CN100363503C - 快速检测it15基因cag重复序列动态突变的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测舞蹈病IT15基因CAG重复序列扩展突变的引物及方法，其特点是采用专门设计的特殊引物，通过两次PCR扩增将DNA量扩增至凝胶电泳可观察的程度，最后利用凝胶电泳直接观察IT15基因CAG重复序列动态突变情况。本发明的优点是：1.简单便宜，不需测序，一般分子生物学实验室或检验室就可操作，从而建立了一个简便易行的扩增CAG重复序列的快速检测方法。2.灵敏度高，25ng基因组DNA就足够检测Htt基因中CAG扩展突变，为临床诊断亨廷顿舞蹈病提供可靠的依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中的临床检测技术，具体涉及一种快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的引物及方法，该检测结果可用于临床辅助诊断亨廷顿舞蹈病。
背景技术
亨廷顿舞蹈病(Huntington’s Disease，HD)是一种以影响运动功能为主的神经退行性疾病，属常染色体显性遗传性疾病。HD的症状通常在45岁以后出现，主要病症是不受控制的大肢体运动，伴有认知障碍和精神异常。导致该疾病的突变基因IT15在1993年被发现。该基因位于人第4号染色体上，它编码一个分子量为350kD的蛋白质，被命名为亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)。IT15基因由67个外显子构成，在外显子起始密码子ATG下游第17个密码子后有一段三核苷酸CAG的重复序列，HD即由CAG重复序列的异常扩展突变引起。该病的发病率在北美和欧洲约为10万分之5。据不完全统计，目前在我国几个地区发现了48个家系。鉴于临床诊断及分子诊断较困难，我国尚无系统的流行病学调查。
舞蹈样疾病种类较多，给HD的确诊增加了难度。目前检测CAG重复数已成为对HD确诊的主要依据。全美医学遗传学学会根据对欧美人群的大样本检测所得的分析结果提出以下诊断标准：CAG重复数≤26时为正常等位基因，不引起疾病；CAG重复数在27～35时为可引起突变的等位基因，不会引起疾病，但在减数分裂时易发扩展突变，使后代患病；CAG重复数在36～39时为不完全外显的HD等位基因，携带者可能发病也可能不发病；CAG重复数≥40时为完全外显的HD等位基因，携带个体必然会患病。然而，由于IT15基因CAG重复序列的C/G含量高达67％，极大地增加了该序列扩增的难度，限制了对我国HD流行病学的调查。
由于CAG重复序列的GC含量很高，扩增困难，为提高DNA解链水平，在PCR反应体系中添加有10％DMSO。为提高敏感性，以往测定CAG重复数时需在做基因扩增时用同位素标记，并在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射自显影。由于采用国外文献报道的引物和条件，难以扩增出目的条带，加上同位素操作需要较高的实验条件，而且同位素操作存在风险与复杂性，因此，导致现有的亨廷顿舞蹈病IT15基因突变检测技术难以推广普及，给普通医院开展临床应用带来困难。
发明内容
本发明提供一种检测IT15基因CAG重复序列动态突变的引物及方法，其目的在于建立一个简便易行的扩增CAG重复序列的快速检测方法，为提高生物临床检测水平，普及应用奠定基础。
为达到上述目的，本发明引物采用的技术方案是：一种快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的引物，由对应第一步PCR扩增的第一对引物和对应第二步PCR扩增的第二对引物组成；
所述第一对引物采用以下四对引物中的任意一对引物：
(I)、外源有义：5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’
外源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、外源有义：5’TTCACACACAGCTTCGC-3’
外源反义：5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’
(III)、外源有义：5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
(IV)、外源有义：5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
所述第二对引物采用以下两对引物中的任意一对引物：
(I)、内源有义：5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’
内源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、内源有义：5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’
内源反义：5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’。
为达到上述目的，本发明方法采用的技术方案是：一种快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的方法，包括下列步骤：
第一步：准备DNA
(1)、从人体抽取血样；
(2)、从血样中获取基因组DNA；
第二步：对含CAG重复序列的DNA片段进行扩增
(1)、第一步PCR扩增
利用PCR扩增方法，以第一步获取的基因组DNA为模板，采用以下四对引物中的任意一对引物进行第一步PCR扩增：
(I)、外源有义：5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’
