CN100358529C - 全反式视黄酰胺和神经酰胺降解抑制剂的制药用途 - Google Patents

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Abstract

一种对需要治疗的受治疗者施行的治疗过度增殖疾病的方法，包括以联合方式使受治疗者服用有效治疗量的：(a)产生神经酰胺的类视色素，如芬维A胺或其药学上可接受的盐；和(b)至少一种(在某些实施方案中为至少两种)神经酰胺降解抑制剂，如选自(ⅰ)葡糖基神经酰胺合成抑制剂(ⅱ)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂和(ⅲ)蛋白激酶C抑制剂的化合物。一种优选的神经酰胺合成抑制剂是1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇。一种优选的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂是D-赤-N，N-二甲基鞘氨醇。一种优选的蛋白激酶C抑制剂是L-苏-二氢鞘氨醇。

Description

全反式视黄酰胺和神经酰胺降解抑制剂的制药用途
技术领域
本发明涉及对过度增殖疾病的治疗的联合化学疗法，和有效地用于此方法的制剂。
发明背景
通常认为芬维A胺(fenretinide)[HPR；全反式-(4-羟基苯基)维安酰胺(retinamide)；CAS登记号65646-68-6]通过产生活性氧类物质而对癌细胞产生细胞毒性。见如D.Delia等，癌发生18，943-948(1997)；N.Oridata等，国立癌症研究所杂志89，1191-1198(1997)。
授予Gibbs的美国专利U.S.4,665,098记载了有效地用于治疗乳腺和膀胱癌的芬维A胺的药物组合物。
授予Schwartz等的美国专利U.S.5,821,072提供了一种筛选能够促进肿瘤细胞内细胞凋亡的蛋白激酶C抑制剂的方法，及筛选适于与能够促进肿瘤细胞内细胞凋亡的蛋白激酶C抑制剂联合治疗的抗癌治疗剂的方法。
发明概述
本发明基于意外的发现，即适当剂量的芬维A胺在人肿瘤细胞系内产生增加的和持续的神经酰胺。因此，可以通过服用对神经酰胺产生的细胞毒性的细胞代谢和细胞控制过程进行控制的药剂(如神经酰胺降解抑制剂)，以促进芬维A胺和其他此类产生神经酰胺的视黄酸衍生物对抗过度增殖疾病的细胞抑制或细胞毒活性(包括以下定义的瘤性和非瘤性的过度增殖疾病)。这些药剂包括但不局限于葡糖基神经酰胺合酶抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂和蛋白激酶C抑制剂，可以单独服用或相互合用。以下给出了特定的例子。优选地，视黄酸衍生物具有导致在肿瘤细胞中的坏死、细胞凋亡或二者的有效量，并且神经酰胺降解抑制剂为能有效地增加在肿瘤细胞中产生坏死、细胞凋亡或二者的量，大于单独由视黄酸衍生物产生的效果，或大于预期由视黄酸衍生物和神经酰胺降解抑制剂分别产生的作用之和(这包括两种化合物以分别服用不产生活性的数量联合，产生一种有效活性的情况)。
一种治疗体内过度增殖疾病的方法，包括服用有效治疗量的联合制剂：(a)产生神经酰胺的视黄酸衍生物，如芬维A胺或其药学上可接受的盐；和(b)葡糖基神经酰胺合成抑制剂(包括其药学上可接受的盐)，如1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇或其药学上可接受的盐。服用促进视黄酸衍生物有效量的葡糖基神经酰胺合成抑制剂，使得两个化合物共用能具有有效的活性。优选地，视黄酸衍生物的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，葡糖基神经酰胺合成抑制剂的量为有效地促进细胞中的坏死、细胞凋亡或二者的量，并且其作用大于单独服用视黄酸衍生物，或大于视黄酸衍生物和葡糖基神经酰胺合成抑制剂分别服用产生的作用之和。也可以服用此处所述的其它化合物。
也公开了一种治疗机体过度增殖的方法，包括使机体服用有效治疗量的联合制剂：(a)产生神经酰胺的视黄酸衍生物，如芬维A胺或其药学上可接受的盐；和(b)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，如D-赤-N，N-二甲基鞘氨醇或其药学上可接受的盐。服用能有效促进视黄酸衍生物活性的量的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，使得两个化合物一起具有有效的活性。优选的，视黄酸衍生物的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，并且其作用大于单独服用视黄酸衍生物，或大于视黄酸衍生物和鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂分别服用产生的作用之和。
也公开了一种治疗机体过度增殖的方法，包括使机体服用有效治疗量的联合制剂：(a)产生神经酰胺的视黄酸衍生物，如芬维A胺或其药学上可接受的盐；和(b)蛋白激酶C抑制剂，如L-苏-二氢鞘氨醇或其药学上可接受的盐。服用促进视黄酸衍生物活性的有效量的蛋白激酶C抑制剂，使得两个化合物一起具有有效的活性。优选的，视黄酸衍生物的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡的量或二者的量，蛋白激酶C抑制剂的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，并且其作用大于单独服用视黄酸衍生物，或大于视黄酸衍生物和蛋白激酶C抑制剂分别服用产生的作用之和。
也公开了一种治疗机体过度增殖的方法，包括使机体服用有效治疗量的联合制剂：(a)产生神经酰胺的类视色素或其药学上可接受的盐；和(b)至少两种(如2或3)选自以下的化合物：(i)葡糖基神经酰胺合成抑制剂，(ii)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，和(iii)蛋白激酶C抑制剂。服用能有效地促进类视色素活性的量的至少两种化合物，使得这些化合物一起能产生有效的活性。此至少两种化合物可以是相同或不同类别的。在一个实施方案中，此至少两种化合物含有葡糖基神经酰胺合成抑制剂和鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂。在另一实施方案中，此至少两种化合物含有葡糖基神经酰胺合成抑制剂和蛋白激酶C抑制剂。在另一实施例中，此至少两种化合物含有鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂和蛋白激酶C抑制剂。在另一实施例中，此至少两种化合物含有葡糖基神经酰胺合成抑制剂、鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂和蛋白激酶C抑制剂。优选的，视黄酸衍生物的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，至少两种其他化合物的量为在肿瘤细胞中有效地促进坏死、细胞凋亡或二者的量，并且其作用大于单独服用视黄酸衍生物，或大于视黄酸衍生物和至少两种其他化合物分别服用产生的作用之和。
进行前述治疗用的在单一药物载体或赋形剂中含有上述化合物的组合的制剂，也是本发明的一个方面。
前述化合物在制备进行上述治疗的药物中的用途，也是本发明的一个方面。
以下的附图和说明书详细描述了本发明的前述和其他目的和其他方面。
附图简述
图1图解说明神经酰胺和相关的前死亡途径。
图2图解说明神经酰胺的代谢途径。
图3说明在药物敏感的神经母细胞瘤细胞系SMS-LHN中(实心圆)和在烷基化试剂和鬼臼乙叉甙神经母细胞瘤细胞系CHLA-90中(空心圆)，10μM芬维A胺(以HPR或H表示)对神经酰胺生成的作用。
图4说明芬维A胺(HPR；H)、L-苏-二氢鞘氨醇(沙芬戈；S)，蛋白激酶C抑制剂和1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PPMP；P)，葡糖基神经酰胺合酶抑制剂的各种组合，在不同浓度，对在高HPR抗性的细胞系(SK-N-RA)中细胞存活的影响。实心圆代表沙芬戈和ppmp的组合；空心圆代表芬维A胺和沙芬戈的组合；实心三角代表芬维A胺和ppmp的组合；空心三角代表芬维A胺、沙芬戈和ppmp的组合。剂量表示在横轴上。
