CH689512A5 - Ester von Baccatin-III-Verbindungen; antitumoral und antiviral wirksame, spontan dispergierbare Konzentrate und Ultramikroemulsionen. - Google Patents

Description

  
 


 Einleitung 
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft Ester von Baccatin-Ill, 10-Deacetylbaccatin-III und 14-OH-10-Deacetylbaccatin-Ill, Herstellungsverfahren, ihre Aufarbeitung zu spontan dispergierbaren Konzentraten und wässerigen Ultramikroemulsionen und deren Verwendung zur Erzeugung von gut verträglichen Heilmitteln mit antitumoraler und/oder antiviraler, bzw. viruzider Wirksamkeit, zur Bekämpfung von Ekzemen und Schuppenflechte, sowie zur Tumorprophylaxe und Tumortherapie, wie auch zur gesteigerten Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Regulatoren. 



  Die erfindungsgemässen Ester von Baccatin-Ill, 10-Deacetylbaccatin-III und 14-OH-10-Deacetylbaccatin-III haben eine sehr gute antitumorale und antivirale, bzw. viruzide Wirkung, und sie eignen sich auch zur Behandlung von Ekzemen und Psoriasis. Die therapeutischen Eigenschaften dieser Ester treten aber erst dann massgeblich verstärkt auf, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet und darauf mit destilliertem Wasser oder 5%iger Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt worden sind, wobei sich thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen mit globulären Mizellen ausbilden, welche einen hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm aufweisen. 


 Beschreibung der Erfindung 
 



  Die erfindungsgemässen Ester von Baccatin-III, 10-Deacetylbaccatin-III und 14-Hydroxy-10-deacetylbaccatin-III haben die allgemeinen Formeln (I) bis (III): 
EMI1.1
 
 
 



  (I) = Baccatin-III; R<1> = R<3> = H, R<2> = COCH3, R<4> = H
 (II) = 10-Deacetylbaccatin-IIl; R<1> = R<2> = R<3> = R<4> = H
 (III) = 14-Hydroxy-10-Deacetylbaccatin-III; R<1> = R<2> = R<3> = H, R<4> = OH
 
 wobei in den Formeln (I) und (II) Mono- oder Diester an C(7) und/oder C(13) mit C6-32-Alkylcarbonyl, C6-32-Alkenylcarbonyl oder C6-32-Alkapolyencarbonyl oder Retinoyl als Esterkomponenten und in der Formel (III) Ester an C(7), C(13) und/oder C(14) mit diesen Esterkomponenten beansprucht sind. 



  Besonders bedeutungsvoll sind die Verbindungen der Formel (I), worin R<1> und R<3> für eine C12-22-Alkylcarbonyl-, eine C11-22-Alkenylcarbonyl- oder eine C11-22-Alkapolyencarbonylgruppe stehen. 


 Beispiele von Verbindungen nach Formel (I) sind u.a.: 
 
 



  7,13-Diundecenoylbaccatin-III
 7,13-Dilauroylbaccatin-III
 7,13-Dipalmitoylbaccatin-III
 7,13-Distearoylbaccatin-III
 7,13-Baccatin-III-di-ölsäureester
 7,13-Baccatin-III-di-linolsäureester
 7,13-Baccatin-III-di-linolensäureester
 7,13-Baccatin-III-di-arachidat
 7,13-Baccatin-III-di-behenat
 7-Lauroylbaccatin-III
 7-Palmitoylbaccatin-III 


 Beispiele von Verbindungen nach den Formeln (II) und (II) sind u.a.: 
 
 



  10-Deacetyl-7,10-dilauroylbaccatin-III
 10-Deacety1-14 beta -hydroxybaccatin-7,10,14-trilaurat
 10-Deacety1-14 beta -hydroxybaccatin-7,10-dilaurat
 10-Deacety1-14 beta -hydroxybaccatin-10,14-dilaurat 


 Das Fettschwanzprinzip und die Bildung von Ultramikroemulsionen bei Taxan-Estern 
 



  In neuerer Zeit sind mehrere Diterpene mit dem ungewöhnlichen Taxangerüst aus Vertretern der Genera Taxus, Cephalotaxus und Austrotaxus isoliert worden; siehe z.B. S. Blechert und D. Guénard in "The Alkaloids" (Ed. A. Brossi), Vol. 39, S. 195-238, Academic Press, N.Y., 1990, sowie M. Suffness und G.A. Cordell, ibid., Vol. 25, 1985. 



  Wegen ihrer teilweise ausgezeichneten cancerostatischen Wirkungen haben Taxan-Derivate grosse Aufmerksamkeit erregt. Gegenstand dieser Patentschrift sind Ergebnisse aus Untersuchungen zu den Taxan-Derivaten Baccatin-Ill, sowie seinen hydroxylierten Modifikationen 10-Deacetylbaccatin-III (10-DAS) und 10-Deacetyl-14 beta -hydroxybaccatin-III (14-OH-10-DAB). 



