KR100561873B1 - 자유 라디칼을 이용한 세포 용해 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금속 이온, 과산화물 및 세포 또는 바이러스 용액의 혼합물에 전기장을 가하여 자유 라디칼 생성을 증가시켜 세포 또는 바이러스를 용해하는 단계를 포함하는 자유 라디칼을 이용하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 적은 전기적 에너지(mV에서 수 V)로 효율적인 세포 용해가 가능하고, 마이크로시스템에 적용시 에너지를 조절하여 원하는 시간, 원하는 공간에만 세포 용해가 가능하므로 LOC(lab-on-a-chip) 구현에 적합하다.

Description

자유 라디칼을 이용한 세포 용해 방법 {Cell lysis method using free radicals}
도 1은 히드록실 라디칼을 생성하는 3 가지 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 통상적인 펜톤 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 세포 용해에 의해 방출된 DNA 의 PCR 증폭 효과를 보여주며, 도 2b는 상기 방법을 이용하여 용해된 세포의 생존능을 보여준다.
도 3은 광 촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 세포 용해에 의해 방출된 DNA 의 PCR 증폭 효과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 방법인 전기화학적 촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 세포 용해에 의해 방출된 DNA 의 PCR 증폭 효과를 보여준다.
본 발명은 자유 라디칼을 이용한 세포 용해 방법에 관한 것이다.
자유 라디칼은 일반적으로 생물체, 특히 생물체의 세포에 악영향을 미친다. 자유 라디칼은 상기 세포의 효소학적 및 분자 장치에 의해 부여된 세포 저항에 의존하는 속도로 세포벽을 공격한다. 세포벽이 분해될 때, 자유 라디칼에 의해 구멍 이 뚫리고, 세포의 내용물이 세포밖으로 흘러 나온다.
세포 용해는 통상적으로 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 수행된다 (Michael T. Taylor 등, Anal.Chem., 73, 492-496 (2001)).
화학적 방법은 세포를 파괴하고 DNA 를 방출하기 위해 용해제를 포함한다. 카오트로픽 시약(chaotropic reagent)를 이용한 세포 추출물의 부가적인 처리 단계가 단백질을 변성시키기 위해 필요하다. 화학적 용해 방법의 단점은 세포를 파괴하기 위해 거친 화학물질을 이용한다는 것이다. 이들은 이은 PCR 반응을 방해할 수 있기 때문에, PCR 반응 전에 DNA 를 정제하는 것이 불가피하다. 상기 화학적 방법은 노동 집약적이고, 시간을 요구하고, 비싼 소모품을 요구하며, 종종 DNA 회수 수율이 낮다는 문제점이 있다.
전기적 방법은 유전영동(dielectrophoresis)의 원리를 이용하는 것으로서, 미생물 세포와 같은 중성 입자는 균일하지 못한 전기장에 놓일 때 극성화되며, 전기장의 비균일성으로 인해, 힘이 입자에 작용한다. 상기 힘은 현탁된 세포의 이동을 야기하여, 세포가 용해하게 된다. 그러나, 상기 방법은 세포 용해 효율이 떨어지고, 높은 전력을 요구하므로 LOC(lab-on-a-chip)에 적용하기에는 부적합하다.
미국 특허 제 6,764,693 호에는 자유 라디칼의 생성을 억제할 수 있는 조성물 및 세포내외의 항산화 작용을 증가시키는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이는 자유 라디칼을 억제하는 항산화제에 대한 기재는 있으나, 자유 라디칼을 이용한 세포 용해 방법에 대한 기재는 없다.