图5说明固定剂量为10μM的芬维A胺，与不同的所示剂量的化合物的各种组合，对SK-N-RA细胞的存活的影响。T或他莫昔芬指柠檬酸他莫昔芬。标以H+P的实心圆代表芬维A胺和ppmp，标以H+T的空心圆代表芬维A胺和他莫昔芬；标以H+S的实心圆代表芬维A胺和沙芬戈；标以H+S+T的空心圆代表芬维A胺和沙芬戈和他莫昔芬(1∶1)；实心三角代表芬维A胺和3μM他莫昔芬和沙芬戈。其它剂量表示在横轴上。
图6显示低剂量的芬维A胺与其他化合物的组合对SK-N-RA细胞存活率的活性。实心圆代表3.3μM芬维A胺加沙芬戈；空心圆代表3.3μM芬维A胺加PPMP；实心三角代表PPMP加沙芬戈(1∶1)而没有芬维A胺；空心三角代表3.3μM芬维A胺加PPMP加沙芬戈(1∶1)。其他剂量表示在横轴上。
图7显示了各种药物组合对SK-N-RA细胞存活率的影响。N-DMS(或N)指d-赤-N，N-二甲基鞘氨醇，一种鞘氨醇激酶抑制剂。实心圆代表N-DMS加ppmp；空心圆代表芬维A胺加ppmp；实心三角代表芬维A胺加N-DMS；空心三角代表芬维A胺加N-DMS加ppmp。剂量表示在横轴上。
图8说明各种药物组合对SK-N-RA细胞存活的活性。标以HPR的实心圆代表芬维A胺，标以N-DMS的空心圆代表N-DMS；实心三角代表HPR 加N-DMS；标以10μM H+N的实心圆代表10μM固定剂量的芬维A胺加N-DMS；标以5μM H+P+N的空心圆代表5μM固定剂量的芬维A胺加5μM ppmp加N-DMS。实线代表芬维A胺加ppmp。所标出的剂量是固定的；其他剂量表示在横轴上。
图9说明药物组合对SK-N-RA细胞存活的活性。实心圆代表芬维A胺，空心圆代表芬维A胺加N-DMS(3∶1)；实心三角代表芬维A胺加沙芬戈(3∶1)；空心三角代表芬维A胺加N-DMS加沙芬戈(3∶1∶1)。剂量表示在横轴上。
图10说明用HPR(芬维A胺)和沙芬戈处理的CHLA-90细胞，在不同的时间间隔去掉沙芬戈，并在所示的时间代之以预平衡的仅含HPR的培养基。
图11说明用HPR和沙芬戈处理的sk-N-RA细胞，在不同的时间间隔去掉沙芬戈，并在所示的时间代之以预平衡的仅含HPR的培养基。
图12说明用HPR和沙芬戈处理的A549细胞，在不同的时间间隔去掉沙芬戈，并在所示的时间代之以预平衡的仅含HPR的培养基。
图13说明用沙芬戈和全反式-视黄酸(ATRA)，或沙芬戈和13-顺式-视黄酸处理的CHLA-90细胞。
图14说明用沙芬戈和全反式-视黄酸(ATRA)，或沙芬戈和13-顺式-视黄酸处理的LAN-6细胞。
图15说明神经酰胺向无毒的葡糖基神经酰胺的转化降低HPR和HPR+沙芬戈的毒性。HPR+沙芬戈的摩尔比为3∶1(如：9μM HPR+3μM沙芬戈)。
图16显示用pan-caspace酶BOC-d-fmk处理使HPR的毒性显著降低。
图17显示在暴露于HPR之前用BOC-d-fmk预处理，显著降低作为细胞凋亡特征的核的形态学改变。
图18显示在24小时内，BOC-d-fmk取消HPR诱发的亚G0/G1期DNA-片段化。
图19显示在暴露于HPR或HPR+沙芬戈之前，用BOC-d-fmk预处理，降低作为细胞凋亡特征的形态学改变，但BOC-d-fmk只能最小限度地影响由HPR+沙芬戈的组合导致的坏死的形态特征。
对优选实施方案的详细描述
本申请的方法使用视黄酸衍生物和一种试剂(即一种加强剂)的联合作用，所述试剂作用是对神经酰胺产生的毒性的细胞代谢和细胞控制过程进行控制，以对抗或防止肿瘤、癌、瘤组织和其他癌前和非瘤性过度增殖疾病的生长，所有这些总称为过度增殖或过度成形类疾病。此处所用的治疗可以用于抑制生长和/或降低靶细胞的细胞毒性(通过坏死或细胞凋亡机制，或通过二者)，靶细胞一般是过度增殖细胞(包括肿瘤、癌、和瘤组织，同时有癌前和非瘤的或非性的过度增殖疾病)。
可以用本发明治疗的肿瘤、癌和瘤组织的例子包括如下的性疾病，但不局限于此：乳癌；骨肉瘤；血管肉瘤；纤维肉瘤和其他肉瘤；白血病；淋巴癌；窦道肿瘤；卵巢肿瘤，输尿管、膀胱、前列腺和其他泌尿生殖癌；结肠食管和胃癌和其他胃肠癌；肺癌；骨髓瘤；胰管癌；肝癌；肾癌；内分泌癌；皮肤癌；和脑癌或中枢和外周神经(CNS)系统肿瘤，性的或良性的，包括神经蚀质瘤和神经母细胞瘤。
癌前和非瘤的或非性的过度增殖疾病的例子包括而不仅限于脊髓发育失调；原位颈癌；家族性肠内息肉，如加德纳综合征；口腔粘膜白斑；组织细胞增多症；瘢痕疙瘩；血管瘤；过度增殖性动脉狭窄，炎性关节炎；表皮角化病和包括关节炎的丘疹鳞屑疹。也包括病毒导致的过度增殖性疾病，如疣和EBV导致的疾病(如传染性的单核细胞增多症)，疤痕形成和类似疾病。此文公开的方法可以用于已知或怀疑患有此处定义的过度增殖疾病或有产生此病的危险的个体。
此处所用的“对过度增殖疾病的治疗”指杀死、抑制或减慢过度增殖细胞的体积或群体的生长或增加，或杀死、抑制或减慢肿瘤或癌的生长。降低过度增殖的细胞的数量，或阻止扩散到其他解剖部位，及降低过度增殖的体积或过度增殖的细胞的数量。此处所用的治疗不必有治愈或完全阻止过度增殖的生长的含义。如此处所用的，治疗有效数量指杀死、减慢过度增殖细胞的生长速度、降低过度增殖细胞的体积、和/或降低过度增殖细胞的数量的有效数量。所包括的增强剂的数量足以促进第一化合物的活性，因此两种(或更多)化合物一起比分别使用单一化合物有更大的治疗效果(例如由于协同作用；降低联合的毒性等)。
如此处所用的，“联合”服用两或多种化合物指两种化合物的服用时间足够接近，使一种化合物的存在改变另一种的生物学效果。可以同时或先后服用两种化合物。可以通过在服用前混合化合物而同时服用，或在同一时间在不同的解剖位置或通过不同的解剖途径而服药。
短语“同时服用”、“联合服用”、“一齐服用”指在同一时间点服用化合物或一种紧接另一种服用。在后一种情况下，在足够接近的时间内服用化合物，使所观察到的结果与在同一时间点服用化合物没有区别。
用本发明的方法治疗的对象包括人体和用于兽医目的的动物。动物优选包括马、牛、狗、猫、兔、羊等的哺乳动物。
已知多种细胞内分子引发或抑制细胞死亡(S.Rowan和D.Fisher，白血病11，457(1997)；K.Saini和N.Walker，分子与细胞生化学178，9(1998))。现在许多工作集中在阐述程序性细胞死亡(细胞凋亡)的途径，其中细胞凋亡的引发因素(如DNA损坏)可以活化多种途径(如p53，Fas和其他)，虽然可以用其他分子调节(如促-和抗-细胞凋亡蛋白的Bcl-2家族)，其caspase活化作用是导致细胞凋亡的最后进程的后一步骤。然而，不是所有的细胞死亡都通过细胞凋亡发生，4-HPR导致的细胞死亡包括细胞凋亡和坏死(J.Clifford等，癌症研究59，14(1999))。已知细胞内脂质神经酰胺参与细胞凋亡(L.Obeid等，科学259，1769(1993)(图1))和坏死(Guo等，美国生理学杂志276，F390(1999)；Condorelli等，英国药理学杂志137，75(1999))。已显示它导致细胞凋亡引起的线粒体膜渗透性转变(S.Susin等，实验医学杂志186，25(1997))，导致细胞凋亡引起的线粒体络合物III抑制的ROS发生(A.Quillet-Mary等，生物化学杂志272，21388(1997))和活化死亡前JNK/SAPK途径(S.Basu等，致癌基因17，3277(1998)；T.Okazaki等，细胞信号10，685(1998)；W.Jarvis，Curr.Opin.Oncol.10，552(1998))。神经酰胺也活化蛋白激酶(CAPK)(S.Mathias等，生物化学杂志335(Pt3)，465(1998))，磷酸化酶(PP2A)(L.Leoni等，生化药物学，55，1105(1998))，并可以导致核转录因子NF-kappaB的活化(L.Johns等，免疫学杂志，152，5877(1998)；C.Gamard等，生物化学杂志272，1682(1997))。癌细胞避免神经酰胺的细胞毒性的机理包括代谢成其他型，包括无毒的葡糖基神经酰胺(Y.Lavie等生物化学杂志272，1682(1997)；Y.Lavie等，生物化学杂志，271，19530(1996)；L.Yong-Yu等，生物化学杂志274，1140(1999))和鞘氨醇-1-磷酸酯。鞘氨醇-1-磷酸酯通过活化活化前(pro-life)ERK1/2途径而对抗神经酰胺导致的细胞死亡(O.Cuvillier等，自然381，800(1996)；O.Cuvillier等，生物化学杂志273，2910(1998))。因此，调节神经酰胺的代谢提供了一种增进4-HPR(芬维A胺)和其他产生神经酰胺的类视色素的细胞毒性的方法。