  Baccatin-III ist erstmals aus dem Kernholz der Eibe (Taxus baccata, L.) isoliert, charakterisiert und strukturell aufgeklärt worden: W.R. Chan, T.G. Halsall, G.M. Hornby, A.W. Oxford, W. Sabel, K. Bjömer, G. Ferguson, J. Monteath Robertson, J.Chem.Soc., Chem.Comm. 1966, 923; D.P. Della Casa de Marcano, T.G. Halsall, G.M. Hornby, ibid. 1970, 216 und 1975, 365. In biogenetischer Hinsicht ist Baccatin-111 in der Pflanze der direkte und spezifische Vorläufer von TAXOL [P.E. Fleming, A.R. Knaggs, X.-G. He, U. Mocek, H.G. Floss, J.Amer.Chem.Soc. 1994, 116, 4137]. 



  Taxol (Paclitaxel) gilt in der therapeutischen Anwendung als potentes Cytostaticum [vgl. Antitumor Compounds of Natural Origin: Chemistry and Biochemistry, Vol. II; Ed. Adorjan Aszalos, NCI, CRC Press, Boca Raton, 1980, pp. 170, 175] und als Antitumormittel; es wird gegenüber Baccatin-III als deutlich wirksamer eingestuft. Ob dies auf die Veresterung der Hydroxylgruppe an C(13) durch die substituierte Zimtsäure oder aber auf andere Faktoren zurückgeführt werden kann, ist bis heute offen geblieben. Wegen seiner relativ ausgeprägten Polarität, seinem hohen Schmelzpunkt und seiner sehr geringen Löslichkeit in Wasser bereitet Baccatin-III erhebliche Schwierigkeiten bei seiner Formulierung zu einem pharmazeutischen Präparat für die intravenöse Anwendung, was aber auch für Taxol-W.S. zutrifft. Vgl. dazu Blechert und Guénard, I.c., S. 232.

   Baccatin-Ill, wie neuerdings auch 10-De acetylbaccatin-III wurden aber als Ausgangsmaterial zu zahlreichen Partialsynthesen eingesetzt. Siehe auch: Kyriacos Costa Nicolaou et al.: "Chemie und Biologie von Taxol", Angew.Chem. 1994, 106, 38-69 und 1672-1675, sowie Lutz Heide: "Pharmazeutische Biologie im Blickpunkt", Pharmazie in unserer Zeit/23. Jahrg. 1994/Nr. 2 (pp. 100-104). 



  10-Deacetylbaccatin-III wurde aus Nadeln von Taxus baccata gewonnen (Isolierung und Strukturbestimmung: G. Chauvière, D. Guénard, F. Picod, V. Sénilh, P. Potier, C.R. Séance, Acad.Sci.Sér. 2, 1981, 293, 561) und für 10-Deacetyl-14- beta -hydroxybaccatin III wurde deren Vorkommen in Taxus wallichiana, Zucc., genutzt. Vgl. u.a. EPA 93 102 633.0/0 559 019 vom 08.09.93 (Indena S.p.A., Milano), sowie: E. Bombardelli und B. Gabetta, J.Chem.S., Perkin Trans. I (1992) (21), 2925-29; (1993) (14), 1563-6. 



  Dass die Aufbereitung von Taxol und Taxol-Analogen zu erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten und die Herstellung daraus von wässerigen Ultramikroemulsionen entscheidende Verbesserungen in der Bioverfügbarkeit und demnach der Bioreaktivität und relativen Toxizität bringen, wurde in der Patentschrift CH 688 504 vom 31. Oktober 1997 aufgezeigt. Wir haben nun gefunden, dass die Anwendung des oben erwähnten Fettschwanzprinzips, d.h. die Veresterung von Baccatin-Ill, von 10-Deacetylbaccatin-Ill, sowie von 14-HO-10-Deacetylbaccatin-III mit langkettigen Fettsäuren, und die anschliessende Einbringung in erfindungsgemässe Konzentrate ebenfalls eine bedeutende Verbesserung ihrer Kinetik und somit ihrer pharmakologischen Wirksamkeit auslöst.

   Da diese drei Verbindungen aus den Nadeln der Eibe (Taxus baccata, L., und Taxus brevifolia, Nutt.) gewonnen werden können und überdies die Totalsynthese sehr aufwendig ist, bietet sich die Nutzung einer biologisch rascher erneuerbaren Grundlage als Vorteil an; die Fällung von Taxus-Bäumen zur Gewinnung von TAXOL lässt sich demnach vermeiden. Die Grundsubstanzen, extrahiert aus Himalayan Yew, wurden von DABUR India Ltd., 22, Site IV, Sahibabad (U.P.), India, bezogen. 



