L'invenzione riguarda il metodo di preparazione di un complesso ferri-idrossido polimaltosato (ferro trivalente), particolarmente utile per la terapia e la profilassi dell'anemia, di qualità farmaceutica particolarmente pura, adatta anche per la somministrazione in pazienti ipertesi ed in donne in stato di gravidanza. Da parecchi decenni sono stati descritti in letteratura dei derivati inorganici ed organici del ferro utilizzati nella terapia e nella profilassi dell'anemia, in particolare di tipo ferropriva, e sono pure noti agli esperti nell'arte i loro metodi di preparazione o di estrazione.
Fra i sali di ferro utilizzati da tempo per la preparazione di medicinali antianemici é opportuno citare ad esempio il solfato ferroso, il citrato di ferro, il gluconato ferroso, il fumarato ferroso, il citrato di ferro ed ammonio, il complesso ferro-colina citrato, il complesso ferro-glicina solfato, il ferro-sorbitolo citrato, il ferro succinato, il ferro sorbitex (ferro sorbitolo citrato o ferro sorbitolo). E inoltre noto che il ferro biologicamente attivo nell'organismo é quello trivalente, che viene abitualmente indicato anche come Fe<+++> (oppure come Fe''' oppure anche Fe<3>) e quindi, in base a questa osservazione, i derivati di ferro trivalente sono da considerarsi più attivi dei derivati del ferro bivalente e quindi sono preferiti dai medici prescrittori.
Alcuni derivati del ferro, con maggiore frequenza quelli inorganici, possono provocare, dopo somministrazione orale (che é solitamente la via più usata per questo tipo di prodotto), degli effetti secondari indesiderati, quali disturbi gastrointestinali e digestivi, nausea e pesantezza allo stomaco. Per questo motivo, negli anni più recenti, la ricerca si era orientata su derivati organici di ferro, quali l'albuminato ferrico, il ferro-destrano complesso (poi indicato come potenziale agente carcinogenetico - Merck Index 12.ma Edizione, pagina 500, codice 2991), il ferro saccarinato, il ferro proteinsuccinato, per citarne alcuni fra i più importanti, che avrebbero potuto presentare una migliore tolleranza gastrica.
Seguendo questa linea di ricerca, agli inizi della scorsa decade, sono poi state introdotte in terapia, con notevole successo medico e commerciale, le ferritine di origine animale, in particolare quelle di origine bovina ed equina. La ferritina é una proteina largamente diffusa nel regno animale e vegetale, ed é la più ricca in ferro (trivalente) e per questa ragione é stata largamente usata, in quanto maggiormente biodisponibile degli altri derivati proteici del ferro.
Molto recentemente però le autorità sanitarie dell'Unione Europea hanno messo completamente al bando l'uso medicinale di qualsiasi estratto o derivato da organi animali in genere, bovini in particolare, a causa del potenziale pericolo di infezioni di Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE) o di Encefalopatia Spongiforme Trasmissibile (TSE) e quindi la ferritina é stata definitivamente ritirata dal mercato europeo e di molti altri stati. Pertanto di recente sono stati necessariamente rivalutati dalle società farmaceutiche i precedenti composti del ferro, specialmente quelli più tollerati dal punto di vista gastrointestinale.
Nel frattempo sono state ottenute ed utilizzate in terapia anche altre nuove sostanze, come ad esempio la eritropoietina, che é ottenuta per mezzo di processi di biotecnologia ricombinante, e per questo risulta estremamente costosa e quindi poco accessibile alla maggior parte della popolazione. Fra i composti o complessi del ferro, somministrabili per via orale come antianemici, si é cercato di dare preferenza a quelli che fossero costituiti da sali, derivati o complessi del ferro trivalente con sostanze di origine vegetale, e fra quelle più utilizzate sta rivestendo un ruolo molto importante anche il complesso ferriidrossido polimaltosato.
Questa sostanza viene attualmente ottenuta applicando metodi già noti nell'arte, che utilizzano come sostanza di partenza il cloruro ferrico (FeCl 3 ). Questo sale di ferro viene poi fatto reagire in ambiente acquoso con una destrina parzialmente idrolizzata, aggiungendo di seguito una soluzione di un sale basico di sodio o di idrato di sodio, e - a reazione avvenuta - neutralizzando la miscela di reazione risultante con acido cloridrico, fino a portarla quasi a neutralità. Dopo un adeguato riposo la miscela di reazione viene raffreddata a temperatura ambiente ed il complesso ferri-idrossido polimaltosato viene precipitato con l'ausilio di una miscela di acqua depurata e di alcol etilico o con altro solvente idoneo. Il precipitato amorfo così raccolto può essere indifferentemente essiccato con mezzi idonei già noti agli esperti nell'arte.