外源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、外源有义：5’TTCACACACAGCTTCGC-3’
外源反义：5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’
(III)、外源有义：5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
(IV)、外源有义：5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
具体操作为：
①、将以上四对引物中的任意一对引物分别与获取的血样基因组DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、10％DMSO、去离子水混合构成单独的反应体系；
②、分别对各反应体系进行PCR扩增，得到第一步扩增产物；
(2)、第二步PCR扩增
利用PCR扩增方法，以第一步扩增产物为模板，采用以下两对引物中的任意一对引物进行第二步PCR扩增：
(I)、内源有义：5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’
内源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、内源有义：5’-ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’
内源反义：5’-GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’
具体操作为：
①、将以上两对引物中的任意一对引物分别与第一步扩增的产物、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、10％DMSO、去离子水混合构成单独的反应体系；
②、分别对各反应体系进行PCR扩增，得到第二步扩增产物；
第三步：凝胶电泳
采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；
第四步：观测结果
根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断IT15基因CAG重复序列动态突变情况，具体判断方法如下：
(1)、如果观察到对应泳带中出现一条DNA条带，则该对等位基因CAG重复数相同；如果观察到对应泳带中出现两条DNA条带，该对等位基因CAG重复数目不同；
(2)、当第二步PCR使用如上所述第一对引物时，若DNA条带大于218个碱基时，则CAG重复数目大于40(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为240个碱基大小)；若DNA条带等于149个碱基时，则CAG重复数目为17(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为160个碱基大小)。
(3)、当第二步PCR使用如上所述第二对引物时，若DNA条带大于304个碱基时，则CAG重复数目大于40(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为330个碱基大小)；当DNA条带等于235个碱基时，则CAG重复数目为17(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为250个碱基大小)。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、关于DNA片段的PCR扩增
PCR(polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只要有一个拷贝的待扩增DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用于基因检测。
PCR扩增的基本原理是：模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列退火复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是：1、将反应体系加热至90～98℃，模板双链DNA变性成为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；2、降温至37～60℃，使两种引物分别与模板DNA链的互补序列退火复性；3、升温至70～75℃，在耐热性DNA聚合酶催化下，四种脱氧核糖核酸按与模板碱基配对原则沿引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA链的互补链。重复以上过程，就可以出现待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，理论上，待扩增的特异性DNA片段可达到2n个拷贝数。
2、上述方案中，为了获得更好PCR扩增效果，第一步PCR扩增和第二步PCR扩增的循环条件为：
| 步骤 | 温度 | 时间 | |
| 基因组DNA变性 | 94℃以上 | 3分钟 | |
| 至少5次循环 | 变性 | 94℃以上 | 20～40秒 |
| 退火 | 55-58℃ | 20～40秒 | |
| 延伸 | 68℃以上 | 至少60秒 | |
| 延伸 | 68℃以上 | 至少3分钟 | |
| 保存 | 10℃以下 |
以上两步PCR扩增中，变性温度以98℃、退火温度为56℃、延伸温度为72℃为最佳。第一步PCR扩增的循环次数以30次为最佳，第二步PCR扩增的循环次数30～40次，其中35次为最佳。
3、上述方案中，凝胶电泳采用6％～10％聚丙烯酰胺凝胶电泳或2.0％～3.0％琼脂糖凝胶电泳，其中，凝胶电泳采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳或2.5％琼脂糖凝胶电泳效果更好。
