CN100339098C - 黄连解毒汤在制备防治肿瘤化疗耐药性的药物应用 - Google Patents

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本发明涉及一种黄连解毒汤在制备预防肿瘤化疗耐药性药物的应用，黄连解毒汤的药用原料为黄连3-9克，黄芩3-9克，黄柏3-9克，栀子6-12克，属于黄连解毒汤的新用途。通过实验可以证明，黄连解毒汤预防给药可以明显增加模拟临床化疗所诱导的小鼠S180细胞凋亡率，增加细胞凋亡因子Fas的表达率，降低黏附因子CD54表达率；明显抑制肿瘤细胞多药耐药的产生；抑制细胞DNA TOPOⅡ活性，降低细胞对化疗药物的耐药性；有利于化疗药物的吸收，从而逆转肿瘤细胞多药耐药。

Description

黄连解毒汤在制备防治肿瘤化疗耐药性的药物应用
(一)所属技术领域
本发明涉及一种黄连解毒汤在制备预防治疗肿瘤化疗耐药性药物的应用，属于黄连解毒汤的新用途。
(二)背景技术
黄连解毒汤原载于《外台秘要》，主要由黄连、黄芩、黄柏和栀子四味药组成，为清热解毒代表方。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用黄连解毒汤来制备预防肿瘤化疗耐药性的药物。
本发明是通过以下措施来实现的：黄连解毒汤在制备预防肿瘤化疗耐药性药物的应用，黄连解毒汤的药用原料为黄连3-9克，黄芩3-9克 黄柏3-9克 栀子6-12克。
黄连解毒汤的制备方法，可以采用普通的水煎液，过滤后口服；也可以采用醇提法提取，提取液浓缩后，制成普通的剂型。
现代药物学研究证实，黄连解毒汤含有小檗碱(berberine)、黄连碱(coptisine)、甲基黄连碱(worenine)、药根碱(jatrorrhizine)、黄柏碱(phellodedrine)、掌叶防己碱(palmatine)、蝙蝠葛碱(menisperine)等多种生物碱，中药生物碱是一类有广泛生物效应的中药成份。
通过实验可以证明，黄连解毒汤预防给药可以明显增加模拟临床化疗所诱导的小鼠S180细胞凋亡率，增加细胞凋亡因子Fas的表达率，降低黏附因子CD54表达率。黄连解毒汤预防给药可以明显降低模拟临床化疗所诱导的小鼠S180细胞耐药基因MDR的表达产物P170、肺耐药蛋白LRP的表达，抑制细胞拓扑异构酶II(TOPOII)的活性明显抑制肿瘤细胞多药耐药的产生。黄连解毒汤逆转肿瘤获得性多药耐药的作用机制，抑制细胞DNA TOPOII活性，降低细胞对化疗药物的耐药性；有利于化疗药物的吸收，从而逆转肿瘤细胞多药耐药。
(四)具体实施方式
实施例1：
取黄连9克，黄芩6克，黄柏6克，栀子9克合并，加水煎煮两次，合并煎煮液，分为两份，口服，早晚各一次。
实施例2：
取黄连4千克，黄芩8千克，黄柏8千克，栀子6千克，合并后粉碎成细粉，加入8倍重量75％的乙醇，提取两次，合并提取液，过滤，减压回收乙醇，浓缩成干浸膏，粉碎后加入适量的淀粉制成片剂，0.5g/片，共计10000片。
用法与用量：口服，一日三次，每次2片。
实施例3：
黄连6g，黄柏6g，黄芩6g，，栀子6g粉碎70％乙醇回流提取，2次，每次1.5h，旋蒸40℃蒸发得干膏5.7g，研磨为细粉配成1％和0.5％的混悬液。
测试例1：黄连解毒汤对多药耐药小鼠S180肿瘤细胞凋亡、凋亡因子Fas及CD54表达的影响
1.试验材料
1.1试验药品：黄连解毒汤由我院植化室杨书斌教授协助制备，与实施例3基本相同；注射用顺铂：山东齐鲁制药厂产品，批号：01111611；环磷酰胺：上海华联制药有限公司产品，批号：030703；5-氟尿嘧啶：天津金耀氨基酸有限公司产品，批号：国药准字H12020959。
1.2试验动物：昆明种小鼠，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字：200210023；小鼠S180腹水型瘤种鼠：由山东医科大学药物所药理室提供。
2.试验方法
2.1小鼠分组及给药