  Baccatin-III enthält drei, strukturell sehr unterschiedlich reaktive Hydroxylgruppen. In Übereinstimmung mit Literaturangaben haben wir festgestellt, dass die Hydroxylgruppe an C(7) wesentlich rascher angegriffen wird als jene an C(13), was erstaunt, da die OH-Gruppe an C(13) allylischer Natur ist; für dieses Verhalten werden sterische Gründe und eine intramolekulare Wasserstoffbrücke verantwortlich gemacht. Die OH-Gruppe an C(1) wird wegen ihrer tertiären Natur und gleichzeitigen Neopentylstellung unter keinen bekannten  Bedingungen verestert. Bei den hydroxylierten Baccatinen sind die Verhältnisse wieder anders: OH-C(10) reagiert schneller als die OH-C(7); die OHC(14) wiederum langsamer als die an C(10). Somit ist es möglich, bei Veresterungen Bindungen an verschiedenen Stellen vorzunehmen. 



  Will man an Baccatin-Ill beide Hydroxylgruppen an C(7) und C(13) verestern, so sind Bedingungen zu wählen, bei denen gleichzeitig auch die Oxetanfunktion C(4)-C(5)-C(20) angegriffen werden könnte. Um dies zu vermeiden, haben wir zwar die gegenüber den Anhydriden reaktiveren Säurechloride verwendet, diese jedoch durch Zusatz von geeigneten Basen von einem möglichen Angriff auf die Oxetanfunktion abgehalten und dazu fallweise auch die entstehenden Chlorid-lonen mit Silbercyanid abgefangen. Auf diese Weise kann auch die Reaktionstemperatur zur vollständigen Reaktion allmählich gesteigert werden, sodass sich bei geeigneter Aufarbeitung Ausbeuten an Reinprodukten von bis zu 70% erreichen lassen. 



  Die erzeugten Ester sind praktisch farblos und im UV nur undeutlich fluoreszierend. Die Veresterungs-Reaktion lässt sich aber mit DC auf Kieselgelfolien durch Besprühen mit einem Cersulfat/Phosphormolybdänsäure/Schwefelsäure-Reagens und anschliessendem Heizen über dem Spiegelbrenner bequem verfolgen: der gesuchte Ester erscheint als dunkelsepiafarbiger Fleck. 10-Deacetylbaccatin-III (10-DAB) enthält vier und 14-HO-10-Deacetylbaccatin-III (14-HO-10-DAB) enthält fünf, strukturell sehr unterschiedlich reaktive Hydroxylgruppen; über deren gefundene Reaktivität siehe die entsprechenden Veresterungsansätze. 



  Die hergestellten Ester lassen sich sehr gut in erfindungsgemässe, spontan dispergierbare Konzentrate einbringen, welche unter Zusatz von destilliertem Wasser, 5%-Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung stabile \l-in-Wasser-Mikroemulsionen ergeben, mit globulären Mizellen im untersten nm-Bereich. 


 1.0 Herstellung von Estern der Verbindungen (I) bis (III) 
 


 1.1 Herstellung von 7,13-Baccatin-III-diundecenoat. 
 



  Zu einer Lösung von 550 mg Baccatin-Ill, 20 mg 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 20 mg N,N-Dimethylformamid (DMF) in 25 ml Dichlormethan werden bei Raumtemperatur 600 mg (Überschuss) 10-Undecenoylchlorid in 40 ml Dichlormethan zugetropft. Nach 2 h Rühren wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand an Kieselgel mit Cyclohexan/Essigester (90:10) als Eluiermittel chromatographisch gereinigt. Man erhält das 7,13-Baccatin-III-diundecenoat mit einem Rf-Wert in Hexan/Essigester 90:10 von 0.85, Esterbindung bei 1710 cm<-><1>  nu (C=O) Ester 


 1.2 Herstellung von 7-Lauroylbaccatin-III. 
 



  In einem gut getrockneten Dreihalskolben mit N2-Einleitrohr, Magnetrührer, Rückflusskühler und Tropftrichter werden 250 mg Baccatin-III unter N2-Atmosphäre in 0.6 ml abs. Pyridin gelöst, dann mit einigen Kriställchen von 4-Dimethylaminopyridin versetzt und unter Zugabe von 150 mg feinst gepulvertem, trockenem AgCN mit 5 ml 1,2-Dichlorethan verdünnt. Nach Kühlen im Eisbad auf 0 DEG C werden 0,2 ml Lauroylchlorid mit Hilfe einer Spritze tröpfchenweise zugegeben. Hierauf wird das Kühlbad entfernt und die Mischung während 18 h im \lbad auf ca. 45 DEG C erwärmt. 



  Zur Aufarbeitung versetzt man die Suspension mit etwas Celite TM , verdünnt mit Ether und filtriert die Suspension. Das Filtrat wird im Scheidetrichter mit verdünnter Schwefelsäure, dann mit Wasser und Sole gewaschen. Das nach üblicher Aufarbeitung erhaltene Produkt, nämlich 500 mg eines blassgelben, honigartigen \les, wird zur Reinigung an einer Kieselgelsäule (KieseIgel Merck 0,015-0,04 mm, Säule 2,3 x 20 cm) mit dem Laufmittelgemisch Essigsäureethylester/Toluof/Aceton 11:9:1) chromatographiert. Das gesuchte Laurat erscheint ziemlich rasch in einer eng begrenzten Zone. Nach Kristallisation aus Diisopropylether bei -14 DEG C wurden farblose Nädelchen von Smp. 87-88,5 DEG C erhalten; Ausbeute 65-70%. 



