로 표시하였으며, 대조군은 처리되지 않았다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 무희석 용액에 대하여 EBS 처리된 시료는 끓인 시료보다 초기 핵산 농도가 높았다. 이들 데이터는 시험된 방법 중에서 EBS 처리가 가장 효과적인 세포 용해 방법이라는 것을 나타낸다.

더욱이, Labchip은 증폭된 PCR 산물의 특이성을 증명하였다. 또한, EBS 처리된 시료의 PCR 산물의 농도는 다른 시료에 비하여 높았다. 이 또한 EBS 처리 방법이 통상적으로 사용되고 있는 끓임 법에 비하여 효과적이라는 것을 나타낸다.

도 4는 전기분해 용액으로 세포를 처리하고 그로부터 얻어지는 용액을 주형 으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 얻어지는 PCR 산물을 전기영동하고 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에서 끓인 시료는 95℃에서 5분 동안 세로를 끓인 것이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, EAS 처리된 세포로부터의 PCR 산물은 모두 다이머였다. 즉, 제대로 PCR이 이루어지지 않음을 나타내는 것이다. EAS 처리된 시료는 모든 시료에서 PCR 산물이 관찰되지 않았으나, 대조군 시료는 무희석 및 1/10 희석 시료에서 PCR 산물이 관찰되었다. EAS에서 PCR 산물이 관찰되지 않는 것은, EAS에 PCR 저해제가 포함되어 있기 때문인 것으로 여겨진다. 따라서, EAS 용액을 포함하고 있는 ETS 용액으로 처리된 시료의 PCR 산물의 농도는 EBS 용액 시료에 비하여 낮았다 (도 5 참조). 도 5는 도 4의 결과를 그래프로 나타낸 것으로 PCR 산물의 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

이상과 같은 결과로부터, PCR과 같은 생물학적 분석을 위하여는 캐소드 채버에서 생성되는 EBS으로 세포를 용해하는 것이 세포 용해의 효율이 가장 높고, PCR과 같은 생물학적 분석이 효과적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.

실시예 2 : 전기분해 챔버에서의 직접적인 세포 용해

본 실시예에서는 세포를 전기분해 용해용 챔버에 주입하고, 인시투 (in situ)로 전기분해용액을 생성시킨 다음 세포 용해 효율을 측정하였다.

(1) 전기분해에 사용된 장치

사용된 전기 분해 장치는 도 1a, 1b 및 1c에 나타낸 바와 같다. 도 1a의 전기분해 장치는 실시예 1에서 설명한 바와 같다. 세포 용해를 위한 히드록사이드 이온을 생성하기 위하여, 대장균 (E. coli)을 포함하는 12ml의 10mM 또는 100mM 소듐 클로라이드 용액을 5 V 직류를 사용하여 실온에서 1 또는 3 분 동안 전기분해하였다.

도 1b에 나타낸 전기분해 장치는 애노드 챔버와 캐소드 챔버를 분리하는 분할 막이 없는 것을 제외하고는 도 1a에 나타낸 전기분해 장치와 동일하다. 전극 사이의 간격은 2cm이다. 도 1c에 나타내는 전기분해 장치는 현미경에 장착된 디지털 카메라에 의한 관찰이 가능하도록 슬라이드 글라스 (Corning, 미국) 상에 구현된 것을 제외하고는 도 1b에 나타낸 전기분해 장치와 동일하다. 전극은 벽 (wall)의 가장 자리에 설치되고, 전극 사이의 간격은 4 cm이다. 이 장치를 이용하여 100mM NaCl를 포함하는 500 ㎕의 CHO 세포 현탁액을 5 V DC 전압을 사용하여 30 초 동안 전기분해하였다.

(3) 분석 방법

전기 분해 직후 수집된 세포 용해액을 실시간 PCR 및 증폭 산물의 분석을 통하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 관찰하였다. 현미경 분석은 디지털 카메라 (Photometrics Inc., 미국)가 구비되어 있는 Nikon Eclipse TE 300 현광 현미경 (Nikon, 일본)을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다.

