CN115404177B - 产生物乳化剂的细菌及应用、用于生产生物乳化剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产生物乳化剂的细菌及应用、用于生产生物乳化剂的方法，属于细菌开发领域。该产生物乳化剂的细菌为苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.19082。利用该菌株产生的乳化剂能使原油乳化评级达到++++，油滴粒径达到4μm，并且该菌株为高温嗜碱菌，适应性强。
Description
技术领域
本发明涉及细菌开发领域，特别涉及产生物乳化剂的细菌及应用、用于生产生物乳化剂的方法。
背景技术
生物乳化剂是一类由微生物代谢产生的大分子生物表面活性物质，一般由多糖、蛋白质、脂多糖、脂蛋白，或者这些物质的复合物组成。生物乳化剂具有稳定界面膜的作用，可与石油烃等疏水物质形成稳定的油水乳状液，并且无毒、可生物降解、与环境兼容性好，在石油开采、石油运输、油罐清洗、污染治理、化妆品、食品等领域具有潜在的应用前景。
目前，国外常见的生物乳化剂包括3种：Emulsan、Alasan和Liposan。Emulsan是由乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) RAG-1以乙醇为碳源发酵产生的胞外生物乳化剂，能使石油明显分散，形成稳定的石油乳状液。Alasan是由抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)KA53以乙醇为碳源的发酵液中分离出来的阴离子生物乳化剂，由杂多糖和蛋白组成。Liposan是一种由碳氢化合物和蛋白质组成的生物乳化活性物质，由嗜石油假丝酵母(Candida petrophilum) 发酵烃类物质的发酵液中分离得到。国内也分离到了多株能够产生乳化剂的菌株:Rhodococcus erythropolis、Brevibacillussp.、Dietziasp.、Ochrobactrumsp.、Pusillimonassp.、Sphingopyxissp.、Achromobacter、Geobacillus pallidus和Geobacillus stearothermophilus等。
目前，还有大量的具有开发潜力的乳化剂产生菌种等待被发现及研究。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种产生物乳化剂的细菌及应用、用于生产生物乳化剂的方法，能够解决上述技术问题。
具体而言，包括以下的技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种产生物乳化剂的细菌，所述产生物乳化剂的细菌为苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus；
所述苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.19082。
另一方面，本发明实施例还提供了用于生产生物乳化剂的方法，所述方法使用了上述所述的产生物乳化剂的细菌。
在一些可能的实现方式中，所述方法包括：在保持搅拌的条件下，于50℃-60℃的温度下，使所述产生物乳化剂的细菌于培养基中培养设定时间，得到生物乳化剂粗产品。
在一些可能的实现方式中，所述搅拌的搅拌速率为150 rpm-250rpm。
在一些可能的实现方式中，使所述产生物乳化剂的细菌于培养基中培养48小时-62小时。
在一些可能的实现方式中，所述培养基包括以下质量百分比的组分：0.3%-0.5%的葡萄糖、0.3%-0.5%的氯化铵、0.2%-0.4%的磷酸二氢钠、0.15%-0.3%的玉米浆干粉、余量为水；
所述培养基的初始pH为7-8。
在一些可能的实现方式中，所述方法还包括：
在得到所述生物乳化剂粗产品之后，将培养所得发酵液依次进行第一离心处理和抽滤处理，得到处理液；
向所述处理液中加入设定量的乙醇进行醇沉处理，然后再次进行第二离心处理，得到含生物乳化剂粗产品的产物；
利用超纯水溶解所述含生物乳化剂粗产品的产物，然后进行透析处理，分离得到所述生物乳化剂粗产品。
在一些可能的实现方式中，所述第二离心处理的操作条件如下所示：离心温度为3℃-5℃，离心转速为10000 rpm-14000 rpm。
在一些可能的实现方式中，所述透析处理采用MD8000-14000的透析袋进行。
再一方面，本发明实施例还提供了上述产生物乳化剂的细菌在生产生物乳化剂中的应用。
本发明实施例提供的技术方案的有益效果至少包括：
本发明实施例提供了一种新型的能够用于生产生物乳化剂的细菌，利用该菌株产生的乳化剂能使原油乳化评级达到++++，油滴粒径达到4μm，并且，该菌株为高温嗜碱菌，具有较强的适应性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的灭菌培养基中不添加外源菌培养后得到的发酵液对原油的乳化效果图；
图2为本发明实施例提供的灭菌培养基中添加苍白空气芽孢杆菌（Aeribacilluspallidus）HB1菌株培养后得到的发酵液对原油的乳化效果图；