Tale metodo di preparazione già noto, che può essere adattato al caso specifico del prodotto in considerazione, riprodotto sperimentalmente dagli autori in vari piccoli lotti, porta ad un complesso ferri-idrossido polimaltosato le cui caratteristiche finali, pur ampiamente variabili, rispondono ai seguenti parametri:
<tb><TABLE> Columns = 2 <tb><SEP> Aspetto:<SEP> polvere di colore bruno scura <tb><SEP> Umidità:<SEP> inferiore al 15,0% <tb><SEP> Oligomeri del maltosio:<SEP> Inferiori al 10% <tb><SEP> Contenuto di Fe<3> ionico:<SEP> Inferiore al 10% <tb><SEP> Contenuto di Fe<3> legato:<SEP> 18,0-25,0% in peso <tb><SEP> Polimaltosio legato:<SEP> 20,0-50,0% in peso <tb><SEP> Cloruro di sodio (NaCI):<SEP> Inferiore al 6,0% (peso/peso % sul Fe<3)> <tb></TABLE>
Dai valori dinanzi citati risulta chiaro che parte del cloro presente nel cloruro di ferro (FeCl 3 ), utilizzato come prodotto di partenza, reagisce con il sale di sodio della sostanza basica usata come neutralizzante per formare notevoli quantità di cloruro di sodio (NaCl), che, dopo precipitazione di quest'ultimo, permane comunque come residuo in alte percentuali anche nel prodotto finale.
Questa alta percentuale di cloruro di sodio residuo costituisce una rilevante impurezza inorganica, tale da impedire l'utilizzo per uso farmaceutico e medicinale del complesso ferri-idrossido polimaltosato ottenibile dal suddetto procedimento, in quanto in certi pazienti, che vengono sottoposti a terapia antianemica con il prodotto, come ad esempio le persone ipertese (che devono seguire diete iposodiche) o le donne in stato di gravidanza, che sono fra le maggiori consumatrici di prodotti medicinali a base di ferro somministrato per via orale, possono sussistere stati patologici in cui l'ingestione di cloruro di sodio é particolarmente sconsigliata, se non addirittura controindicata.
Inoltre il prodotto così precipitato può anche contenere concentrazioni piuttosto elevate della destrina parzialmente idrolizzata di partenza ed anche di ferro ionico, che possono facilmente rimanere inglobati nel complesso ferri-idrossido polimaltosato durante il processo di precipitazione.
La presenza di importanti quantità di cloruro di sodio e delle suddette impurezze rende poi particolarmente rischioso l'impiego del complesso ferri-idrossido polimaltosato così ottenuto per la preparazioni di soluzioni iniettabili, confezionate in fiale, da utilizzare per via intramuscolare.
Pertanto il complesso ferri-idrossido polimaltosato dinanzi ottenuto, a causa del suo elevato contenuto di cloruro di sodio, é da considerasi un prodotto "grezzo", non idoneo per uso farmaceutico. Le rese del ferri-idrossido polimaltosato "grezzo" possono variare da un 60% ad un 70%, ma se il "grezzo" deve successivamente essere riprecipitato almeno una o due volte, per eliminare l'eccesso di cloruro di sodio residuo, in modo da ottenere un prodotto farmaceuticamente accettabile, la resa scende precipitosamente molto al di sotto di un 50%, talvolta al di sotto di un 40%, con la conseguente maggiorazione dei relativi costi di produzione.
Vi era quindi la necessità piuttosto impellente di produrre un complesso ferri-idrossido polimaltosato utilizzando un metodo di sintesi differente, che offrisse il vantaggio di potere ottenere un prodotto finale farmaceuticamente puro, che non avesse alti contenuti di cloruro di sodio residuo ed anche ferro ionico e oligomeri del maltosio parzialmente idrolizzati o complessi degli stessi, che non dovesse quindi essere riprecipitato ulteriormente, consentendo quindi delle rese economicamente più accettabili. Inoltre un complesso ferri-idrossido polimaltosato puro risulterebbe anche più idoneo per la preparazione di soluzioni iniettabili.