18-22g，随机分为4组，每组14只，分别为正常对照S180组、模型组、黄连解毒汤100mg/kg和50mg/kg组，无菌抽出3只S180小鼠腹水，由无菌NS稀释至含瘤细胞1×106/ml，摇匀，每只小鼠腹腔接种0.2ml，接种24h后(除正常对照组外)，均开始给予顺铂3mg/kg·ip，每周一次；环磷酰胺和5-FU各3mg/kg·ig，每天一次。接种第15天，存活的小鼠无菌抽出腹水，一对一传代，传代24h后，再给予上述化疗药物。在化疗诱导的同时，模型组和正常对照小鼠S180组，给予凉开水0.2ml/10g·ig，黄连解毒汤2/kg和50mg/kg组分别给予0.5％、0.25％的黄连解毒汤混悬液0.2ml/10g·ig，共给药四周，停药24h后，无菌抽出各小鼠腹水2ml，入肝素抗凝试管中，1500rpm离心5min，去除上清液，由PH7.4 PBS液漂洗，离心洗脱3次，以70％乙醇，1.0ml固定，4℃保存，待测。
2.2细胞凋亡测定
70％乙醇固定的小鼠S180细胞，PI染色前，由PBS液稀释后再离心洗脱一次，并调至含肿瘤细胞1×106/ml，摇匀，取细胞混悬液500μl，加入10μg/ml的PI工作液500μl，37℃避光反应30min后，由FACScan流式细胞仪，激发光351nm荧光散射检测，每标本1万个细胞，测试数据由Macintosh650计算机应用ModiFit软件(美国BD公司提供)，分析数据。
2.3Fas和CD54表达的检测
取70％乙醇固定的小鼠S180细胞，由PH7.4PBS液稀释后，1500rpm离心5min，再次洗脱一次，并调整细胞浓度为1×106/ml，摇匀，取细胞悬液500μl，加入各自相对应的异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人的单克隆抗体IgG1工作液20μl，另各取一支阴性对照抗IgG1-FITC，37℃避光反应30min后，由流式细胞仪荧光检测。仪器的检测变异系数＜2％，测定1万个细胞的上述2种相关生物分子的表达，激发光波长均为488nm。
3试验结果
3.1预防给药对化疗诱导耐药小鼠S180细胞凋亡的影响
取70％乙醇固定的各组S180细胞，由PH7.4PBS液洗脱后，并调整细胞浓度至1×106/ml后，取细胞悬液PI染色，37℃避光反应30min后，由流式细胞仪荧光检测，激发光为488nm，测得各组小鼠S180细胞凋亡率，如表1
表1预防给药对多药耐药小鼠S180细胞凋亡的影响 X±SD
  组别   N   凋亡率   增加率(％)
  正常S180细胞组   11   2.07±1.13**   ——
  模型细胞组   10   4.47±2.17   115.94&
  黄连解毒汤100mg/kg   10   14.82±6.32***   231.54
  黄连解毒汤50mg/kg   10   11.87±5.36***   165.55
注：与模型组比较：“**”P＜0.01，“***”P＜0.001；“&”与化疗诱导四周组比较；增加率(％)＝(生物碱组-模型组)÷模型组×100％。
试验结果提示：黄连解毒汤明显增加化疗诱导而致的小鼠S180细胞的凋亡(P＜0.001)，说明其干预化疗获得性多药耐药与其促进耐药细胞凋亡有关，增加耐药肿瘤细胞凋亡可能黄连解毒汤干预肿瘤细胞多药耐药的重要机制之一。
3.2预防给药对化疗诱导多药耐药小鼠S180肿瘤细胞凋亡因子Fas(CD95)表达的影响
取经PBS液再次洗脱的70％乙醇固定的小鼠S180细胞，由PBS调整细胞浓度为1×106/ml，由Fas荧光单克隆抗体IgG1结合20min，由流式细胞仪荧光检测，激发波长488nm，结果如表2
表2预防给药对耐药基因小鼠S180细胞Fas(CD95)表达的影响 X±SD
  组别   N   Fas表达率   增加率(％)
  正常S180细胞组模型细胞组黄连解毒汤100mg/kg   111010   7.21±3.8811.15±7.3458.18±22.76***   ——54.65&421.74
  黄连解毒汤50mg/kg   10   49.67±23.12***   345.47
注：与模型组比较：“***”P＜0.001；“&”与化疗诱导四周组比较；增加率(％)＝(生物碱组-模型组)÷模型组×100％。