图3为本发明实施例提供的利用苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus）HB1菌株乳化后的油滴粒径显微图像；
图4为本发明实施例提供的苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus）HB1菌株序列系统发育树。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
一方面，本发明实施例提供了一种产生物乳化剂的细菌，该产生物乳化剂的细菌为苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus；
该苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus于2019年12月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.19082。其中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明提供的苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus简称苍白空气芽孢杆菌HB1，该苍白空气芽孢杆菌HB1的特征如下：
好氧，能运动，内生芽孢；菌体大小0.38μm x 2.75μm，菌落呈白色，湿润，表面光滑。菌株HB1为耐碱嗜热菌，生长pH范围为6.0-10.0；生长温度范围为45℃–70℃；可以在1~4%的盐度下生长，最适生长盐度为2%。
利用本发明实施例提供的白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus来产生生物乳化剂，其适宜的培养基发酵条件如下：0.3%-0.5%的葡萄糖、0.3%-0.5%的氯化铵、0.2%-0.4%的磷酸二氢钠、0.15%-0.3%的玉米浆干粉、余量为水；培养基的初始pH为7-8。
经过单因素正交实验，得到优化的培养基发酵条件如下所示：0.4%的葡萄糖、0.38%的氯化铵、0.27%的磷酸二氢钠、0.2%的玉米浆干粉、余量为水，培养基初始pH为7.8。
在上述条件下所得到的生物乳化剂对油滴进行乳化后，乳化前的油滴粒径超出测量范围，乳化后的油滴粒径最小可达到4μm，获得良好的乳化效果。
本发明实施例涉及的乳化效果评级如下所示：
肉眼观察油水样原油乳化分散效果，将其分为“-”到“++++”五个等级，其中，各个等级的判断标准如下所示：
以原油培养基刚加入原油的情况为对照，如果原油紧贴于瓶壁或者成一大块漂浮于发酵培养基中，且发酵液中非但不含有溶解的原油颗粒，反而变得更加澄清，则定为“-”；
如果原油紧贴于瓶壁或者成一大块漂浮于发酵培养基中，但发酵液中含有溶解的原油小颗粒，则定为“+”；
如果原油大量溶于发酵液，但仍旧存在较多的大油滴漂浮于发酵液液面，则定为“++”；
如果原油大量溶于发酵液，且只有少量的小油滴漂浮于发酵液液面，则定为“+++”；
如果原油大量溶于发酵液，且不挂壁、颗粒细小均匀、振荡形成均匀悬浊液且呈墨汁状，则定为“++++”。
本发明实施例涉及的油滴粒径可以通过多种测定方式测定得到，作为一种示例，油滴粒径的测定方法如下所示：
根据原油乳状液中油滴颗粒的多少，对其进行一定倍数稀释，并取少许滴于载玻片上于光学显微镜下进行原油乳状液图像采集。然后，用显微图像分析软件将采集到的图像进行二值化处理，并用二值筛选功能将其中面积非常小的杂点过滤掉；对于那些在二值化后中间出现空洞的图像要用图像处理工具进行填充，对于处于边界上和有粘连的颗粒需要借助图像处理工具进行去除和分割处理，使之成为独立的颗粒。接着，通过显微图像分析软件“颗粒计算”功能对颗粒整体分布参数进行计算，可以得到的参数包括每个颗粒的周长、面积、等效直径、最大径、最小径等。最后，将这些计算结果保存到系统数据库中，并将数据导入文本文档后通过SPSS软件进行统计学描述。
本发明实施例提供了一种新型的能够用于生产生物乳化剂的细菌，利用该菌株产生的生物乳化剂能使原油乳化评级达到++++（参见图2），乳化前的油滴粒径超出测量范围，乳化后的油滴粒径最小可达到4μm（参见图3），获得良好的乳化效果，并且该菌株为高温嗜碱菌，适应性强。
本发明实施例提供了一种新型的能够用于生产生物乳化剂的细菌，相比如图1所示的灭菌培养基中不添加外源菌培养后得到的发酵液对油水样原油的乳化效果，其评级为“-”，用本发明实施例提供的菌株产生的生物乳化剂获得了极佳的乳化效果。
另一方面，本发明实施例还提供了用于生产生物乳化剂的方法，该方法使用了上述所述的产生物乳化剂的细菌。
在一些可能的实现方式中，该生产生物乳化剂的方法包括：在保持搅拌的条件下，于50℃-60℃的温度下，使产生物乳化剂的细菌于培养基中培养设定时间，得到生物乳化剂粗产品。其中，该生物乳化剂粗产品即为本发明实施例预期的由苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus所产生的生物乳化剂。
示例地，上述温度包括但不限于：50℃、52℃、55℃、56℃、58℃、59℃、60℃等。