神经酰胺的合成和代谢中的一些关键代谢途径示于图2(Y.Hannun，科学274，1855(1996))。通过活化(1)神经酰胺合酶，从头合成途径或通过活化(2)导致鞘磷脂降解的中性或酸性鞘磷脂酶，在细胞内产生神经酰胺。神经酰胺经神经酰胺合酶代谢成(3)无毒的葡糖基神经酰胺；并通过碱性或酸性神经酰胺酶转化成(4)无毒的鞘氨醇。鞘氨醇进一步通过鞘氨醇激酶转化成(5)鞘氨醇-1-磷酸。以下显示对这些途径的调节可以促进甚至协同促进产生神经酰胺的类视色素如4-HPR的细胞毒性。
以下详细描述可以用于实现本发明的化合物及其制剂，及服用的方式。
1.产生神经酰胺的类视色素：
可以用于实现本发明的产生神经酰胺的类视色素或视黄酸衍生物是在服药的宿主细胞内产生神经酰胺的化合物，并包括授予Gander的美国专利U.S.No.4,190,594(所参考的全部说明书引用于此作为参考)所述的化合物。产生神经酰胺的类视色素包括全反式视黄酸(ATRA)和视黄酸衍生物，包括但不局限于此：
(A)具有下式的全反式视黄酸的酯：
Figure C9980814200131
其中X选自：
Figure C9980814200141
2-环己乙基；10-甲酯基癸基；4-羟基丁基；胆甾醇基；混合的间和对乙烯基苯甲基；和4-溴苯甲基；
(B)具有下式的全反式视黄酸的酯：
Figure C9980814200142
其中Y选自：氧化胆甾醇基(cholesteryloxy)；苯基；4-溴苯基；4-甲氧基苯基；4-硝基苯基；4-羟基苯基；4-甲基苯基；4-氰基苯基；4-乙氧基苯基；4-乙酰氧基苯基；2-萘基；4-二苯基；2，5-二甲氧基苯基；2，4-二氯苯基；2，4-二甲基苯基；3，4-二乙酰氧基苯基；3，4，5-三甲氧基苯基；和2，4，6-三甲基苯基；和
(C)具有下式的全反式视黄酸的酰胺：
Figure C9980814200143
其中Z选自：正丙基氨基；叔-丁基氨基；1，1，3，3-四甲基丁基氨基；1-吗啉代；4-羟基苯基氨基；4-甲酯基-2-羟基苯基氨基；β-(3，4-二甲氧基苯基)-乙氨基；2-苯并噻唑基氨基；1-咪唑基；1-(2-烟酰基迭氮基(nicotinoyl hydrazolyl))；1-苯并三唑基；1-(1，2，4-三唑基)；
Figure C9980814200151
尤其优选的是全反式-N-(4-羟基苯)视黄酰胺，也叫芬维A胺，其CAS的登记号为65646-68-6，具有以下结构：
Figure C9980814200152
可以按本领域已知的方法制备上述化合物。如见授予Gander等的美国专利U.S.4,190,594，和授予Gibbs的美国专利U.S.4,665,098.
可以用于实现本发明的其他视黄酸衍生物包括N-(4-羟苯基)视黄酰胺-O-葡萄糖醛酸化物的C-葡萄糖甙类似物。这些化合物及其制备见于授予Curley等的美国专利U.S.5,663,377和5,599,953，将其说明书全部引用于此作为参考。这些化合物具有以下通式：
Figure C9980814200153
其中R是COOH，CH2OH，或H，n是0或1。
这些化合物的特定的例子包括：4-(视黄酰胺基(retinamido))苯基-C-葡萄糖醛酸化物；4-(视黄酰胺基(retinamido))苯基-C-葡萄糖甙；4-(视黄酰胺基(retinamido))苯基-C-木糖甙；4-(视黄酰胺基(retinamido))苯甲基-C-葡萄糖醛酸化物；4-(视黄酰胺基(retinamido))苯甲基-C-葡萄糖甙；4-(视黄酰胺基(retinamido))苯甲基-C-木糖甙；1-(β-D-吡喃葡萄糖基)视黄酰胺；和1-(D-吡喃葡萄糖基uronosyl)视黄酰胺。
2.葡糖基神经酰胺合成抑制剂
可以使用任何抑制葡糖基神经酰胺合成的化合物，尤其是葡糖基神经酰胺合成抑制剂。这些化合物的例子包括而不局限于具有下式的化合物：
Figure C9980814200161
其中R是如苯基等芳环、环己基或具有10-15个碳原子的alpiphatic基团，R1是胺基，如吗啉代基团，n是4-18的整数(包括功能的同系物，异构体和其药学可接受的盐)。优选地，n是4、6、8、10、12或14，并优选这些化合物的D对映体。例如这些化合物公开于授予Shayman和Radi n的美国专利U.S.5,041,441中；和授予Inokuchi等的美国专利U.S.5,707,649。特定的葡糖基神经酰胺合成抑制剂的例子包括：
1-苯基-2-酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇，其中n是6-12；
1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PDMP)；
1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇(PPMP)；和
他莫昔芬，包括柠檬酸他莫昔芬。
3.鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂
可以用任何鞘氨醇-1-磷酸酯合成抑制剂完成本发明，通常优选鞘氨醇激酶抑制剂如D-赤-N，N-二甲基鞘氨醇。其他鞘氨醇激酶抑制剂是已知的。如可以是日本专利申请9176083(1997)公开的SankyoCo.鞘氨醇激酶抑制剂F12509A(或其药学上可接受的盐)，其具有以下结构：
Figure C9980814200171
4.蛋白激酶C抑制剂
蛋白激酶C抑制剂的例子包括授予Bell等的美国专利U.S.4,816,450所公开的。这些化合物包括具有以下通式的化合物：见P13式II：
Figure C9980814200172
其中Q是CH3-(CH2)n-或CH3-(CH2)m-CH＝CH-(CH2)p-，其中n是2-30，m是1-15，p是1-15；
其中X是CH2-CH2-或-CH-CH-或被一或多个卤素或C1-C3烷基取代；
其中Y是-C(-OH)H-，-C(＝O)-，-C(-SH)H-，-CH2-或-C(-W)H-：其中W是卤素(此处所用的术语“卤素”指氟、氯、溴、碘)；
其中R1和R2是相同或不同的，选自氢、具有1-7个碳的低级烷基、芳烷基和芳基的基团。
其中Z选自含有磷酸酯、H、半乳糖基、磺基半乳糖基、葡萄糖基、乳糖基、三己糖基、磷酰胆碱、GalNAc-Gal-Glc，Gal-Gal-Glc，Sia-Gal-Glc，
Figure C9980814200181
和
Figure C9980814200182
优选二氢鞘氨醇和异构体D、L或DL-苏-二氢鞘氨醇。更优选的是L-苏-二氢鞘氨醇，也称为(2S，3S)-2-氨基-1，3-十八烷二醇或沙芬戈。可以按授予Lyons的美国专利U.S.5,677,341所述的方法制备给药用的这些化合物的乳剂。
注意：根据被抑制的特定的PKC亚类型(subtype)，不是所有的蛋白激酶抑制剂都必须是活性的。在本申请中staurosporine衍生物UCN01是非活性的，表明抑制剂应抑制不被此化合物抑制的亚类型，或应在一个比UCN01更大的程度上抑制它们。现在相信，应选择PKC抑制剂以抑制蛋白激酶Czeta。
不排除沙芬戈发挥一种区别于PKC抑制的对本发明的功效有贡献的功效。因此，沙芬戈和其他发挥此功效的化合物在本发明中是活性的并包括在这里，不将申请人约束到下面所述的本发明的特殊的理论。
5.另外的活性化合物及其筛选
可以用已知的技术产生另外的化合物，包括合理的药物设计技术和/或随机的药物设计技术(或组合化学技术)。
在与受体反应的活性化合物中，反应发生在稳定的三维分子的表面易接近的位点。通过安排决定性的结合位点的残基有一合适的构象，可以按已知技术设计和合成出模仿活性化合物结合区域的必要的表面特征的化合物。一种具有对于活性化合物的结合表面必需的同样的分子拓扑结构的表面区域的分子，将能模仿活性化合物与其对应的受体的相互作用。设计活性化合物的三维结构并制备其活性模拟物是已知的，并作为合理的药物设计技术。见授予Chen的美国专利U.S.5,593,853和授予Balaji等的美国专利U.S.5,612,895和5,331,573；授予Geysen的美国专利U.S.4,833,092；授予Nestor的美国专利U.S.4,859,765；授予Pantoliano的美国专利U.S.4,853,871和授予Blalock的美国专利U.S.4,863,857(将所有这些美国专利的说明书引用于此作为参考)。