试验结果提示：黄连解毒汤对化疗诱导的多药耐药小鼠S180细胞Fas表达率有明显的增强作用，说明中药生物碱增加耐药S180细胞凋亡，与其增加凋亡基因Fas(CD95)表达相关。
3.3预防给药对化疗诱导多药耐药小鼠S180肿瘤细胞黏附分子CD54表达的影响
细胞处理与检测均同3.1，荧光检测各组小鼠耐药S180细胞黏附因子CD54表达，如表3。
表3预防给药对耐药基因小鼠S180黏附因子CD54表达的影响 X±SD
  组别   N   CD54表达率   抑制率(％)
  正常S180细胞组模型细胞组黄连解毒汤100mg/kg黄连解毒汤50mg/kg   11101010   89.44±37.4879.75±37.447.89±2.76***20.65±5.78   ——10.83&90.1112.67
注：与模型组比较：“***”P＜0.001。“&”与化疗诱导四周组比较，增加率(％)＝(生物碱组-模型组)÷模型组×100％。
试验结果提示：诱导4周与再传代10天S180细胞的CD54表达率基本一致，黄连解毒汤明显抑制耐药S180细胞黏附因子CD54的表达率，降低了细胞间黏附性，抑制肿瘤细胞的黏附转移，从而提高了化疗效果。说明降低耐药肿瘤细胞黏附作用，可能也是生物碱逆转肿瘤多药耐药的机制之一。
讨论：
肿瘤细胞多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一，与肿瘤患者死亡密切相关，干预和逆转肿瘤多药耐药，提高化疗疗效，对于肿瘤治疗有着积极的意义。
肿瘤化疗获得性多药耐药MDR的发生时，肿瘤细胞凋亡基因Fas表达降低、降低肿瘤细胞凋亡率；细胞黏附因子CD54表达增强，促进肿瘤细胞黏附转移，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低[4～6]。阻止化疗药物作用于肿瘤细胞，而产生耐药性。我们应用模拟临床肿瘤患者临床化疗诱导小鼠S180细胞表达产生耐药性，观察黄连解毒汤体内给药对肿瘤细胞耐药细胞凋亡率及相关生物活性物质细胞凋亡因子Fas、CD54表达的影响，结果可知黄连解毒汤预防给药可以明显增加模拟临床化疗所诱导的小鼠S180细胞凋亡率，增加细胞凋亡因子Fas的表达率，降低黏附因子CD54表达率。说明黄连解毒汤预防给药可以通过上述途径抑制肿瘤细胞多药耐药的产生，这对于应用中药临床防止和降低化疗多药耐药的发生、提高临床化疗疗效具有重要指导意义。
测试例2：黄连解毒汤提取物对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞P170、LRP、TOPOII表达的影响
1.试验材料
1.1试验药品：黄连解毒汤醇提物由我院植化室杨书斌教授协助制备，与实施例3基本相同；注射用顺铂：山东齐鲁制药厂产品，批号：01111611；环磷酰胺：上海华联制药有限公司产品，批号：030703；5-氟尿嘧啶：天津金耀氨基酸有限公司产品，批号：国药准字H12020959。
1.2试验动物：昆明种小鼠，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字：200210023；小鼠S180腹水型瘤种鼠：由山东医科大学药物所药理室提供。
1.3试验试剂：碘化嘧啶PI：C27H34N4I2，编号[25535-16-4]，美国Sigarm公司产品，批号：NO.247-081-0；MDR表达产物P170(P-糖蛋白、P-gp)、TOPOII、LRP、异硫氢酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体IgC1及免疫阴性对照品IgC1-FITC均由美国pharmingen公司产品，由北京岳泰生物公司提供。
2.试验方法
2.1分组及给药