其中，为了获得更佳的生物乳化剂生产效果，使上述搅拌的搅拌速率为150 rpm-250 rpm，例如为150 rpm、170 rpm、190 rpm、200 rpm、210 rpm、220 rpm、230 rpm等。
在一些可能的实现方式中，使产生物乳化剂的细菌于培养基中培养48小时-62小时。
作为优选，本发明实施例提供的用于生产生物乳化剂的方法，可以包括以下步骤：在温度为58℃，搅拌速率为200 rpm的条件下，使产生物乳化剂的细菌于培养基中培养48h，终止培养，得到生物乳化剂粗品。
为了获得更佳的培养效果，以获得更高的生物乳化剂产率，本发明实施例中所适用的培养基包括以下质量百分比的组分：0.3%-0.5%的葡萄糖、0.3%-0.5%的氯化铵、0.2%-0.4%的磷酸二氢钠、0.15%-0.3%的玉米浆干粉、余量为水，并且，培养基的初始pH 为7-8。
示例地，葡萄糖的质量百分含量包括但不限于以下：0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%等；
氯化铵的质量百分含量包括但不限于以下：0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%等；
磷酸二氢钠的质量百分含量包括但不限于以下：0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%等；
玉米浆干粉的质量百分含量包括但不限于以下：0.15%、0.2%、0.22%、0.25%、0.27%、0.3%等。
经过单因素、正交实验得到的优化的培养基发酵条件如下所示：0.4%的葡萄糖、0.38%的氯化铵、0.27%的磷酸二氢钠、0.2%的玉米浆干粉、余量为水，培养基初始pH为7.8。
在一些可能的实现方式中，为了分离得到纯度更高的生物乳化剂，本发明实施例提供的用于生产生物乳化剂的方法还包括：
在得到生物乳化剂粗产品之后，将培养所得发酵液依次进行第一离心处理和抽滤处理，得到处理液。
其中，通过离心处理能够去除发酵液中的菌体和大颗粒杂质；通过抽滤处理能够进一步地去除发酵液中更微小的杂质。
向处理液中加入设定量的乙醇进行醇沉处理，然后再次进行第二离心处理，得到含生物乳化剂粗产品的产物。
示例地，向处理液中加入体积为其3-5倍的乙醇进行醇沉处理，在该醇沉处理时，使醇沉体系于3℃-5℃下过夜处理，以获得更佳的醇沉效果。
利用超纯水溶解含生物乳化剂粗产品的产物，然后进行透析处理，分离得到生物乳化剂粗产品。
示例地，第一离心处理的离心转速可以为150rpm-250 rpm，例如为150rpm、180rpm、200rpm、230rpm等。
第二离心处理的操作条件如下所示：离心温度为3℃-5℃，离心转速为10000 rpm-14000 rpm。
举例来说，离心温度可以为3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃等，离心转速可以为10000rpm、11000 rpm、12000 rpm、13000 rpm、14000 rpm等。
在一种优选的实现方式中，使离心温度为4℃，离心转速为12000 rpm。
在一些可能的实现方式中，透析处理采用MD8000-14000的透析袋进行，以获得更佳的透析效果，进而获得高纯度的生物乳化剂粗产品。
该MD8000-14000透析袋为本领域所常见的，例如可以为市售的透析袋MD10（8000-14000）。
在一些优选的实现方式中，在得到生物乳化剂粗产品之后，将培养所得发酵液依次进行离心处理和抽滤处理，得到处理液。
向处理液中加入三倍量的乙醇，于4℃下过夜进行醇沉处理，然后再次进行离心处理，得到含生物乳化剂粗产品的产物。
利用超纯水重新溶解含生物乳化剂粗产品的产物，然后采用MD8000-14000的透析袋进行透析处理，温度为4℃放置过夜，分离得到生物乳化剂粗产品。
再一方面，本发明实施例还提供了上述所述的产生物乳化剂的细菌在生产生物乳化剂中的应用。
本发明实施例提供的新型的能够用于生产生物乳化剂的细菌，利用该菌株能够产生生物乳化剂粗产品，该生物乳化剂粗产品能使原油乳化评级达到++++，乳化前的油滴粒径超出测量范围，乳化后的油滴粒径最小可达到4μm，获得良好的乳化效果，并且该菌株为高温嗜碱菌，适应性强。
以下将结合具体实施例，进一步地阐述本发明的技术方案，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
菌株筛选
（1）、从华北油田区域采集原油油样为唯一碳源，取2g油样于100mL培养基中，具体配方为（g/L）：KH2PO4：3.4；Na2HPO4：1.5；(NH4)2SO4：4；MgSO4：0.07；酵母粉：0.05；初始pH为7.2。然后，置于200rpm摇床58℃富集培养7天，原油被分散成细小颗粒。
（2）、吸取5mL富集液移至新鲜的100mL培养基中，进行发酵培养，培养条件同上，三个周期富集。
（3）、在LB固体平板上反复划线，挑取单菌落划斜面保存。
菌株鉴定
（1）、菌株DNA的提取方法
用Axygen细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取DNA，-80℃保存备用。