在组合化学(或随机药物设计)技术中，用候选化合物的大的组合库筛选其中的活性化合物。可以用各种任何拆分合成方法制备用于进行本发明的库。在拆分合成方法中将可释放的标记附加在粒子和感兴趣的有机化合物上，此方法也被称作同合成方法。已知多种此类方法。见A.Furka等，J.Pept.Protein Res.37，487(1991)；K.Lam等自然354，82(1991)；R.Zuckermann等，Int.J.Pept.ProteinRes.40，498(1992)；F.Sebestyen等，Bioorg.Med.Chem.Lett.3，413(1993)；K.Lam等，Bioorg.Med.Chem.Lett.3，419(1993)。例如，可以是有机金属化合物的库，其中化合物是金属-配基络合物。络合物中的金属可以是在高、低或零氧化态的早或晚跃迁金属。金属也可以是任何主族金属，碱金属，碱土金属，镧系元素或锕系元素.金属配基络合物中的配基可以由以下物质组成或得自以下物质：手性或非手性形式的环戊二烯、氨基酯、唑烷酮(oxazolidoinone)、羟基酸、羟基酯、羟基酰胺、吡啶、稠合吡啶、氮杂环、唑、咪唑、吡咯、冠醚、穴状配体、carcerands、磷化氢、二磷化氢、聚磷化氢、奎宁环、奎宁、生物碱、糊精、环糊精、salen、卟啉、联芳、磺胺、Schiff碱、金属茂、monool、二醇(diol)、多元醇、胺、二胺、多胺、铵盐、肽、蛋白质、核酸等。
作为第二个例子，可以是一个非金属化合物的库，包括但不局限于手性或非手性的环戊二烯、氨基酯、唑烷酮(oxazolidoinone)、羟基酸、羟基酯、羟基酰胺、吡啶、稠合吡啶、氮杂环、唑、咪唑、吡咯、冠醚、穴状配体、carcerands、磷化氢、二磷化氢、聚磷化氢、奎宁环、奎宁、生物碱、糊精、环糊精、salen、卟啉、联芳、磺胺Schiff碱、金属茂、monool、二醇(diol)、多元醇、胺、二胺、多胺、铵盐、肽、蛋白质、核酸等。
固体支持物可以是相互分离的，或在整个的反应物的表面部分不连续的区域，此表面部分可以位于分界处，而使大多数不连续区域位于分界处。这些片型或针型固体支持物是已知的。见授予Ellman的美国专利5,288,514(针型)；授予Fodor等的美国专利5,510,270(片型)。通常优选分离的不连续支持物(如颗粒或珠粒)。可以按已知技术，如美国专利5,565,324所述的方法(将其全部引用于此作为参考)或对本领域技术人员显而易见的此方法的变化方式，合成催化剂库并将其连接到预计的固体支持物上。
对于按任何方法(包括但不局限于上述方法)选择的化合物，可以按以下方法筛选其增强活性，包括附加地和协同地增强的活性，但优选协同地增强产生神经酰胺的类视色素对肿瘤细胞(或其他过度增殖的细胞)的细胞抑制活性和细胞毒活性，该方法包括：
(a)将第一对照肿瘤细胞与一定量的(如能够或不能够自身有效地抑制所述肿瘤细胞生长的量)产生神经酰胺的类视色素接触；
(b)将第二对照肿瘤细胞与一定量的(如能够或不能够自身有效地抑制所述肿瘤细胞生长的量)测试化合物接触；并
(c)将实验肿瘤细胞与步骤(a)所述数量的产生神经酰胺的类视色素和步骤(b)所述数量的测试化合物接触；并
(d)测定以上步骤(a)、(b)、(c)的肿瘤细胞的生长抑制，然后
(e)将对步骤(c)的肿瘤细胞的生长抑制或细胞毒活性与对步骤(a)和(b)的对照肿瘤细胞的生长抑制进行比较，在步骤(c)的实验肿瘤细胞中，测得比步骤(b)和(c)的对照肿瘤细胞的联合生长抑制更大程度的抑制作用，表示测试化合物促进了产生神经酰胺的类视色素的活性。
可以用任何合适的方法进行比较，如通过计算联合指数，其中小于1的值(如小于0.9)表示化合物具有协同作用。可以使用任何肿瘤细胞，包括但不局限于神经母细胞、肺、黑素瘤、前列腺的、白血病、结肠、乳腺和胰腺等肿瘤细胞。可以使用任何产生神经酰胺的类视色素如芬维A胺。考虑上述治疗条件，可以使用其他过度增殖的细胞包括癌前和非癌变的细胞代替肿瘤细胞。在优选实施方案中，试验化合物是一种神经酰胺降解抑制剂，或操纵(manipulate)对神经酰胺产生的细胞毒性进行的细胞代谢或细胞控制过程的其他物质。可以通过总体观察生长抑制或细胞毒性，或通过具体测定坏死、细胞凋亡，或通过两种方式进行测定。可以用此方法确定作为神经酰胺降解抑制剂的活性化合物，其他操纵对神经酰胺产生的细胞毒性进行细胞代谢或细胞控制过程的化合物，或通过不同于此处所述的其他机理发挥作用的化合物。
除了神经酰胺降解抑制剂之外，或作为代替其的另一种选择，可以按照本申请所述方法制备、配制或应用以前未被认为与产生神经酰胺的类视色素联用可有效地用于治疗过度增殖疾病的化合物(包括其药学上可接受的盐)。根据所选的用于筛选的化合物的不同，这些化合物可以是新化合物，可以是已知的但以前未被用于医疗或药物用途的化合物，可以是以前已被用于医疗或药物用途，但未如本申请所述的与产生神经酰胺的类视色素联合使用的化合物。
6.配制和服用
可以将以上所述的化合物配制在单一药物载体或分别的药物载体中服用，治疗各种疾病。根据本发明制备药物制剂时，活性化合物包括其生理上可接受的盐，或其酸性衍生物，一般地-特别是与一种可接受的载体混合。此载体当然必须是可接受的，其含义是，能与配方中其他活性成分相容，并必须对人体无害。载体可以是固体或液体，或是两种形式。优选与化合物配制成单剂量的制剂，如片剂，可以含有重量0.5％-95％的活性化合物。本发明的制剂中可以含有一或多种活性化合物，可以用任何药学已知的方法制备，必要时将这些成分混合，可选地包括一或多种附加成分。
本发明的制剂包括适于口、直肠、局部、口腔(如舌下)、阴道、胃肠外(如皮下、肌内或静脉内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括表面导管)和经皮给药，但在某一情况下需根据所治疗病情的性质和严重程度，和所用的特定活性化合物的性质决定最适宜的途径。
适于口服给药的制剂可以是分散的剂量单位，如胶囊、扁囊剂(cachet)、锭剂、或片剂，各自含有预定数量的活性化合物；可以是粉剂或颗粒剂；是水溶液或非水溶液中的溶液或悬浮液；或是水包油或油包水乳剂。可以用任何药学的适宜方法制备这些制剂，包括将活性化合物与适宜的载体(可以一或多种上述附加成分)结合的步骤。一般地，是将活性化合物与液体和/或精细分散固体载体均匀而密切地混合，然后如果需要将所得混合物成型而制备本发明的制剂。如，可以通过将含有活性化合物的粉末或颗粒压片或模塑而制备片剂，可选地在制备过程中可以加入一或多种附加成分。可以用一适宜的机器将处于自由流动状态-如为粉末或颗粒态，可选地可混有一种粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂-的化合物压制成片剂。可以用一适宜的机器将用惰性液体粘合剂湿润的粉末状的化合物铸型而制备模塑片剂。
适于口腔(舌下)给药的制剂包括在有味的基质中含有活性化合物的糖锭剂，这些基质通常为蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶；和在一惰性基质如凝胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中含有化合物的香锭剂。
本发明适于肠胃外或阴道给药的制剂通常包括活性化合物的无菌水溶液制剂，这些制剂优选与受体的血液是等渗的。这些制剂可以用皮下、静脉内或真皮内注射的方式给药。通常可以将化合物与水或甘氨酸缓冲液混合，并将所得溶液灭菌，及调节成与血液等渗而制备这些制剂。
适于直肠的给药的制剂优选单剂量栓剂。可以通过将活性化合物与一或多种通常的固体载体，如可可脂混合，然后使所得混合物成型而制备。
适于皮肤局部给药的制剂优选采用软膏、霜、洗液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油的形式。所用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮促进剂，及两或三种这些物质的组合。
适于透皮给药的制剂可以是分散的片，能与受体的表皮密切接触更长的时间。适于透皮给药的制剂也可以通过电离子渗入疗法给药(如，见药物研究3(6)：318(1986))，一般采取活性化合物的缓冲水溶液的形式。适宜的制剂含有柠檬酸盐或bis/tris缓冲剂(pH6)或乙醇/水，并含有0.1-0.2M活性组分。