18-22g，随机分为4组，每组14只，分别为正常对照S180组、模型组、黄连解毒汤100mg/kg和50mg/kg组，无菌抽出3只S180小鼠腹水，由无菌NS稀释至含瘤细胞1×106/ml，摇匀，每只小鼠腹腔接种0.2ml，接种24h后(除正常对照组外)，均开始给予顺铂3mg/kg·ip，每周一次；环磷酰胺和5-FU各3mg/kg·ig，每天一次[1]。接种第15天，存活的小鼠无菌抽出腹水，一对一传代，传代24h后，再给予上述化疗药物。在化疗诱导的同时，模型组和正常对照小鼠S180组，给予凉开水0.2ml/10g·ig，黄连解毒汤100mg/kg和50mg/kg组分别给予0.5％、0.25％的黄连解毒汤混悬液0.2ml/10g·ig，共给药四周，停药24h后，无菌抽出各小鼠腹水2ml，入肝素抗凝试管中，1500rpm离心5min，去除上清液，由PH7.4PBS液漂洗，离心洗脱3次，以70％乙醇，1.0ml固定，4℃保存，待测。
2.2P170、TOPOII、LRP表达的检测
取70％乙醇固定的小鼠S180细胞，由PH7.4PBS液稀释后，1500rpm离心5min，再次洗脱一次，并调整细胞浓度为1×106/ml，摇匀，取细胞悬液500μl，加入各自相对应的异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人的单克隆抗体IgG1工作液20μl，另各取一支阴性对照抗IgG1-FITC，37℃避光反应30min后，由流式细胞仪荧光检测。仪器的检测变异系数＜2％，测定1万个细胞的上述5种相关生物分子的表达，激发光波长均为488nm。
3.试验结果
3.1对化疗诱导的多药耐药腹水型小鼠S180肉瘤细胞MDR表达产物P170(P-糖蛋白、P-gp)的影响
在给予化疗药物诱导的同时给予黄连解毒汤醇提物，连续四周，测得各组小鼠S180腹水细胞P170，表达率如表4。
表4预防给药对获得性多药耐药小鼠S180细胞膜糖粘蛋白P170表达的影响 X±SD
  组别   N   表达率   抑制率(％)
  正常S180细胞组模型细胞组黄连解毒汤醇提物高剂量   111010   3.61±1.75***13.13±5.336.12±3.32***   ——53.39
  黄连解毒汤醇提物低剂量   10   8.35±2.36**   36.41
注：与模型对照组比较：“**”P＜0.01，“***”P＜0.001。
试验结果提示：经模拟临床化疗诱导4周后，腹水型小鼠S180细胞其P170表达明显增加；黄连解毒汤醇提物显著抑制化疗诱导后的S180细胞P170的表达，说明其预防给药可以明显降低肿瘤细胞耐药基因的表达，干预获得性多药耐药的发生。
3.2预防给药对小鼠获得性多药耐药S180细胞多药耐药相关蛋白LRP表达的影响
70％乙醇固定后的各组小鼠S180细胞，由免疫荧光单抗体IgG1结合后，由流式细胞仪检测其荧光强度，统计小鼠耐药S180肿瘤细胞肺耐药LRP表达率如表5
表5预防给药对小鼠获得性多药耐药S180细胞多药耐药相关蛋白LRP表达的影响X±SD
  组别   N   LRP表达率   抑制率(％)
  正常S180细胞组模型细胞组黄连解毒汤醇提物高剂量   111011   4.99±1.75***62.73±15.245.80±3.90***   ——90.75
  黄连解毒汤醇提物低剂量   10   11.97±5.10***   80.92
注：与模型组比较：“***”P＜0.001。抑制率为：(模型组-生物碱组)÷模型组×100％(表达率)。
试验结果提示：经模拟临床化疗诱导后的小鼠S180细胞表达耐药相关蛋白肺耐药蛋白(Lung resistant protein.LRP)明显增加，而黄连解毒汤醇提物能有效的降低化疗诱导小鼠S180细胞LRP的表达率。说明抑制LRP可能是中药生物碱干预肿瘤MDR的途径之一。
3.3预防给药对化疗诱导多药耐药小鼠S180细胞DNA拓扑异构酶II(DNA，TopoisomeraseII，TOPOII)活性的影响
70％乙醇固定的S180细胞，由PH7.4PBS液洗脱后配成细胞悬液，经荧光单克隆抗性结合后，由488nm激发，测定细胞内荧光强度，检测各组细胞TOPOII活性，如表6
表6预防给药对小鼠耐药S180细胞TOPOII活性的影响 X±SD
  组别   N   topOII活性   抑制率(％)