Sorprendentemente gli autori hanno scoperto che l'utilizzo di solfato ferrico, di formula Fe 2 (SO 4 ) 3 , ma ancor meglio del ferri solfato di ammonio, di formula NH 4 Fe(S0 4 ) 2 , molto più solubile in acqua del primo, disponibile commercialmente come dodecaidrato, al posto del cloruro ferrico (FeCl 3 ), unitamente all'adozione di altri importanti accorgimenti produttivi, che sono descritti di seguito, evita la formazione del residuo indesiderato di cloruro di sodio nel prodotto finale e risulta più vantaggioso economicamente, in quanto permette maggiori rese di prodotto puro.
Inoltre gli altri accorgimenti produttivi adottati permettono l'ottenimento diretto di un complesso ferri-idrossido polimaltosato praticamente privo di cloruro di sodio e che quasi non contiene oligomeri della destrina parzialmente idrolizzata e di ferro ionico e quindi un prodotto sufficientemente puro da potere essere essiccato direttamente ed utilizzato tal quale, senza la necessità di ulteriori precipitazioni aggiuntive, contribuendo così ad ottenere delle rese superiori a quelle ottenute con il metodo precedentemente noto, derivato dalla letteratura per prodotti similari. Per maggiore semplicità si riporta lo schema del metodo di fabbricazione dell'invenzione del complesso ferri-idrossido polimaltosato, che include i passaggi che caratterizzano l'invenzione stessa:
<tb><TABLE> Columns = 3 <tb>Head Col 1: Materiali/Apparecchia <tb>Head Col 2: Operazione <tb>Head Col 3: Parametri del processo <tb><SEP> Fase 1 Destrina oppure maltosio oppure miscela di maltosio/glucosio + Acqua depurata<SEP> Soluzione<SEP> Mescolamento meccanico Tempo tra 10 e 15 minuti Temperatura tra 40 DEG e 60 DEG C <tb><SEP> Fase 2 Acqua depurata + NH 4 Fe(SO 4 ) 2 oppure Fe 2 (SO 4 ) 3 <SEP> Soluzione<SEP> Mescolamento meccanico <tb><SEP> Fase 3 Soluzione di carbonato di sodio in acqua al 17%<SEP> Mescolamento<SEP> Aggiustamento di pH tra 1.8 e 2.2 <tb><SEP> Fase 4 Sodio idrato 10N<SEP> Riscaldamento<SEP> Durata: tra 15 e 30 minuti Temperatura:
tra 35 DEG e 50 DEG C <tb><SEP> Fase 5 Acido inorganico mono o bivalente<SEP> Raffreddamento Riscaldamento Raffreddamento<SEP> Aggiustamento di pH tra 5.5 e 6.5 15-35 minuti tra 25 DEG e 50 DEG C e 15-35 minuti tra 75 DEG e 95 DEG C A temperatura ambiente <tb><SEP> Fase 6 Centrifuga per filtrazione molecolare od apparecchio per dialisi<SEP> Filtrazione molecolare o dialisi attraverso membrana idonea<SEP> Eliminazione per filtrazione dei reagenti ed addotti con peso molecolare inferiore a 100.000 Dalton e concentrazione del complesso ferri-idrossido polimaltosato (trattenuto)
<tb><SEP> Fase 7 Liofilizzatore od essiccatore a corrente di aria calda<SEP> Liofilizzazione od essiccamento della soluzione concentrata<SEP> Liofilizzazione su vassoio od in essiccatore con spruzzatore in corrente d'aria calda con produzione di complesso ferriidrossido polimaltosato essiccato <tb></TABLE>
L'invenzione é soprattutto caratterizzata dal fatto che nella Fase 2 del metodo di produzione dianzi descritto viene utilizzato del solfato ferrico, od ancor meglio del ferri solfato di ammonio, molto più solubile in acqua, anziché il cloruro ferrico, dato che i primi evitano la possibile formazione di cloruro di sodio nel corso della reazione, che é in seguito difficilmente eliminabile. Un secondo importante aspetto caratteristico dell'invenzione, che gli autori hanno sorprendentemente trovato, é che si possono ottenere dei risultati qualitativi e quantitativi ancor più soddisfacenti utilizzando nella Fase 1, al posto della destrina parzialmente idrolizzata, del maltosio oppure una miscela di maltosio/glucosio, purché il contenuto di maltosio in questa miscela non sia inferiore al 70%.