(4) 실험 결과

도 6은 사용된 염농도, 전류 및 시간 조건 하에서 전기 분해에 의하여 용해된 세포 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR 증폭 결과를 나타내는 도면이다. 도 6에 서, [1] ~ [4]; Nafion^TM 막이 존재하는 전기분해장치를 사용한 것이고, [5] ~ [8]; 막이 없는 전기분해장치를 사용하였다. [1] 100mM NaCl 용액을 1 분 동안 전기분해, [2] 100mM NaCl 용액을 3 분 동안 전기분해, [3] 10mM NaCl 용액을 1 분 동안 전기분해, [4] 10mM NaCl 용액을 3 분 동안 전기분해, [5] 100mM NaCl 용액을 1 분 동안 전기분해, [6] 100mM NaCl 용액을 3 분 동안 전기분해, [7] 10mM NaCl 용액을 1 분 동안 전기분해, [8] 10mM NaCl 용액을 3 분 동안 전기분해, [9] 대조군.

표 2는 사용된 염농도, 전류 및 시간 조건 하에서 전기 분해에 의하여 용해된 세포 용액을 주형으로 하여 얻어지는 실시간 PCR 증폭 곡선으로부터 Ct 값을 나타내는 도면이다.

표 2. 다양한 조건하에서의 Ct 값

번호	막	염농도 (mM)	시간	Ct
[1]	O	100	1	16.43±0.11
[2]	O	100	3	16.62±0.12
[3]	O	10	1	16.70±0.01
[4]	O	10	3	15.30±0.01
[5]	X	100	1	19.74±0.01
[6]	X	100	3	18.11±0.02
[7]	X	10	1	21.45±0.47
[8]	X	10	3	21.29±0.40
[9]	대조군			22.86±0.48

표 2에 나타낸 바와 같이, 실험 번호 [4] (막 있음, 10mM NaCl, 3 분 동안의 전류 인가)에서 가장 강한 신호와 가장 낮은 Ct 값이 관찰되었다. 이는 실험 번호 [4]의 조건에서 세포가 가장 효율적으로 용해된다는 것을 의미한다. 이 결과는 중앙에 막을 갖는 장치로부터 EBS 중에서 세포 용해가 EBS와 EAS와으 혼합물 중에서의 세포 용해 보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다. Nafion^TM 막은 애노드 및 캐소 드로부터 전기분해된 용액의 혼합을 저해하기 대문에 EAS와 EBS는 상기 전기분해장치에서 분리되어 있다.

도 7은 다양한 조건하에서 전기분해에 의하여 용해된 세포 용해액을 주형으로 하여 PCR하여 얻어진 최종 PCR 산물을 전기영동하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 8은 도 6에서 전기분해로 얻어진 세포 용액을 처리하고, 그로부터 얻어지는 용액을 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 얻어지는 PCR 산물을 전기영동하고 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 프라이머 다이머의 생성 없이 맞는 단일 증폭 산물이 얻어졌다.

도 9는 CHO 세포를 슬라이드 글라스 상의 웰에 올려놓고, DC 5 V 및 1mA 전류를 인가하고 시간에 따라 연속적으로 현미경에 부착된 디지털 카메라로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포는 아주 짧은 시간 내에 변형되어 결국에는 파열되었다. 도 9의 결과는 전기화학적으로 생성된 히드록사이드 이온이 세포를 빠르게 용해시킨다는 것을 입증하는 것이다. 세포 용해는 히드록사이드 이온이 생성되는 캐소드 근처에서 일어난다.

실시예 3 : 전기분해에 의하여 용해된 세포 용해액의 중화

본 실시예에서는 도 1a에 나타낸 바와 같은 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 상기 챔버들 사이에 설치된 분리 막을 갖는 전기분해장치를 이용하고, 각각 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 여러 용해액을 사용하여 전기분해하고, 그로부터 얻어지는 용액의 pH 변화를 관찰하였다.

도 10은 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 각각 10ml의 100 mM NaCl 수용액 (초기 pH =6.0)을 첨가하고, 5 V의 직류 전압을 가하고 시간에 따른 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 60 초 경과 후 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 용액을 1:1의 비율로 혼합한 경우의 pH는 9.49이었다. 따라서, 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 용액을 1:1의 비율로 혼합하는 경우, 초기 pH로 중화되지 않고 염기성 상태로 딤을 알 수 있다.

