CN100363058C - 用于分离植物内生菌的消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于分离植物内生菌的消毒方法，包括以下步骤：1)在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗；2)选用消毒后的密封容器，使上述清洗后的宿主样品完全浸没于所述密封容器内的无菌水中；3)然后将上述密封容器放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，所述超声波消毒机的工作频率为15～25KHz、功率为50～200W、时间为10～30分钟。采用本发明的消毒方法，既能充分消灭宿主表面的杂菌，又能最大限度减少宿主内生菌的损伤。

Description

用于分离植物内生菌的消毒方法

技术领域

本发明涉及一种用于分离植物内生菌的消毒方法。

背景技术

1993年，美国科学家A.Stierle在太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifolia)上发现了抗肿瘤紫杉醇的产生菌(Taxomyces andreanae)，为解决紫杉醇药源危机提供了新的途径，也为药用植物资源的合理利用提供了参考。从此，药用植物和濒危植物内生真菌及其活性物质的研究成为了药物开发的重要方向。受此启发，植物内生菌的研究也成为了筛选农药活性成分的新方向。

但是，内生菌的研究由于历史不长，在研究方法等方面都还存在问题，还有待改进。如在内生菌分离过程中，对宿主植物表面消毒既不能过重，否则内生菌可能被杀死；但又不能过轻，否则不是内生菌的大量杂菌也会被混作内生菌研究，耗费人力物力。

已往的研究，多采用化学消毒法：无菌水清洗，用75％酒精浸泡，再用0.1％的氯化汞浸泡后，用无菌水洗涤，备用。也有个别采用物理消毒方法：用无菌水清洗数10次后，再用紫外线照射1h，备用。但上述两种方法均存在明显缺点。化学消毒法要么消毒过轻，印迹法检验，待用宿主表面消毒不彻底，仍含有较多菌；要么消毒过重，浸泡消毒时间过长，使得内生菌也被杀死。因此采用化学消毒法，无法达到既要充分消灭宿主表面的杂菌、又要最大限度减少宿主内生菌损伤的要求。物理消毒法由于紫外线照射有些部位难以照射到，产生的臭氧又不能足以百分之百地消毒；印迹法检验，待用宿主表面消毒不彻底，仍含有菌。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种操作简便，既能充分消灭宿主表面的杂菌、又能最大限度减少宿主内生菌损伤的用于分离植物内生菌的消毒方法。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种用于分离植物内生菌的消毒方法，包括以下步骤：

1)、在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗；

2)、选用消毒后的密封容器，使上述清洗后的宿主样品完全浸没于所述密封容器内的无菌水中；

3)、然后将上述密封容器放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，所述超声波消毒机的工作频率为15～25KHz、功率为50～200W、时间为10～30分钟。

作为本发明的用于分离植物内生菌的消毒方法的一种改进：步骤1)中宿主样品用无菌水清洗3～5次。

作为本发明的用于分离植物内生菌的消毒方法的进一步改进：密封容器为配有杯盖的玻璃杯。

作为本发明的用于分离植物内生菌的消毒方法的进一步改进：超声波消毒机的水槽容积为10～40升。

作为本发明的用于分离植物内生菌的消毒方法的进一步改进：超声波消毒机的工作频率为15～22KHz。

作为常规知识：超声波消毒机工作时，水槽内必须放水；步骤1)后的无菌水清洗后的宿主样品必须在无菌状态下转移入步骤2)中的密封容器内的无菌水中。

采用本发明的用于分离植物内生菌的消毒方法，既能充分消灭宿主表面的杂菌、又能最大程度地减少宿主内生菌的损害；且本发明的消毒方法，操作简便，易于实施。

具体实施方式

实施例1、一种用于分离植物内生菌的消毒方法，选用半夏作为欲分离内生菌的宿主样品，选用水槽容积为10升的超声波消毒机；依次进行以下步骤：

1)、在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗3次；

2)、选用消毒后的且配有杯盖的玻璃杯，在无菌状态下将上述清洗后的宿主样品放入杯体内，然后向杯体内加入足够量的无菌水，使得宿主样品能完全浸没于无菌水中；然后盖上杯盖，使整个玻璃杯成为一个密封容器；整个步骤均在无菌状态下完成；

3)、然后将上述玻璃杯放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，超声波消毒机设定的工作频率为19KHz、功率为100W、时间为10分钟。

实施例2、一种用于分离植物内生菌的消毒方法，选用半夏(等同于实施例1的半夏)作为欲分离内生菌的宿主样品，选用水槽容积为20升的超声波消毒机；依次进行以下步骤：

1)、在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗5次；

2)、选用消毒后的且配有杯盖的玻璃杯，在无菌状态下将上述清洗后的宿主样品放入杯体内，然后向杯体内加入足够量的无菌水，使得宿主样品能完全浸没于无菌水中；然后盖上杯盖，使整个玻璃杯成为一个密封容器；整个步骤均在无菌状态下完成；

3)、然后将上述玻璃杯放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，超声波消毒机设定的工作频率为15KHz、功率为50W、时间为30分钟。

