CN102006866B - 激酶蛋白结合抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及磷酸化抑制剂化合物及其鉴别和使用方法。本发明还涉及治疗细胞增殖病症特别是癌症的药物组合物及方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年2月18日提交的美国临时专利申请No.61/066,192以及于2008年3月11日提交的美国临时专利申请No.61/068,903的优先权,这两篇专利的全部内容引入本文作为参考。
对在联邦政府资助下完成的发明的权利声明
本工作的一部分得到了美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)/NCI Grant的支持,资助号2-R01-CA65910-09-13。政府对本发明享有一定的权利。
发明背景
粘着斑激酶(FAK)是一种重要的生存分子(survival molecule),其在种类繁多的实体瘤中被上调而在正常组织中表达水平非常低,这产生了治疗窗(therapeutic window)并且使该蛋白质成为引起高度关注的治疗癌症的靶。参见例如WO 2005/049852,该专利内容引入本文作为参考。
市场广泛需要新的针对乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和甲状腺癌的药物治疗。根据美国癌症协会(American Cancer Society)的报道,估计今年仅在美国将会诊断出425000例这些癌症的新病例。癌症的药物治疗是一些制药公司现有的主要产品系列,靶向FAK药物的开发自然会是对这些现有产品的补充。
在许多类型的癌症中,FAK相对于其他激酶靶而言是过表达的。靶向FAK的化合物可以用作治疗包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌和黑素瘤的许多类型的癌症的药物。
一些研究小组正在探索以靶向FAK作为潜在的癌症治疗方法。靶向FAK通常关注于FAK的激酶结构域。该方法已被证明是不成功的,这是因为对激酶结构域的干扰不会特异性地干扰FAK下游的信号传导,并且其他相关的酪氨酸激酶已经受到了药物的影响。本文所说明的是一种关注于FAK磷酸化的新方法。
FAK是一种125kDa的蛋白质,其定位于粘着斑(1)且响应于整联蛋白簇集而得到的激活以及酪氨酸磷酸化(2)。酪氨酸397是FAK的自磷酸化位点且是下游信号传导的重要成分(3),并提供与Src家族激酶的SH2结构域的高亲和结合位点(4)、(5)。Y397-激活的FAK和Src之间的相互作用导致在FAK的多个位点(-576、-577、-925)上的酪氨酸磷酸化的级联,与其它的信号传导分子例如p130CAS和桩蛋白一样,结果导致细胞骨架的变化以及激活其它下游信号传导途径(6)。Y397也是结合PI3激酶、生长因子受体结合Grb-7、Shc和其它蛋白质的位点。因此,Y397位点是激活细胞中的FAK信号传导的主要磷酸化位点中的一个。
粘着斑激酶与多种细胞功能有关,例如细胞增殖、存活、活动能力、侵袭、转移以及血管发生(7)。通过FAK反义寡核苷酸(8),显性失活(dominat-negative)FAK的C端结构域、FAK-CD或FRNK(9、10)或FAK siRNA(11)、(12)的不同手段来抑制FAK的方法引起细胞存活力的减少、生长抑制或细胞凋亡。近来,FAK已被提议为癌症的新的潜在治疗靶(13,14)。近来开发和报道了阻碍(block)FAK催化活性的两种新型FAK激酶抑制剂,其一为Novartis公司的NVP-TAE226(15)(16)以及另一为Pfizer公司的PF-573,228(17)。第一种抑制剂,TAE226,体内抑制神经胶质瘤和卵巢肿瘤生长(16,18),虽然该抑制剂也抑制IGFR激酶(16)。未有关于PF-573,228在体内对肿瘤生长的功效的报道,其在体外仅抑制活动能力而不能抑制细胞生长和存活(17)。这些抑制剂都有效地阻断了Y397-FAK的磷酸化。
由于Y397位点对于FAK存活功能是重要的,我们实现了计算机模拟方法(如(19)所述),来特异性地靶向FAK的Y397位点并寻找抑制FAK功能和减小细胞存活力和肿瘤生长的潜在的小分子药物。
我们发现了一些化合物,包括1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐,称作Y15,靶向Y397位点,在体外直接地且特异性地减少FAK的Y397磷酸化、体外抑制癌细胞存活力、引起脱附、减少细胞粘着和体内阻断肿瘤的生长。因此,靶向Y397位点可以是用来开发未来新FAK抑制剂的有效治疗方法。
发明概述
在一方面,本发明提供了治疗患有或易于患有细胞增殖病症(cellproliferative disorder)的受试者的方法,该方法包括给予需要该方法治疗的受试者以治疗有效量的能够调节FAK蛋白-蛋白结合相互作用的化合物。在一个实施方案中,该化合物能与影响FAK结合的结合口袋(binding pocket)结合或相互作用从而。在另一个实施方案中,该化合物能与影响FAK的磷酸化的结合口袋结合或相互作用。
在一个实施方案中,该化合物能抑制FAK的Y397磷酸化。在另一个实施方案中,该化合物被鉴定为能抑制FAK的Y397磷酸化。
在一方面,本发明提供了治疗患有或易于患有细胞增殖病症的受试者的方法。该方法包括给予需要该方法治疗的受试者以治疗有效量的FAK磷酸化抑制剂化合物。
在另一方面,本发明提供了治疗患有或易于患有细胞增殖病症的受试者的方法。该方法包括给予需要该方法治疗的受试者以治疗有效量的能够抑制FAK的Y397的化合物。
在另一个实施方案中,本发明提供了治疗患有或易于患有细胞增殖病症的受试者的方法。该方法包括给予需要该方法治疗的受试者以治疗有效量的FAK磷酸化抑制剂化合物或FAKY397磷酸化抑制剂化合物。
在另一方面,本发明提供了治疗患有或易于患有细胞增殖病症,包括癌症的受试者的方法。该方法包括给予需要该方法治疗的受试者以治疗有效量的可以结合FAK的Y397结构域的化合物。
在另一方面,本发明提供了治疗患有或易于患有癌症的受试者的方法,其包括给予该受试者以有效量的能够干扰FAK结合(包括与FAK结合配偶体(FAK-binding partner)的结合)的化合物,由此治疗受试者。
在另一方面,本发明提供了治疗患有或易于患有癌症的受试者的方法,该方法包括给予该受试者以有效量的能够结合FAK的Y397结构域的化合物,由此治疗受试者。
在另一方面,所述化合物对FAK自磷酸化的抑制效力是其对其它的激酶的抑制效力(例如结合)至少两倍大(例如,“X”倍大,其中X是2~1000(包括端值)之间的一个数);其中,所包括的其它激酶是IGFR-1、MAPK、或AKT;或c-RAF、c-Src、EGFR、VEGFR-3、IGF-1、Met、PDGFR-α、Pyk2、P13K(p110δ/p85α)等。
在另一方面,本发明提供抑制细胞粘着的方法,其包括在此经鉴定的化合物与细胞进行接触从而抑制细胞粘着。在另一个方面,本发明提供抑制受试者中细胞粘着的方法,其包括给予该受试者以有效量的能够结合(或被鉴定为能够结合)FAK的Y397结构域的化合物。
在另一方面,本发明提供了用于鉴定调节FAK蛋白-蛋白结合相互作用的化合物的方法,该方法包括获得FAK蛋白的晶体结构或获得FAK蛋白的晶体结构的相关信息,及对测试化合物在FAK蛋白质结构中或在FAK蛋白质结构上进行模拟从而确定该化合物是否可以调节FAK蛋白-蛋白结合相互作用或调节FAK的磷酸化(例如在Y397上)。在某些实施方案中,模拟(modeling)步骤包括模拟或确定化合物结合或配合结合口袋的能力,该结合口袋由FAK的Y397结构域的结构坐标(structure coordinates)所定义。
本发明的另一方面是鉴定抑制细胞增殖化合物的方法。此方法包括使FAK复合物(complex)与测试化合物进行接触,并评价测试化合物调节(例如抑制)FAK的磷酸化(例如在Y397上)、抑制细胞增殖、诱导凋亡、或调节FAK与FAK蛋白结合配偶体结合的能力。
本发明的另一方面是鉴定调节FAK活性的化合物的方法,该方法包括使用FAK的Y397结构域的原子坐标(atomic coordinates)来生成包含结合口袋的分子的三维结构(例如利用计算机(in silico)),并且使用此三维结构来鉴定调节FAK的Y397结构域的活性(例如,磷酸化)的化合物或鉴定调节FAK与FAK蛋白结合配偶体结合的化合物。
在另一方面,本发明提供了成套的组合物(packaged composition),其包含治疗有效量的FAK磷酸化抑制剂或FAK蛋白-蛋白结合相互作用抑制剂化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。可配制该组合物用于治疗患有或易患有细胞增殖病症的受试者,并且与说明书一起包装以治疗患有或易患有细胞增殖病症的受试者。
在一方面,本发明提供了用于治疗受试者中细胞增殖病症的试剂盒(kit),其中包含本文的化合物及其药学上可接受的酯、盐、前体药物和使用说明书。在另一个方面,本发明提供试剂盒,该试剂盒用于抑制细胞增殖、评估受试者抗细胞增殖治疗的效果、监测正通过细胞增殖抑制剂治疗的受试者的病情进展、选择患有细胞增殖病症的受试者通过细胞增殖抑制剂来进行治疗和/或治疗患有或易患癌症的受试者。在某些实施方案中,本发明提供了用于治疗受试者中细胞增殖病症的试剂盒,其包含能够调节(例如抑制)FAK活性(例如磷酸化)或FAK蛋白-蛋白结合相互作用的化合物。
在另一方面,本发明涉及FAK的Y397结构域或FAK蛋白质结合配偶体(各自单独的或它们的组合)的三维结构。
因此,本发明提供了分子或分子复合物(molecular complex),其包含这些结合口袋中的一方或双方,或包含任一结合口袋的具有相似三维形状的同源物。
本发明也提供了本文所述化合物的药物组合物,其包含能够抑制FAK的Y397磷酸化或调节FAK与FAK蛋白结合配偶体的结合的化合物,或其药学上可接受的酯、盐或前体药物,以及药学上可接受的载体。
在另一方面,本发明提供了可机读存储介质,其包含定义FAK的Y397结构域的结合口袋的结构坐标,或包含同源结合口袋的结构坐标。
在另一方面,本发明提供了一种用于产生分子或分子复合物三维图示的计算机,其中所述分子或分子复合物包含由FAK的Y397结构域的结构坐标定义的结合口袋;或b)所述分子或分子复合物的同源物的三维图示,其中所述同源物包含结合口袋,该结合口袋自所述氨基酸的骨架原子的均方根偏差为约2.0埃以下。这种计算机包括:(i)可机读数据存储介质,其包含以可机读数据编码的数据存储材料,其中所述数据包含FAK的Y397结构域的结构坐标;(ii)用于存储指令以处理所述可机读数据的工作存储器;(iii)与所述工作存储器和所述可机读数据存储介质耦联的中央处理器,其用于将所述可机读数据处理成所述三维图示;及(iv)与所述中央处理器耦联的显示器,其用于显示所述三维图示。
本发明也提供了设计、评价和鉴定与上述结合口袋结合的化合物的方法。本发明其他实施方案将在下文中说明。
附图说明
将参照下列非限制性实例与附图进一步说明本发明,其中:
图1.图1A、B通过基于结构的分子对接方式来说明对FAK的Y397位点的靶向作用。
图2.图2A、B示出靶向Y397位点的化合物对乳腺癌和黑素瘤细胞系存活力的作用。
图3.图3示出1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)化合物的结构。
图4.图4A、B、C、D示出Y15以剂量依赖性方式对细胞存活力的抑制和对Y397的FAK磷酸化的降低。图4E示出Y15以时间依赖性方式对FAK自磷酸化的抑制。
图5.图5示出Y15直接阻断体外FAK的激酶活性。
图6.图6A示出Y15引起的BT474细胞的剂量依赖性细胞脱附。图6B示出Y15不会引起BT474细胞显著的细胞凋亡。图6C示出经Y15处理的BT474细胞的Hoechst染色。图6D示出Y15以剂量依赖性方式对细胞粘着的阻断。
图7.图7A、B示出Y15在体内对肿瘤生长的作用。图7C、D示出显示出Y15降低肿瘤中的Y397-FAK磷酸化的结果。
图8.图8A、B、C示出Y15对胰腺癌细胞系(cell line)和FAK野生型和缺失型(null)成纤维细胞(fibroblast)的存活力的影响。
图9.图9A、B示出Y15对FAK和ERK磷酸化的影响。
图10.图10示出Y15对胰腺癌细胞和肿瘤关联的成纤维细胞的细胞存活力的影响。
图11.图11A、B示出与吉西他滨(Gemcitabine)组合的Y15的体外和体内的效力。
发明详述
本发明的发明人已经发现了一种治疗策略,该策略通过靶向FAK Y397磷酸化而实现对FAK磷酸化的抑制。这种相互作用与调节细胞凋亡和增殖有关,特别是在FAK机理起重要作用的某些癌症类型中。
本发明(至少部分地)涉及发现FAK Y397磷酸化介导的过程可以用作肿瘤治疗的靶(例如选择性的)。在体外干扰这些相互作用会引起癌的存活力降低和凋亡,但是不会引起正常细胞的存活力的降低和凋亡。
1.定义
在进一步说明本发明之前,首先定义和汇总一些术语以方便更容易地理解本发明。
术语“给药”或“给予”包括将本发明化合物引入受试者以实现这些化合物的预定功能的各种途径。可以使用的给药途径的实例包括注射(皮下注射、静脉注射、肠胃外注射、腹膜内注射、鞘内注射)、口服、吸入、直肠和经皮。给予药物制剂可以通过对于每种给药途径适合的形式。例如,这些制剂可以以片剂或胶囊、注射剂、吸入剂、洗眼剂、软膏剂、栓剂等形式通过注射、输注或吸入给药;通过洗剂或软膏剂局部给药;及通过栓剂直肠给药。优选的是口服给药。注射可以是推注或连续式输注。根据给药的途径,可以用选定的材料对本发明化合物进行包衣或将本发明化合物设置在选定的材料中,从而保护其不受自然条件的影响,这些自然条件对化合物实现其预定的功能有不利的影响。本发明化合物可单独给药,或与上述另一种试剂和/或药学上可接受的载体共同给药。可以在其他试剂给药之前、同时或之后给药本发明的化合物。另外,本发明化合物也可以以前体药物的形式给药,所述前体药物形式在体内转化成其活性代谢物或更具有活性的代谢物。