  HPLC fast einheitlicher peak mit tR 3,6 und  lambda max 242 nm an Spherisorb S-5 CN, 4.6 x 250 mm, flow 0.8 ml/min. Laufmittel 1% B in A (A = Hexan mit 0.1% Ethyldiisopropylamin; B = CH2Cl2 mit 5% Methanol). 



  UV (CH2Cl2):  lambda max 235 nm ( epsilon  11 100), 277 (1500), 285 (1300). 



  [ alpha ] DELTA  -60.9 DEG  (CHCl3, c = 0.041%; zum Vergleich Baccatin-III = -85.5 DEG ) 



  IR (CHCI3; cm<-><1>, Auswahl von Banden): 3620 und 3570s (OH): 3020, 2925, 2855m-s (Methylen- und Methylgruppen), 1733ss, breit [Carbonyl-Gruppen] 



  CI-Ms (NH3): m/z 786,4 (100%, [M+NH3]*) 



  <1>1/4 <->7/81/8p (CDCl3, 600 MHz,  delta  in ppm, Interpretationshilfen <1>H, <1>H-DFQ-CO-SY, <1><3>C, <1>H-HMBC, <1><3>C, <1>H-HSQC, DEPT-Techniken):
 H-2: 5.62 (d J = 6.9); H-3: 3.99 (d J = 6.9); H-5: 4.96 (d J = 9.0); H-6: 1.55 und 2.6 (je m); H-7: 5.6 (dd); H-10: 6.28 (s); H-13: 4.84 (t, J = 7.8); H-14: 2.3 und 2.6 (je m); CH3 (16): 1,13* (s); CH3 (17): 1.07* (s); CH3 (18): 2,10 (s); CH3 (19): 1,79 (s) CH2-20: 4,43 (AB-System); CH3CO-4: 2,28 (s). 



  <1><3>D<->7/81/8p (Auswahl von Signalen): C-4: 80,6; C-5: 84,0; C-7: 71,3; C-10: 75,8; C-11: 131,5; C-12: 144,8; C-13: 67,7; ArylCO: 166,9; LauroylCO-7: 173,0; CH3CO-4: 170,5; CH3CO-10: 168,8; CO-9: 202,4. 



  Auf vergleichbare Weise werden auch andere Fettsäureester von Baccatin-III von 10-Deacetyl-Baccatin-III und von 14-OH-10-Deacetyl-Baccatin-III hergestellt. 


 1.3 Herstellung von 7-Palmitoylbaccatin-III 
 



  Die Umsetzung von Baccatin-III mit Palmitoylchlorid erfolgte wie oben unter 1.3, jedoch unter Verlängerung der Reaktionszeit auf das Doppelte; die Reinigung wurde analog vorgenommen. Nach Umkristallisation aus Diisopropylether/Pentan erhält man seidige Nadeln mit Doppelsmp. 77-80/90-92 DEG C. 



  UV (CH2Cl2):  lambda max 237 nm ( epsilon  19 800) 



  Circulardichroismus (CH2Cl2, RT): 230,8 ( DELTA  epsilon  27,0), 258,6 (0), 300,2 (-12,4). 



  IR (CH2Cl2: 3628w und 3570w (OH); 3049m, 2926s, 2852m (Methyl- und Methylengruppen), 1736ss, und 1725ss [Carbonyle] 



  <1>1/4 <->7/81/8p (CDCl3, ARX 300): H-2: 5.63 (d J = 6.7); H-3: 4.00 (d J = 6.9); H-5: 4.97 (dd); H-6: 1.57 und 2.6 (je m); H-7: 5.61 (dd, teilweise verdeckt); H-10: 6.29s; H-13: 4.89 (t J = 7.8); H-14: 2.2 und 2.3 (je m); CH3 (16): 1,14* (s); CH3 (17): 1.12* (s); CH3 (18): 2,11 (d, J = 1,0); CH3   (19): 1,80 (S); CH2-20: 4,23 (AB-System); CH3CO-4: 2,28 (s). 



  <1><3>D<->7/81/8p C-5: 84,1; C-7: 71,3; C-11: 131,6; C-12: 144,7; C-13: 67,9; C-14: 38,6; ArylCO: 167,0; LauroylCO-7: 173,1; CH3CO-4: 170,6; CH3CO-10: 168,8; CO-9: 202,4. 


 1.4 Herstellung von 10-Deacetyl-7,10-dilauroylbaccatin-III. 
 



  500 mg 10-Deacetylbaccatin-111 wurden wie im Beispiel 1.2 mit Lauroylchlorid umgesetzt und das erhaltene Rohprodukt durch Säulenchromatographie gereinigt. Durch Kristallisation aus Diisopropylether bei -14 DEG C wurden 660 mg als feines, weisses Pulver, Smp. 106,5-108 DEG C gewonnen. 