미국 특허 제 5,135,850 호에는 자유 라디칼을 이용하여 생물체의 항산화 성질을 평가 또는 측정하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이는 자유 라디칼을 이용한 세포 용해는 기재되어 있으나, 전기화학적 방법을 이용한 세포 용해에 대한 기재는 없다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 세포 또는 바이러스의 용해 방법을 연구하던 중, 종래의 전기적 방법 및 화학적 방법을 조합한 전기화학적 방법을 이용함으로써 자유 라디칼의 생성이 증가되어 세포가 효율적으로 용해된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 용해시, 용해 효율이 높고 마이크로시스템 적용이 용이하며, 낮은 전력을 요구하므로 LOC 구현에 적합한 자유 라디칼을 이용한 세포 용해 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
금속 이온, 과산화물 및 세포 또는 바이러스 용액의 혼합물에 전기장을 가하여 자유 라디칼 생성을 증가시켜 세포 또는 바이러스를 용해하는 단계를 포함하는 자유 라디칼을 이용하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 금속 이온은 금속이온 분말, 금속 전극 및 금속 비드로 구성된 군으로부터 공급될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 금속 이온은 Fe2+, Cu2+, Mn2+, Cr2+ , 및 Ti2+ 로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 과산화물은 과산화수소 또는 과산화수소와 산 혼합물일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 금속 이온은 Fe2(SO4)3·xH20 로부터 유도되며, 상기 과산화물은 H2O2 일 수 있다
본 발명의 방법에서, 상기 생성된 자유 라디칼이 히드록실 라디칼, 슈퍼옥사이드 라디칼, 및 일중항산소(1O2)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 혼합물은 제 1 및 제 2 마이크로채널이 합류하는 형태인 Y 모양의 마이크로채널을 포함하는 미세유동장치 내에서 상기 금속이온과 과산화물, 및 세포 또는 바이러스 용액을 각각 상기 제 1 또는 제 2 채널을 통하여 이송하여 합류시킴으로써 혼합될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 전기장은 미세유동장치의 마이크로채널에 배치된 전극에 의하여 발생될 수 있다.
이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
금속 이온, 과산화물 및 세포 또는 바이러스 용액의 혼합물에 전기장을 가하여 자유 라디칼 생성을 증가시켜 세포 또는 바이러스를 용해하는 단계를 포함하는 자유 라디칼을 이용하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법에 관한 것이다.
본 발명은 금속이온과 산화제인 과산화물을 이용하여 자유 라디칼을 발생시켜 세포를 용해하는 것이다. 특히, 전기장을 가하여 촉매 반응을 유도하여 자유 라디칼 생성을 증가시켜 세포 용해 효율을 향상시키는 것이다.
활성 산소는 에너지를 만드는 과정에서 사용하고 남은 산소로서, 쌍을 이루지 못한 전자를 지닌 원자 또는 분자이며, 자유 라디칼(free radical)이라고 불리는 매우 불안정한 원자나 분자 상태이므로, 주변에 있는 다른 물질과 결합해서 세포막, 미토콘드리아, DNA 및 기타 세포 성분을 파괴한다. 따라서, 생물체의 조직과 기관의 손상을 초래하고, 이는 생물체의 천연 방어기작을 악화시킨다.
자유 라디칼은 짝짓지 않은 전자를 가지는 원자단을 말한다. 보통의 분자에서는 스핀의 방향이 반대인 2개의 전자쌍을 만들어 안정된 상태로 존재하나, 자유라디칼은 짝을 짓지 않은 활성 전자를 가지고 있기 때문에 일반적으로 불안정하고, 매우 큰 반응성을 가지며 수명이 짧다. 또한, 본래는 공유결합의 생성에 관여했어야 하지만, 결합을 이루지 않은 전자가 있기 때문에, 중심원자는 원자가의 수만큼의 화학결합을 이루지 못하고 있다.
산소 라디칼의 종류에는 산소와 산소가 불안정한 형태로 결합한 슈퍼옥사이드 음이온(O2-), 과산화수소(H2O2), 히드록실 라디칼 (·OH), 일산화질소(NO), 일중항산소(1O2) 가 포함된다.
히드록실 라디칼은 H2O2 와 산화환원 활성인 전이금속 (Fe(II) 또는 Cu(I)) 들이 참여하는 하기 펜톤 반응(Fenton reaction)에 의해 생성된다.