术语“烷基”是指饱和脂肪族基团,包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族基团)、烷基取代的环烷基以及环烷基取代的烷基。术语烷基还包括另外含有氧、氮、硫或磷原子的烷基基团,这些原子代替烃骨架中的一个或多个碳,例如氧、氮、硫或磷原子。在优选的实施方案中,直链烷基或支链烷基的骨架具有30个或更少的碳原子(例如直链烷基为C1-C30,支链烷基为C3-C30),优选是26个或更少的碳原子,更优选是20个或更少的碳原子,还更优选的是4个或更少的碳原子。相似地,优选的环烷基的环结构具有3-10个碳原子,更优选地具有3、4、5、6或7个碳原子。
另外,贯穿说明书及文句的术语烷基还包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”,后者涉及这样一种烷基:其中取代基取代了烃骨架的一个或多个碳原子上的氢。这样的取代基可包括,例如:卤素、羟基、烷基羰基氧、芳基羰基氧、烷氧基羰基氧、芳氧基羰基氧、羧酸酯基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基(phosphonato)、次膦酸酯基(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯、磺酸酯基(sulfonato)、氨基磺酰基、氨磺酰基(sulfoamido)、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族基团或杂芳香族基团。本领域技术人员应该理解的是:若合适的话,在烃链上取代的基团自身也可以被取代。环烷基可进一步被取代,例如以上述取代基取代。“烷基芳基”基团是被芳基(例如苯甲基(苄基))取代的烷基。术语“烷基”也包括不饱和的脂肪族基团,其在长度和可能的取代方式上与上述烷基相似,但是分别含有至少一个双键或三键。
除非对碳原子数另作说明,本文所使用的“低级烷基”是指上述的烷基基团,但是其直链或支链的骨架结构上具有1至10个碳,更优选具有1至6个碳,再优选地具有1至4个碳原子。低级烷基的实例包括:甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、己基、庚基、辛基等等。在优选的实施方案中,术语“低级烷基”包括其骨架上具有4个或更少的碳原子的直链烷基,例如C1-C4烷基。
如上所述,术语“烷氧基烷基”、“多氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”均涉及上述的烷基,其还包含氧、氮或硫原子,这些原子代替了烃骨架的一个或多个碳,例如氧、氮或硫原子。
术语“烯基”和“炔基”是指不饱和的脂肪族基团,其在长度和可能的取代方式上与上述烷基相似,但是分别含有至少一个双键或三键。例如,本发明涉及氰基和炔丙基。
本文所使用的术语“芳基”是指芳香基团,其包括可包含0至4个杂原子的五元和六元环单环芳香基,例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、苯并唑、苯并噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等等。芳香基团也包括多环稠合芳香基团,例如萘基、喹啉基、吲哚基等等。这些在环结构中具有杂原子的芳香基团也可被称为“芳杂环基”、“杂芳基”或“杂芳族基团”。可以在一个或多个环位置上以上述取代基取代芳香环,所述取代基例如卤素、羟基、烷氧基、烷基羰基氧、芳基羰基氧、烷氧基羰基氧、芳氧基羰基氧、羧酸酯基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯、磺酸酯基、氨磺酰基、氨磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族基团或杂芳香族基团。芳基还可与非芳香性的脂环或杂环稠合或桥连以形成多环结构(例如四氢萘)。
术语“结合(associating with)”是指化学个体(chemical entity)或化合物或其一部分与蛋白质上的结合口袋或结合位点之间接近的状态。此结合可以是非共价的(其中氢键或范德华力或静电相互作用在能量上促成所述并列(juxtaposition))或共价的。
本文所使用的术语“结合口袋”是指分子或分子复合物的区域,该区域由于其形状而有利地与另一化学个体或化合物结合。
本发明化合物的“生物活性”包括由本发明化合物在应答细胞(responsivecell)中引起的所有活性。“生物活性”包括由这些化合物引起的基因组活性和非基因组活性。
“生物组合物”或“生物样品”是指包含或源自于细胞或生物高分子的组合物。含有细胞的组合物包括,例如:哺乳动物的血液、红细胞浓缩液、血小板浓缩液、白细胞浓缩液、血细胞蛋白质、血浆、富血小板血浆、血浆浓缩物、来自于任何血浆级分的沉淀、来自于任何血浆级分的上清液、血浆蛋白级分、纯化或部分纯化的血蛋白或其他组分、血清、精液、哺乳动物初乳、乳、唾液、胎盘提取物、冷沉淀物、冷上清液、细胞溶胞产物、哺乳动物细胞培养液或培养基、发酵产物、腹水(ascites fluid)、在血细胞中诱导的蛋白质、在细胞培养物中由正常细胞或转化细胞(例如通过重组DNA或单克隆抗体技术)产生的产物。生物组合物可以不含有细胞。在优选的实施方案中,合适的生物组合物或生物样品是红细胞悬浮液。在一些实施方案中,血细胞悬浮液包含哺乳动物血细胞。优选地,血细胞从人、非人类灵长类动物、狗、猫、马、牛、山羊、绵羊或猪获得。在优选的实施方案中,血细胞悬浮液包含红细胞和/或血小板和/或白细胞和/或骨髓细胞。
术语“手性”是指分子与其镜像分子不重合的性质,术语“非手性”是指分子与其镜像分子重合的性质。
术语“非对映异构体”是具有两个或更多个不对称中心的立体异构体,并且分子间彼此不互为镜像。
术语“有效量”包括为获得期望的结果(例如足以治疗细胞增殖性疾病)就剂量和必要的给药时间而言的有效的量。本发明化合物的有效量根据例如如下的因素而不同:疾病状态、受试者年龄和体重、及本发明化合物在受试者中引起期望的应答的能力。可以调节给药方案以提供最佳的治疗反应。有效量也是指本发明化合物的治疗有益效果胜于任何毒性反应或不良反应(例如副反应)的量。
本发明化合物的治疗有效量(如有效剂量)可以是从约0.001至30mg/kg体重,优选约0.01至25mg/kg体重,更优选为约0.1至20mg/kg体重,甚至更优选为约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg体重。本领域技术人员应该理解的是某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量,这些因素包括但不局限于疾病或病症的严重程度、在先的处理、受试者的健康状况和/或年龄及其他存在的疾病。另外,以治疗有效量的本发明化合物治疗受试者可包括单一治疗,或优选包括系列治疗。在一个实例中,每周1次持续约1至10周,优选2至8周,更优选约3至7周,再优选4、5或6周,在约0.1至20mg/kg体重的范围以本发明化合物治疗受试者。还应该理解的是可在具体的治疗期间增加或降低用于治疗的本发明化合物的有效剂量。
术语“对应异构体”是指化合物的镜像结构之间彼此不重合的两个立体异构体。两个对应异构体的等摩尔混合物称为“外消旋混合物”或“外消旋体”。本发明化合物可以含一个或多个非对称中心且因此显示为消旋体和外消旋混合物、单对应异构体、单个的非对映异构体和非对映异构体混合物。本发明清楚包括所有所述的这些化合物的异构形式。本发明化合物也可以以多重互变异构形式表现,例如,本发明清楚包括在此所述的化合物的所有互变异构形式。本发明清楚包括在此所述的化合物的所有所述的异构形式。本发明清楚包括在此所述的化合物的所有晶体形式。
术语“卤代烷基”包括被卤素单取代、二取代或多取代的上述烷基基团,例如氟代甲基和三氟甲基。
术语“卤素”是指-F、-Cl、-Br或-I。
术语“羟基”是指-OH。
本文使用的术语“杂原子”是指任何非碳或非氢的原子。优选的杂原子是氮、氧、硫和磷。
本领域技术人员认为术语“内环境稳定”是指在内部环境中静态或恒定条件的维持。
短语“改善的生物性质”是指本发明化合物固有的任何活性在体内效力的增强。在优选的实施方案中,该术语是指任何定性地或定量地改善本发明化合物的治疗性质,例如降低的毒性。
术语“细胞增殖性疾病”包括涉及不期望的或不可控制的细胞增殖的疾病。所述疾病的实例包括但不局限于肿瘤或癌症(例如肺癌(小细胞型和非小细胞型)、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌或结肠癌)、肉瘤或黑素瘤。
术语“FAK蛋白-蛋白结合配偶体”是指与FAK(例如全长、N-端、C-端、羧基端、激酶结构域、FERM结构域、FAT结构域)结合的蛋白质(包括在本文中所说明的那些)。
术语“任选取代的”包括未取代的基团或在一个或多个可取代的位置(通常是1、2、3、4或5个位置)上被非氢的、一个或多个合适的基团(可相同或不同)取代的基团。所述任选的取代基包括,例如:羟基、卤素、氰基、硝基、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C1-C8烷氧基、C2-C8烷基醚、C3-C8烷酮(alkanone)、C1-C8烷硫基、氨基、单或双(C1-C8烷基)氨基、卤代C1-C8烷基、卤代C1-C8烷氧基、C1-C8链烷酰基(alkanoyl)、C2-C8链烷酰氧基(alkanoyloxy)、C1-C8烷氧基羰基、-COOH、-CONH2、单或双(C1-C8烷基)氨基羰基、-SO2NH2和/或单或双(C1-C8烷基)亚磺酰氨基、及碳环基团和杂环基团。任选取代也可以以短语“以0至X个取代基取代”表示,其中X是可能的取代基的最大数。某些任选取代的基团以0至2、3或4个独立选定的取代基取代(即不取代或以多至所述最大数的基团取代)。
术语“异构体”或“立体异构体”是指化学组成相同但是原子或基团的空间排列不同的化合物。
术语“调节”是指:例如提高或降低在与本发明化合物接触并应答时的细胞增殖能力,例如提高或降低对至少一种动物细胞亚群的增殖的抑制,如此以获得期望的最终结果,例如治疗效果。
在“获得能够抑制FAK的Y397磷酸化的化合物”中的术语“获得”包括购买、合成或其他得到化合物的方式。
本文使用的短语“肠胃外给药”以及“非经肠胃地给药”是指除了经肠给药和局部给药之外的给药模式,通常使用注射方式给药,其包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射以及输注。
术语“多环基”或“多环基团”是指具有两个或多个环的基团(例如环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基),其中共用两个或多个碳原子形成两个桥连的环,例如所述环是“稠环”。通过非相邻的原子而连接的环被称为“桥”环。多环结构的每个环可以被上述取代基取代,例如卤素、羟基、烷基羰基氧、芳基羰基氧、烷氧基羰基氧、芳氧基羰基氧、羧酸酯基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯、磺酸酯基、氨磺酰基、氨磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基、烷基芳基或芳香族基团或杂芳香族基团。
术语“前体药物(“prodrug”或“pro-drug”)”包括具有可在体内代谢的基团的化合物。通常,前体药物通过酯酶或其他机理在体内代谢成活性药物。本领域已公知前体药物及其用途的实例(见例如Berge等人,(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。可以在最终分离和纯化化合物期间原位制备前体药物,或使纯化的化合物以其游离酸形式或羟基形式单独与合适的酯化试剂反应来制备前体药物。羟基可以以羧酸处理转换成酯。前体药物系列的实例包括取代和未取代的、支链或无支链的低级烷基酯基团(例如丙酸酯)、低级烯基酯、二低级烷基氨基-低级烷基酯(例如二甲基氨基乙基酯)、酰基氨基低级烷基酯(例如乙酰氧基甲基酯)、酰氧基低级烷基酯(例如新戊酰氧基甲基酯)、芳基酯(苯基酯)、芳基低级烷基酯(例如苄酯)、取代的(例如以甲基、卤素或甲氧基取代基取代的)芳基和芳基低级烷基酯、酰胺、低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺和羟基酰胺。优选的前体药物基团是丙酸酯和酰基酯。本发明也包括在体内通过其他机理转化成活性形式的前体药物。
化合物的“预防有效量”是指为了有效地预防或治疗细胞增殖病症,本文中任何给出公式的或以其它方式说明的本发明化合物以单剂量或多剂量给药至受试者的量。
“降低的毒性”包括本发明化合物在体内给药时引起的任何不期望的副作用的降低。
术语“硫氢基”或“巯基”是指-SH。
术语“受试者”包括可能患有细胞增殖病症或可以其他方式受益于给药本发明化合物的生物体,例如人类和非人类的动物。优选的人包括上述患有或易于患有细胞增殖病症或相关病症的人类患者。本发明术语“非人类的动物”包括所有的脊椎动物,例如哺乳动物(例如啮齿类动物,例如小鼠)和非哺乳动物,例如非人类灵长类动物,例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
术语“易于患有细胞增殖病症”意图包括具有形成细胞增殖病症(例如癌症)的风险的受试者,即患有癌病毒病毒感染的受试者、已暴露于电离辐射或致癌化合物的受试者、具有癌症家族史或病史的受试者,等。
本文使用的短语“全身给药”和“外周给药”是指给予本发明化合物(一种或多种)、药物或其他物质,从而使本发明化合物、药物或其他物质进入患者体内并因此发生代谢及其他相似的过程,例如皮下给药。
本发明化合物的“治疗有效量”是指以单剂量或多剂量形式给予患者时有效地抑制细胞增殖和/或抑制细胞增殖性疾病症状,或有效地将患有所述细胞增殖病症患者的生命存活力延长至超过不采取这种治疗的期望值的试剂的量。
对于手性中心的命名法,术语“D”和“L”构型根据IUPAC命名法(IUPACRecommendation)而定义。非对映异构体、外消旋体、差向异构体和对映异构体这些术语的将用来根据其常见含义描述制剂的立体化学。