Gli autori hanno anche sperimentalmente osservato che, in caso venga utilizzata una miscela di maltosio/glucosio, tanto maggiore é il titolo del maltosio utilizzato, tanto migliori risultano le rese del complesso ferri-idrossido polimaltosato ottenuto. Qualora venga utilizzato il maltosio al posto della destrina parzialmente idrolizzata, l'intensità e la durata dei trattamenti delle Fasi 3 e 4 possono essere modificate sui valori inferiori.
Nella Fase 5 l'acido inorganico utilizzato può essere un qualsiasi acido monovalente o bivalente, preferibilmente acido solforico. Un altro ulteriore aspetto che caratterizza l'invenzione é che il prodotto ottenuto dalle fasi precedenti viene purificato per mezzo di filtrazione molecolare o per mezzo di dialisi attraverso membrana, quest'ultima operazione meno vantaggiosa in quanto più lenta, utilizzando una membrana da 100.000 Dalton, in modo che si ottengono contemporaneamente con una sola operazione due scopi: a) l'eliminazione per filtrazione del ferro ionico, dei residui della destrina parzialmente idrolizzata o del maltosio o del glucosio, che non hanno reagito, degli oligomeri del maltosio o degli addotti di ferro degli stessi, di ioni e cationi che si sono formati durante le varie fasi della preparazione;
b) la concentrazione del neo-formato complesso ferri-idrossido polimaltosato, che ha un peso molecolare superiore a 100.000 Dalton e che quindi viene trattenuto dall'operazione di filtrazione molecolare. La purezza del prodotto trattenuto dalla filtrazione molecolare é tale che non vi é la necessità di una successiva precipitazione, in quanto il prodotto trattenuto nella fase acquosa può passare direttamente alla successiva fase di essiccazione. Nessun accorgimento particolare viene invece adottato nella Fase 7, operazione già ben nota, che viene citata solamente per una migliore comprensione del procedimento, ma che non costituisce oggetto della presente invenzione.
Il complesso ferri-idrossido polimaltosato ottenuto dal procedimento dell'invenzione risulta pertanto molto più puro farmaceuticamente ed é quindi utilizzabile per preparazioni medicinali, sia orali che iniettabili, senza dovere subire ulteriori purificazioni o precipitazioni, con le conseguenti perdite di prodotto. Le rese del prodotto ottenuto con il procedimento dell'invenzione variano da un 55 ad un 75%, risultando comunque di parecchio superiori alle rese ottenibili applicando con i necessari adattamenti i metodi già noti per la sintesi del complesso ferri-idrossido polimaltosato. Il prodotto risultante dal procedimento dell'invenzione ha migliori caratteristiche farmaceutiche, che vengono riportate qui di seguito:
<tb><TABLE> Columns = 2 <tb><SEP> Aspetto:<SEP> Polvere amorfa di colore bruno scura <tb><SEP> Umidità (perdita a secco):<SEP> Inferiore al 10,0% <tb><SEP> Oligomeri del maltosio:<SEP> Pressoché assenti <tb><SEP> Contenuto di Fe<3> ionico:<SEP> Assente <tb><SEP> Cloruro di sodio (NaCl):<SEP> Pressoché assente (peso/peso % sul Fe 3 ) <tb><SEP> Contenuto di Fe<3> legato:<SEP> 24,0-32,0% in peso <tb><SEP> Polimaltosio legato:<SEP> 25,0-50,0% in peso <tb></TABLE>
La migliore qualità farmaceutica del complesso ferri-idrossido polimaltosato così ottenuto é evidenziata in particolare dall'assenza di residui di cloruro di sodio e di ferro allo stato ionico e dalla assenza di quantità apprezzabili di oligomeri del maltosio, di maltosio e/o glucosio. Il metodo é anche caratterizzato per offrire un prodotto farmaceuticamente accettabile, con rese superiori a quelle ottenibili applicando i processi già noti agli esperti alla produzione di questo complesso.
Inoltre il complesso ferri-idrossido polimaltosato ottenuto con il metodo dell'invenzione può quindi essere vantaggiosamente utilizzato per la preparazione di medicinali, che pertanto possono essere utilizzati sia per via orale che per via iniettabile e, senza alcuna limitazione, anche da persone ipertese e da donne in stato di gravidanza, in quanto non contiene alti residui dannosi di cloruro di sodio e di altri prodotti secondari della sintesi.