（2）、菌种鉴定采用27F和338R进行16sRNA基因的PCR扩增。
反应体系如下表1所示：
表1
PCR程序如下表2所示：
表2
其中，扩增产物由华大基因公司进行测序。序列同源性搜索使用Blast在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）上进行。并用MEGA 6.0（MolecularEvolutionary Genetics Analysis, version 6.0）对其进行分子进化系统发育树分析，图4为苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus）HB1菌株序列系统发育树。
实施例2
将菌株Aeribacillus pallidus HB1种子液（100 μL）接种于250 mL灭菌发酵培养基中，以质量百分比计，灭菌发酵培养基包括：0.4%的葡萄糖、0.38%的氯化铵、0.27%的磷酸二氢钠、0.2%的玉米浆干粉、余量为水，培养基初始pH为7.8。
在温度为58℃，搅拌速率为200 rpm的条件下，使该产生物乳化剂的细菌于培养基中培养48h，终止培养，得到含有生物乳化剂的粗品发酵液。
实施例3
为了进一步增强Aeribacillus pallidus HB1发酵所产生的生物乳化剂的工业应用性，利用实施例3进一步从实施例2的含有生物乳化剂的粗品发酵液中分离提取生物乳化剂粗品，具体操作如下：
（1）将含有生物乳化剂的粗品发酵液依次进行离心处理和抽滤处理，得到处理液。
（2）向处理液中加入三倍量的乙醇，于4℃下过夜进行醇沉处理，然后再次进行离心处理，得到含生物乳化剂粗产品的产物。
（3）利用超纯水重新溶解含生物乳化剂粗产品的产物，然后采用MD8000-14000的透析袋进行透析处理，温度为4℃放置过夜，分离得到生物乳化剂粗产品。
实施例4
本实施例4利用实施例3提供的生物乳化剂粗产品，来对油水样原油乳化进行分散，测试结果如下所示：
如图2所示，原油大量溶于生物乳化剂粗产品的发酵液，且不挂壁、颗粒细小均匀、振荡形成均匀悬浊液且呈墨汁状，评级为“++++”。
经测试，乳化前的油滴粒径超出测量范围，如图3所示，乳化后的油滴粒径最小可达到4μm，获得了良好的乳化效果。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种产生物乳化剂的细菌，其特征在于，所述产生物乳化剂的细菌为苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus；
所述苍白空气芽孢杆菌Aeribacillus pallidus在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.19082。
2.用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述方法使用了权利要求1所述的产生物乳化剂的细菌。
3.根据权利要求2所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述方法包括：在保持搅拌的条件下，于50℃-60℃的温度下，使所述产生物乳化剂的细菌于培养基中培养设定时间，得到生物乳化剂粗产品。
4.根据权利要求3所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述搅拌的搅拌速率为150rpm-250rpm。
5.根据权利要求3所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，使所述产生物乳化剂的细菌于培养基中培养48小时-62小时。
6.根据权利要求3所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述培养基包括以下质量百分比的组分：0.3％-0.5％的葡萄糖、0.3％-0.5％的氯化铵、0.2％-0.4％的磷酸二氢钠、0.15％-0.3％的玉米浆干粉、余量为水；
所述培养基的初始pH为7-8。
7.根据权利要求3-6任一项所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在得到所述生物乳化剂粗产品之后，将培养所得发酵液依次进行第一离心处理和抽滤处理，得到处理液；
向所述处理液中加入设定量的乙醇进行醇沉处理，然后再次进行第二离心处理，得到含生物乳化剂粗产品的产物；
利用超纯水溶解所述含生物乳化剂粗产品的产物，然后进行透析处理，分离得到所述生物乳化剂粗产品。
8.根据权利要求7所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述第二离心处理的操作条件如下所示：
离心温度为3℃-5℃，离心转速为10000rpm-14000rpm。
9.根据权利要求7所述的用于生产生物乳化剂的方法，其特征在于，所述透析处理采用MD8000-14000的透析袋进行。
10.权利要求1所述的产生物乳化剂的细菌在生产生物乳化剂中的应用。
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