Fe(II)(또는 Cu(I)) + H2O2 → Fe(III)(또는 Cu(II)) + OH- +·OH
히드록실 라디칼은 활성산소 중에 가장 반응성이 크고(전형적인 속도 상수: 109∼1011M-1s-1), 수명(반감기: 10-10초)이 짧으므로 그 자체로서 분석을 위한 충분한 농도에 이르기는 어렵다.
도 1은 히드록실 라디칼을 생성하는 3 가지 방법을 나타낸 모식도이다. 먼저, 통상적인 방법에서, 금속 이온과 과산화물을 혼합하면, 상기 펜톤 반응에 의해 히드록실 라디칼이 생성된다. 그러나, 상기 반응에서는 Fe(III) 가 침전이 되고 Fe(II) 로 환원이 되지 않는다. 또한, 상기 반응에 의해 생성된 자유 라디칼은 빨리 분해되므로, 용액 중의 농도가 매우 빨리 감소하여 세포 용해 효율이 낮다. 따라서, 히드록실 라디칼을 많이 생성하기 위해서는 많은 양의 Fe(II) 의 첨가가 필요하다.
그러나, 본 발명의 방법인 전기화학적 촉매 방법에 따라 상기 혼합물에 전기장을 가하면 양극에서 Fe(III)→Fe(II)로 환원이 일어나면서 침전되었던 Fe(III)이 다시 Fe(II)로 전환되므로 펜톤 반응이 다시 시작되어 자유 라디칼 생성이 증가되는 것이다. 따라서, 소량의 기질만 있어도 대량의 자유 라디칼을 생성할 수 있는 것이다.
히드록실 라디칼의 생성을 증가시키는 또 다른 방법은 광 촉매 방법을 이용하는 것이다. 상기 방법은 상기 혼합물에 자외선 램프를 이용하여 자외선을 조사하면 양극에서 Fe(III)→Fe(II)로 환원이 일어나면서 반응이 시작되어 자유 라디칼 생성이 증가되는 것이다.
상기 방법에 의해 생성된 자유 라디칼에 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하면 자유 라디칼이 이들의 가전자 배치를 안정화하기 위해 세포로부터 전자를 빼앗게 되므로, 세포는 용해되는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 금속 이온은 금속이온 분말, 금속 전극 및 금속 비드로 구성된 군으로부터 공급될 수 있다. 금속 이온은 Fe2(SO4)3 ㆍxH2O 등과 같이 화합물 형태도 가능하지만, 금속을 함유하는 금속이온 분말, 금속 전극, 금속 비드 등의 형태도 가능하며, 금속을 함유하고 있는 것이면 어느 것이라도 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 금속 이온은 Fe2+, Cu2+, Mn2+, Cr 2+, 및 Ti2+ 로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 금속 이온은 산화환원 활성이 있는 전이금속이면 어느 것이라도 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 과산화물은 과산화수소 또는 과산화수소와 산 혼합물일 수 있다. 상기 과산화수소와 산 혼합물은 과산화 수소와 염산, 질산 등과 같은 산의 혼합물을 말한다. 과산화물은 분자 내에 -2가의 O₂기를 가지 고 있는 산화물을 말한다. 무기화합물에서는 알칼리금속 및 알칼리토금속 등의 화합물, 즉 금속 과산화물이 대표적인 것이며, 각각 M2O2 (M= H, Li, Na, K, NH 4, Rb, Cs), MO2 (M= Mg, Ca, Sr, Ba, Zn, Cd, Hg)의 형이 알려져 있다. 이들 금속 과산화물은 금속의 양성(陽性)이 강할수록 안정하고, 양성이 약해짐에 따라 불안정해진다. 따라서, 리튬을 제외한 알칼리금속과 바륨, 스트론튬, 칼슘 등은 안정한 과산화물을 만들지만, 리튬, 마그네슘, 아연, 카드뮴 등의 과산화물은 불안정하다. 과산화물은 일반적으로 금속 또는 산화물을 공기 또는 산소 속에서 가열하거나, 금속염 수용액에 과산화수소를 가하면 생기며, 물 또는 산에 녹이면 과산화수소를 생성한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 생성된 자유 라디칼이 히드록실 라디칼, 슈퍼옥사이드 라디칼, 및 일중항산소(1O2)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 혼합물은 제 1 및 제 2 마이크로채널이 합류하는 형태인 Y 모양의 마이크로채널을 포함하는 미세유동장치 내에서 상기 금속이온과 과산화물, 및 세포 또는 바이러스 용액을 각각 상기 제 1 또는 제 2 채널을 통하여 이송하여 합류시킴으로써 혼합될 수 있다. 