原技术方法与本发明方法的比较见下表：
| 原技术方法 | 本发明方法 | 本发明特点 | |
| 基因组DNA制备 | 要求纯度高，白细胞裂解后需酚：氯仿抽提两次以上，取水层，再沉淀DNA，加水溶解后分装冻存，备用 | 白细胞裂解后，酚：氯仿抽提一次，取水层直接分装冻存，备用。 | 极大简化了基因组DNA制备过程，对大批量突变基因的筛查更具有实际意义。此外，比用试剂盒分离DNA便宜。 |
| PCR | 使用了一次PCR | 使用了两步PCR | 提高了PCR的灵敏度和可信度 |
| 检测 | PCR过程中添加放射性同位素α-<sup>32</sup>P-dCTP | 无任何放射性物质 | 操作简便，不需要特别的防护 |
| 电泳 | 变性PAGE测序胶电泳，X-光胶片暴光，冲洗X-光胶片。 | 琼脂糖凝胶电泳，紫外成像仪拍照。 | 时间花费少(原方法需要至少8h，本方法最多只需要2h； |
| 操作人员背景要求 | PCR操作测序胶制备及电泳技术，同位素操作防护知识，X-光冲洗知识和技巧 | PCR操作琼脂糖凝胶电泳紫外成像仪拍照 | 技术要求低，一般有相关背景人员经简单培训都可操作。 |
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1、本发明应用特殊设计的引物，利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来判断IT15基因CAG重复序列动态突变情况。
2.本发明简单，不需测序。
3、本发明便宜，一般分子生物学实验室或检验室就可操作。
4、本发明灵敏度高，可以检测Htt基因中CAG扩展突变，为临床诊断亨廷顿舞蹈病提供可靠的依据。
5、本发明建立了一个快速的简便易行的扩增CAG重复序列的方法，为提高生物样本临床检测水平，及其推广应用奠定基础。
附图说明
附图1为本专利方法流程图；
附图2为实施例三(安徽省一亨廷顿舞蹈病家系)的HD家系遗传图谱；
附图3为实施例三(安徽省一亨廷顿舞蹈病家系)的家系成员Htt基因CAG重复序列扩增的PCR产物电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的引物，由对应第一步PCR扩增的第一对引物和对应第二步PCR扩增的第二对引物组成；
所述第一对引物采用以下四对引物中的任意一对引物：
(I)、外源有义：5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’
外源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、外源有义：5’TTCACACACAGCTTCGC-3’
外源反义：5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’
(III)、外源有义：5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
(IV)、外源有义：5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
所述第二对引物采用以下两对引物中的任意一对引物：
(1)、内源有义：5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’
内源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、内源有义：5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’
内源反义：5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’。
因此，本实施例可以通过排列组合产生一系列不同的引物组合。这些引物组合中的每一种组合均可作为快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的引物，其中每一种组合均由两对四引物构成。
实施例二：一种快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的方法，其特征在于包括下列步骤：
第一步：准备DNA
(1)、从人体抽取血样；
(2)、从血样中获取DNA，即血样基因组DNA样品准备：
试剂准备：
抗凝剂：每100ml含0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖；
红细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl，PH7.6；
5mmol/L MgCl2；
10mmol/L NaCl；
白细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl，PH7.6；
10mmol/L EDTA PH8.0
50mmol/L NaCl
10mg/ml蛋白酶K(Protease K)：10mg Protease K溶于1ml ddH2O。分装，-20℃保存。使用时，在4℃融化。
从血样中获取DNA过程：
①、取3ml新鲜血液加0.5ml抗凝剂，混匀，1500rpm离心10min，小心吸取红细胞与血清之间呈一层乳白色的白细胞到一个新的15ml离心管。
②、加10ml红细胞裂解液，轻轻混匀，放置10min，并经常对溶液进行混匀以充分裂解红细胞。
③、1500rpm离心10min，弃上清，沉淀为白细胞。
④、加白细胞裂解液3ml，加50μl10％SDS和50μl10mg/ml蛋白酶K，50℃温育过夜。
⑤、加等体积酚∶氯仿(1∶1)，轻柔混匀15次，5000g离心10min，取上层水溶液。
⑥、加60μl5mol/L NaCl，轻轻混匀。再加2/3体积异丙醇，轻轻混匀5min，可见白色絮状沉淀即基因组DNA。
⑦、8000g离心10min，弃上清。