2.本发明化合物
一方面,本发明提供了能够(直接或间接地)调节(例如抑制或刺激)FAK结合活性的化合物。
在一个实施方案中,本发明提供了能够调节FAK蛋白-蛋白结合的化合物;及其药学上可接受的酯、盐和前体药物。
某些优选的化合物包括下文具体说明的化合物:
抑制剂:
Y11:3,5,7-三氮杂-1-氮三环(3.3.1.13,7)癸烷,1-(2-羟乙基)-,溴化物;(1,3,5,7-triaza-1-azoniatricyclo(3.3.1.13,7)decane,1-(2-hydoxyethyl)-,bromide)
Y15:1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐;
Y30:9-硫杂-1,3,6,8-四氮杂三环[4.3.1.1(3,8)]十一烷,9,9-二氧化物(9-thia-1,3,6,8-tetraazatricyclo[4.3.1.1(3,8)]undecane,9,9-dioxide)。
本发明也涉及上述化合物的药学上可接受的盐和酯。
可以通过本领域已知的一些方法分离天然存在的或合成的异构体。分离两个对映异构体的外消旋混合物方法包括使用手性固定相的色谱法(参见例如“Chiral Liquid Chromatography”,W.J.Lough,Ed.Chapman and Hall,NewYork(1989))。也可使用传统的拆分技术分离对映异构体。例如,形成非对映异构体盐和分步结晶可用于分离对映异构体。对于羧酸的对映异构体的分离,可通过加入对映异构体纯的手性碱(例如马钱子碱、奎宁、麻黄碱、士的宁等)形成非对映异构体盐。或者,可通过与对映异构体纯的手性醇(例如甲醇)形成非对映异构体酯,然后通过分离非对映异构体酯和水解而获得游离的对映异构体浓缩的羧酸。为分离氨基化合物的旋光异构体,加入手性羧酸或磺酸(例如樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸)可形成非对映异构体盐。
根据另一实施方案,本发明提供了通过本文所述方法制备或鉴别的化合物,该化合物能抑制FAK的Y397磷酸化。
3.本发明化合物的用途
在一个实施方案中,本发明提供了治疗受试者的细胞增殖病症的方法,其通过给予受试者有效量的能够抑制FAK Y397磷酸化的化合物。细胞增殖病症包括癌症。在某些实施方案中,受试者是哺乳动物,例如灵长类动物,例如人。
在此实施方案中,本发明化合物可直接或间接地调节FAK的磷酸化活性,或其特定结构域的磷酸化活性。可使增殖失控的细胞与本发明化合物接触以抑制细胞增殖或诱导凋亡。使细胞接触本发明化合物或给予受试者本发明化合物是治疗患有或易于患有不希望的或不期望的细胞增殖或细胞增殖病症的细胞或受试者的一种方法。
在一个实施方案中,治疗患有或易于患有不希望的或不期望的细胞增殖或细胞增殖病症的方法,包括给予需要该方法治疗的受试者以治疗有效量的化合物,该化合物能抑制FAK或其结构域的磷酸化,从而治疗患有或易于患有不希望的或不期望的细胞增殖或细胞增殖病症的受试者。示例性的化合物包括本文所述的化合物。
因此,在一个实施方案中,本发明提供了用于治疗受试者的细胞增殖病症的方法,其通过给予受试者有效量的能抑制FAK Y397磷酸化的化合物。
在某些实施方案中,本发明方法包括给予受试者治疗有效量的本发明化合物和另一药学活性化合物。药学活性化合物的实例包括已知的用于治疗细胞增殖病症的化合物,例如抗癌剂、抗增殖剂、化疗剂。在Harrison′s Principlesof Internal Medicine(第十三版,T.R.Harrison等编,McGraw-Hill N.Y.,NY)和Physicians Desk Reference(第50版,1997,Oradell New Jersey,MedicalEconomics Co.)中可以找到其他可以使用的药学活性化合物,其中这两篇文献的全部内容引入本文作为参考。本发明化合物和药学活性化合物可以在同一药物组合物中或不同药物组合物中(同时或不同时地)给药至受试者。
在某些实施方案中,本发明化合物可以与常规的癌症化疗剂用于联合治疗。白血病和其他肿瘤的常规治疗方案包括放射、药物或其组合。除放射外,下列药物也常用于治疗急性白血病:长春新碱、泼尼松、甲氨蝶呤、巯嘌呤、环磷酰胺和阿糖胞苷,它们通常彼此组合使用。其他实例包括,例如多柔比星、顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、吉西他滨等,这些药物在与本发明所述的化合物组合时表现出优势(例如细胞的化学敏化)。在慢性白血病中,例如可组合使用白消安、美法仑、和苯丁酸氮芥。大多数的常规抗癌药物毒性极大,易于使病人在治疗期间感觉非常不适。强效治疗(Vigoroustherapy)基于这样的前提:除非杀死所有的癌细胞,否则残留的癌细胞将大量增加并导致复发。
本文中所述的方法包括其中鉴定受试者为需要特别规定的治疗方案的方法。鉴定受试者是否需要该治疗方案可以由受试者进行判断或由卫生保健专家进行判断以及可以是主观的(例如意见)或客观的(例如通过测试方法或诊断方法测定)。换言之,通过评估对于治疗方案的合适性的相关标记物或指示物从而预筛选或鉴定需要该治疗方案的受试者。
作为本领域技术人员的医生和兽医(“主治医师”)可以通过使用已知的技术和通过在相似的环境下进行观察所获得的结果而容易地确定本发明化合物的抗增殖治疗有效量或抗增殖预防有效量。取决于主治医师对病人需求的判断、正在治疗的病症的严重程度及正在使用的具体化合物,可以相应地改变剂量。在确定抗增殖治疗有效量或有效剂量和抗增殖预防有效量或有效剂量中,主治医师需考虑许多因素,包括但不局限于:相关的具体的细胞增殖病症;具体试剂的药效学性质及其给药模式和方案;期望的疗程;哺乳动物的种类;其大小、年龄及健康状况;相关的具体的疾病;疾病的程度、牵涉状况或严重性;个体患者的反应;具体给药的化合物;给药的模式;给予制剂的生物利用度性质;选择的剂量方案;同步治疗(concurrent treatment,即本发明化合物与其他一起给药的治疗剂的相互作用)的种类;及其他相关情况。
治疗可以从小于本发明化合物最佳治疗剂量的较小剂量开始。然后,以小增量逐渐加大剂量直至达到在该环境下的最佳治疗效果。为方便起见,若需要的话可将每日总剂量分份并在该日内按份给药。预期本发明化合物的抗增殖治疗有效量和预防有效量在约0.1毫克每千克体重每天(mg/kg/天)至约100mg/kg/天之间变化。
确定为有效预防或治疗动物(例如狗、鸡和啮齿类动物)细胞增殖病症的化合物也可用于治疗人类肿瘤。治疗人类肿瘤疾病领域的技术人员根据在动物研究中所获得的数据会知道该化合物用于人类的给药剂量和给药途径。一般来说,预期用于人类的给药剂量和给药途径与用于动物的相似。
鉴别那些需要预防性治疗细胞增殖病症的患者在本领域技术人员的能力和认知范围之内。鉴别具有形成(可通过所述方法治疗的)细胞增殖病症风险的病人的某些方法在医疗领域中是已知的,例如家族史,以及存在的与受试患者形成疾病状态有关的风险因素。临床领域技术人员可通过使用例如临床测试、身体检查和病历/家族史容易地鉴别这些候选患者。
评估受试者治疗效果的方法包括通过本领域已知的方法确定细胞增殖病症的预治疗程度(例如确定肿瘤大小或筛选肿瘤标记物,其中细胞增殖病症是癌症),然后根据本发明给予受试者治疗有效量的细胞增殖抑制剂(例如本文上述的那些)。在给予所述化合物之后的合适时间(例如1天、1周、2周、1个月、6个月)之后,再次确定细胞增殖病症的程度。对细胞增殖疾病的程度或侵害力的调节(例如降低)表明了治疗效果。可在治疗过程中周期性地确定细胞增殖病症的程度或侵害力。例如,可以每数小时、数天或数周检测细胞增殖性疾病的程度或侵害力以评价进一步的治疗效果。细胞增殖病症的程度或侵害力的降低表明了治疗是有效的。所述方法可用于筛选或选择可受益于以细胞增殖病症抑制剂治疗的患者。
如用于本文时,“从受试者获得生物样品”包括获得用于本文上述方法的样品。以上说明了生物样品。
本发明的再一方面在于鉴定可调节FAK或其特定结构域磷酸化的化合物的方法。该方法可包括在存在和/或不存在测试化合物时获得FAK或其特定结构域(任选是原始型态(apo form)或复合型态(complexed))的晶体结构,或获得FAK或其特定结构域(任选是原始型态或复合型态)的晶体结构的相关信息。然后可以通过计算机模拟使化合物在FAK或其特定结构域的结合位点的晶体结构之中或之上,从而预测FAK或其特定结构域与测试化合物之间的相互作用的稳定性。一旦鉴定出了潜在的调节化合物,则可使用体外检测、体内检测或细胞检测筛选化合物,例如本文鉴别的方法以及本领结构域已知的竞争测试。依此方式鉴定的化合物可用作治疗剂。
在另一方面,治疗有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂一起包装。可配制该组合物用于治疗患有或易于患有细胞增殖病症的受试者,并且与说明书一起包装以治疗患有或易于患有细胞增殖病症的患者。
在另一方面,本发明提供了抑制细胞增殖的方法。在一个实施方案中,本发明抑制细胞增殖(或细胞增殖病症)的方法包括将细胞与能调节FAK、FAK结合配偶体、或其特定的结构域的化合物接触。在任一实施方案中,该接触可在体外进行,例如将化合物加入细胞周围的液体(例如生长培养基,细胞生活或存在于其中)中。接触也可以是直接使化合物与细胞接触。供选地,接触可以在体内进行,例如将化合物通过受试者;例如给药后,取决于给药途径,化合物可经消化道或血流输送或直接应用于或给药至需要治疗的细胞。
在另一方面,抑制受试者中细胞增殖病症的方法包括给予治疗有效量的本发明化合物(即本文所述化合物)至受试者。给药可以是药学领域已知的任何给药途径。受试者可能患有细胞增殖病症,可能具有形成细胞增殖病症的风险,或在预期或不预期接触能增加对细胞增殖病症易感性的条件(例如暴露于致癌物或离子辐射下)之前可能需要预防治疗。
在一方面,监测以本发明化合物治疗的受试者病情进展的方法包括确定细胞增殖病症的预治疗状态(例如肿瘤的大小、生长速度或侵害力)、给予受试者治疗有效量的本发明化合物及在以该化合物初个治疗期之后确定细胞增殖病症的状态(例如肿瘤的大小、生长速度或侵害力),其中对状态的调节表明治疗的效果。
受试者可以具有患有细胞增殖病症的风险,可以表现出细胞增殖病症的症状,可以易于患有细胞增殖病症和/或已经被诊断为患有细胞增殖病症。
如果对状态的调控表明受试者对治疗可能具有有利的临床反应,则受试者可以以该化合物治疗。例如,可给予受试者治疗有效剂量的该化合物(一剂或多剂)。
在另一方面,评价测试化合物的方法包括使FAK或其特定结构域与测试化合物接触(复合),并评价接触后的结合相互作用,其中复合物稳定性相对于参照值的改变表明测试化合物对复合物稳定性的调节。
FAK或其特定结构域的复合物可以利用计算机模拟,或为细胞中的复合物、从细胞中分离、重组表达、从细胞或重组表达系统中纯化或分离,或从细胞或重组表达分离系统中部分纯化和分离的复合物。
本发明试剂盒包括用于治疗受试者细胞增殖病症的试剂盒。该试剂盒可包含本发明化合物(例如上述化合物)及其药学上可接受的酯、盐和前体药物以及使用说明书。使用说明书可包括剂量、递送方法、试剂盒的存储等信息。试剂盒也可包括试剂,例如测试化合物、缓冲液、培养基(例如细胞生长培养基)、细胞等。测试化合物也可包括已知的化合物或新开发的化合物,例如化合物的组合库。一种或多种本发明试剂盒可一起包装,例如根据本发明评价细胞增殖病症治疗效果的试剂盒可与监测正在接受细胞增殖病症治疗的受试者的病情进展的试剂盒一起包装。
本发明方法可在培养基中的细胞上实施,例如体外或回体,或者在受试动物中的细胞上实施,例如体内。本发明化合物可使用增殖细胞的原代培养物在体外初步测试,所述增殖细胞为例如转化的细胞、肿瘤细胞系等。
本发明方法可在培养物中的细胞上实施,例如体外或回体,或者在受试动物中的细胞上实施,例如体内。本发明化合物可使用啮齿类动物胚胎幼仔(embryonic rodent pups)呼吸道的细胞在体外初步测试(见例如美国专利No.5,179,109-fetal rat tissue culture(大鼠胎儿组织培养物))或其他哺乳类动物模型(见例如美国专利No.5,089,517-fetal mouse tissue culture(小鼠胎儿组织培养物))或非哺乳类动物模型。
供选地,可以通过使用动物模型表征本发明化合物的体内效果。
4.药物组合物
本发明也提供包含有效量的本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中,有效量可有效地治疗如上所述的细胞增殖病症。
在一个实施方案中,使用药学上可接受的制剂将本发明化合物给药至受试者,例如将药学上可接受的制剂给药至受试者后,这种药学上可接受的制剂使得本发明化合物向受试者持续递送至少12小时、24小时、36小时、48小时、一周、两周、三周或四周。
在某些实施方案中,这些药用组合物适于局部或口服给药至受试者。在其他实施方案中,如下文所详述,可将本发明组合物具体配制成以固体或液体形式给药,包括适合于下列的形式:(1)口服给药,例如浸液(drench)(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂;(2)肠胃外给药,例如通过皮下注射、肌肉内注射或静脉注射,例如灭菌溶液或悬浮液;(3)局部应用,例如应用于皮肤的乳剂、软膏剂或喷雾剂;(4)阴道内或直肠内给药,例如阴道栓、乳剂或泡沫剂;或(5)气溶胶,例如含有该化合物的水性气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒剂。
短语“药学上可接受的”是指本发明的这些化合物、含有这些化合物的组合物、和/或剂型,它们在合理的医学判断范围之内,适合用于与人类或动物组织接触,并没有过多的毒性、刺激性、变应性应答或其他问题或并发症,具有合理的收益/风险比。