상기 화합물과 세포 또는 바이러스 용액을 처음부터 혼합하는 것도 가능하나, Y 모양의 마이크로채널을 통해 혼합하는 것도 가능하다. 상기 마이크로채널에서, 채널 중의 하나에는 세포 또는 바이러스 용액을 주입하고, 채널 중의 다른 하나에는 금속 이온과 과산화물을 주입하여, 두 채널이 합쳐지는 곳에서 세포 용해가 일어날 수 있도록 하는 것이다. 이 는 마이크로시스템에 적용시 원하는 시간 및 원하는 공간에만 세포 용해를 가능하게 할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 전기장은 미세유동장치의 마이크로채널에 배치된 전극에 의하여 발생될 수 있다. 마이크로채널내의 특정 위치에 존재하는 전극에서 전기장을 가해주면, 마이크로채널을 통해 주입된 세포 또는 바이러스가 자유 라디칼의 생성이 증가되는 특정 위치의 전극에서 용해될 수 있는 것이다. 따라서, 원하는 공간에만 세포 용해를 가능하게 할 수 있는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
제조예 1: 박테리아, 프라이머 및 중합효소 연쇄반응
인간 간염 바이러스(HBV) 유전자가 재조합된 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주 DH5α(3 ml)를 37℃에서 대수기까지(OD600=0.64) LB 배지(Sambrook 등, 1989)에서 호기 조건하에 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리로 수합하고, 3 ml의 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세정하였다. 세포를 PBS 에서 재현탁하였다 (세포 밀도; 1 x 108 세포/ml).
용해된 세포로부터 방출된 DNA 를 검출하기 위해, 하기 쌍의 PCR 프라이머를 사용하였다: 프라이머 TMP5-F (서열번호 1); 및 프라이머 TMP5-R (서열번호 2). 이 프라이머 쌍은 인간 간염 바이러스 (HBV) 게놈의 코아 영역에 해당하는 부위이다. PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Takara, 한국)를 이용하여 50℃에서 10분, 95℃에서 1분 동안 예비변성 후, 50 사이클(95℃에서 5초 동안 변성, 및 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 신장)동안 수행하였다. 증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.
제조예 2: 세포 생존능의 측정
생존 세포수를 콜로니를 형성하는 단일 세포의 능력으로 측정하였다. 재조합 대장균 저장 용액 (ATCC #45020) 또는 박테리아 저장 용액을 50 mg/l 암피실린을 포함하고 있는 LB (10 g/l 트립톤, 5 g/l 효모 추출액, 15 g/l 한천 및 10 g/l NaCl) 한천 플레이트에 분주하였다. 37℃에서 12시간 배양한 후, 콜로니를 한천 플레이트 표면에서 씻어내고 이를 50 mg/l 암피실린을 가진 10ml LB 배지로 옮겼다. 세포를 100ml 진탕 플라스크에 100ml 넣고 37℃, 250rpm 에서 6-8시간동안 배양하였다. 대장균 세포의 진탕 플라스크 배양을 수행하였다. Gibco (NY, USA)사에서 구입한 1X PBS 로 세포를 세정한 후 재현탁하고, Eppendorf 5810R 원심분리기(Eppendorf AG, Hamburg, 독일)를 이용하여 10분 동안 6,000g, 4℃ 에서 원심분리하였다.
자유 라디칼을 이용하여 세포를 용해한 후, 용액을 13,200rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하고 남은 침전물을 1X PBS 로 재현탁한 후, 한천 플레이트에 분주하고 37℃에서 12시간 배양한 후 콜로니를 관찰하였다.