如上所述，本申请提供了在供口服、直肠、局部、口腔、肠胃外、肌内、真皮内或静脉内，和经皮给药的药学可接受的载体中含有活性化合物的药物制剂(包括其药学上可接受的盐)。
在本发明的范围内使用时，任一活性成分的治疗有效剂量，将根据具体化合物、具体的病人，并根据一些因素如病情和给药途径作些调整。可以参照本领域技术人员已知的常规步骤，尤其是本文所公开的方法确定这些活性成分的剂量。
芬维A胺用于系统治疗时，将采用能达到约1、2或3μM至10或20μM的血浆浓度的浓度；典型的(口服剂量)为每日50或100至500或1000、2000或3000mg/m2体表面积。
对于他莫昔芬，血清水平1.5至2μM可达到临床所需的效果，在约150至300或500mg/天柠檬酸他莫昔芬P.O.，或300或400至500或700mg/m2每天的剂量时可达到此水平。在用更高的400-500mg/天的P.O.脉冲剂量基础上可达到这些水平。
服用沙芬戈达到约为1-10μM(如7.5)峰形血清水平，或服用剂量为5或10-30或40mg/kg(如20mg/kg)。
用以下非限定性的实施例进一步详细说明本申请。
例1
细胞毒性作用的测定
用DIMSCAN测定系统测定细胞毒性(R.Proffitt等，血细胞计数24，204-213(1996)；T.Frgala等，AACR学报36，303(1995))；此系统使用数字成像显微镜计数活细胞的个数，活细胞选择性地积聚荧光黄二醋酸盐变成亮色的荧光。此系统能通过用曙红Y淬灭已死亡或濒临死亡的细胞的残存荧光，并用数字阈测定活细胞的总荧光，而在4-5log动态范围内测定细胞毒性。所测定的荧光与活细胞数量成正比。将经药物治疗的细胞群体的总荧光和相似数量的未经治疗的细胞的荧光对比，得出存活率。简而言之，在有0.1cc培养基的96-孔组织培养板中的60个孔中重复植入5000-10,000 SK-N-RA神经母细胞瘤细胞/孔，过夜。然后加入0.05cc含药培养基，使药物浓度达到标示的终浓度。用每种药物浓度处理12个孔。12个孔仅接受适宜的终浓度的药物媒介物，并作为对照培养板。细胞在5％CO2中，在37℃条件下温育96-120小时。然后在每孔中加入含荧光黄双醋酸酯的0.05cc培养基，使其终浓度达8mg/cc。在37℃再将细胞温育15分钟，在每孔中加入0.5％曙红Y0.03cc。然后用数字成像显微镜测定存活细胞的总荧光。
例2
测定神经酰胺
按如下方法测定神经酰胺。在6孔组织培养板中重复植入500，000神经母细胞瘤细胞/孔，使其过夜。将氚化(3H)-棕榈酸(一种脂质前体)加至1微居里/cc，加入芬维A胺至终浓度为10μM。对照细胞仅接受氚标记物，而不接受药物。在所标示的时间，从三份重复的孔中采集细胞，洗涤，用甲醇、乙酸、水和氯仿提取脂质。分离有机层(含有结合在脂质中的氚标记物)并在氮气流中干燥。将脂质样品溶解在氯仿：甲醇中，测定各样品的10％以确定脂质样品中的总氚。然后用薄层色谱法分离样品中的氚和未标记的神经酰胺基准物，用碘蒸汽使薄层显色。刮下与神经酰胺基准物对应的薄层区域，测定共迁移样品神经酰胺的氚。然后将总样品的神经酰胺表示为神经酰胺中标记的氚相对于总脂质中的氚的百分比。
例3-9
对细胞毒性和神经酰胺的研究
用图3-9分别说明例3-9。按以上例1和例2的方法进行例3-9。
图3说明在20％O2中的10μM芬维A胺(标以HPR或H)对在药物敏感的神经母细胞瘤细胞系SMS-LHN(实心圆)中和在抗药的神经母细胞瘤细胞系CHLA-90(空心圆)中产生神经酰胺的影响。注意发现两种细胞系均对芬维A胺有反应产生神经酰胺。
图4说明芬维A胺(HPR或H)、L-苏-二氢鞘氨醇(沙芬戈；S)、蛋白激酶C抑制剂和1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇(ppmp；P)、葡糖基神经酰胺合成酶抑制剂等各种组合，对在各种浓度、在20％O2条件下，在高稳定性的细胞系(sk-N-RA)中细胞存活的影响。注意药物的联合效果。实心圆代表沙芬戈与ppmp的组合；空心圆代表芬维A胺与沙芬戈的组合；实心三角代表芬维A胺和ppmp的组合；空心三角代表芬维A胺、沙芬戈与ppmp的组合。剂量标示在横轴上。
图5说明固定剂量10μM的芬维A胺与所标示的剂量变化的各种化合物的组合，对SK-N-RA细胞在20％O2条件下细胞存活的影响。T或他莫昔芬代表柠檬酸他莫昔芬。注意各个化合物具有低的细胞毒性，而化合物的组合产生高的细胞毒性。标以H+P的实心圆代表芬维A胺ppmp；标以H+T的空心圆代表芬维A胺加他莫昔芬；标以H+S的实心圆代表芬维A胺加沙芬戈；标以H+S+T的空心圆代表芬维A胺加沙芬戈加他莫昔芬(1∶1)；实心三角代表芬维A胺加3μM他莫昔芬加沙芬戈。其他剂量标示在横轴上。
图6显示在与其他化合物的组合中，低剂量的芬维A胺对20％O2中SK-N-RA细胞的存活率的活性。实心圆代表3.3μM芬维A胺加沙芬戈；空心圆代表3.3μM芬维A胺加ppmp；实心三角代表ppmp加沙芬戈(1∶1)而无芬维A胺；空心三角代表3.3μM芬维A胺加ppmp加沙芬戈(1∶1)。其他剂量标示在横轴上。
图7显示各种化合物的组合对20％O2中sk-N-RA细胞的存活率的影响。N-DMS(或N)指d-赤-N，N-二甲基鞘氨醇，一种鞘氨醇激酶抑制剂。实心圆代表N-DMS加PPMP；空心圆代表芬维A胺加ppmp；实心三角代表芬维A胺加N-DMS；空心三角代表芬维A胺加N-DMS加PPMP。其他剂量标示在横轴上。
图8说明各种药物组合对20％O2中的sk-N-RA细胞的存活的活性。标以HPR的实心圆代表芬维A胺；标以N-DMS的空心圆代表N-DMS；实心三角代表HPR加N-DMS；标以10μM H+N的实心圆代表10μM固定剂量的芬维A胺加N-DMS；标以5μM H+P+N的空心圆代表5μM固定剂量的芬维A胺加5μM固定剂量的PPMP加N-DMS。实线代表芬维A胺加PPMP。已标出的剂量是固定的；其他剂量如横轴所示。注意当N-DMS加入芬维A胺和PPMP中时，细胞毒性增加。
图9说明药物组合对20％O2中的SK-N-RA细胞的存活的活性。实心圆代表芬维A胺；空心圆代表芬维A胺加N-DMS(3∶1)；实心三角代表芬维A胺加沙芬戈(3∶1)；空心三角代表芬维A胺加N-DMS加沙芬戈(3∶1∶1).剂量如横轴所示。注意三个化合物的组合的细胞毒性。
例10
在整个治疗周期中不需要全部化合物同时出现
在一些细胞系中，我们发现沙芬戈只需要在整个治疗周期中的一段与HPR同时出现，就可得到增加的抗肿瘤细胞活性。在这些实验中，在时间＝0的一点，一起加入沙芬戈和HPR。然后在不同时间，除去含有两种药的细胞培养基并代之以仅含有相似浓度的HPR的培养基。然后将细胞温育96-120小时，将其存活率与如前所述在整个96-120小时内暴露于两种药物下的细胞比较。结果显示即使为使本发明得到高于HPR单独治疗的肿瘤细胞杀死效果，沙芬戈也不需要与HPR共同出现在整个治疗过程中。在一些情况下，在HPR治疗的96-120小时治疗周期中，沙芬戈与HPR共同出现少于12小时就足以获得本发明所致的细胞杀死量方面大比例的增长。这证实为使本发明发挥作用，本发明所要求的所有化合物不需要在全部时间内同时出现。
方法：在如前所述的DIMSCAN细胞毒性测定所用的96孔微量板中的每孔中的全部100μl培养基中加入细胞。所用的细胞系包括神经母细胞瘤细胞系CHLA-90和SK-N-RA，和肺性肿瘤细胞系A549。在时间+0时，在每孔的50μl全部培养基中(每孔最终为150μl培养基)，加入HPR和沙芬戈至所标出的最终药物浓度。也在时间+0时，将在50μl培养基中的同样浓度的HPR作为单一试剂，加入到重复的微量板中的孔中(每孔中最终总培养基量为150μl)。将培养板在37℃温育。在标出的时间，从HPR+沙芬戈培养板的12个孔中分别移出150μl培养基，弃去，代之以从仅有HPR的培养板中的12个孔中分别得到的150μl培养基(预平衡培养基)。HPR+沙芬戈培养板的孔中的培养基被预平衡的培养基代替，而不是在新培养基中加入新的HPR，以模拟培养基的任何可能的情况或可能在原有的两药物的孔中随时间发生的HPR降解。各培养板重复制备并在所标示的+96-120小时用DIMSCAN测定法测定细胞毒性。在各图上的最终数据点表示两种药物共同温育整个+96-120小时细胞的存活率。整个方法试图模拟在整个HPR治疗周期内，仅在一段时间内同时暴露于沙芬戈的体内的情况。