L'invenzione é inoltre meglio illustrata nei seguenti esempi, che però non costituiscono limitazione alcuna della sostanza e delle rivendicazioni dell'invenzione stessa. Esempio 1
Preparazione di complesso ferri-idrossido polimaltosato puro, di qualità farmaceutica (167 g di Fe<+++>, corrispondente a 610 g di complesso)
800 g di destrina parzialmente idrolizzata vengono disciolti a caldo in circa 1600 ml di acqua industriale demineralizzata. Dopo completa dissoluzione, viene aggiunta una mistura preparata a parte, ottenuta sciogliendo a caldo 1027 g di Fe 2 (SO 4 ) 3 (calcolato come prodotto anidro) in 2900 ml di acqua demineralizzata. Il pH della miscela di reazione ben omogeneizzata viene portato a 2 utilizzando una soluzione al 17% di carbonato di sodio in acqua demineralizzata, che viene aggiunta molto lentamente alla miscela di reazione. Vengono successivamente aggiunti 800 g di una soluzione acquosa di idrato di sodio 10 N e la miscela risultante viene riscaldata tra 45 DEG e 50 DEG C e lasciata reagire per la durata di 30 minuti. La miscela viene poi portata a pH vicino 6 con acido solforico 3N.
Dopo un successivo breve riscaldamento tra 45 DEG e 50 DEG C, la soluzione viene portata intorno a 90 DEG C per il tempo necessario a completare la reazione. La miscela di reazione viene raffreddata a temperatura ambiente e viene introdotta in una piccola centrifuga molecolare attrezzata con apposito filtro da 100.000 Dalton, in modo da eliminare tutti i residui dei reagenti ed anche i complessi risultanti, di peso molecolare inferiore. Questa operazione consente di concentrare il prodotto formatosi, che viene trattenuto all'interno durante questa operazione.
La soluzione trattenuta, contenente prevalentemente il complesso ferri-idrossido polimaltosato allo stato puro, viene poi stesa su vassoi di acciaio inossidabile, posizionati sugli appositi sostegni all'interno del liofilizzatore, ed essiccata in modo conveniente per mezzo di un comune processo di liofilizzazione.
Resa: 58,2% di complesso ferri-idrossido polimaltosato puro, di grado farmaceutico (resa espressa come Fe<+++>). Contenuto Fe<3> legato: 27,37%. Esempio 2
Preparazione di complesso ferri-idrossido polimaltosato puro, di qualità farmaceutica (88,9 g di Fe<+++>, corrispondente a 311 g di complesso)
400 g di maltosio vengono disciolti a caldo in circa 800 ml di acqua industriale demineralizzata. Dopo la completa dissoluzione, viene aggiunta una soluzione, preparata a parte, di 1239 g di NH 4 Fe(SO 4 ) 2 . 12 H 2 O (ferri solfato di ammonio dodecaidrato) in 950 ml di acqua demineralizzata. Il pH della miscela di reazione viene portato a 2 utilizzando una soluzione al 17% di carbonato di sodio in acqua demineralizzata, che viene aggiunta molto lentamente alla miscela di reazione. Vengono successivamente aggiunti 400 g di una soluzione acquosa di idrato di sodio 10 N e la miscela risultante viene riscaldata tra 45 DEG e 50 DEG C e lasciata reagire per la durata di 30 minuti. La miscela viene poi portata a pH vicino 6 con acido solforico 3N.
Dopo un successivo breve riscaldamento a 45 DEG C, la soluzione viene portata intorno a 75 DEG C per il tempo necessario a completare la reazione. La miscela di reazione viene raffreddata a temperatura ambiente e viene introdotta in una centrifuga molecolare attrezzata con apposito filtro da 100.000 Dalton, in modo da eliminare tutti i residui dei reagenti ed anche i complessi risultanti, di peso molecolare inferiore. Questa operazione consente di concentrare il prodotto formatosi, che viene trattenuto all'interno durante questa operazione. La soluzione trattenuta, contenente prevalentemente il complesso ferri-idrossido polimaltosato allo stato puro, viene poi stesa su vassoi di acciaio inossidabile, posizionati sugli appositi sostegni all'interno del liofilizzatore, ed essiccata in modo conveniente per mezzo di un comune processo di liofilizzazione.