  UV (CH2Cl2):  lambda max 243,5 nm ( epsilon  15 400) 



  IR (CH2Cl2: 3677w und 3608w (OH); 3006m, 2925s, 2352m (Methyl- und Methylengruppen), 1713s, breit [Carbonyle] 



  CI-MS (NH3): m/z 926,6 (47%, [M+NH3]<+>); 909,5 (15% [M<+>]; 804,5 (30%, [M+NH3]<+>-H2O; 709,3 (100% [M<+>-Laurinsäure], etc. 



  <1>1/4 <->7/81/8p (CDCl3, 300 MHz): H-2: 5.62 (d J = 7.11); H-3: 3.89 (d J = 7.1); H-5: 4.99 (d mit Feinaufspaltung, J = 7,6); H-6: 1.7 und 2.5 (je m); H-7: 4.48 (dd,  J = 10,9/6,9); H-10: 6.32 (s); H-13: 4.89 (t, J = 7.5); H-14: 2.3 und ?, verdeckt (je m); CH3 (16,17): 1,11 (s); CH3 (18): 2.05 (d, J = 1.0); CH3 (19): 1,67 (s); CH2-20: 4,23 (AB-System). 



  <1><3>D<->7/81/8p (CDCl3): C-1: 79,1; C-4: 80,8; C-7: 72,3; C-10: 76,4; C-11: 131,9; C12: 146,3; C-13: 67,9; C-14: 38,6; ArylCO: 167,0; CH3CO-4-. 170,7; LaurylCO-7: 174,1; LaurylCO-10: 179,0. 


 1.5 Veresterung von 10-Deacetyl-14 beta -hydroxybaccatin-III mit Lauroylchlorid. 
 



  738 mg der Formel (III) wurden mit 1,3 ml Lauroylchlorid wie oben angegeben umgesetzt. Die Säulenchromatographie an Kieselgel brachte 3 Hauptfraktionen mit Rf 0,90; 0,53; 0,30. (Laufmittel auf Kieselgelfolien Merck mit Essigsäureethylester/Toluol/Aceton 11:9:1). Die unpolare Verbindung erwies sich als 10-Deacetyl-14 beta -hydroxybaccatin-7,10,14-trilaurat, die polare als 10-Deacetyl-14 beta -hydroxybaccatin-III-7,10-dilaurat; die mittelpolare Verbindung liess sich nach Spektrenvergleich als das 10-Deacetyl-14 beta -hydroxy-10,14-dilaurat bestimmen. 


 Eigenschaften von 14-OH-10-DAB-trilaurat: 
 



  Ausbeute 0,1 g, farblose Kristalle aus Methanol/Spur Diisopropylether bei -12 DEG C; Smp. 87-92 DEG C. 



  UV (CH2Cl2):  lambda max 234 nm ( epsilon  18 100) 



  Circulardichroismus (CH2Cl2, RT): 229,4 ( DELTA  epsilon  19,2), 257,6 (0), 299,6 (-7,9) 



  IR 3575w OH); 2043w-m, 2853s (Methylen- und Methylgruppen), 1733ss, breit [Carbonyle] 



  CI-MS (mit NH3): m/z 1124,5 (60%, [M+NH3]<+>); 1107,5 (23%, [M<+>]; 1089,5 (M<+>-18]); 924,5 (100%, [M+NH3]<+>-Laurinsäure]); 907,4 (66% [M<+>]-Laurinsäure). 



  <1>1/4 <->7/81/8p (CDCl3, 600 MHz): H-2: 5.75 (d J = 7,3); H-3: 3.95 (d J = 7,1); H-5: 4.90 (dd); H-6: 1.6 und 2.5 (je m); H-7: 5.56 (dd); H-10: 6.29 (s); H-13: 4.62 (s breit), 2,1 und 2,3 (je m); CH3 (16): 0,98*; CH3 (17): 1,12*; CH3 (18): 2,08; CH3 (19): 1,75 (s); CH2-20: 4,18 (AB-System); CH3CO-4: 2,31 (s). 



  <1><3>D<->7/81/8p (CDCl3): C-4: 80,5; C-5: 83,9; C-7: 71,1; C-10: 75,2; C-11: 133,1; C-12. 141,1; C-13: 76,7; C-14: 75,2; ArylCO: 165,7; CH3CO-4: 170,8; CO-9: 201,8; LaurylCO-7: 172,8; LaurylCO-10: 171,5; LauroylCO-14: 173,9. 


 Eigenschaften von 7,10-Dilaurat: 
 



  Ausbeute 1,02 g; farbloses, sehr dickflüssiges \l, das langsam zu einer festen Masse erstarrt. 



  UV (CH2Cl2):  lambda max 233 nm ( epsilon  13 200) 



  IR 3600w und 3186w, breit (OH); 3043m, 2922ss (Methylen- und Methylgruppen), 1733ss und 1710s [Carbonyle] 



  <1>1/4 <->7/81/8p (CDCl3, 600 MHz): H-2: 5.81 (d J = 7,2); H-3: 3.95 (d J = 7,1); H-5: 4.96 (d verbreitert, J = 8,3); H-6: 1.63 und 2.41 (je m); H-7: 5.58 (dd); H-10: 6.32 (s); H-13: 4.79 (d mit Feinaufspaltung, J = 6,3); H-14: 4,04 (d, J = 6,4); CH3 (16): 1,18* (s); CH3 (17): 1,07* (s); CH3 (18): 2,10 (d, J = 1,1); CH3 (19): 1,81 (s); CH2-20: 4,25 (AB-System); CH3CO-4: 2,31 (s). 