短语“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的物质、组合物或运载体,例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质,其涉及将受试化学物质从身体的一个器官或部位携带或转运至另一器官或另一部位。每种载体是“可接受的”是指其可与制剂中的其他组分相容并不会对患者造成伤害。一些可用作药学上可接受的载体的物质的实例包括:(1)糖,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,例如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉末状西黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石;(8)赋形剂,例如可可脂和栓剂蜡;(9)油,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;(10)二醇,例如丙二醇;(11)多元醇,例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯,例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,例如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格溶液;(19)乙醇;(20)磷酸缓冲液;及(21)其他用于药物制剂中的非毒性可相容物质。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(例如月桂硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣料、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂也可存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括:(1)水溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏重亚硫酸钠(sodium metabisulfite)、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸棕榈酸盐、叔丁对甲氧酚(BHA)、二叔丁对甲酚(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;及(3)金属螯合剂,例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
含有本发明化合物(一种或多种)的组合物包括那些适于口服给药、经鼻给药、局部给药(包括含服和舌下给药)、直肠给药、阴道给药、气溶胶给药和/或肠胃外给药的组合物。这些组合物可以方便地以单位剂量形式存在,并且可通过药学领域内已知的任何方法制备。依据治疗的主体、具体的给药模式,可与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量可不同。可与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。一般而言,除了100%含量外,该活性成分的量的范围为从约1%至99%,优选为从约5%至约70%,更优选为从约10%至约30%。
制备这些组合物的方法包括将本发明化合物(一种或多种)与载体混合的步骤,并且任选加入一种或多种另外的成分。一般来说,制剂通过将本发明化合物与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且充分混合来制备,然后根据需要使产物成型。
适于口服的本发明组合物可以是胶囊、扁胶囊、丸剂、片剂、锭剂(使用香料基体,通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂、或在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或油包水乳剂或水包油液体乳剂、酏剂或糖浆、或软锭剂(使用惰性基质,例如明胶和甘油,或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等,每种均含有预定量的作为活性成分的本发明化合物(一种或多种)。化合物也可以以巨丸剂、药糖剂或糊剂形式给药。
在本发明用于口服给药的固体剂型中(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂等),活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合,所述药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙,和/或:(1)填料或膨胀剂,例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和/或硅酸;(2)粘合剂,例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶;(3)保湿剂,例如甘油;(4)崩解剂,例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠;(5)溶液阻滞剂,例如石蜡;(6)吸收促进剂,例如季铵盐化合物;(7)润湿剂,例如乙酰基醇和单硬脂酸甘油酯;(8)吸收剂,例如高岭土和膨润土;(9)润滑剂,例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸钠及其混合物;及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况中,药物组合物还可含有缓冲剂。在使用了例如乳糖及高分子量的聚乙二醇等作为赋形剂的软胶囊和硬胶囊(soft and hard filled gelatin capsules)中,相似类型的固体组合物也可用作填料。
片剂可任选与一种或多种助剂通过压制方式或模制方式制备。压制片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羧甲基淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片可通过在合适的机器中模压以惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物而制备。
本发明药物组合物的片剂和其他固体剂型,例如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂,可任选地以包衣和外壳标记或制备,例如肠溶衣和其他药剂学领域已知的包衣材料。也可使用例如提供期望的释放曲线的不同比例的羟丙基甲基纤维素或其他聚合物基体、脂质体和/或微球体将这些组合物配制成缓释或控释活性成分的制剂。可对这些组合物进行灭菌,例如通过细菌滤器(bacteria-retaining filter)过滤,或通过掺入可溶于无菌水的无菌固体组合物形式的灭菌剂,或在使用前立即掺入一些其他的无菌可注射介质。这些组合物也可任选地含有遮光剂,并可以是仅在或优先在胃肠道的某个部位释放活性成分(一种或多种)的组合物,任选是延迟方式。可以使用的植入式组合物的实例包括高分子物质和蜡。活性成分也可以是微囊形式,若合适的话,其中包含一种或多种上述赋形剂。
本发明化合物(一种或多种)的用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆和酏剂。除了活性成分外,液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂,例如水或其他溶剂,增溶剂和乳化剂(例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇)、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、失水山梨醇的脂肪酸酯,及其混合物。
除惰性稀释剂外,口服组合物可包括助剂,例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了本发明活性化合物(一种或多种)外,混悬剂还可包含助悬剂,例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。
用于直肠和和阴道给药的本发明药物组合物可以是栓剂形式,该栓剂可通过混合一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐(酯))而制备,该栓剂在室温下是固态,但是在体温下是液态,因此其将会在直肠或阴道腔中熔化并释放活性试剂。
适于阴道给药的本发明组合物还包括阴道栓、阴道塞(tampon)、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂,其中含有在本领域内已知为合适的那些载体。
本发明化合物(一种或多种)的局部给药或经皮给药剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。本发明活性化合物(一种或多种)可在无菌条件下与药学上可接受的载体及任何需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶除含有本发明化合物(一种或多种)之外,还可含有赋形剂,例如动物或植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或它们的混合物。
粉剂和喷雾剂除含有本发明化合物(一种或多种)外,还可含有赋形剂,例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末,或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规的推进剂,例如氯氟烃和挥发性无取代的烃(例如丁烷和丙烷)。
供选地,本发明化合物(一种或多种)可通过气溶胶给药。这可通过制备含有本发明化合物的液体气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒而实现。也可使用非水(例如氟代烃推进剂)混悬剂。因为Sonic喷雾器将试剂与剪切力的接触降至最低,其中剪切力会导致化合物的降解,所以Sonic喷雾器是优选的。
通常,液体气溶胶由试剂的水溶液或悬浮液与常规的药学上可接受的载体和稳定剂制备。载体和稳定剂根据具体化合物的需要可不同,但通常包括非离子型表面活性剂(吐温、普流罗尼克类(Pluronics)或聚乙二醇)、无毒蛋白质(例如血清的蛋白)、失水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(例如甘氨酸)、缓冲液、盐、糖或糖醇。气溶胶通常由等渗溶液制备。
透皮贴剂的额外优点是向机体控制递送本发明化合物(一种或多种)。该剂型可通过将试剂溶于或分散于合适的介质中制备。吸收促进剂也可用于增加活性成分经过皮肤的透入(flux)。所述透入的速率可通过设置控制速率的膜来控制,或通过将活性成分分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
眼制剂、眼软膏剂、粉剂、溶液等制剂也在本发明的考虑范围之内。
适用于肠胃外给药的本发明药物组合物含有一种或多种本发明化合物和一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散剂、混悬剂或乳剂或无菌粉剂(其在使用之前可再配制成无菌可注射溶液或分散剂),该组合物可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质(其使得制剂与目标受试者的血液等渗)、助悬剂或增稠剂。
可在本发明药物组合物中使用的合适的水性载体和非水性载体的实例包括:水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及它们合适的混合物、植物油(例如橄榄油)及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、通过在分散剂中维持所需粒径和通过使用表面活性剂可以保持合适的流动性。
这些组合物也可含有助剂,例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。加入不同的抗细菌剂和抗真菌剂可确保对微生物的预防作用,所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。有利的是,本发明组合物也可含有等渗试剂,例如糖、氯化钠等。另外,含有可延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)能引起可注射药物剂型的吸收的延长。
在一些情况下,为延长药物的作用,希望减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。这可通过使用具有较差水溶性的晶型或无定形物质的液体混悬剂而实现。此时,药物的吸收速率取决于其溶解速率,而溶解速率又取决于其晶体大小以及晶型。供选地,延迟肠胃外给药药物的吸收还可通过将药物溶于或悬浮于油性介质中实现。
可注射缓释剂型(depot forms)通过在可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成本发明化合物(一种或多种)的微囊基质而制备。取决于药物与聚合物的比例以及所使用的具体聚合物的性质,可控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可通过将药物包封于与机体组织相容的脂质体或微乳剂中制备可注射缓释剂型。
当本发明化合物(一种或多种)作为药物给药至人和动物时,其可以单独给药或作为药物组合物给药,所述药物组合物含有例如0.1至99.5%(更优选为0.5至90%)的活性成分,以及药学上可接受的载体的组合。