Resa: 62,5% di complesso ferri-idrossido polimaltosato puro, di grado farmaceutico (resa espressa come Fe<+++>). Contenuto Fe<3> legato: 28,58%. Esempio 3
Metodi di determinazione analitica dei parametri considerati del complesso ferri-idrossido polimaltosato.
Preparazione della soluzione campione : preparare una soluzione campione in acqua al 5,0% (peso/volume) di ferro. Una quantità di prodotto, pari a 5 g di ferro, viene disciolta a 20 DEG C, agitando per un'ora circa, in 80 ml di acqua distillata. Dopo completa dissoluzione, il volume viene portato a 100 ml con acqua distillata ad una t DEG di 20 DEG C e filtrata adeguatamente.
Aspetto (Specifica: polvere amorfa di colore bruno scura): esame visivo soggettivo della polvere in esame.
Umidità (Specifica: inferiore al 10,0%): l'umidità viene determinata direttamente per perdita a secco della polvere in esame, utilizzando i metodi tradizioni riportati nelle farmacopee (1 g; sotto vuoto su P 2 O 5 ; 60 minuti).
Assenza di oligomeri del maltosio (Specifica: pressoché assenti): a) adattamento del metodo pubblicato "Mahnkopf" W. e Lettenbauer G. "Kennzeichnung von Dextranen durch schnelle Flüssigchromatographie", Infusionstherapie (1979) 3: 106-109; b) diluire in 8,0 ml di acqua distillata 2,0 ml di soluzione campione ed aggiungere 1,0 ml di acido cloridrico concentrato (37%, volume/volume), riscaldando durante 5 minuti circa su bagno maria bollente, aggiungere ammoniaca (25%, volume/volume) e filtrare. Lavare con acqua il precipitato raccolto sul filtro, costituito da Fe(OH) 3 . Riprenderlo con una minima quantità di acido cloridrico 2N, diluire poi con acqua a 40 ml. Aggiungendo 4,0 ml di NH 4 SCN 2N, si ottiene una colorazione rosso sangue, costituita da Fe(SCN) 3 , che può venire anche estratto con una aliquota di alcol amilico.
Contenuto di Fe <3> ionico (Specifica: pressoché assente): Diluire 1,0 ml della soluzione campione in 4,0 ml di acqua distillata ed aggiungere 1,0 ml di NH 3 2N, mescolando bene: assenza di formazione di un precipitato bruno di idrossido ferrico.
Cloruro di sodio (NaCl) (Specifica: pressoché assente): Mettere 20 ml di soluzione da esaminare, precedentemente preparata, in una beuta di vetro da 200 ml e diluire con 120 ml di acqua distillata, aggiungendo poi 0,4 ml di acido nitrico concentrato e mescolare convenientemente. Strumenti e reagenti: agitatore magnetico, potenziometro ad elettrodo d'argento e successiva titolazione con nitrato di argento (AgNO 3 ) 0,1 N.
Calcolo: 1 ml di 0,1 N AgNO 3 = 5,844 NaCl
Effettuare la necessaria proporzione del contenuto di NaCI (peso/peso %), utilizzando il contenuto di ferro della polvere nella soluzione in esame.
Contenuto di Fe <3> (Specifica: 24,0-32,0% in peso): Pesare esattamente 600 mg del prodotto in esame e collocare in una beuta a bocca larga, aggiungere 20 ml di acido cloridrico concentrato (37,0%, volume/volume) e riscaldare sopra un bagno maria a 100 DEG C, agitando la miscela per 1-2 minuti. La dissoluzione deve essere completa. Lasciare riposare durante 5 minuti, aggiungere 200 ml di acqua distillata e 20 ml di acido acetico glaciale per analisi, e successivamente portare il pH tra 2,2 e 2,4 (controllando con un pH-metro, mescolando con un agitatore magnetico), utilizzando una soluzione acquosa di idrossido di sodio al 30% (peso/peso), che viene aggiunta alla soluzione goccia a goccia per mezzo di una buretta o di una pipetta. Aggiungere infine 0,5 ml di acqua ossigenata al 30% (peso/peso).
Aggiungere alla soluzione l'indicatore (5,0 ml di pirocatecolo sodio bisolfonato al 2,0%, peso/volume) e titolare con una soluzione acquosa di edetato disodico (EDTA Na 2 ) 0,1 M, preparato di recente, ad una temperatura compresa tra 38 DEG C e 50 DEG C, fino al viraggio completo di colore da verde ad un bel giallo deciso.