  <1><3>D<->7/81/8p (CDCl3): C-1: 76,6; C-2. 74,0: C-3: 46,4; C-4: 80,7; C-5: 83,9; C-7: 71,2; C-10: 75,3; C-11: 132,7; C-12: 146,9; C-13: 75,9; C-14: 74,0; C-15: 42,8; CH3 (16): 21,9*; CH3 (17): 26,1*; CH3 (18): 14,9: CH3 (19): 10,8; CH2-20: 76,2; ArylCO: 166,2; CH3CO-4: 170,5; LaurylCO-7: 173.2; LaurylCO-10: 173,2. 


 Eigenschaften von Baccatin-III-10,14-Dilaurat, 
 



  Ausbeute 60 mg; farblose Kristalle aus Diisopropylether bei -14 DEG C; Smp. 93-103 DEG C. 



  UV (CH2Cl2):  lambda max 234 nm ( epsilon  15 800). 


 2.0 Bedeutung der angemessenen Solubilisierung der Ester 
 



  Die Ester von ausgewählten Baccatin-Verbindungen der Formeln (I) bis (III) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumorale und antivirale, bzw. viruzide Wirkung und eignen sich auch zur Behandlung von Ekzemen, Psoriasis und von metabolischen Störungen, vornehmlich dann, wenn sie in erfindungsgemässe, spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit destilliertem Wasser, 5%iger Glucoselösung oder Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile \l-in-Wasser-Ultramikro-Emulsionen ergeben. 



  Derartige Ultramikroemulsionen weisen kugelförmige Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm auf. (Messungen mit QLS = quasielastischer, dynamischer Lichtstreuung wurden durchgeführt an der E.T.H., Zürich, Institut für Polymere (Prof. Dr. Pier Luigi LUISI und Prof. Dr. Peter SCHURTENBERGER)]. Vgl. "Mode-selective dynamic light scattering; theory versus experimental realization", Thomas Gisler, et al., Applied Optics/Vol. 34, No. 181 20 June 1995, pp. 3546-3553. 



  Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach auch spontan dispergierbare Konzentrate mit antitumoral und/oder antiviral, bzw. viruzid wirksamen Estern von ausgewählten Baccatin-Verbindungen der Formeln (I) bis  (III). Die erfindungsgemässen Ester mit Baccatin-Verbindungen der Formeln (I) bis (III) sind nahezu wasserunlösliche und hoch agglomerierte Verbindungen. Damit solche Verbindungen aber durch die Membranbarrière der Tumor-, bzw. Wirtzellen diffundieren und im Innern der Zelle wirksam werden können, müssen sie vorerst in geeigneter Weise im wässrigen Medium solubilisiert werden. Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen \l-in-Wasser Ultramikroemulsionen mit Hilfe von besonders ausgewählten Cotensiden oder Lösungsvermittlern einerseits und geeigneten Tensiden anderseits gelingt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der neuen Ester zu erzielen. 



  Alle experimentellen Beobachtungen an dergestalt ausgebildeten Ultramikroemulsionen lassen sich einheitlich durch die Annahme deuten, dass die ausgewählten Tenside und Cotenside, als ausgewogenes System genommen, in der wässerigen Phase organisierte Aggregate, sog. Mizellen bilden. Diese besitzen mehr oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm. Die Tenside und Hydrotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusseren, wässerigen Phase und der inneren, öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die Ester der Formeln (I) bis (III), gelöst im biotensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung dieser beiden Phasen unterbleibt. In der öligen, inneren Phase, d.h. im mizellaren Kern, liegen die Moleküle der erfindungsgetreuen Ester in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor. 



  Die Mizellen der Baccatinester-haltigen inneren Phase der erfindungsgemässen Ultramikroemulsionen sind demnach an ihrer Oberfläche, d.h. an ihrer Grenzschicht mit einem Tensidmantel geschützt, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran ins Innere der Tumor- oder Wirtzelle, bzw. durch die Proteinhülle von Viren zu diffundieren. Die Diffusion durch die äussere Membran solcher Zellen erfolgt ausschliesslich aufgrund thermischer Molekularbewegungen. 



  Die Richtung, die ein konkreter Diffusionsvorgang einschlägt, wird vom Konzentrationsunterschied bestimmt, welcher an der Plasmamembran zwischen ausserhalb und innerhalb der Tumor- oder Wirtzelle besteht. Die Diffusion verläuft solange entlang dem Konzentrationsgefälle, bis es abgebaut ist. Zwischen der extrazellulären Zone und dem Inneren der einzelnen Zielzelle wird die Konzentration an Wirksubstanz, bzw. am Wirkstoffsystem ("multiple drug system") ausgeglichen, wobei auch verzögerte Abgabeeffekte ("sIow release effects") auftreten können. Derartige Diffusionsvorgänge verlaufen unabhängig von jeglicher Energiezufuhr. Sie haben keinen Bezug auf  die zelluläre Stoffwechselenergie.