⑧、加70％乙醇10ml，轻轻旋转离心管，使管壁都充分接触到乙醇。
⑨、8000g离心5min，弃上清，室温风干明显的乙醇液滴，不要使白色沉淀干透，否则基因组DNA难溶于水。
⑩、加无菌去离子水500μl，置于摇床，室温轻轻摇2h。之后，4℃过夜，使其充分溶解。
第二步：对DNA进行扩增
(1)、第一步PCR扩增
利用PCR扩增方法，以第一步获取的DNA为模板，采用以下四对引物中的任意一对引物进行第一步PCR扩增：
(I)、外源有义：5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’
外源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、外源有义：5’TTCACACACAGCTTCGC-3’
外源反义：5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’
(III)、外源有义：5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
(IV)、外源有义：5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
具体操作为：
①、将以上四对引物中的任意一对引物分别与获取的DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、10％DMSO，去离子水混合构成单独的反应体系，具体见下表：
| ddH<sub>2</sub>O | 8μl |
| 2x PCR Bufier(含10％DMSO) | 15μl |
| dNTP(2.5mM) | 2μl |
| 以上四对引物中的任意一对引物 | 2μl+2μl |
| Taq酶(5u/μl) | 0.3μl |
| 基因组DNA(50ng/μl) | 1μl |
②、分别对各反应体系进行PCR循环，扩增含CAG重复序列DNA片段。PCR循环条件见下表：
| 步骤 | 温度 | 时间 | |
| 总变性 | 98℃ | 3分钟 | |
| 30次循环 | 变性 | 98℃ | 30秒 |
| 退火 | 56℃ | 30秒 | |
| 延伸 | 72℃ | 90秒 | |
| 延伸 | 72℃ | 12分钟 | |
| 保存 | 4℃ | ------ | |
(2)、第二步PCR扩增
利用PCR扩增方法，以第一步扩增的产物为模板，采用以下两对引物中的任意一对引物进行第二步PCR扩增：
(I)、内源有义：5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’
内源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、内源有义5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’
内源反义：5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’
具体操作为：
①、将以上两对引物中的任意一对引物分别与第一步扩增的产物、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系，具体见下表：
| ddH<sub>2</sub>O | 8μl |
| 2 x PCR Buffer(含10％DMSO) | 15μl |
| dNTP(2.5mM) | 2μl |
| 以上两对引物中的任意一对引物 | 2μl+2μl |
| Taq酶(5u/μl) | 0.3μl |
| 第一步PCR扩增的产物 | 0.5μl |
②、分别对各反应体系进行PCR循环，将DNA量扩增至凝胶电泳可现察即可。PCR循环条件见下表：
| 步骤 | 温度 | 时间 | |
| 总变性 | 98℃ | 3分钟 | |
| 35次循环 | 变性 | 98℃ | 30秒 |
| 退火 | 56℃ | 30秒 | |
| 延伸 | 72℃ | 90秒 | |
| 延伸 | 72℃ | 12分钟 | |
| 保存 | 4℃ | ------ | |
第三步：凝胶电泳
采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；
第四步：观测结果
根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断IT15基因CAG重复序列动态突变情况，具体判断方法如下：
(1)、如果观察到对应泳带中出现一条DNA条带，则该等位基因CAG重复数相同；如果观察到对应泳带中出现两条DNA条带，该等位基因CAG重复数目不同；
(2)、当第二步PCR使用如上所述第一对引物时，若DNA条带大于218个碱基时(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为240个碱基大小)，则CAG重复数目大于40；当DNA条带等于149个碱基时，则CAG重复数目为17(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为160个碱基大小)。
(3)、当第二步PCR使用如上所述第二对引物时，若DNA条带大于304个碱基时，则CAG重复数目大于40(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为330个碱基大小)；当DNA条带等于235个碱基时，则CAG重复数目为17(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为250个碱基大小)。
实施例三：利用本发明方法快速检测安徽省一亨廷顿舞蹈病家系的IT15基因CAG重复序列动态突变。
1、材料与方法
1.1研究对象：安徽省1个HD家系的包括4代成员，对其中11名成员进行采样分析。外周静脉血各3ml(3.8％枸橼酸钠抗凝)。裂解红细胞，离心获得白细胞，常规饱和氯化钠法提取白细胞中的基因组DNA。