为了证明本发明的创造性，发明人进行了如下的对比试验，所用宿主样品相同，均为半夏：

对照实施例1：化学消毒法，无菌水清洗宿主样品数10次后，用75％酒精浸泡5min，再用0.1％的氯化汞浸泡10min后，立即用无菌水洗涤7次。

对照实施例2：化学消毒法，无菌水清洗宿主样品数10次后，用75％酒精浸泡5min，立即用无菌水洗涤7次。

对照实施例3：紫外线照射法，用无菌水清洗宿主样品数10次后，再用紫外线照射1h。

将本发明的2个实施例和作为对比的3个对照实施例，均进行如下的测试法：

一、将宿主样品表面进行印迹法检验，结果表明：

对照实施例1：无菌，符合质量要求。

对照实施例2：有菌，不符合质量要求。

对照实施例3：有菌，不符合质量要求。

实施例1：无菌，符合质量要求。

实施例2：无菌，符合质量要求。

二、将上述消毒处理后的宿主样品分别在无菌状态下移入无菌工作台，然后切成小片，按常规方法培养内生菌(本发明可具体为在消毒步骤完成后，取出玻璃杯放入无菌工作台，然后用无菌镊子取出宿主样品，切成小片，按常规方法培养内生菌)，具体结果见表1，

表1宿主样品经不同消毒方法处理后内生菌的菌量(cfu/g)

处理方法	真菌	细菌	总菌量
				对照实施例1	0	1.1×10<sup>3</sup>	1.1×10<sup>3</sup>
对照实施例2	51	3.4×10<sup>4</sup>	3.4051×10<sup>4</sup>
				对照实施例3	31	4.1×10<sup>4</sup>	4.1031×10<sup>4</sup>
实施例1	15	2.2×10<sup>3</sup>	2.215×10<sup>3</sup>
				实施例2	17	2.3×10<sup>3</sup>	2.317×10<sup>3</sup>

结果表明：本发明的菌量比对照实施例1的菌量明显提高。且无明显内生菌被杀死的现象。

实施例3、一种用于分离植物内生菌的消毒方法，选用马铃薯作为欲分离内生菌的宿主样品，选用水槽容积为15升的超声波消毒机；依次进行以下步骤：

1)、在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗5次；

2)、选用消毒后的且配有杯盖的玻璃杯，在无菌状态下将上述清洗后的宿主样品放入杯体内，然后向杯体内加入足够量的无菌水，使得宿主样品能完全浸没于无菌水中；然后盖上杯盖，使整个玻璃杯成为一个密封容器；整个步骤均在无菌状态下完成；

3)、然后将上述玻璃杯放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，超声波消毒机设定的工作频率为22KHz、功率为200W、时间为20分钟。

为了证明本发明的创造性，发明人进行了如下的对比试验，所用宿主样品相同，均为马铃薯：

对照实施例4：化学消毒法，无菌水清洗宿主样品数10次后，用75％酒精浸泡5min，再用0.1％的氯化汞浸泡10min后，立即用无菌水洗涤7次。

对照实施例5：化学消毒法，无菌水清洗宿主样品数10次后，用75％酒精浸泡5min，立即用无菌水洗涤7次。

对照实施例6：紫外线照射法，用无菌水清洗宿主样品数10次后，再用紫外线照射1h。

将本发明的1个实施例和作为对比的3个对照实施例，均进行如下的测试法：

一、将宿主样品表面进行印迹法检验，结果表明：

对照实施例4：无菌，符合质量要求。

对照实施例5：有菌，不符合质量要求。

对照实施例6：有菌，不符合质量要求。

实施例3：无菌，符合质量要求。

二、将上述消毒处理后的宿主样品在无菌状态下移入无菌工作台，然后切成小片，按常规方法培养内生菌，具体结果见表2。

表2宿主样品经不同消毒方法处理后内生菌的菌量(cfu/g)

处理方法	真菌	细菌	总菌量
				对照实施例4	0	1.8×10<sup>4</sup>	1.8×10<sup>4</sup>
对照实施例5	236	9.0×10<sup>4</sup>	9.0236×10<sup>4</sup>
				对照实施例6	67	5.5×10<sup>4</sup>	5.5067×10<sup>4</sup>
实施例3	23	3×10<sup>4</sup>	3.0023×10<sup>4</sup>

结果表明：本发明的菌量比对照实施例4的菌量明显提高。且无明显内生菌被杀死的现象。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于分离植物内生菌的消毒方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗；

2)、选用消毒后的密封容器，使上述清洗后的宿主样品完全浸没于所述密封容器内的无菌水中；

3)、然后将上述密封容器放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，所述超声波消毒机的工作频率为15～25KHz、功率为50～200W、时间为10～30分钟。

2.根据权利要求1所述的用于分离植物内生菌的消毒方法，其特征是：所述步骤1)中宿主样品用无菌水清洗3～5次。

3.根据权利要求1或2所述的用于分离植物内生菌的消毒方法，其特征是：所述密封容器为配有杯盖的玻璃杯。

4.根据权利要求3所述的用于分离植物内生菌的消毒方法，其特征是：所述超声波消毒机的水槽容积为10～40升。

5.根据权利要求4所述的用于分离植物内生菌的消毒方法，其特征是：所述超声波消毒机的工作频率为15～22KHz。