   Ihre Geschwindigkeit, bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Tumor- oder Wirtzelle wird bestimmt: 
 
   1. vom Konzentrationsunterschied in den beiden Kompartimenten 
   2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wirkstoffmoleküls oder Wirkstoffsystems 
   3. von der Viskosität der diffundierenden wässrigen Lösung (Emulsion) 
   4. von der Temperatur 
 



  Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, hat eine globuläre "Mizelle" mit einem hydrodynamischen Radius von einem Centimeter ein Volumen von 4,189 cm<3> und eine Phasenoberfläche von 12,564 cm<2>. Demgegenüber weisen 10<1><8> Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von nur 10<-><6> cm (10 nm), welche zusammen das gleiche Volumen von 4,189 cm<3> ausmachen, schon eine Gesamt-Phasenoberfläche von 1256,4 m<2> auf. 


 Mizellen: Verhältnis Volumen zu Gesamtoberfläche 
 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 1: Zahl der Mizellen 
<tb>Head Col 2: Hydrodynamischer 
 Radius der Mizellen 
<tb>Head Col 3: Volumen 
 der Mizellen 
<tb>Head Col 4:

   Gesamt Oberfläche 
 der Mizellen
<tb><SEP>1<SEP>1 cm<SEP>4,189 cm<3><SEP>12,564 cm<2>
<tb><SEP>10<3><SEP>0,1 cm = 1 mm<CEL AL=L>4,189 cm<3><SEP>125,64 cm<2>
<tb><SEP>10<6><SEP>0,01 cm<SEP>4,189 cm<3><SEP>1256,4 cm<2>
<tb><SEP>10<9><CEL AL=L>0,001 cm<SEP>4,189 cm<3><SEP>12 564 cm<2>
<tb><SEP>10<1><2><SEP>0,001 cm = 1 mm = 1000 nm<SEP>4,189 cm<3><CEL AL=L>125 640 cm<2>
<tb><SEP>10<1><5><SEP>0,00001 cm = 100 nm <SEP>4,189 cm<3><SEP>1 256 400 cm<2>
<tb><SEP>10<1><8><CEL AL=L>10<-><6> cm = 10 nm<SEP>4,189 cm<3><SEP>1256,4 m<2>
<tb><SEP>10<2><1><SEP>10<-><6> mm = 1 nm<SEP>4,189 cm<3><CEL AL=L>12 564 m<2> 
<tb></TABLE> 
EMI11.1
 
 



  Fazit: Durch die grosse Phasenoberfläche, welche die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 1 bis 5 nm in Ultramikroemulsionen ausbilden, wird zusätzlich zu deren gesteigertem Diffusionsvermögen die rheologische Verteilung (Spreitung oder "spreading") und somit die Bioverfügbarkeit und Bioaktivität der Wirkstoffe, welche im Kern der Mizellen in monomer oder oligomer agglomerierter Form vorliegen, ebenfalls stark verbessert. Das kann eine beträchtliche Ermässigung der kritischen Dosierung erlauben und damit unerwünschte Nebenwirkungen vermeiden oder wenigstens verringern helfen. 



  Die "Packungsdichte" eines spontan dispergierbaren, stabilen Marigenol TM -Konzentrates nimmt in exponentieller Funktion mit der kleiner werdenden Teilchengrösse der Mizellen zu. Entscheidend sind die richtige Ausbildung der inneren Phase, ihr ausgewogenes Verhältnis zum Gesamtkonzentrat und die Auswahl der je dazu passenden Tenside. 


 3.0 Marigenol TM -Konzentrate 
 



  Die erfindungsgemäss spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten:
 0,1 bis 10 Gew.-% einzelner Ester der Formeln (I) bis (III), bzw. Kombinationen solcher Ester, 
 sowie 0 bis 10 Gew.-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe wie nachstehend umschrieben, 
 1 bis 26 Gew.-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, 5 bis 90 Gew.-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemisches, 
 bis zu 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins, bis zu 10 Gew.-% eines Stabilisators, eines Radikalfängers oder eines Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel. 