비교예 1: 통상적인 펜톤 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼의 세포 생존능 및 PCR 증폭에의 효과
통상적인 펜톤 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼의 세포 생존능 및 PCR 증폭에의 효과를 알아보기 위해, 인간 간염 바이러스(HBV) 유전자가 재조합된 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주를 이용하였다.
도 2a는 통상적인 펜톤 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 세포 용해에 의해 방출된 DNA 의 PCR 증폭 효과를 보여준다. 본 실험에서, Fe(II)는 각각 3mM 및 5mM FeSO4·7H2O 를 사용하였고, H2O2 는 30% 농도를 이용하였으며, 대조군은 세포 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 취한 것이며, 보일링 방법은 세포 배양액을 95℃에서 5분 동안 처리한 것이며, 반응은 튜브내에서 30 분 동안 수행하였으며, 인산염 완충액 pH 7.4에서 수행하였다. 펜톤 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼에 의한 세포 용해에 의해 방출된 DNA 를 이용하여 PCR 을 수행한 결과, 보일링 방법에 비해 PCR 산물의 농도가 낮았다. 이는 상기 조건에서 히드록실 라디칼의 생성이 효율적이지 않고, 또한 높은 농도의 Fe(II) 는 PCR 저해제로 작용한다는 것을 알 수 있었다.
도 2b는 통상적인 펜톤 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 용해된 세포의 생존능을 보여준다. 상기 도 2a와 같은 조건으로 실험한 후, 세포 생존능을 측정한 결과 H2O2 가 첨가된 경우에는 세포가 거의 생존하지 못했으며, 보일링 방법에 의한 경우에는 세포가 모두 사멸했다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 도 2a의 결과와 상반되는 것 처럼 보인다. 왜냐하면, 세포 생존능이 낮아지면 세포가 많이 용해되어 PCR 산물이 많이 생성되어야 하기 때문이다. 그러나, 본 결과에서는 세포 생존능이 떨어져도 PCR 산물은 적게 나오는데, 이는 높은 농도의 H2O2 는 세포 생존을 낮추기 때문인 것으로 나타났다. 즉, H2O2 가 세포를 용해하는 것이 아니라, 세포를 불활성화시켜 세포 생존능을 낮추므로, 세포는 용해되지 않고, PCR 산물도 적게 나오는 것이다.
비교예 2: 광촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼의 PCR 증폭 효과
광촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼의 PCR 증폭에의 효과를 알아보기 위해, 인간 간염 바이러스(HBV) 유전자가 재조합된 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주를 이용하였다.
도 3은 광촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 세포 용해에 의해 방출된 DNA 의 PCR 증폭 효과를 보여준다. Fe(III)는 각각 100μM 및 1000μM Fe2(SO4)3·xH20 을 사용하였고, H2O2 는 30% 농도를 이용하였으며, 대조군은 세포 배양액을 30분 동안 자외선 조사 후, 원심분리하여 상등액을 취한 것이며, 보일링 방법은 세포 배양액을 95℃에서 5분 동안 처리한 것이며, 반응은 튜브내에서 각각 5분, 10분 및 30 분 동안 수행하였으며, 인산염 완충액 pH 7.4에서 수행하였다. 공급되는 자외선은 UV-C 램프를 이용하여 메인 피크가 365nm 이며, UV 파워가 약 2W 이었다. 도 3에 보여주는 바와 같이, 100μM Fe(III)를 이용한 경우에 보일링 방법에 비해 PCR 산물의 농도가 증가하였으나, 1000μM Fe(III)를 이용한 경우에는 보일링 방법에 비해 PCR 산물의 농도가 감소한 것을 알 수 있다. 즉, 1000μM Fe(III) 의 농도에서는 PCR 저해 효과가 크게 작용하고, 세포 용해 효율에는 크게 도움이 되지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 결과는 생성된 히드록실 라디칼에 의한 세포 용해 효과도 있지만, 조사된 자외선에 의한 세포 용해의 가능성도 배제할 수는 없다는 것을 알 수 있다. 세포 생존능 측정 결과, 세포 생존능은 0% 이었는데, 이는 자외선 조사에 의해 세포가 모두 불활성화되었다는 것을 알 수 있다 (데이타 미제시).