结果：图10、11、12代表在短于整个HPR治疗周期的一段时间内沙芬戈与HPR共同出现，从各种细胞系得到的细胞毒性结果。在一些情况下，通过在短于整个HPR治疗周期的时间内共同使用药物，会得到由本发明引起的肿瘤细胞杀死的大比例的增长。在一些情况下，在整个HPR治疗周期内的一段时间共同使用沙芬戈和HPR足以使本发明发挥作用。这证实为使本发明发挥作用，不需要所有化合物出现在全部时间内。
例11
沙芬戈增加其他类视色素的细胞毒性
类视色素全反式视黄酸(ATRA)已被发现在Neuro 2a神经母细胞瘤细胞的神经酰胺的水平上能产生适度的(1.5x)增长(L.Riboni等，生物化学杂志270：26868(1995))。此处我们证实与沙芬戈共同使用ATRA，或类视色素13-顺-视黄酸，与各种类视色素分别单独使用相比，使CHLA-90和LAN-6神经母细胞瘤细胞的细胞存活率显著降低。这证实本发明与各种不同的类视色素共同使用是具有活性的。
方法：在如前所述的DIMSCAN细胞毒性测定所用的96孔微量板的每孔中的全部100μl培养基中加入细胞。所用的细胞系包括神经母细胞瘤细胞系CHLA-90和LAN-6。在0时，在50μl培养基中加入全反式视黄酸(ATRA)，或13-顺式视黄酸(13-cis-RA)，或类视色素与沙芬戈以3∶1摩尔比的组合。温育培养板并用DIMSCAN测定法在+120小时对CHLA-90细胞，在+144小时对LAN-6细胞测定细胞毒性。
结果：示于图13-14的数据证实在ATRA或13-顺式-RA中加入沙芬戈，使CHLA-90和LAN-6细胞系的存活率产生显著的降低。沙芬戈在4μM(在以下实验中所用的最大浓度)时对CHLA-90的存活率为0.11，对LAN-6细胞的存活率为0.39。这证实本发明与一些不同类视色素使用时具有活性。
例12
神经酰胺向无毒的葡糖基神经酰胺的特定的转化降低HPR和HPR+沙
芬戈的细胞毒性
我们已看到HPR按依赖剂量和时间的方式在神经母细胞瘤细胞系中产生神经酰胺(B.Maurer等，国立癌症研究所杂志(1999)(印刷中))。葡糖基神经酰胺(GC)是神经酰胺的无毒的代谢产物。神经酰胺通过葡糖基神经酰胺合酶(GCS)的作用转化成葡糖基神经酰胺。葡糖基神经酰胺合酶(GCS)已使用MCF7/GCS细胞系中的四环素诱导表达结构转染进人MCF7乳腺肿瘤细胞(Y.Liu等，生物化学杂志274：1140-46(1999))。已发现在含多西环素(一种四环素)的培养基中温育MCF7/GCS细胞能增加GCS活性，增加神经酰胺向葡糖基神经酰胺的转化，降低阿霉素-一种已知能增加这些细胞中的神经酰胺的药物-的毒性(Y.Liu等，supra)。我们将MCF7/GCS细胞暴露于有或无多西环素条件下的HPR、沙芬戈和HPR+沙芬戈中。我们发现用多西环素在MCF7/GCS细胞中增加GCS的活性，显著降低HPR的细胞毒性并显著降低HPR+沙芬戈药物组合的细胞毒性。这证实在MCF7/GCS细胞中由HPR产生的神经酰胺具有细胞毒性，本发明至少部分依赖神经酰胺和其细胞毒性的增加。
方法：将MCF7/GCS细胞置于培养板中，并与10％胎牛血清和用于上述DIMSCAN细胞毒测定的200mg/ml Hygromycin B(tet关闭)在RPMI培养基中温育。为增加GCS表达，也将MCF7/GCS细胞在上述培养基中与3mg/ml多西环素(tet开放)温育3天，然后将其再次置于培养板上进行DIMSCAN细胞毒测定。用多西环素诱导的(tet开放)细胞进行的DIMSCAN细胞毒测定在培养基中也包括3mg/ml多西环素。“tet关闭”和“tet开放”MCF7/GCS细胞均暴露于HPR、沙芬戈及HPR+沙芬戈(3∶1摩尔比)96小时，如前所述用DIMSCAN测定存活百分率。
结果：典型的结果示于图15。MCF7/GCS细胞与多西环素(tet开放)共同温育，先显示促进GCS表达并增加神经酰胺向无毒的葡糖基神经酰胺的转化(Y.Liu等，supra)，与“tet关闭”MCF7/GCS细胞相比显著降低HPR和HPR+沙芬戈的细胞毒性(在≥6μM HPR时，用student’st检验得到P＜.005)。在研究HPR+沙芬戈组合所用浓度范围内(0-4μM)，沙芬戈没有显著的细胞毒性的降低。这证实HPR细胞毒性部分依赖于具有细胞毒性的神经酰胺的产生。进一步证明HPR+沙芬戈药物组合(本发明的一部分)的活性也至少部分依赖于具有细胞毒性的神经酰胺的产生和其毒性的增强。
例13
HPR和HPR+沙芬戈通过细胞凋亡和坏死的组合导致细胞死亡；如果细胞凋亡受到抑制，HPR和HPR+沙芬戈可以通过坏死导致细胞死亡
通常认为在细胞发生生化损害后，有两种主要的机制导致细胞死亡：细胞凋亡和坏死(G.Nunez G.等 致癌基因 17：3237-45(1998)；G.Cohen，生物化学杂志326：1-16(1997)；Y.Hannun，血液89：1845-53(1997)；N.Thornberry，化学与生物学5：R97-103(1998)；N.Zamzami等，Bioenerg Biomembr.，29：185-193(1997)；D.McConkey，毒物学快报，99：157-98(1998)；M.Raffray和G.Cohen，药理治疗学.75：153-77(1997)；J.Lemasters，美国生理学杂志276：G1-6(1999))。细胞凋亡包括一系列完全独特、完全相继的酶活化步骤(caspase酶级联)，通常导致特殊类型的DNA降解(核小体间的DNA序列梯)和细胞死亡。细胞凋亡在形态学上的特征是将核染色体和细胞核片段压缩成细胞中的细胞凋亡体而不丧失膜的完整性，及通过流式细胞术测得的亚G0/G1期DNA内含物的增加。坏死是一种生物化学上不甚明确的情况，其特征是细胞膜完整性的大范围破坏，并涉及细胞内ATP水平的降低(C.Renvoize等，细胞生物毒物学14：111-20(1998))。坏死的形态学上的特征是细胞膜完整性的丧失(通过碘化丙锭(propidiuM iodide)染色证实)以及细胞变圆和细胞分离。这两个过程在其生化机制中可以部分重叠，但一般认为是分开的或至少在机制的进行中有不同的终点。如下所示，HPR和HPR+沙芬戈均通过细胞凋亡和坏死的结合引起细胞死亡。这些观察是有意义的，因为具有受损的细胞凋亡机制的肿瘤细胞可以通过坏死而将其杀死。因此，此处所述的药物组合比其他主要依赖于一个完整的细胞凋亡机制或依赖于增强细胞凋亡的抗瘤杀死方法具有显著的优势。
方法：为测定在神经母细胞瘤细胞中4-HPR或HPR+沙芬戈导致细胞死亡的方式，评定了在有或无一种特定的细胞凋亡抑制剂、神经细胞渗透剂、pan-caspase酶抑制剂、BOC-d-fmk的情况下，在CHLA-90细胞中细胞凋亡和/或坏死的形态学迹象(酶系统产品，Livermore，CA)。BOC-d-fmk通过介导细胞凋亡的caspase酶特定地抑制并阻止死亡。CHLA-90细胞以一个重复置于Lab Tek载玻片的小室中(Nunc，Naperville，IL)，吸附24小时，然后在有或无BOC-d-fmk(40μM)的情况下处理1小时，再用HPR(10μM)处理。用0.1％乙醇(4-HPR)和/或0.2％DMSO(BOC-d-fmk)载体溶剂处理对照细胞。用体外活体的DNA着色剂Hoechst 33342(10ug/ml在37℃进行30分钟)在+24或+48小时的未分离的细胞中产生蓝核荧光，对此进行目测，观察细胞凋亡的形态学特征(DNA凝聚和/或细胞凋亡体)，此时用碘化丙锭(propidiuM iodide)(0.5μM/ml)的红色荧光着色分辨出坏死的细胞和已产生的细胞凋亡细胞。有凝聚的核残余物的红色荧光着色细胞作为细胞凋亡细胞。为在+48小时测定细胞，在+24小时时加入另外的BOC-d-fmk(40μM)或适当的对照载体。在OlympusVanox表荧光显微镜上使用一系列适于各种染料的滤光片观察细胞。对多个随机的区域内(每个区域内的细胞数为100-500)的细胞计数并对活细胞、细胞凋亡细胞和坏死细胞照相。为进一步考察用HPR处理的细胞，测定CHLA-90细胞的细胞毒性，预先用或不用40μMBOC-d-fmk处理此细胞1小时，然后加入4-HPR(3-10μM)，并在+24小时用DIMSCAN测定法测定对生活力的caspase抑制效果。用载体溶剂0.1％乙醇(4-HPR)和/或0.2％DMSO(BOC-d-fmk)处理对照细胞。使用在低渗的裂解缓冲液(A.Krishan等，细胞生物学杂志66：188-193(1975))中的碘化丙锭用流式细胞术评估细胞凋亡(Z.Darnzynkiewicz等，血细胞计数13：795-808(1992))，用亚G0/G1期DNA含量标示细胞。如上处理细胞并在+24小时测定。用有488nm氩激光和定位在610nm的20nm谱带滤过器的Coulter Epics ELITE流式细胞仪分析着色的核。误差范围(error bars)为95％置信限。用未配对的、双边(two-sided)Student’st-检验法进行统计学分析。全部P值均为双边的。