  正常S180细胞组模型细胞组黄连解毒汤醇提物高剂量   111010   5.46±1.95***26.66±10.0215.95±8.31**   ——40.17
  黄连解毒汤醇提物低剂量   10   20.31±2.10*   23.82
注：与模型对照组S180细胞比较：“*”P＜0.05，“**”P＜0.01，“***”P＜0.001。抑制率为：(模型组-生物碱组)÷模型组×100％(表达率)。
试验结果提示：给予模拟临床化疗诱导后小鼠S180细胞TOPOII活性明显增强，而黄连解毒汤醇提物明显抑制化疗诱导后S180细胞的TOPOII活性，说明抑制TOPOII活性是中药生物碱干预肿瘤细胞MDR的途径之一。
讨论：
肿瘤细胞多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一，与肿瘤患者死亡密切相关，干预和逆转肿瘤多药耐药，提高化疗疗效，对于肿瘤治疗有着积极的意义。
肿瘤化疗获得性多药耐药MDR的发生，可见到肿瘤细胞多药耐药基因、耐药蛋白过度表达，肿瘤细胞DNA拓扑异构酶TOPOII等相关酶活性增加等表现。耐药基因和耐药蛋白的过度表达时，可将化疗药物经跨膜转运排出细胞并阻止药物进入细胞核，使化疗药物不能发挥细胞毒性作用；TOPOII活性增强，增强DNA修复能力，拮抗化疗药物的细胞毒性，还原性谷胱苷肽酶活性增加，与化疗药物结合，阻止化疗药物作用于肿瘤细胞，而产生耐药性。
我们应用模拟临床肿瘤患者临床化疗诱导小鼠S180细胞表达产生耐药性，观察黄连解毒汤醇提物体内给药对肿瘤细胞耐药相关生物活性物质P170、LRP、TOPOII表达的影响，结果可知黄连解毒汤醇提物预防给药可以明显降低模拟临床化疗所诱导的小鼠S180细胞耐药基因MDR的表达产物P170、肺耐药蛋白LRP的表达，抑制细胞拓扑异构酶II(TOPOII)的活性。说明黄连解毒汤醇提物预防给药可以明显抑制肿瘤细胞多药耐药的产生，其干预机制可能是通过对耐药基因和耐药蛋白表达的调控，相关酶活性的影响而实现的。
测试例3：黄连解毒汤提取物逆转小鼠S180细胞多药耐药相关分子P170、LRP、TOPOII表达的研究
1.试验材料
1.1试验药品：黄连解毒汤由我院植化室杨书斌教授协助制备，与实施例3基本相同；注射用顺铂：山东齐鲁制药厂产品，批号：01111611；环磷酰胺：上海华联制药有限公司产品，批号：030703；5-氟尿嘧啶：天津金耀氨基酸有限公司产品，批号：国药准字H12020959。
1.2试验动物：昆明种小鼠，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字：200210023；小鼠S180腹水型瘤种鼠：由山东医科大学药物所药理室提供。
1.3试验试剂：碘化嘧啶PI：C27H34N4I2，编号[25535-16-4]，美国Sigarm公司产品，批号：NO.247-081-0；MDR1表达产物P170、TOPOII、LRP、异硫氢酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体IgC1及免疫阴性对照品IgC1-FITC均由美国pharmingen公司产品，由北京岳泰生物公司提供。
2.试验方法
2.1小鼠S180细胞肿瘤耐药模型的建立及小鼠分组
S180小鼠(腹水型)经模拟化疗PFC方案，顺铂3mg/kg·ip，每周一次；环磷酰胺和5-FU各3mg/kg·ig，每日一次，连续四周，(两周时一对一传代一次)。获得耐药小鼠S180模型，无菌抽取化疗诱导4周的耐药小鼠S180腹水，无菌NS稀释至含细胞数1×106/ml，每鼠0.2ml·ip接种，并取各化疗诱导4周的耐药小鼠S180腹水2ml，肝素抗凝，PBS液洗脱三次后，70％乙醇固定，4℃保存。小鼠接种耐药S180细胞后24h，随机分为对照组、黄连解毒汤100mg/kg、50mg/kg组，每组14只，对照组为水0.2ml/10g·ig，黄连解毒汤100mg/kg和50mg/kg组分别给予0.5％、0.25％的黄连解毒汤混悬液0.2ml/10g·ig，连续10天，于末次给药24h后，无菌抽出腹水，肝素抗凝，PH7.4PBS液洗涤，1500rpm离心5min，共3次，后70％乙醇固定，4℃保存，备测。