不管选定的是哪种给药途径,本发明化合物(一种或多种)(其可以以合适的水合形式使用)和/或本发明药物组合物可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
在本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平及给药时间过程可以不同,以便于获得一定量活性成分,其对于具体的患者而言该组合物和给药模式可有效地达到期望的治疗效果响应,并且不会对患者产生毒性反应。示例性的剂量范围是每天从0.1至10毫克。
本发明化合物优选的剂量是患者能承受并且不会产生严重的副反应的最大量。优选地,本发明化合物给药的浓度在约0.001毫克至约100毫克每千克体重、约0.001至约10毫克每千克体重或约0.001毫克至约100毫克每千克体重。上述值的中间范围的值也在本发明范围之内。
6.筛选方法及筛选系统
在另一方面,本发明提供了可机读存储介质,该介质包含本文鉴定的结合口袋的结构坐标或形状相似的同源结合口袋的结构坐标或两者的结构坐标。以这些数据编码的所述存储介质能在计算机屏幕或相似的显示设备上显示包含这些结合口袋的分子或分子复合物的三维图示(three-dimensionalrepresentation)。
本发明也提供了设计、评价和鉴定与上述结合口袋结合的化合物的方法。因此,计算机产生了包含结合口袋的分子或分子复合物的三维图形结构。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于生成分子或分子复合物的三维图示的计算机(computer),所述分子或分子复合物由FAK或其结构域的结构坐标所定义,或所述分子或分子复合物的同源物的三维图示的计算机,其中所述同源物包含结合口袋,该结合口袋自所述氨基酸的骨架原子的均方根偏差为2.0埃以下(更优选地为1.5埃以下)。
在示例性的实施方案中,计算机或计算机系统可包括本领域常规的组件,例如在美国专利5,978,740和/或6,183,121(引入本文作为参考)中所公开的组件。例如,计算机系统可包括计算机,该计算机包括中央处理器(“CPU”)、工作存储器(其可以是例如RAM(随机存取存储装置)或“磁芯”存储器)、大容量存储器(例如一个或多个磁盘驱动器或CD-ROM驱动器)、一个或多个阴极射线管(CRT)显示终端或液晶显示器(LCD)显示终端、一个或多个键盘、一个或多个输入线路和一个或多个输出线路,所有的这些通过常规的系统总线互相连接。
本发明的可机读数据可经一个调制解调器或通过数据线连接的多个调制解调器输入至计算机。供选地或另外地,输入硬件可包括CD-ROM驱动器、磁盘驱动器或闪存。键盘与显示终端连接时,该键盘也可用作输入设备。
通过输出线耦联至计算机的输出硬件可通过常规的设备相似地提供。作为实例,输出硬件可包括CRT或LCD显示终端以使用例如QUANTA或PYMOL的程序显示本发明结合口袋的图示。输出硬件也可包括打印机或磁盘驱动器以存储系统输出以便于以后的使用。
在运行过程中,CPU协调各种输入和输出设备的使用,协调来自大容量存储介质的数据读取以及向工作存储的数据存取,并决定数据处理步骤的顺序。许多程序可用于处理本发明可机读的数据,包括市售的软件。
用于存储本发明可机读数据的磁性存储介质可以是常规的。磁性数据存储介质可以以可机读数据编码,这些数据可通过例如上述的计算机系统执行。该介质可以是具有合适的基体材料(可以为常规的)及合适的涂层(也可以是常规的)的常规的软盘或硬盘,在其一面或两面上含有磁畴(magneticdomain),该磁畴的极性或取向可随磁性改变。该介质也可具有开口(未显示)以接收磁盘驱动器或其他数据存储仪器的主轴(spindle)。
介质的磁畴可以被极化或定向,从而以常规的方式编码例如本文所述的可机读数据,这通过例如本文所述的计算机系统的系统执行。
光学可读数据存储介质可以以可机读数据或一系列指令编码,这可通过计算机系统实行。该介质可以是常规的光盘只读存储器(CD-ROM)或可擦写介质(例如其光学可读且磁-光可写的磁光盘)。
在CD-ROM的情况下,众所周知的是,磁盘涂层是反射性的,并压制了许多凹坑以编码可机读数据。通过从涂层表面反射的激光可读取凹坑的排列。在反射涂层的顶部提供有保护涂层,其优选是基本透明的。
在磁光盘的情况下,众所周知的是,数据记录涂层不具有凹坑但是具有许多磁畴,当加热(例如通过激光加热)至高于某温度时,可在磁性方面改变该磁畴的极性或取向。畴的取向可通过测量从涂层反射的激光的极性来读取。畴的排列编码上述数据。
当结构数据与配备了软件的计算机一起使用以将那些坐标翻译成包含结合口袋的分子或分子复合物的三维结构时,其可用于多种目的,例如药物研发。
例如,以数据编码的结构可计算评估其与化学个体的结合能力。与FAK或其特定结构域的结合口袋相结合的化学个体是可能的药物候选分子。供选地,以数据编码的结构可在计算机屏幕上以三维图示显示。这实现了可肉眼观察结构,以及肉眼观察结构与化学个体的结合。
因此,根据另一个实施方案,本发明涉及评估化学个体与以下结构结合的可能性的方法:a)包含FAK或其特定结构域的结合口袋的分子或分子复合物,或b)所述分子或分子复合物的同源物,其中所述同源物包含结合口袋,该结合口袋自所述氨基酸的骨架原子的均方根偏差为2.0埃以下(更优选为1.5埃以下)。
本方法包括如下步骤:
i)使用计算方法进行化学个体与分子或分子复合物的结合口袋之间的配合(fitting)操作;及
ii)分析配合操作的结果以量化化学个体与结合口袋之间的结合。本文所使用的术语“化学个体”是指化合物、至少两个化合物的复合物、及这些化合物或复合物的片段。
根据本发明设计化合物使之结合或抑制FAK或其特定结构域的结合口袋,通常需要考虑一些因素。首先,所述个体必须能与部分或所有的FAK或其特定结构域相关的结合口袋在物理性质上或在结构上结合。非共价键分子间相互作用在此结合中是重要的,其包括氢键、范德华相互作用、疏水作用和静电作用。第二,化学个体必须能呈现一种构象,该构象使得其与FAK或其特定结构域相关的结合口袋(一个或多个)直接结合。尽管所述个体的一些部分并不会直接参与这些结合,但是所述个体的这些部分将仍然会影响分子的总体构象。这反过来对效能具有重要的影响。这种构象要求包括:与所有或部分结合口袋有关的化学个体的总体三维结构和取向,或与包含一些直接与结合口袋或其同源物相互作用的化学个体的个体的官能团之间的间隔。
通过使用计算机模拟技术在实际合成和测试化学个体之前分析,该化学个体对与FAK或其特定结构域相关的结合口袋的可能的抑制或结合作用。如果给定的个体的理论结构表明其与靶向结合口袋之间的相互作用或结合不充分,则排除对该化学个体的测试。然而,如果计算机模拟表明相互作用强,则可以合成该分子并测试其与结合口袋的结合能力。例如,这可以通过测试该分子抑制FAK或其特定结构域的活性的能力而实现,其中例如使用本文描述的或本领域已知的测试方法。以此方法可避免合成无效的化合物。
与FAK或其特定结构域相关的结合口袋的潜在抑制剂可借助于一系列步骤计算评估,在所述步骤中针对化学个体或片段结合FAK或其特定结构域相关的结合口袋的能力进行筛选并选择化学个体或片段。
针对化学个体或片段结合与FAK或其特定结构域相关的结合口袋的能力,本领域技术人员可使用一些方法中的一种来筛选化学个体或片段。基于本文所述的FAK或其特定结构域的结构坐标,或基于产生自可机读存储介质的、定义了相似形状的其他坐标,此方法可始于在计算机屏幕上肉眼观察例如与FAK或其特定结构域相关的结合口袋。然后可以将选定的片段或化学个体以各种取向放置或对接(dock)在以上定义的结合口袋中。对接可使用例如Quanta和DOCK的软件实现,然后根据例如CHARMM和AMBER的标准分子力学的力场能量最小化及分子动力学。
专门的计算机程序(例如本领域已知的和/或市售的和/或上文所述的)在选择片段或化学个体的过程中也可发挥辅助作用。
一旦选定了合适的化学个体或片段,可将这些化学个体或片段组装成单一的化合物或复合物。可通过肉眼观察在计算机屏幕上显示的三维图像的各个片段之间的关系而进行组装,其中所述三维图像与靶向结合口袋的结构坐标相关。
作为以分步方式构建结合口袋的抑制剂方法的代替,使用空的结合位点或任选包含已知的抑制剂(一种或多种)部分(一部分或多个部分)可以一次性整体设计或“从头(de novo)”设计一个上述片段或化学个体、抑制化合物或其他结合化合物。本领域已知许多从头的配体(ligand)设计方法,其中一些是市售的(例如从Tripos Associates,St.Louis,Mo.可得的LeapFrog)。
根据本发明也可使用其他分子模拟技术(参见N.C.Cohen等,“MolecularModeling Software and Methods for Medicinal Chemistry”,J.Med.Chem.,33,pp.883-894(1990);参见M.A.Navia和M.A.Murcko,“The Use of StructuralInformation in Drug Design”,Current Opinions in Structural Biology,2,pp.202-210(1992);L.M.Balbes等,“A Perspective of Modern Methods inComputer-Aided Drug Design”″,in Reviews in Computational Chemistry,Vol.5,K.B.Lipkowitz及D.B.Boyd,Eds.,VCH,New York,pp.337-380(1994);还可以参见W.C.Guida,“Software For Structure-Based Drug Design”,Curr.Opin.Struct.Biology,4,pp.777-781(1994))。
一旦设计或选定了化合物,个体与结合口袋的结合效率可通过计算评价方式来测试并优化。
在本领域中可获得特定的计算机软件用来评价化合物形变能和静电相互作用。用于所述用途的程序的实例包括:AMBER、QUANTA/CHARMM(Accelrys,Inc.,Madison,WI)等。这些程序可例如使用市售的图形工作站来工作。其他硬件系统和软件包为本领域技术人员所知。
另一种技术涉及利用计算机的,例如本文所述的模拟化合物数据库筛选。这种技术可以快速筛选数以千计的化合物并选择最好的模拟化合物用于进一步筛选(例如通过合成和体外测试)。可筛选小分子库以得到可全部或部分结合FAK或其特定结构域的结合口袋的化学个体或化合物。在此筛选过程中,所述个体与结合位点的配合质量可通过形状的互补性或估算的相互作用能量来判断。
实施例
本发明将通过下列实施例进一步说明,其中这些实施例意图说明本发明而不是限制本发明。
材料
细胞系和培养液-BT474乳腺癌细胞保持在添加了10%的胎牛血清(FBS)、5μg/ml的胰岛素和1μg/ml的青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。MCF-7细胞系从ATCC得到且依照生产者的流程进行保持。结肠癌细胞系,HT-29,保持在McCoy′s 5A+10%FBS的培养基中。MCF10A细胞和其它的癌细胞系依照ATCC的流程保持。Panc-1和Miapaca-2癌症细胞、正常的人成纤维细胞和良性人乳腺上皮细胞从ATCC得到且保持在添加了10%的胎牛血清(FBS)、5μg/ml的胰岛素和1μg/ml的青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。
小分子抑制剂化合物-从美国国家癌症研究院(National CancerInstitute)、治疗发展计划(Developmental Therapeutics Program)(NCI/DTP)免费定购了,由DOCK程序检测出的36种最优配合入FAK的Y397位点的化合物。各化合物在水中或在DMSO中溶解,浓度为25mM,且存放于-20℃和-80℃。化合物Y15从Sigma定购用于体外的生物化学分析和用于注射入小鼠进行体内研究。Y15溶解在水中,浓度为25mM,且存放于-20℃和-80℃。
FAK抑制剂-FAK激酶抑制剂,NVP-TAE226(称作TAE226)从NovartisInc.(15)得到。TAE226溶解在DMSO中,浓度为25mM。化合物的结构和疗效在参考文献(15,16,18)中有所描述。TAE-226抑制剂用作实验中的FAK的抑制作用的对照。TAE-226抑制剂用作体外实验中的FAK的抑制作用的对照。
抗体-N端FAK的单克隆抗-FAK(4.47)抗体和单克隆抗桩蛋白抗体从Upstate Biotechnology,Inc.得到。多克隆的抗-磷酸-Tyr397-FAK和抗-磷酸Tyr-418-Src抗体来自Biosource Inc.。单克隆抗-胱天蛋白酶-3抗体从Transduction Labs.定购。单克隆抗-α-微管蛋白和β-肌动蛋白抗体从Sigma得到。多克隆抗c-Src抗体来自Santa Cruz Inc.并用于蛋白质印迹法(Westernblotting)。单克隆抗-Src抗体(克隆327)来自Oncogene Research Products Inc.。单克隆和ERK抗体从Millipore(Lake Placid,NY)得到。胱天蛋白酶-3和Ki67的抗体分别从DAKO(Carpinteria,CA)和Cell Signaling(Danvers,MA)得到。
实施例1
潜在FAK小分子抑制剂的基于结构的分子对接
FAK、N端FERM结构域(20)的晶体结构用于对接FAK抑制剂。我们使用一种基于结构的方法,该方法结合了分子对接与功能测试。将20000种具有类药性质(遵循Lipinski原则)的小分子化合物使用DOCK5.1在100个不同的方向上对接至人FAK晶体结构的FAK结构域中的N端结构域。Pyk2和FAK共有类似的具有酪氨酸激酶结构域的结构组织,在该酪氨酸激酶结构域的N端和C端侧面相临有非催化结构域。这两种激酶在中心催化结构域中大约有60%是相同的且在N端和C端结构域中大约均有40%的同一性。由于Pyk2和FAK之间的高序列同源性以及相似的总体构造,特别有意思的是比较Y15和这两种分子的相互作用。遵循Lipinski原则,如之前所述,通过使用DOCK5.1程序在100个不同的方向上利用FAK和Pyk2的人晶体结构(hurmancrystal structure)使Y15对接至FAK和Pyk2的N端结构域。对接计算在佛罗里达大学的使用16个处理器的高性能计算的超级计算集群上进行(http://hpc.ufl.edu)。