따라서, 본 방법은 히드록실 라디칼을 이용한 세포 용해 방법으로는 개선의 여지가 많은 방법으로 생각된다.
실시예 1: 전기화학적 촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼의 PCR 증폭 효과
본 발명의 방법인 전기화학적 촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼의 PCR 증폭에의 효과를 알아보기 위해, 인간 간염 바이러스(HBV) 유전자가 재조합된 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주를 이용하였다.
도 4는 본 발명의 방법인 전기화학적 촉매 방법에 의해 생성된 히드록실 라디칼을 이용하여 세포 용해에 의해 방출된 DNA 의 PCR 증폭 효과를 보여준다. Fe(III)는 100μM Fe2(SO4)3·xH20 을 사용하였고, H 2O2 는 30% 농도를 이용하였으며, 대조군은 세포 배양액을 30분 동안 전기장에 방치 후, 원심분리하여 상등액을 취한 것이며, 보일링 방법은 세포 배양액을 95℃에서 5분 동안 처리한 것이며, 반응은 튜브내에서 각각 5분, 10분 및 30 분 동안 수행하였으며, 인산염 완충액 pH 7.4에서 수행하였다. 전기장 조건은 전해질은 NaCl 1mM, 전압은 1.5V, 전극은 금 전극(반경이 2mm)을 이용하였다. 도 4에 보여주는 바와 같이, 100μM Fe(III)를 이용하여 히드록실 라디칼을 생성한 경우에 보일링 방법에 비해 PCR 산물의 농도가 증가한 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 방법을 이용하여 세포를 용해하는 경우에, 보일링 방법에 비해 세포 용해 효율이 양호하다는 것을 알 수 있다. 그러나, 반응 시간이 증가할수록 PCR 산물의 농도는 감소한다는 것을 알 수 있는데, 이는 아마도 세포 또는 용해된 DNA 가 전극에 흡착됨으로써 PCR 산물의 농도가 감소하는 것으로 추측된다.
따라서, 전기화학적 촉매 방법을 이용하여 히드록실 라디칼을 생성하여 세포를 용해하는 본 발명의 방법은 기존의 보일링 방법에 비해 양호한 세포 용해 효율을 보이며, 마이크로시스템 적용이 용이하므로, 전극에 의한 DNA 의 흡착 가능성만 줄인다면 LOC 구현에 적합한 세포 용해 방법이 될 것으로 생각된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 적은 전기적 에너지(mV에서 수 V)로 효율적인 세포 용해가 가능하고, 마이크로시스템에 적용시 에너지를 조절하여 원하는 시간, 원하는 공간에만 세포 용해가 가능하므로 LOC 구현에 적합하다.
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Claims (8)

  1. 금속 이온, 과산화물 및 세포 또는 바이러스 용액의 혼합물에 전기장을 가하 여 자유 라디칼 생성을 증가시켜 세포 또는 바이러스를 용해하는 단계를 포함하는 자유 라디칼을 이용하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 이온은 금속이온 분말, 금속 전극 및 금속 비드로 구성된 군으로부터 공급되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Fe2+, Cu2+, Mn2+, Cr2+ , 및 Ti2+ 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 과산화물은 과산화수소 또는 과산화수소와 산 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Fe2(SO4)3·xH 20 로부터 유도되며, 상기 과산화물은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 생성된 자유 라디칼이 히드록실 라디칼, 슈퍼옥사이드 라디칼, 및 일중항산소(1O2)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합물은 제 1 및 제 2 마이크로채널이 합류하는 형태인 Y 모양의 마이크로채널을 포함하는 미세유동장치 내에서 상기 금속이온과 과산화물, 및 세포 또는 바이러스 용액을 각각 상기 제 1 또는 제 2 채널을 통하여 이송하여 합류시킴으로써 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 전기장은 미세유동장치의 마이크로채널에 배치된 전극에 의하여 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
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