Calcolo: 1 ml edetato (EDTA) disodico 0,1 M = 5,5844 mg di Fe
Polimaltosio (contenuto) (Specifica: 25,0-50,0% in peso): il metodo si basa sull'utilizzo del reattivo "antrone" ("carbotrone" o "9(10H)-antracenone" Merck Index 12.ma Ed. monografia 730), sostanza largamente usata per la determinazione colorimetrica degli zuccheri.
Preparazione del reagente "antrone ": Pesare esattamente 300 mg di antrone in un matraccio calibrato da 150 ml. Sciacquare bene le pareti per fare scendere il prodotto che eventualmente é rimasto aderente alla parete del collo del matraccio con circa 30 ml di acqua distillata. Aggiungere poi alla soluzione, molto adagio e con molta attenzione, circa 100 ml di acido solforico concentrato, raffreddando costantemente il matraccio in acqua ghiacciata o ruotandolo sotto un rubinetto di acqua corrente. Agitare bene fino a quando tutto l'antrone é completamente sciolto, raffreddare con molta attenzione e riempire fino al segno con altro acido solforico concentrato. Soluzioni standard:
Soluzione standard: S/1 = pesare 150 mg di glucosio anidro in un matraccio dosato da 150 ml. Rimuovere all'interno il glucosio eventualmente aderente alle pareti del collo del matraccio con dell'acqua distillata e quindi portare a volume a 20 DEG C con acqua distillata.
Soluzione di Fe: F/1 = Riporre 3,0 ml della soluzione campione in esame in un matraccio da 150 ml e portare a volume con acqua distillata ad una temperatura intorno a 20 DEG C. Diluizioni:
Prelevare 30 ml della soluzione standard S/1 e riporla in un matraccio tarato da 150 ml e portare a volume con acqua distillata a 20 DEG C, ottenendo la soluzione S/2.
Prelevare 30 ml della soluzione di ferro F/1 e riporla in un matraccio tarato da 150 ml e portare a volume con acqua distillata a 20 DEG C, ottenendo la soluzione F/2. Manualità del saggio:
Preparare 6 provette da saggio con etichetta di riconoscimento, due delle quali contenenti 1,0 ml di acqua distillata, due la soluzione S/1 e due la soluzione F/1 e collocandole in un apposito portaprovette di metallo. Usando siringhe dosate da 1,0 ml, preparare le seguenti soluzioni:
1 ml di acqua distillata in ciascuna provetta marcata con l'etichetta "acqua" 1 ml di S/2 in ciascuna provetta marcata con l'etichetta "S/1" 1 ml di F/2 in ciascuna provetta marcata con l'etichetta "F/1"
Aggiungere infine a ciascuna provetta, per mezzo di una idonea pipetta da 10 ml, una quantità di 10 ml di "reattivo antrone" e mescolare accuratamente.
Le provette, collocate nell'apposito portaprovette, vengono poste in un bagno maria bollente, avendo l'avvertenza di richiudere le provette con tappi di vetro ed esattamente dopo 10 minuti (misurati con orologio a suoneria), riporle in un bagno di acqua corrente fredda. Una volta raffreddate, scuoterle 5-6 volte ed effettuare le determinazioni. Misurazione dei valori:
Usare un idoneo fotometro, determinando i valori fra 650 e 600 nm (determinare la linea 0 a 625 nm), con cuvette in vetro da 10 mm.
Confrontare le due letture in bianco delle due provette marcate "acqua" e successivamente confrontare i valori delle soluzioni S/1 ed F/1 con il valore inferiore dell'assorbanza del bianco. Calcoli:
180 mg di glucosio = 1 mmol corrispondente a
162 mg di polimaltosio = 1 mmol di glucosio anidro
ottenendo il valore in mg di polimaltosio in 2,0 ml di soluzione in esame
EMI12.1
dove:
AmF/1 = assorbanza media di F/1
AmS/1 = assorbanza media di S/1
Esempio dimostrativo;
mg di polimaltosio in 2,0 ml di soluzione in esame 82
Fe libero (% peso/peso) nella polvere 28,9
Fe (% peso/peso) nella soluzione in esame 4,96
1 ml di soluzione in esame contiene 82 : 2 = 41 mg di polimaltosio e 49,6 mg di Fe
Polimaltosio nella preparazione solida in esame (% peso/peso):
28,9 x 41,0 : 49,6 = 23,89%