所有的对接计算通过加利福尼亚大学旧金山分校DOCK 5.1程序(University of California,San Francisco 5.1program)进行,使用集团匹配算法(clique-matching algorithm)定向Y15至FAK的Y397位点和Pyk2的氨基端上。使用SYBDB程序创建针对氢原子和部分电荷的文件。
实施例2
细胞存活力测定-以不同肽浓度用肽对细胞进行24小时的处理。添加Promega存活力试剂盒(Madison,IL)中的化合物3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺酸苯基)-2H-四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium),并在37℃温育细胞1-2个小时。用酶标仪分析96孔板490nm处的光密度以确定细胞存活力。另外,用锥虫蓝对通过Y15处理24小时后的细胞进行染色,以及通过血细胞计数器确定被染色为阳性的细胞的百分数。
细胞粘着测定-聚L-赖氨酸或胶原(5μg/ml)涂敷的96孔培养板在37℃用封闭缓冲液(具有0.5%的BSA的培养基)封闭一小时。所述细胞用药物进行预处理3小时且以4×105个细胞在平板接种以供粘着用。细胞在37℃温育1小时,在3.7%的甲醛中固定,用含0.1%BSA的PBS溶液冲洗并用结晶紫(5mg/ml在2%的乙醇中)染色10分钟。然后在干燥的平板上添加2%的SDS并测量590nm处的OD用于检测细胞粘着。
蛋白质印迹法-用冷1×PBS冲洗细胞或均匀化的肿瘤样本两次且在冰上在含有以下物质的缓冲液中溶胞30分钟:50mM的Tris-HCl(pH 7.5)、150mM的NaCl、1%的Triton-X、0.5%的NaDOC、0.1%的SDS、5mM的EDTA、50mM的NaF、1mM的NaVO3、10%的甘油和以下蛋白酶抑制剂:10μg/ml的亮抑酶肽、10μg/ml的PMSF和1μg/ml的抑酶肽。溶胞产物在4℃、10000rpm离心分离30分钟进行净化。使用Bio-Rad试剂盒确定蛋白质浓度。煮沸的样本上样到现成的SDS-10%PAGE凝胶(Bio Rad,Inc)上并用于利用蛋白质特异性抗体的蛋白质印迹法分析。用化学发光Renaissance试剂(NEN LifeScience Products,Inc)使免疫印迹显影。
免疫沉淀-根据标准流程实施免疫沉淀。简言之,预净化过的溶胞产物和等量的蛋白质于4℃和1μg的初次抗体和30μl的A/G琼脂糖小球进行隔夜温育。沉淀物用溶胞缓冲液冲洗三次并重悬于2×Laemmli缓冲液中。如上所述,煮沸的样本用于蛋白质印迹法。
脱附测定-在有抑制剂和无抑制剂的条件下平板培养细胞24个小时,且用血细胞计数器计数脱附的和附着的细胞。我们用脱附的细胞数目除以细胞总数计算脱附百分数。脱附细胞的百分数在三个独立的实验中进行计算。
细胞凋亡测定-收集脱附的细胞并固定在3.7%的甲醛的1×PBS溶液中用于细胞凋亡测定。用Hoechst 33342染色来进行细胞凋亡检测。凋亡的细胞的百分比计算为凋亡的脱附的细胞除以细胞的总数的比例,其通过荧光显微镜在一些视野中进行三个独立的实验。每次实验每次处理计数300个细胞。
体外激酶测定-10μCi的[γ-32P]-ATP在激酶缓冲液(20mM的HEPES、pH 7.4、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.1mM Na3VO4)中,0.1μg纯化的FAK蛋白质在具有10μCi的[γ-32P]-ATP的激酶缓冲液中温育。在室温进行该激酶反应5分钟且通过添加2×Laemmli缓冲液中止该反应。蛋白质在现成的SDS-10%PAGE凝胶上进行分离,通过放射自显影术使磷酸化了的烯醇化酶可视化。
激酶剖析程序筛选-通过激酶剖析程序操作(KinaseProfilerTMService)(Millipore)进行激酶特异性筛选,该激酶剖析程序操作可从http://www.millipore.com/drugdiscovery/dd3/KinaseProfiler得到。根据Millipore的流程利用1μM的Y15、10μM的ATP和激酶底物在9种重组激酶上实施筛选。
裸鼠内的肿瘤生长-雌性裸鼠,6周大,购自Harlan实验室。小鼠保持在动物实验室中且遵照NIH使用动物指导(NIH animal-use guidelines)和UF动物保护委员会(UF Animal Care Committee)通过的IACUC流程(IACUCprotocol)进行所有的实验。注射BT474细胞(2百万细胞/皮下注射)。注射后第二天(The day after injection),通过IP注射每天以30mg/kg的剂量注入药物,5天/星期并持续三个星期。注射Panc-1细胞(2×106个细胞/皮下注射)。在预备实验中,向小鼠注入不同剂量的化合物,且选择30mg/kg作为最佳的、无毒的剂量。对该剂量抑制肿瘤生长的能力进行测定。在接种肿瘤的第二天,通过IP注射每天以30mg/kg的剂量注入化合物,5天/星期并持续三个星期。接着,对该化合物在吉西他滨化学疗法存在时的效力进行评估。用测径器测量肿瘤直径且通过使用下式来计算肿瘤体积(mm3):=(宽度)2×长度/2。在实验的最后,测定肿瘤质量和体积。
免疫组织化学染色法-如之前(21)所述,通过Y397抗体在具有石蜡包埋的肿瘤样本的载玻片上进行FAK染色。在有石蜡包埋的肿瘤样本的载玻片上进行胱天蛋白酶-3(caspase-3)(1∶400稀释)和Ki67(1∶500稀释)的免疫组织化学染色(参考Golubovskaya VM,Finch R,Kweh F,Massoll NA,Campbell-Thompson M,Wallace MR,Cance WG.P53 regulates FAK expressionin human tumor cells.MoI Carcinog 2007;47:373-82)。
统计分析-进行斯式t检验(Student′s t-test),如适当的话,对显著性进行测定。P<0.05的数据间差异认为是显著的。
实施例3
通过基于结构的分子对接方法靶向FAK的Y397位点和NCI数据库筛选显示减少细胞存活力的Y397药物
近来已鉴定了FAK的N端(FERM)结构域的晶体结构(20)。替代高流量筛选,我们使用了基于结构的方法,该方法结合了细胞对接和功能测试。多于20000种具有已知的三维结构的化合物对接至包含Y397位点的FAK的结构口袋中。该方法结合了NCI/DTP数据库(原子坐标和小分子)和改进的分子对接和评分算法的DOCK 5.1程序(19)。通过使用DOCK 5.1.0.在100个不同的方向上对接20000种小分子化合物中的每种小分子化合物。作为实例,一种这样对接至FAK的Y397位点上的化合物示出在图1中。从NCI订购多于20000种化合物中的36种具有和Y397FAK相互作用的最高分数的化合物,并通过MTT测定测试其对于癌细胞存活力的效力。
Y15对接至Pyk2的氨基端,Pyk2是FAK的同源物。利用范德华力(vandel Waals charge)和静电力,Y15对接至Pyk2的最高分数为-14.2。注意到,Pyk2上不存在结合Y15的FAK上的口袋。表示Y15对接至FAK的分数(-38.5)比对接至Pyk2的分数高的多。
我们用36种靶向FAK的Y397位点的化合物测试以下6种不同的癌细胞系:BT474、T47D、MCF-7乳腺癌细胞系、HT29结肠癌、C8161黑素瘤和A549肺癌细胞系。这些化合物中的其中一种化合物,Y15化合物,最大程度地减少了所有癌细胞系的细胞存活力(图2A、B)。图2示出了减少的T47D乳腺癌细胞的存活力(图2A)以及减少的C8161黑素瘤细胞的存活力(图2B)且和已知的FAK催化抑制剂TAE226(Novartis)进行比较。Y15有效地阻断了具有过表达的Src和激活的FAK的抗性乳腺癌细胞的细胞存活力(未示出)。对接至Y397位点的Y15的结构,和该化合物的名称1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐如图3所示(为简便起见,在本文中我们称该化合物为Y15)。
实施例4
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)以剂量依赖性方式抑制细胞存活力
为了确定1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)对细胞存活力的抑制是否是以剂量依赖性方式,我们用不同的剂量0、0.1、1、10、30、50和100μM的Y15进行MTT测定(图4A)。BT474细胞的存活力在10μM剂量的Y15药物时开始减少且在50-100μM剂量的Y15药物时显著地被阻断。因此,Y15对癌细胞存活力的阻断是以剂量依赖性的方式。
使用MTT,研究72小时的时候Y15对于胰腺肿瘤细胞存活力的效力。Y15在1μM的剂量时开始抑制胰腺癌细胞存活力且在更高剂量时抑制作用增加(图8A、8B)。因此,Y15对胰腺癌细胞存活力的抑制是以剂量依赖性的方式。比较Y15对FAK缺失和野生型成纤维细胞的效力。从0.1μM的剂量开始,与缺失FAK的成纤维细胞相比,Y15减少了FAK野生型成纤维细胞的存活力(p<0.05,图8C)。这表示FAK的存在对于Y15发挥其效力是重要的。
实施例5
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)特异性阻断Y397-FAK磷酸化
为了测试Y15对于Y397磷酸化的效力,我们用100μM剂量的Y15处理BT474乳腺癌细胞且用Y397FAK抗体进行蛋白质印迹法(图4B)。Y15特异性抑制FAK的Y397磷酸化以及也抑制FAK下游底物桩蛋白、Y118-桩蛋白的磷酸化(图4B)。Y15不会抑制其它蛋白质的磷酸化,例如VEGFR-3和c-Src(未示出)。因此,Y15的效力对于FAK是特异性的。为了测试Y15对于总FAK自磷酸化活性的效力,我们免疫沉淀FAK且用P-酪氨酸抗体进行蛋白质印迹法(图4C)。因此,靶向FAK的Y397且减少细胞存活力的Y15特异性抑制Y397和总FAK的磷酸化。
实施例6
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)以剂量依赖性方式阻断FAK自磷酸化
接着我们分析Y15以剂量依赖性方式对FAK的Y397磷酸化的抑制的效力。我们用0、0.1、1、10、50和100μM的Y15药物处理BT474乳腺癌细胞24个小时且用Y397抗体进行蛋白质印迹法(图4D)。Y15以剂量依赖性方式降低Y397磷酸化,且在50μM和100μM的剂量时分别检测到较高的和最大的抑制作用,所述抑制作用和对于细胞存活力的效力是一致的。在100μM剂量时Y15具有和TAE226抑制剂(Novartis)一样的抑制作用(图4D)。因此,Y15药物即1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐对FAK的抑制是以剂量依赖性的方式。
为了测试Y15对于Y397磷酸化的效力,我们用剂量逐渐增加的Y15或TAE226处理Panc-1胰腺癌细胞24小时且用Y397FAK抗体进行蛋白质印迹法(图9A)。Y15从0.1μM起开始抑制Panc-1细胞中的FAK Y397磷酸化。在剂量为100μM时,Y15具有和TAE226一样的或更好的抑制作用。注意到,在更高剂量的Y15时总FAK被下调。Y15也阻断FAK下游底物,桩蛋白的磷酸化(图9B)。和FAK类似,总桩蛋白在更高剂量时减少。因此,Y15即1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐,对FAK磷酸化的抑制是以剂量依赖性的方式。在Miapaca-2细胞中也可见类似的结果。
实施例7
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)以时间依赖性方式阻断FAK自磷酸化
接着我们分析Y15对FAK的Y397磷酸化的抑制是否是以时间依赖性的方式。我们用100μM的Y15对BT474细胞进行0、1、4、8和24小时的处理,然后用Y397抗体进行蛋白质印迹法(图4E)。结果显示用Y15进行4小时的处理没有显著减少Y397磷酸化,但是8小时的处理足够完全阻断Y397磷酸化并下调FAK。100μM的对照抑制剂TAE226(Novartis)也完全地阻断Y397磷酸化。和Y15药物类似,TAE226也下调了总FAK(图4E)。因此,数据表示了Y15对FAK Y397磷酸化的抑制和对FAK的下调是以时间依赖性的方式。
实施例8
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)是FAK自磷酸化的直接抑制剂
为了测试Y15是否为FAK的直接抑制剂,我们通过重组子进行体外激酶测定,该重组子是从通过杆状病毒系统纯化的FAK蛋白质中分离的,如(22)所述。我们用1-100μM剂量进行体外激酶测定。我们使用TAE226(Novartis)抑制剂作为阳性对照。Y15从1μM剂量起直接阻断FAK的自磷酸化活性,与对照TAE226一样(图5)。另外,通过9种另外的市售的重组激酶(c-RAF、c-Src、EGFR、VEGFR-3、IGF-1、Met、PDGFR-α、Pyk2、PI3K(pi 10δ/p85α)(Upstate Biotechnology,Inc)进行体外激酶测定以筛选Y15,如在材料和方法中所述。与FAK一样(图5),Y15在1μM的剂量时没有显著地减少其它激酶的激酶活性。因此,Y15是FAK自磷酸化的直接且特异的抑制剂。
实施例9
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)引起依赖于剂量的细胞脱附但在抑制FAK自磷酸化的高浓度时Y15对于细胞是非细胞毒性的