2.2MDR1表达产物P170、TOPOII、LRP表达的检测方法
取70％乙醇固定的小鼠S180细胞，由PH7.4PBS液稀释后，1500rpm离心5min，再次洗脱一次，并调整细胞浓度为1×106/ml，摇匀，取细胞悬液500μl，加入各自相对应的异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人的单克隆抗体IgG1工作液20μl，另各取一支阴性对照抗IgG1-FITC，37℃避光反应20min后，由流式细胞仪荧光检测。仪器的检测变异系数＜2％，测定1万个细胞的上述5种相关生物分子的表达，激发光波长均为488nm。
3.试验结果
3.1对化疗诱导的多药耐药腹水型小鼠S180肉瘤细胞MDR1表达产物P170(P-糖蛋白、P-gp)过度表达的逆转作用
取70％乙醇固定的各鼠多药耐药S180肿瘤细胞，由PH7.4PBS液，以1500rpm离心5min再次洗涤，并配成细胞浓度为1×106/ml悬液，由荧光P170单克隆抗体IgG1标记避光30min，由流式细胞仪测定各鼠S180细胞荧光强度，统计分析各组小鼠S180肿瘤细胞P170表达率，如表7。
表7黄连解毒汤提取物对化疗诱导的多药耐药小鼠S180细胞P170过度表达的逆转作用 X±SD
组别 n 表达率 抑瘤率(％)
  化疗诱导四周组对照组黄连解毒汤100mg/kg   91110   24.01±7.4828.12±9.795.52±2.61***   ——17.12&80.37
  黄连解毒汤50mg/kg   10   9.16±3.67***   67.43
注：与诱导后传代对照组比较：“***”P＜0.001；“&”与化疗诱导四周组比较；抑瘤率(％)＝(对照组-给药组)÷对照组×100％。
试验结果提示：诱导4周的和再传代10天后对照组小鼠S180肿瘤细胞肿瘤多药耐药相关基因P170表达无显著性差异，说明诱导后的耐药小鼠S180细胞的基因表达较为稳定。黄连解毒汤明显逆转对耐药小鼠S180细胞耐药基因P170过度表达。说明黄连解毒汤逆转化疗诱导的多药耐药细胞耐药基因P170表达是其逆转肿瘤多药耐药的重要途径之一。
3.2黄连解毒汤提取物逆转获得多药耐药小鼠S180细胞肺耐药蛋白LRP过度表达
各组小鼠耐药S180细胞测试前处理如3.1，细胞经避光反应30min，与荧光单克隆IgG1结合，流式细胞仪检测结果如表8。
表8黄连解毒汤提取物逆转耐药S180细胞LRP过度表达的影响 X±SD
  组别   n   LRP表达率   抑制率(％)
  化疗诱导四周组对照组黄连解毒汤100mg/kg   91110   70.21±21.7567.65±25.426.86±3.39***   ——-3.65&89.86
  黄连解毒汤50mg/kg   10   10.76±6.28***   84.09
注：与诱导后传代对照组比较：“***”P＜0.001；“&”与化疗诱导四周后比较；抑瘤率(％)＝(对照组-给药组)÷对照组×100％。
试验结果提示：经化疗诱导4周后传代10天的小鼠耐药S180肿瘤细胞LRP表达率与诱导4周比较无明显变化，而给予黄连解毒汤明显逆转了耐药S180肿瘤细胞LRP的过度表达，说明生物碱具有逆转耐药肿瘤细胞LRP过度表达的作用，这可能是生物碱逆转多药耐药的机制之一。
3.3生物碱逆转小鼠S180耐药细胞DNA拓扑异构酶TOPOII表达
各组小鼠S180耐药细胞前处理如3.1，测试前室温避光反应30min，荧光单克隆抗体IgG1结合20min，测定结果如表9。
表9黄连解毒汤提取物逆转小鼠S180耐药细胞TOPOII表达的影响 X±SD
  组别   N   topOII表达率   抑制率(％)
  化疗诱导四周组对照组黄连解毒汤100mg/kg   91110   22.57±12.3824.45±14.356.18±3.78***   ——8.33&74.72
  黄连解毒汤50mg/kg   10   8.58±4.10***   64.91