도 11은 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 각각 200ml의 100 mM MgSO₄ 수용액 (초기 pH =5.75)과 200ml의 100 mM NaCl 수용액 (초기 pH =5.75)을 첨가하고, 10 V의 직류 전압을 가하고 시간에 따른 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 300 초 경과 후 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 용액을 1:1의 비율로 혼합한 경우의 pH는 5.75로써, 초기 pH와 동일하였다.

도 12는 애노드 챔버 및 캐소드 챔버에 각각 200ml의 100 mM Na₂SO₄ 수용액 (초기 pH =5.82)과 200ml의 100 mM NaCl 수용액 (초기 pH =5.82)을 첨가하고, 10 V의 직류 전압을 가하고 시간에 따른 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 300 초 경과 후 애노드 챔버 및 캐소드 챔버의 용액을 1:1의 비율로 혼합한 경우의 pH는 5.82로써, 초기 pH와 동일하였다.

도 10의 결과는 아래와 같은 반응 이론에 의하여 설명될 수 있으나, 본 발명이 특정한 이론에 한정되는 것은 아니다.

하기 반응식에 나타낸 바와 같이, NaCl을 포함하는 용액의 전기분해 중 애노드 챔버에서는 물이 환원되어 염소가 발생하고 캐소드 챔버에서는 물이 환원되어 수소 기체와 히드록사이드 이온이 발생하는 것으로 여겨진다.

애노드 반응 :

2Na⁺(aq)+2Cl^-(aq) + 2H₂O(l) → Cl ₂ (g) + 2Na⁺(aq) (1)

2Cl^-→ Cl₂ + 2e^-

Cl₂ (aq)+ H₂O → HOCl(aq) + H⁺+ Cl^-

HOCl(aq) → H⁺+ OCl^-

캐소드 반응 :

2Na⁺(aq)+2 Cl^-(aq) + 2H₂O(l) → H ₂ (g)+2Na⁺(aq)+2OH ^- (aq) (2)

2H₂O+2e^- → H₂ + 2OH^-(aq)

애노드에서 생성된 염소는 물에 적절하게 용해되어, 물과 반응하여 하이포클로러스 산 (HOCl) 및 염산 (HCl)을 생성한다. 애노드에서 생성된 하이포클로러스 산 (HOCl)은 박테리아의 생존력을 상실시키고 (disinfect), 반면 캐소드에서 생성된 히드록사이드 이온은 알칼리 세포 용해법에서 소듐 히드록사이드와 같이 세포를 효과적으로 파괴하는 것으로 여겨진다. 즉, 하이포클로러스 산 (HOCl)은 박테리아 를 죽이지만 파괴시키지는 않고, 히드록사이드는 세포를 파괴시키는 것으로 여겨진다.

또한, 상기 반응식에 나타낸 바와 같이, 애노드 챔버에서 생성되는 H⁺ 이온은 Cl₂ 기체가 물에 용해되어 발생하는 것인 반면, 히드록사이드는 물의 환원에 의하여 발생하는 것이기 때문에 H⁺ 이온에 비하여 히드록사이드 이온이 더 많이 생성된다. 따라서, 전기분해 결과 얻어지는 애노드 챔버 용액과 캐소드 챔버 용액을 1:1로 혼합하는 경우 초기 용액에 비하여 더 알칼리성으로 변화하게 된다.

반면, 도 11과 12에 나타낸 바와 같이, 애노드 챔버에 MgSO₄ 또는 Na₂SO₄와 같은 물보다 표준산화전위가 낮은 이온을 포함하는 경우에는, 상기 애노드 챔버에서는 산소 기체와 2H⁺ 이온이 생성된다. 또한, 캐소드 챔버에서는 Na+ 이온과 같은 수소 보다 표준환원전위가 낮은 이온을 포함하는 용액을 사용하는 경우 물이 전기분해되어 수소기체와 2OH^- 이온을 생성한다. 따라서, 애노드 챔버와 캐소드 챔버에서 동일한 당량의 2H⁺ 이온과 2OH^- 이온 발생하여, 전기분해 각 챔버의 전기분해액을 1:1로 혼합함으로써 중화된 용액을 얻을 수 있다.