1.2扩增含CAG重复序列的部分IT15基因。使用本专利述及的第一步PCR引物(I)和第二步PCR引物(I)，按实施例二方法对安徽省一舞蹈病家系成员htt基因进行扩增。
采用NEST-PCR进行扩增。1st PCR：扩增体积为25μl，其中含2×GC缓冲液(含Mg2+)12.5μl，各种dNTP 250μmol/L，HD2和HD3各0.6μmol/L，LATaq多聚酶1U和200ng基因组DNA。扩增条件：95℃3min；(95℃30s，56℃30s，和72℃90S)，循环30次；72℃10min。
2nd PCR：扩增体积为50μl，其中含2×GC缓冲液(含Mg2+)25μl，各种dNTP 250mol/L，HD1和HD2各0.6μmol/L，LATaq多聚酶1U和1μl 1stPCR产物。扩增条件：95℃3min；(95℃30s，56℃30s，和72℃90S)，循环30次；72℃10min。PCR反应试剂均为TAKARA产品。
2结果
2.1该家系共15名成员，固该病死亡人数为3名，发病年龄分别为58，41，42岁。家系图谱见图2。
图2说明如下：
○ 女 □ 男
●■分子诊断CAG＞37 ○口无症状者，分子诊断CAG＜37者
●■已表现出舞蹈病症状者 
已去世者
I.II，III代表该家系的第一代.，第二代和第三代
2.2对该家系11位成员进行了HD的分子诊断，对IT15基因CAG重复序列进行了扩增，该分析结果见图3。右一为核酸分子量标记，其他泳道为对一HD家族共11名成员IT15基因含CAG重复序列扩增的结果。
按本专利述及的观察方法，(1)如果观察到对应泳带中出现一条DNA条带，则该等位基因CAG重复数相同；如果观察到对应泳带中出现两条DNA条带，该等位基因CAG重复数目不同；(2)、当第二步PCR使用如上所述第一对引物时，若DNA条带大于218个碱基时(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为240个碱基大小)，则CAG重复数目大于40；当DNA条带等于149个碱基时，则CAG重复数目为17(由于CG含量高，迁移率变慢，电泳图谱显示约为160个碱基大小)。
2.3对扩增得到的各样本的重复序列进行割胶回收、测序。分析序列，计数各扩增片段CAG重复数。对本实验HD家系成员临床及基因分析结果见
表1
表1本实验HD家系成员临床及基因分析结果
| 性别 | 年龄 | CAG重复数目<sup>1</sup> | 评价<sup>2</sup> | 结论 | |
| I1II1II2II3II4II5II6II7III1III2III3III4III5 | 男男女男女女男女女男男男男 | //51/444241372926231915 | //17/17/17/1717/1717/4417/4417/4417/4417/1717/4417/17 | //N/N/N/NN/NN/HN/HN/HN/HN/NN/HN/N | 58岁发病，11年后去世41岁发病，12年后去世正常42岁发病，12年后去世正常正常已表现症状，38岁表现HD，但尚无症状HD，但尚无症状HD，但尚无症状正常HD，但尚无症状正常 |
| III6 | 男 | 11 | 7/27 | N/N | 正常 |
注：1斜线两边的数字代表一对同源染色体的两个不同等位基因上的CAG重复数。
2斜线两边的字母代表对一对同源染色体的两个不同等位基因上的CAG重复数的评价：N代表正常，H代表HD。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种快速检测IT15基因CAG重复序列动态突变的引物，其特征在于：由对应第一步PCR扩增的第一对引物和对应第二步PCR扩增的第二对引物组成
所述第一对引物采用以下四对引物中的任意一对引物：
(I)、外源有义：5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’
外源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、外源有义：5’TTCACACACAGCTTCGC-3’
外源反义：5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’
(III)、外源有义：5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’
外源反义：5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
(IV)、外源有义：5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’
外源反义： 5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’
所述第二对引物采用以下两对引物中的任意一对引物：
(I)、内源有义：5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’
内源反义：5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’
(II)、内源有义：5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’
内源反义：5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’。
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| 辽宁地区Huntington舞蹈病两家系IT15基因的分子分析. 赵育海等.中国医科大学学报，第32卷第4期. 2003 * |
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