结果：如图16所示，pan-caspase酶、细胞凋亡抑制剂、BOC-d-fmk(40μM)能显著降低所有浓度的HPR的细胞毒性(P＜0.01)，但在BOC-d-fmk存在时，HPR还导致显著的细胞毒性(在3μM HPR，P＝0.02，在＞3μM HPR，P＜0.01)。这些结果显示HPR通过细胞凋亡和非细胞凋亡(坏死)两种机制杀死细胞。
图17在暴露于HPR之前用BOC-d-fmk预处理CHLA-90细胞显著降低(P＝0.001)其标示细胞凋亡的核的形态学变化(进入未丧失膜的活性的细胞凋亡体内的凝聚的、强着色的核染色体和核片段)。然而，HPR引起的(由碘化丙锭着色和细胞周期证实的膜的完整性的丧失)坏死的显著的形态学的迹象(P＝0.002)受BOC-d-fmk的微弱影响，但与对照物相比仍显著(P＝.016).HPR单独导致显著的细胞凋亡(P＝.006)，在用HPR+BOC-d-fmk处理的细胞中的细胞凋亡与对照物没有显著的差异(P＝.48)。这些结果提示HPR导致的细胞死亡是由混合的细胞凋亡和坏死引起的，即使细胞凋亡引起的死亡受到抑制，此过程可由坏死机制进行。
图18在+24小时，BOC-d-fmk(40μM)排除流式细胞术测得的HPR(10μM)在CHLA-90中引起的亚G0/G1期DNA片段化，它是细胞凋亡的特征。由于大部分的CHLA-90细胞在+24小时已死亡或濒临死亡，此数据提供了HPR可以通过非细胞凋亡(坏死)机制杀死细胞的证据。
最近也报道在淋巴母细胞瘤样(lymphoblastoid)细胞系内(L.Spreinger和B.Stewart，癌症快报128：189-196(1998))和胚胎癌细胞系中(J.Clifford等，癌症研究59：14-18(1999))由HPR(10-20μM)导致的细胞死亡由坏死引发。
图19在暴露于HPR或HPR+沙芬戈(10∶3微摩尔比例)之前用BOC-d-fmk预处理CHLA-90细胞，降低在+48小时表示细胞凋亡的核的形态学变化。然而，在48小时由HPR+沙芬戈药物组合引起的坏死的显著的形态学的迹象受BOC-d-fmk的微弱影响，但与对照物相比仍显著(P＜.001)。这些结果提示药物组合物HPR+沙芬戈(本发明的一个实施方案)可以导致由混合的细胞凋亡和坏死引起的细胞死亡，即使细胞凋亡引起的细胞死亡受到抑制，此过程可由坏死机制引发。
例14
在多数的肿瘤细胞系内沙芬戈协同4-HPR的细胞毒性
如上所述，我们已通过抑制多种与神经酰胺相关的途径成功地增进了4-HPR的细胞毒性。多数抑制剂仅在体外进行了研究。然而沙芬戈，一种具有对抗神经酰胺活化的PKC-ζ的活性的PKC抑制剂，近期收到部分I期评价(G.Schwartz等，临床肿瘤研究3，537-543(1997))。此试验由于缺少药物过早地终止。然而，I期结果显示沙芬戈在120mg/m2浓度下温育1小时，在温育中达到3μM血清水平，而没有报道的毒性。因此，从这些结果和动物模型数据，我们对4-HPR+沙芬戈的细胞毒性进行研究，HPR：沙芬戈为固定的3∶1摩尔比，其浓度为预期会在人体中达到的浓度(G.Kell off等，细胞生物化学杂志，增刊(suppl.)20，176-196(1994))。首先在包括许多高度抗烷基化剂(alkylator-resistant)细胞系的神经母细胞瘤细胞的代表模型中测试4-HPR+沙芬戈的活性。然后在由其他肿瘤类型衍生的细胞系中测试4-HPR+沙芬戈的活性。结果归纳于表I，它也显示由用于计算药物协同作用的Chou分析法计算得出的联合指数(CI)(CI是描述两种药物联合的药理学效果的术语。CI＜1表示协同效果，具有小数量的增加的协同；CI＝1表示增加的效果；CI＞1表示药物的联合是拮抗的)。值得注意的是在p53零位(null)或突变体细胞系中，和在高度抗烷基化试剂的细胞系中达到了多-log细胞毒性。我们的结果证实沙芬戈显著促进并甚而协同4-HPR的对抗具有多种p53-非依赖方式的肿瘤类型的肿瘤细胞系的细胞毒性。
表I
对于0-12μM的HPR，HPR+沙芬戈(3∶1)的联合指数
    细胞类型     联合指数Index(Cl)ED99     细胞杀死的对数HPR(3∶1)
    9μM     12μM
    神经母细胞瘤SK-N-RASMS-LHN Pd-INDCHLA-90 Pd-BMTCHLA-171CHLA-79 Pd-BMT ＜0.1＜0.1＜0.1＜0.1＜0.1 1.93.53.12.93.5 3444
    肺
    NCl-H146 SCLC ＞c-mycNCl-H157鳞状的NCl-H1792A549          p53wt     ＜0.1＜0.1＜0.10.2     3.22.92.11     4442
    黑素瘤
    A375 p53wtA2058     ＜0.10.2     2.60.9     42.7
    前列腺
    LNCaP.FGC  p53wtPC-3 p53null     ＜0.11.0     2.81.4     41.9
    结肠
    LoVo p53wtHT-29 p53mut     0.10.3     0.51.3     1.82.4
    乳腺
    MCF7 p53wtDox RMCF7MDA-MB-231 p53mut     0.50.10.3     1.10.90.9     1.51.53
    胰腺
    PANC-1上皮的p53mutHs766T     0.21.7     0.32.9     1.72.5
联合指数(Cl)              说明
＜0.1               非常强的协同
0.1-0.3             强的协同
0.3-0.7             协同
0.7-0.85            中等的协同
0.85-0.9            轻微的协同
0.9-1.10            接近于累积
1.1-1.20            轻微的拮抗
上述是对本发明的说明，但不局限于此。用以下权利要求书对本申请进行限定，此处包括权利要求书的等同物。

Claims (27)

1.一种产生神经酰胺的全反式视黄酰胺或其药学上可接受的盐和一种神经酰胺降解抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗过度增殖疾病的药物中的用途，其中所述产生神经酰胺的全反式视黄酰胺由视黄酸衍生物组成，并且其中所述过度增殖疾病是一种肿瘤，选自神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌；
其中所述视黄酸衍生物的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，所述神经酰胺降解抑制剂的量为有效地将肿瘤细胞中产生的坏死、细胞凋亡或二者增加到大于预期由视黄酸衍生物和神经酰胺降解抑制剂分别产生的作用之和；