많은 생물학적 분석 과정은 중성 pH에서 수행되는 경우 그 효율이 높기 때문에 애노드 챔버에 물보다 표준산화전위가 낮은 이온을 포함하는 용액을 사용하고, 캐소드 챔버에 물보다 표준환원전위가 낮은 이온을 포함하는 용액을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이 경우 상기 실시예에 밝혀진 바와 같이 HOCl이나 Cl^-과 같이 잠재적으로 생물학적 과정 예를 들면 PCR을 저해할 수 있는 물질의 발생을 줄일 수 있다. 더욱이, 종래 상기 캐소드 챔버 용액과 애노드 챔버 용액의 유량을 각각 조절하여 중화된 pH를 갖는 용액을 얻기 위하여 전기분해 장치에 2 개의 펌프를 필요로 하였으나, 본 발명에 있어서는 상기한 바와 같이 캐소드 챔버 전기분해 용액과 애노드 챔버 전기분해 용액을 단순히 혼합함으로써 중화된 용액을 얻을 수 있기 때문에, 하나의 유량 조절 펌프만을 사용하여도 된다 (도 1f 참조).

실시예 4 : 애노드 챔버에 포함되는 전해용액이 세포 용해 및/또는 PCR에 미치는 영향

본 실시예에서는 도 1에 나타낸 전기분해 장치를 이용하여 캐소드 챔버에 100 mM NaCl 용액 중에 10⁸ cell/ml 대장균 세포를 포함하는 용액을 넣고, 애노드 챔버에는 각각 10ml의 100mM NaCl과 100mM Na₂SO₄ 용액을 넣고, DC 5V를 3 분 동안 가하여 전기분해를 실시하였다. 전기분해 후 애노드 챔버 및 캐소드 챔버로부터 동일한 양의 시료를 채취하여 혼합하고 이를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR은 실시예 1의 (3)에 나타낸 방법에 따라 수행하였으며, 사용된 폴리머라제는 Hot-start Taq DNA polymerase(Roche Diagnostics)이었다.

도 13은 애노드 챔버의 전해액을 달리하여 전기분해한 후 애노드 전기분해 용액과 캐소드 전기 분해용액을 혼합하여 실시간 PCR 한 결과를 나타내는 도면이 다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 애노드 챔버에 Na₂SO₄ 용액을 포함하는 경우가 NaCl을 포함하는 경우에 비하여 초기 핵산 농도 및 최종 증폭되는 핵산의 농도가 높은 것으로 나타났다. 이는 애노드 챔버에 물보다 낮은 표준산화전위를 갖는 물질을 포함하는 경우 추후의 생물학적 분석 및 전기분해용액의 중화에 더 유리하다는 것을 나타내는 것이다.

본 발명의 미세유동장치에 의하면, 별도의 세포 용해 용액을 이용하지 않고서도 세포를 마이크로채널에 이송시키면서 전류를 가하여 전기분해를 수행함으로써 세포를 용이하게 용해시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 미세유동장치를 사용하는 경우 세포용액을 주입하는데 필요한 장치를 사용할 필요가 없기 때문에 단순하고, 장치를 소형화하는데 유리하다. 또한, 본 발명의 장치에 의하면, 세포를 용이하게 용해시킬 수 있다.

본 발명의 세포 또는 바이러스의 용해 방법에 의하면, 세포 또는 바이러스를 용이하게 효율적으로 용해시킬 수 있으면서도, 추후의 생물학적 분석에 적합한 pH 및 전해질 구성을 갖는 세포 용해 용액을 제조할 수 있다.

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Claims (26)