为了测试Y15药物对于乳腺癌细胞的细胞毒性效力,我们用1和100μM的Y15药物处理BT474细胞24小时。我们分析了Y15处理过的BT474细胞的脱附和细胞凋亡(图6A)。Y15引起了BT474细胞剂量依赖性的脱附(图6A)。在10μM剂量时,Y15仅引起8%的BT474细胞脱附,而在50μM剂量时,脱附为38%。在100-200μM剂量时,脱附分别达到58%-66%。相比较于TAE226(Novartis)抑制剂,Y15引起的脱附少,TAE226(Novartis)抑制剂在10μM诱导促使30%的脱附且在50μM剂量时诱导>80%的脱附。因此,Y15有效地引起剂量依赖性的细胞脱附。
为了测试Y15对于细胞凋亡的效力,我们在未用Y15处理的细胞和用Y15处理过的细胞上实施了Hoechst染色。在50-100μM的高剂量时,Y15没有引起BT474细胞显著的细胞凋亡,该细胞凋亡的程度小于6%(图6B)。相反,TAE226抑制剂(Novartis)引起较高程度的细胞凋亡,在10μM时为35%且在20μM剂量时达到69%(图6B)。Hoechst染色的Y15和TAE226处理过的细胞的细胞核在图6C中示出。与用20μM剂量的TAE226处理过的细胞相对,200μM剂量的Y15处理过的细胞中未检测到凋亡的细胞核(图6C)。由于50和100-200μM剂量的Y15药物不会引起显著的细胞凋亡,该细胞内FAK激酶抑制作用的机理和细胞毒性无关。因此,Y15抑制剂不是毒性的且不会造成细胞凋亡。
为了测试Y15对于细胞凋亡的效力,我们在未用Y15处理的细胞和用Y15处理过的细胞上实施了Hoechst染色。在高剂量(50-100μM)时,Y15引起Panc-1细胞的细胞凋亡的小量且不显著(小于10%)的增加。同样的效力在处理Miapaca-2细胞时也可见。相比较于用类似剂量的Y15进行的处理,TAE226(Novartis)在处理48个小时之后引起稍高程度的细胞凋亡。经Y15处理和TAE226处理的细胞的Hoechst染色细胞核示出了:在用50μM剂量的Y15处理过的细胞中没有检测到细胞凋亡的细胞核,与用50μM剂量的TAE226处理过的细胞相反。由于高剂量Y15不引起显著的细胞凋亡,细胞内FAK激酶抑制作用的机理与凋亡细胞的死亡无关。
Panc-1和Miapaca-2细胞的锥虫蓝染色示出减少了的细胞存活力,其表示剂量逐渐增加的Y15造成坏死(图10D)。这和在正常乳腺上皮细胞(MCF10A)上观察到的效力相反,在该正常乳腺上皮细胞上当剂量增至10μM时未观察到细胞存活力的减少。
实施例10
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)以剂量依赖性方式抑制细胞粘着
为了测试Y15对细胞粘着的效力,我们在胶原涂覆的平板上用不同剂量的Y15和100μM的TAE226处理BT474并测量粘着。Y15以剂量依赖性方式抑制细胞粘着(图6D)。从50μM起细胞粘着显著地减少,这和在这些剂量时的Y397-降低的FAK磷酸化是一致的。100μM剂量的Y15与TAE-226药物一样显著地抑制了细胞的粘着(图6D)。因此,Y15有效地阻断细胞粘着。
为了测试Y15对细胞粘着的效力,我们在胶原涂覆的平板上用不同剂量的Y15和50μM的TAE226对胰腺癌细胞进行处理并测量粘着。Y15以剂量依赖性方式抑制细胞粘着。从10μM的剂量起,细胞粘着显著地减少,这和在这些剂量时的Y397-降低的FAK磷酸化是一致的。50μM剂量的Y15以与50μM的TAE226类似的方式减少粘着。因此,Y15有效地以剂量依赖性的方式阻断细胞粘着。
实施例11
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)体内抑制乳腺肿瘤生长并降低Y397-FAK
为了检测Y15药物在体内的效力,我们对裸鼠皮下注入BT474细胞。最初我们确定30mg/kg的剂量作为最优剂量。我们以5天/星期,用30mg/kg剂量的Y15处理小鼠且和未处理过的小鼠的肿瘤生长进行比较。Y15显著地阻断了体内肿瘤生长(图7A)。和未处理的小鼠进行比较,Y15显著地降低了肿瘤重量(图7B,上图),并且肿瘤体积显著小于未处理样品中的(图7B,下图)。我们从未处理的小鼠和用Y15处理的小鼠中分离出肿瘤且通过蛋白质印迹法探测Y397水平。和用Y15处理的肿瘤相比,来自于未处理的小鼠的肿瘤具有显著更高的Y397磷酸化水平,而总FAK水平相同(图7C)。用Y397抗体对肿瘤进行免疫组织化学染色得到类似的结果(图7D)。与来自于未处理的小鼠的肿瘤相比,来自于Y15处理过的小鼠的肿瘤具有更少的Y397-FAK磷酸化。因此,Y15显著地抑制了乳腺的肿瘤发生,这与体外存活力和生物化学数据是一致的。
实施例12
因此,通过基于结构的分子对接靶向FAK的Y397和NCI数据库筛选方法显示出在20000种不同的化合物中36种化合物最适于与上述这样的口袋配合。在这些化合物当中,1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(称作Y15化合物)在减少一些癌细胞系的细胞存活力方面是最有效的。
重要的是,该化合物减少Y397磷酸化和总FAK磷酸化。它在体外直接减少FAK自磷酸化。Y15对FAK磷酸化的减少是以剂量和时间依赖性的方式,且对细胞不是细胞毒性的,如在100μM高剂量时未检测到显著的细胞凋亡。Y15增加细胞脱附和减少细胞粘着。另外在体内,Y15化合物显著地抑制BT474乳腺癌细胞(皮下注射入小鼠)的肿瘤生长。来自用Y15处理的小鼠的肿瘤具有减少的FAK的Y397磷酸化。因此,Y15抑制剂,靶向FAK的Y397位点,在抗癌治疗中是有效的。
因此,本研究报告表明DOCK程序表明验证了使用用于鉴定FAK的新抑制剂的基于计算机的方案(silico-based strategy)的原理。之前该方法成功地用于Jak2激酶(19),但是没有关于将该方法用于FAK激酶和用于靶向FAK的主要磷酸化位点的报道。从而,筛选靶向其他磷酸化的化合物也可以提供可以潜在用于治疗的新抑制剂。
Y15(1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐)的分子结构是已知的,且其包括一个单个的芳香环。因此,该单个的芳香环化合物可以作为针对未来的化学合成的衍生物和新FAK抑制剂的潜在的引导化合物(lead compound)。
最重要的发现是Y15体内阻断小鼠的肿瘤发生,示出这些药物的治疗潜力。已有关于两种其他的新FAK药物的报道,Pfizer报道了PF-228,Novartis报道了TAE226。两种药物有其自身的限制;第一种药物对细胞存活力没有效力且无关于肿瘤发生的报道。第二种药物对于IGFR-I,MAPK和AKT具有抑制效力(16)。Y15药物以剂量依赖性的方式阻断细胞粘着。与TAE226药物相比较,Y15较少地抑制细胞粘着和较少地引起脱附的这一事实,可以通过TAE226药物对于FAK具有较小的特异性(TAE226也和其他的激酶进行交叉反应)来进行解释。Y15对FAK的Y397磷酸化进行特异地阻断且不会抑制其他的激酶。在低于TAE226的剂量条件下,Y15药物可以阻断肿瘤发生。在神经胶质瘤中使用50-75mg/kg的TAE226(16)。在卵巢肿瘤模型中,30mg/kg单独的TAE226不是有效的,需要额外的多西他赛(docetaxel)的处理以减少肿瘤生长(18)。在乳腺癌模型中,30mg/kg剂量单独的Y15有效地抑制>74%的肿瘤生长。因此,开发可以阻断肿瘤发生的新的、更加特异性的FAK抑制剂对于本领域是重要的。
因此,本研究指向鉴定1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐,一种小分子FAK抑制剂,其可以直接靶向FAK的Y397自磷酸化位点并减少其的磷酸化、在体外抑制细胞存活力和粘着并在体内阻断肿瘤发生。因此,这个化合物和其衍生物对于将来的治疗是重要的。
实施例13
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)用24小时阻断FAK自磷酸化
接着我们分析了Y15对FAK的Y397磷酸化的作用是否是以时间依赖性的方式。我们用100μM的Y15处理胰腺肿瘤细胞0、1、4、6和24小时,且然后用Y397抗体进行蛋白质印迹法。结果表示用Y15处理6小时或更短不能显著地减少Y397磷酸化,但是24小时对于完全阻断Y397磷酸化和下调FAK是足够的。
实施例14
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)阻断ERK1/2磷酸化
已知ERK 1/2是存活信号传导中的FAK的下游参与者(downstreamplayer)。为了证明Y15对于FAK信号传导的效力,我们测试其对ERK 1/2磷酸化的效力。对Y15下调p-ERK的能力进行了评估。和Y15对p-FAK的效力一致,在两种细胞系中p-ERK均以剂量依赖性方式被下调。类似的结果在Miapaca-2细胞中可见。
实施例15
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)引起的依赖于剂量的细胞脱附
为了测试Y15抑制剂对胰腺癌细胞的细胞毒性效力,我们用增加剂量的Y15抑制剂处理Panc-1细胞24小时和48小时。我们在不同的时间点上分析脱附和细胞凋亡。Y15引起剂量依赖性方式的脱附作用。在用10μM的剂量处理48小时后,Y15引起13%的Panc-1细胞脱附,当用50μM的剂量时则引起32%的脱附。与TAE226(Novartis)抑制剂相比,Y15引起更多的脱附。因此,Y15有效地引起剂量依赖性方式的细胞脱附。类似的结果在Miapaca-2细胞中可见,其中从3μM的剂量起有显著的脱附。Y15,在高达至10μM的剂量时没有引起正常人类成纤维细胞的形态的显著变化或细胞脱附的显著增加。因此,与正常的成纤维细胞相比,两种胰腺癌细胞系对Y15诱导的脱附是更敏感的。
实施例16
1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)体内抑制人类胰腺肿瘤生长且减少Y397-FAK的磷酸化
吉西他滨被认为是在对胰腺癌患者的治疗中的最有效的试剂。因此,我们仅用Y15或仅用吉西他滨、或用Y15和吉西他滨化学疗法的组合来体外评估胰腺癌细胞的存活力。如图11A所示,与仅用吉西他滨(10μM)或仅用Y15(10μM)的治疗相比,吉西他滨(10μM)化学疗法+Y15(10μM)治疗的组合显著地减少了细胞的存活力。接下来,为了评估Y15的体内效力,我们通过皮下向裸鼠导入了胰腺肿瘤细胞。最初我们确定30mg/kg的剂量是最优的无毒剂量。我们以5天/周,腹膜内30mg/kg的Y15处理小鼠,并和接受安慰剂盐水对照的小鼠的肿瘤生长进行比较。在36天的肿瘤生长抑制试验中没有观察到动物体重减少或死亡(数据未示出)。接着,在裸鼠皮下位置注射Panc-1肿瘤细胞。肿瘤生长一个星期之后,动物(n=5个/组)随机地每天接受腹膜内注射的PBS、仅Y15(30mg/kg)、仅吉西他滨(30mg/kg)或Y15(30mg/kg)+吉西他滨(30mg/kg)。如图11B所示,单独提供时,Y15或吉西他滨抑制了肿瘤生长。仅Y15比仅吉西他滨甚至更好地抑制了肿瘤生长。重要的是,与仅Y15或仅吉西他滨相比,Y15+吉西他滨处理的组合显著地抑制肿瘤生长Y15。另外,与其他组相比,Y15+吉西他滨处理的组合引起肿瘤重量显著地减少。在第36天,最后处理之后,处死小鼠并用蛋白质印迹法分析肿瘤的FAK-Y397水平。与用PBS(对照)处理过的肿瘤相比,来自Y15处理过的小鼠的肿瘤具有更低水平的Y397磷酸化。因此,Y15显著地抑制胰腺癌肿瘤发生,并且与吉西他滨化学疗法具有协同效力。这些发现和体外存活力数据一致。
对所有的四组中的肿瘤进行评价胱天蛋白酶-3和Ki67的免疫组织化学分析。胱天蛋白酶-3染色显示了在仅用Y15(6%)、仅用吉西他滨(2%)或用Y15+吉西他滨(2%)处理的肿瘤中在细胞凋亡方面无显著地增加。然而,在用Y15+吉西他滨处理过的肿瘤中,Ki67染色减少的最多。
附图图例
图1A,B.通过基于结构的分子对接方法靶向FAK的Y397位点。在(20)中报道的,FAK(FERM)结构域的晶体结构,具有一种靶向FAK(用箭头示出)的Y397位点的NCI化合物(A)。Y397位点和该实例化合物的放大图像(B)。
图2A,B.靶向Y397位点的化合物对于乳腺癌和黑素瘤细胞系的效力。将36种药物以100μM的剂量添加至细胞24小时,并进行MTT测定,如在材料和方法中所述。已知的FAK抑制剂TAE226(Novartis)用作对照。T47D乳腺癌细胞系(A)和C8161黑素瘤细胞系(B)。误差棒显示平均值±标准偏差。
图3 1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐(Y15)化合物的结构。上图:1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐靶向FAK的Y397位点。下图:Y15化合物的化学结构和名称。
图4A,B,C,D.Y15以剂量依赖性方式抑制细胞存活力并降低Y397的FAK磷酸化。用不同剂量的Y15药物处理BT474乳腺癌细胞24小时并进行MTT测定以检测其对于细胞存活力的效力(A)。误差棒显示平均值±标准偏差。Y15以剂量依赖性的方式抑制细胞存活力。*P<0.05Y15处理过的细胞的存活力对比未处理过的对照细胞。
Y15特异性抑制FAK的Y397磷酸化。用100μM的Y15药物处理BT474细胞24小时并用Y397和Y118桩蛋白进行蛋白质印迹法以分别检测磷酸化的FAK和桩蛋白水平(B)。用总FAK、桩蛋白和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹法以检测细胞中的蛋白质的表达。Y15有效地抑制Y397和FAK底物,Y118-桩蛋白的磷酸化。Y15阻断了总的FAK的磷酸化(C)。用FAK抗体进行免疫沉淀并用磷酸酪氨酸抗体进行蛋白质印迹法。剥离印迹且用FAK抗体对其进行探测。Y15阻断了FAK的磷酸化。用Y397抗体的免疫染色示出在用Y15处理过的细胞中和用对照TAE226(Novartis)处理过的细胞中降低的Y397,抑制剂Y15以剂量依赖性方式抑制FAK自磷酸化(D)。用不同剂量的Y15抑制剂处理细胞并用Y397以及随后用FAK抗体来进行蛋白质印迹法。用β-肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹法以控制相等的蛋白质上样。