其中所述的神经酰胺降解抑制剂选自：葡糖基神经酰胺合酶抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，蛋白激酶C抑制剂，和其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的过度增殖疾病包括恶性、癌前和非恶性的过度增殖疾病。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的神经酰胺降解抑制剂是葡糖基神经酰胺合成抑制剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺是芬维A胺或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述的葡糖基神经酰胺合成抑制剂是葡糖基神经酰胺合酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述的葡糖基神经酰胺合成抑制剂是1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述的神经酰胺降解抑制剂是鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺是芬维A胺或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂是鞘氨醇激酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂是D-赤-N，N-二甲基鞘氨醇或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述的神经酰胺降解抑制剂是蛋白激酶C抑制剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺是芬维A胺或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述的蛋白激酶C抑制剂是L-苏-二氢鞘氨醇或其药学上可接受的盐。
14.根据权利要求1所述的用途，其是包括：
(a)产生神经酰胺的全反式视黄酰胺或其药学上可接受的盐；和
(b)选自以下的至少两种化合物(i)葡糖基神经酰胺合成抑制剂及其药学上可接受的盐，(ii)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂及其药学上可接受的盐，和(iii)蛋白激酶C抑制剂及其药学上可接受的盐，
的混合物在制备用于治疗过度增殖疾病的药物中的用途，其中所述全反式视黄酰胺由视黄酸衍生物组成，并且其中所述过度增殖疾病选自神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌；
其中所述视黄酸衍生物的量为在肿瘤细胞中有效地产生坏死、细胞凋亡或二者的量，所述至少两种化合物的量为有效地将肿瘤细胞中产生的坏死、细胞凋亡或二者增加到大于预期由所述至少两种化合物和视黄酸衍生物分别产生的作用之和；
其中所述的神经酰胺降解抑制剂选自：葡糖基神经酰胺合酶抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，蛋白激酶C抑制剂，和其药学上可接受的盐。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺是芬维A胺或其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述的至少两种化合物包括葡糖基神经酰胺合成抑制剂或其药学上可接受的盐，和鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂或其药学上可接受的盐。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述的至少两种化合物包括葡糖基神经酰胺合成抑制剂或其药学上可接受的盐，和蛋白激酶C抑制剂或其药学上可接受的盐。
18.根据权利要求14所述的用途，其中所述的至少两种化合物包括鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂或其药学上可接受的盐，和蛋白激酶C抑制剂或其药学上可接受的盐。
19.一种筛选增加产生神经酰胺的全反式视黄酰胺对包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织的细胞毒性的化合物的方法，包括：
(a)将第一对照包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织与一定量的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺接触；
(b)将第二对照包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织与一定量的测试化合物接触，其中所述的测试化合物是神经酰胺降解抑制剂或其药学上可接受的盐；并
(c)将实验包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织与步骤(a)所述数量的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺和步骤(b)所述数量的测试化合物接触；并
(d)测定以上步骤(a)、(b)、(c)的包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织的生长抑制，然后
(e)将对步骤(c)中实验包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织的生长抑制与对步骤(a)和(b)中的包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织的生长抑制进行比较，在步骤(c)的实验包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织中，测得比步骤(b)和(c)的对照包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织的联合生长抑制更大程度的抑制作用，表示测试化合物促进了产生神经酰胺的全反式视黄酰胺的活性；
其中所述的神经酰胺降解抑制剂选自：葡糖基神经酰胺合酶抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，蛋白激酶C抑制剂，和其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的比较步骤通过计算联合指数进行。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述的过度增殖细胞是肿瘤细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的肿瘤细胞选自神经母细胞瘤、黑素瘤、前列腺、结肠、乳腺、白血病、胰腺和肺的肿瘤细胞。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺是芬维A胺或其药学上可接受的盐。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述的测定生长抑制的步骤通过测定坏死、细胞凋亡或二者进行。
25.根据权利要求1所述的用途，其是包括：
(a)产生神经酰胺的全反式视黄酰胺或其药学上可接受的盐；和
(b)一种由权利要求19的方法产生的化合物或其药学上可接受的盐，该化合物增加产生神经酰胺的全反式视黄酰胺在过度增殖细胞中的细胞抑制或细胞毒活性，
的混合物在制备用于治疗过度增殖疾病的药物中的用途，其中所述过度增殖疾病选自神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌，其中所述的神经酰胺降解抑制剂选自：葡糖基神经酰胺合酶抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，蛋白激酶C抑制剂，和其药学上可接受的盐。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述的过度增殖疾病包括恶性、癌前和非恶性的过度增殖疾病。
27.一种药物制剂，含有在一种药学可接受的载体中的、治疗有效量的由权利要求19的方法产生的化合物或其药学上可接受的盐，该化合物增加产生神经酰胺的全反式视黄酰胺在包括癌前和非恶性条件的肿瘤、癌和瘤组织中的细胞抑制或细胞毒活性，其进一步含有治疗有效量的产生神经酰胺的全反式视黄酰胺或其药学上可接受的盐，其中所述的神经酰胺降解抑制剂选自：葡糖基神经酰胺合酶抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制剂，蛋白激酶C抑制剂，和其药学上可接受的盐。
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