1. 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 분할 막을 포함하는 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동 장치로서, 상기 분할 막은 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔버 사이에 설치되어 있고, 상기 애노드 챔버에는 상기 애노드 챔버 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버에는 상기 캐소드 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 애노드 챔버의 유출구와 상기 캐소드 챔버의 유출구는 하나의 채널로 합류되는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
3. 제2항에 있어서, 상기 애노드 챔버 용액은 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
4. 제3항에 있어서, 상기 화합물은 NO₃ ^-, F^-, SO₄ ^{2 -},PO₄ ^{3 -} 및 CO₃ ^{2 -}로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
5. 제1항에 있어서, 상기 애노드 챔버의 유출구와 상기 캐소드 챔버의 유출구는 각각 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
6. 제5항에 있어서, 상기 애노드 챔버 용액은 물보다 표준산화환원전위가 낮은 화합물 또는 높은 화합물이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
7. 제6항에 있어서, 상기 애노드 챔버 용액은 Cl^-, NO₃ ^-, F^-, SO₄ ^{2 -},PO₄ ^{3 -} 및 CO₃ ^{2 -}로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
8. 제1항에 있어서, 상기 캐소드 챔버 용액은 세포 또는 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
9. 제1항에 있어서, 상기 캐소드 챔버 용액은 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
10. 제8항에 있어서, 상기 용액은 Na⁺, K⁺, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, 및 Al^{3 +}로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
11. 제1항에 있어서, 상기 분할 막은 전류를 통과시키나 각 챔버에서 전기 분해에 의하여 발생한 이온 및 가스를 분리하는 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 미세유동장치.
12. 제1항에 있어서, 상기 전극은 백금, 금, 구리 및 팔라듐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 미세유동장치.
13. 제1항에 있어서, 상기 애노드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것인 미세유동장치.
14. 제1항에 있어서, 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것인 미세유동장치.
15. 제1항에 있어서, 상기 전기분해 장치를 포함하는 세포 용해 구획, 핵산 분리 구획, 핵산 증폭 구획 및 검출 구획으로 구성되는 미세유동장치.
16. 애노드 챔버, 캐소드 챔버 및 분할 막을 포함하는 세포 용해용 전기분해 장치를 포함하는 미세유동 장치로서, 상기 분할 막은 상기 애노드 챔버와 캐소드 챔 버 사이에 설치되어 있고, 상기 애노드 챔버에는 상기 애노드 챔버 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있고, 상기 캐소드 챔버에는 상기 캐소드 용액이 각각 유입 및 유출되는 유입구 및 유출구와 전극이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동장치를 이용하여 전기분해를 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해하는 방법으로서,

    (a) 상기 애노드 챔버의 유입구를 통하여 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물 또는 높은 화합물이 포함되어 있는 애노드 챔버 용액을 상기 애노드 챔버로 유입시키는 단계;

    (b) 상기 캐소드 챔버의 유입구를 통하여 세포 또는 바이러스를 포함하고 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물이 포함되어 있는 캐소드 챔버 용액을 상기 캐소드 챔버로 유입시키는 단계; 및

    (c) 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 구비되어 있는 상기 전극을 통하여 전류를 인가하여 상기 애노드 챔버와 상기 캐소드 챔버에서 전기분해를 일으켜 세포를 용해하는 단계를 포함하는, 전기분해를 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 물보다 표준산화전위가 낮은 화합물은 NO₃ ^-, F^-, SO₄ ^{2 -}PO₄ ^3- 및 CO₃ ^{2 -}로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 물보다 표준산화전위가 높은 화합물은 Cl^-를 포함하는 것인 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 물보다 표준환원전위가 낮은 화합물은 Na⁺, K⁺, Ca^{2 +}, Mg²⁺ 및 Al^{3 +}로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제16항에 있어서, 상기 분할 막은 전류를 통과시키나 각 챔버에서 전기 분해에 의하여 발생한 이온을 분리하는 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제16항에 있어서, 상기 전극은 백금, 금, 구리 및 팔라듐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
22. 제16항에 있어서, 전기분해 단계 후에 상기 애노드 챔버로부터 유래하는 산성 용액을 상기 유출구를 통하여 상기 애노드 챔버로부터 유출시키고, 상기 캐소드 챔버로부터 유래하는 염기성의 세포 또는 바이러스의 용해액을 상기 유출구를 통하여 상기 캐소드 챔버로부터 유출시키고 서로 혼합하여 상기 세포 또는 바이러스 용 해액을 중화하는 단계를 더 포함 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 애노드 챔버로부터 유래하는 산성 용액과 상기 캐소드 챔버로부터 유래하는 염기성의 세포 또는 바이러스의 용해액은 1:1의 부피 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제16항에 있어서, 상기 애노드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것인 방법.
25. 제16항에 있어서, 상기 애노드 챔버 및 상기 캐소드 챔버에 용액을 각각 유입 및 유출시키기 위한 펌프가 더 구비되어 있는 것인 방법.
26. 제16항에 있어서, 상기 미세유동장치는 상기 전기분해 장치를 포함하는 세포 용해 구획, 핵산 분리 구획, 핵산 증폭 구획 및 검출 구획으로 구성되어 있는 것인 방법.

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