图4E.Y15以时间依赖性方式抑制FAK自磷酸化。用100μM的Y15处理细胞1、1、4、8和24小时。以100μM的TAE226药物的24小时处理作为对照。用Y397进行蛋白质印迹法以检测Y397-FAK水平。然后剥离印迹以及用FAK和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹法。Y15对以时间依赖性方式抑制Y397-FAK磷酸化。
图5.Y15在体外直接阻断FAK激酶活性。于室温用γ-ATP32、0.1μg的纯化FAK蛋白质和不同剂量的Y15药物进行10分钟的体外激酶测定,如在材料和方法中所述。Y15以剂量依赖性方式直接阻断FAK激酶活性。
图6A.Y15引起BT474细胞的剂量依赖性细胞脱附。用不同剂量的Y15处理BT474细胞。在血细胞计数器上确定脱附作用,如在材料和方法中所述。误差棒显示三个独立实验的平均数±标准偏差。Y15显著地减少了细胞脱附。
图6B.Y15不会在BT474细胞中引起显著的细胞凋亡。对有不同剂量的Y15和TAE226药物的BT474细胞进行Hoechst染色,如在材料和方法中所述。相比较于TAE226抑制剂,利用Y15药物时未检测到显著的细胞凋亡。误差棒表示三个独立实验的平均值±标准偏差。*P<0.05对未处理过的细胞。
图6C.Y15-处理过的BT474细胞的Hoechst染色。示出Hoechst染色的细胞凋亡的细胞核。相比较于20μM剂量的TAE226抑制剂在200μM剂量的Y15抑制剂时未观察到细胞凋亡的细胞核。
图6D.Y15以剂量依赖性方式阻断细胞粘着。用不同浓度的Y15药物处理BT474细胞并测量细胞粘着,如在材料和方法中所述。100μM的TAE226抑制剂用作对照。Y15以剂量依赖性的方式显著地阻断细胞粘着。误差棒显示四个独立实验的平均值±标准误差,*P<0.05,Y15处理过的细胞的细胞粘着比未处理的对照的细胞粘着少。
图7A,B.Y15在体内对于肿瘤生长的效力。BT474乳腺癌细胞皮下注射入5只小鼠内(A)。注射后的第二天,五天每星期,每天添加30mg/kg的Y15。五只未处理的小鼠用作对照组。用测径器测量肿瘤体积。Y15在体内显著地阻断了肿瘤的生长。误差棒表示平均值±标准偏差(n=5),P<0.05,斯式t-检验。Y15抑制(block)了肿瘤重量和体积(B)。在乳腺癌细胞注射后的第23天,提取肿瘤,且分别确定重量(以克计,上图)和体积(以mm3计,下图)。Y15显著地抑制了肿瘤重量(上图)和体积(下图)。误差棒表示平均值±标准偏差。*p<0.05,斯式t-检验。
图7C,D.Y15减少肿瘤中的Y397-FAK磷酸化。我们从未处理过的小鼠和用Y15药物处理过的小鼠中分离出肿瘤。制备细胞溶胞产物,且用Y397抗体进行蛋白质印迹法(C)。FAK和β-肌动蛋白抗体用于检测总FAK水平和β-肌动蛋白水平。对未处理过的肿瘤和用Y15处理过的肿瘤用Y397-抗体进行免疫组织化学的染色分析(D)。示出来自未处理过的和Y15处理过的小鼠组的两个代表性肿瘤(在各组中标记为T1和T2肿瘤)(C,D)。相比较于未处理过的小鼠,在用Y15(30mg/kg)处理过的肿瘤中Y15减少了Y397FAK。
图8A,B,C.Y15对于胰腺癌细胞系和FAK野生型以及缺失型成纤维细胞的效力。将剂量逐渐增加的Y15添加至Panc-1(A)和Miapaca-2(B)细胞中72小时并进行MTT测定,如在材料和方法中所述。已知的FAK抑制剂,TAE226(Novartis)用作对照。误差棒显示平均值±标准偏差,*p<0.05相对于未处理过的。C.Y15添加至FAK缺失和野生型MEFs中72小时并进行MTT测定。误差棒显示平均值±标准偏差,*p<0.05相对于未处理过的。
图9A,B.Y15对于FAK和ERK磷酸化的效力(A)。用不同剂量的Y15或TAE226抑制剂处理细胞24小时且用Y-397以及然后用FAK抗体和p-桩蛋白以及桩蛋白的抗体进行蛋白质印迹法(B)。用β-肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹法以控制相等的蛋白质上样。图下示出光密度测定。类似的结果在Miapaca-2细胞中可见。
图10.Y15引起胰腺癌细胞中的无显著细胞凋亡的剂量依赖性细胞脱附。Y15引起细胞存活力的剂量依赖性降低,其可能是通过胰腺癌细胞的坏死而不是肿瘤相关的成纤维细胞的坏死。用剂量逐渐增加的Y15处理细胞24小时。锥虫蓝染色示出在胰腺癌细胞中在无显著增加细胞凋亡的情况下存活力减少。在成纤维细胞中未显著减少存活力。
图11A,B.组合了吉西他滨的Y15的体外和体内效力。(A).Y15在体外增强了吉西他滨的活性。仅用吉西他滨(10μM)、仅用Y15(10μM)或者用吉西他滨(10μM)和Y15(10μM)二者的组合处理Panc-1细胞72小时。通过MTT测定确定细胞存活力。*p<0.05相对于仅用Y15或仅用吉西他滨。(B).Y15在体内显著地阻断肿瘤生长且其效力和吉西他滨处理是协同的。用Panc-1细胞皮下注射小鼠(n=5/组)。在注射后的第二天,每天用腹膜内PBS、腹膜内Y15(30mg/kg)、腹膜内仅吉西他滨(30mg/kg)或腹膜内Y15(30mg/kg)+吉西他滨(30mg/kg)对小鼠进行处理。相比较于仅用Y15或仅用吉西他滨(Gen),Y15+吉西他滨的组合显著地减少肿瘤体积。*p<0.05相对于仅用Y15或吉西他滨。
参考文献:
1.Schaller,M.D.(1996)J Endocrinol 150(1),1-7
2.Hildebrand,J.D.,Schaller,M.D.,and Parsons,J.T.(1993)Journal ofCell Biology 123(4),993-1005
3.Xing,Z.,Chen,H.C,Nowlen,J.K.,Taylor,S.J.,Shalloway,D.,andGuan,J.L.(1994)MoI Biol Cell 5(4),413-421
4.Cobb,B.S.,Schaller,M.D.,Leu,T.H.,and Parsons,J.T.(1994)Molecular & Cellular Biology 14(1),147-155
5.Schaller,M.D.,Hildebrand,J.D.,Shannon,J.D.,Fox,J.W.,Vines,R.R.,and Parsons,J.T.(1994)Molecular & Cellular Biology 14(3),1680-1688
6.Hanks,S.K.,and Polte,T.R.(1997)Bioessays 19(2),137-145
7.Golubovskaya,V.M.,and Cance,W.G.(2007)Int Rev Cytol 263,103-153
8.Smith,C.S.,Golubovskaya,V.M.,Peck,E.,Xu,L.H.,Monia,B.P.,Yang,X.,and Cance,W.G.(2005)Melanoma Res 15(5),357-362
9.Xu,L.-h.,Yang,X.-h.,Bradham,C.A.,Brenner,D.A.,Baldwin,A.S.,Craven,R.J.,and Cance,W.G.(2000)J.Biol.Chem.275,30597-30604
10.Golubovskaya,V.,Beviglia,L.,Xu,L.H.,Earp,H.S.,3rd,Craven,R.,and Cance,W.(2002)J Biol Chem 277(41),38978-38987
11.Haider,J.,Landen,C.N.,Jr.,Lutgendorf,S.K.,Li,Y.,Jennings,N.B.,Fan,D.,Nelkin,G.M.,Schmandt,R.,Schaller,M.D.,and Sood,A.K.(2005)Clin Cancer Res 11(24 Pt 1),8829-8836
12.Beierle,E.A.,Trujillo,A.,Nagaram,A.,Kurenova,E.V.,Finch,R.,Ma,X.,Vella,J.,Cance,W.G.,and Golubovskaya,V.M.(2007)J Biol Chem 282(17),12503-12516
13.McLean,G.W.,Carragher,N.O.,Avizienyte,E.,Evans,J.,Brunton,V.G.,and Frame,M.C.(2005)Nat Rev Cancer 5(7),505-515
14.van Nimwegen,M.J.,and van de Water,B.(2006)Biochem Pharmacol
15.Golubovskaya,V.M.,Virnig,C,and Cance,W.G.(2007)MoI Carcinog
16.Liu,T.J.,LaFortune,T.,Honda,T.,Ohmori,O.,Hatakeyama,S.,Meyer,T.,Jackson,D.,de Groot,J.,and Yung,W.K.(2007)MoI Cancer Ther 6(4),1357-1367
17.Slack-Davis,J.K.,Martin,K.H.,Tilghman,R.W.,Iwanicki,M.,Ung,E.J.,Autry,C,Luzzio,M.J.,Cooper,B.,Kath,J.C,Roberts,W.G.,and Parsons,J.T.(2007)J BiolChem 282(20),14845-14852
18.Haider,J.,Lin,Y.G.,Merritt,W.M.,Spannuth,W.A.,Nick,A.M.,Honda,T.,Kamat,A.A.,Han,L.Y.,Kim,T.J.,Lu,C,Tari,A.M.,Bommann,W.,Fernandez,A.,Lopez-Berestein,G.,and Sood,A.K.(2007)Cancer Res 67(22),10976-10983
19.Sandberg,E.M.,Ma,X.,He,K.,Frank,S.J.,Ostrov,D.A.,and Sayeski,P.P.(2005)J Med Chem 48(7),2526-2533
20.Ceccarelli,D.F.,Song,H.K.,Poy,F.,Schaller,M.D.,and Eck,M.J.(2006)J Biol Chem 281(1),252-259
21.Golubovskaya,V.M.,Finch,R.,Kweh,F.,Massoll,N.A.,Campbell-Thompson,M.,Wallace,M.R.,and Cance,W.G.(2007)MoICarcinog,Sept.11[Epub]
22.Golubovskaya,V.M.,Finch,R.,and Cance,W.G.(2005)J Biol Chem280(26),25008-25021
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在对本文变量的任何定义中对一系列的化学基团的引述包括作为任何单个基团形式的或所列出基团的组合形式的变量的定义。对本文变量的实施方案的引述包括作为任何单个实施方案形式的或与任何其他实施方案或其部分的组合形式的实施方案。
尽管参照具体的实施方案公开了本发明,但是本领域其他技术人员显然可以在不偏离本发明实际精神与范围时设计出本发明其他实施方案和变化方案。权利要求应理解为包括所有这些实施方案和等价变化。
Claims (12)
2.权利要求1所述的用途,其中所述化合物能减少肿瘤中的Y397-FAK磷酸化。
3.权利要求1所述的用途,其中所述化合物在体外减少FAK自磷酸化。
4.权利要求1所述的用途,其中所述化合物在体内减少FAK自磷酸化。
5.权利要求1所述的用途,其中所述癌症是乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌或黑素瘤。
7.能够抑制FAK的Y397磷酸化的化合物在制备用于治疗受试者癌症的药物组合物中的用途,其中所述化合物是:
Y11:3,5,7-三氮杂-1-氮三环(3.3.1.13,7)癸烷,1-(2-羟乙基)-,溴化物;
Y15:1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐;
Y30:9-硫杂-1,3,6,8-四氮杂三环[4.3.1.1(3,8)]十一烷,9,9-二氧化物。
8.权利要求7所述的用途,其中抑制FAK的Y397磷酸化从而实现对癌细胞的凋亡或细胞增殖的调节。
9.权利要求7所述的用途,其中所述癌症是乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌或黑素瘤。
10.Y15:1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐和吉西他滨的组合在制备用于治疗受试者癌症的药物组合物中的用途。
11.权利要求10所述的用途,其中Y15:1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐能够抑制FAK的Y397磷酸化以及吉西他滨是另外的治疗试剂。
12.权利要求10或11所述的用途,其中所述癌症是乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌或黑素瘤。
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