注：与诱导传代后对照组比较：“***”P＜0.001；“&”与化疗诱导四周比较；抑瘤率(％)＝(对照组-给药组)÷对照组×100％。
试验结果提示：黄连解毒汤显著逆转由化疗诱导后的获得性耐药小鼠S180细胞TOPOII的过度表达，而诱导后传代10天的对照组与诱导后4周时其表达率无明显差异，说明黄连解毒汤通过逆转TOPOII的过度表达，干预化疗多药耐药的逆转。
4.讨论
抑制肿瘤多药耐药基因、耐药蛋白和肿瘤细胞TOPOII的表达，促进多药耐药肿瘤细胞凋亡是公认的逆转获得性肿瘤多药耐药(MDR)的有效途径。中药生物碱是一类具有多种生物活性的中药成份，其抗菌、抗心律失常、钙拮抗和降血糖等作用已被医药界广泛接受，粉防己碱体外对K562等细胞系的耐药性的影响近年也有报告[8]。我们以模拟临床化疗PFC方案成功的诱导了小鼠S180细胞多药耐药相关因子过度表达的在体细胞模型，以中药最常见的口服给药观察中药常见生物碱对小鼠耐药S180细胞耐药相关因子的表达的逆转和细胞凋亡的影响，实验结果提示：黄连解毒汤明显降低小鼠耐药S180细胞多药耐药基因MDR1的表达产物P170、肺耐药蛋白LRP和细胞DNA拓扑异构酶TOPOII的表达。说明黄连解毒汤逆转肿瘤获得性多药耐药的作用机制，与其降低多药耐药相关基因(MDR1，MDR1是肿瘤耐药的主要表达基因，其主要由粘蛋白P170也称为P-gp构成)和耐药相关蛋白LRP表达从而抑制化疗药物毒性；抑制细胞DNA TOPOII活性，降低细胞对化疗药物的耐药性；有利于化疗药物的吸收，从而逆转肿瘤细胞多药耐药。
测试例4：黄连解毒汤逆转小鼠耐药S180肉瘤化疗抗性；
1.试验材料
1.1试验药品：黄连解毒汤由我院植化室杨书斌教授协助制备，与实施例3基本相同；注射用顺铂：山东齐鲁制药厂产品，批号：01111611；环磷酰胺：上海华联制药有限公司产品，批号：030703；5-氟尿嘧啶：天津金耀氨基酸有限公司产品，批号：国药准字H12020959。
1.2试验动物：昆明种小鼠，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字：200210023；小鼠S180腹水型瘤种鼠：由山东医科大学药物所药理室提供。
2.试验方法
2.小鼠S180细胞肿瘤耐药模型的建立及黄连解毒汤逆转化疗抗性的作用
S180小鼠(腹水型)经模拟化疗PFC方案，顺铂3mg/kg·ip，每周一次；环磷酰胺和5-FU各3mg/kg·ig，每日一次，连续四周，(两周时一对一传代一次)。获得耐药小鼠S180模型，无菌抽取化疗诱导4周的耐药小鼠S180腹水，无菌NS稀释至含细胞数1×106/ml，每鼠0.2ml·ip接种于左腋下，随机分为对照组、黄连解毒汤100mg/kg加环磷酰胺20mg/kg和环磷酰胺20mg/kg，每组14只，对照组为水0.2ml/10g·ig，连续给药10天，于末次给药24h后，剥离肿瘤，电子天平称重，结果如表10：
表10黄连解毒汤提取物逆转小鼠耐药S180肉瘤化疗抗性 X±SD
  组别   N   肿瘤重mg   抑制率(％)
  对照组环磷酰胺20mg/kg黄连解毒汤100mg/kg加环磷酰胺20mg/kg   141414   1.57±0.381..15±0.35**0.96.±3.78***   ——26.7542.03
试验结果提示：黄连解毒汤提取物明显提高环磷酰胺20mg/kg对耐药小鼠S180肉瘤的抑瘤率，逆转小鼠耐药S180肉瘤化疗抗性。
3.讨论
黄连解毒汤提取物明显提高环磷酰胺20mg/kg对耐药小鼠S180肉瘤的抑瘤率，说明黄连解毒汤具有逆转小鼠耐药S180肉瘤化疗抗性的作用。肿瘤化疗抗性主要因为肿瘤多药耐药的产生，降低化疗药物的抑瘤作用，黄连解毒汤提取物明显提高环磷酰胺的抑瘤作率，显示了其逆转化疗抗性的作用。

Claims (1)

1.黄连解毒汤在制备预防肿瘤化疗耐药性药物的应用，黄连解毒汤的药用原料为黄连3-9克，黄芩3-9克、黄柏3-9克以及栀子6-12克。
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