  Unter pharmazeutischen Wirkstoffen sind im vorliegenden Falle alle üblicherweise in der Humanmedizin verwendbaren Wirkstoffe zu verstehen. Hiezu zählen z.B.: 


 Beta-Blocker 
 
 



  Pindolol [1-(4-Indolyloxy)-3-Isopropylamino-2-propanol]
 Propanolol [1-Isopropylamino-3-(1-naphthyloxy)-2-propanol]
 Oxprenofol [1-(o-Allyloxyphenoxy)-3-isopropylamino-2-propanol]
 Metoprolol (Di- (+-)-1-(isopropylamino)-3-[p- 2-methoxyethyl)-phenoxy-2-propanol]-L (+) tartratÜ]
 Labetalol [5-[1-Hydroxy-2 (1-methyl-3-phenylpropyl-aminoethylÜsalicylamid] 


 Diuretica 
 
 



  Acetazolamid [5-Acetamido-1,3,4-thiadiazol-2-sulfonamid]
 Hydrochlorothiazid [6-Chlor-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazin-7-sulfonamid-1,1-dioxid]
 Chlortalidon [1-Oxo-3-(3-sulfamyl-4-chlorphenyl)-3-hydroxy-isoindolin]
 Metolazon [7-Chlor-1,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-4-oxo-3-o-tolyl-6-chinazolinsulfonamid] 


 Schwache Beruhigungsmittel 
 
 



  Diazepam [7-Chlor-1,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzodiazepin-2-on]
 Medazepan [7-Chlor-2,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzodiazepin-2-on] 


 Starke Beruhigungsmittel 
 



  Sulpirid [N-(1-Ethyl-2-pyrrolidinyl-methyl)-2-methoxy-5-sulfamoyl-benzamid] 


 Muskelentspannende Mittel 
 
 



  Baclofen [ beta -(Aminoaethyl)-p-chlorhydrozimtsäure) 


 Antibiotica 
 
 



  Sulfamethoxazol [5-Methyl-3-sulfanifamido-isoxazol]
 Trimethoprim [2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-pyrimidin]
 Chloramphenicol [D (-)-threo-2-dichlor-acetamido-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol]
 Cefaclor [3-Chloro-7-D(2-phenyl-glycinamido)-cephalosporansäure-monohydrat]
 Cefradin [7- D-2-Amino-2-(1,4-cyclohexadien-1-yl)-acetamido)-3-methyl-cephalosporansäure]
 Bacampicillin [1-Äthoxycarbonyloxy-ethyl-6-(D- alpha -aminophenyl-acetat-amido)-penicillinat]
 Minocyclin [7-Diäthylamino-6-desoxy-6-desmethyltetracyclin]
 Sulfadoxin [N min -(5,6-Dimethoxy-4-pyrimidinyl)-sulfanilamid]
 Sulfamethoxazol [3-Methyl-3-sulfanil-amido-isoxazol]
 Sulfisoxazol [3,4-Dimethyl-5-sulfanil-amido-isoxazol]
 Sulfadimethoxin [2,4-Dimethoxy-6-sulfanilamido-1,3,diazin] 


 Dermatologica 
 
 



  Chlorquinaldol [5,7-Dichlor-8-hydroxy-chinaldin]
 Crotamiton [N-Crotonyl-N-ethyl-o-toluidin]
 Diamthazol [6(-)2-Dimethylamino-ethoxy-( beta -diaethylamino-)-benzo-thiazol-dihydrochforid]
 Flumethason-pivalat [6 alpha ,9-Difluor-11 beta ,17,21-trihydroxy-16 alpha -methyl-pregna-1,4-dien-3,20,dion-21-pivalat]
 Tretinoin [Vitamin-A-Säure] 


 Corticosteroide 
 
 



  Cortison [17 alpha -21,Dihydroxy-pregn-4-en-3,11,20-trien-21-acetat]
 Prednison [11 beta -17,21-Trihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion]
 Dexamethason [9-Fluor-11 beta ,17,21-dihydroxy-16 alpha -methyl-pregna-1,4-dien-3,20-dion]
 Desoxycorton-acetat [21-Hydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-acetat] 


 Endokrine Regulation 
 
 



  Melatonin [N- 2-(5-Methoxy-1H-indol-3yl)ethylÜacetamid]; N-acetyl-5-methoxytryptamin 


 Coronarmittel 
 
 

 

  Pentaerythrityltetranitrat (PETN)
 Nitroglycerin (Glyceryltrinitrat)
 Pindolol [1-(4-Indolyloxy-3-isopropylamino-2-propanol] 


 Cytostatica 
 
 



  Melphalan [p-Di-(2-chlorethyl)-amino-L-phenylalanin]
 Procarbazin [p-(N min -Methyl-hydrazinomethyl)-N-isopropyl-benzamid]
 Dactinomycin [Actinomycin D]
 Polyöstradiolphosphat
 Cyclophosphamid [N,N-bis-( beta -Chlorethyl)-amino-1-oxa-3-aza-2-phosphocyclohexan-2-oxid] 


 Entzündungshemmende Mittel 
 
 



  Mefenaminsäure [3-Xylyl-2-aminobenzoesäure]
 Dexamethason [9-Fluor-11 beta ,17,21-trihydroxy-16 alpha -methyl-pregna-1,4-dien-3,20-dion]
 Hydrocortison [17 alpha -Hydroycorticosteron] 


 Coronardilatoren 
 
 



  Nifedipin [1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(o-nitrophenyl)-pyridin-3,5-dicarbonsäure-dimethylester]
 Isosorbid-dinitrat [1,4;3,6-Dianhydrosorbit-2,5-dinitrat]
 Nitroglycerin (Glyceryl-trinitrat)
 Dipyramidol [2,6-Bis-(diethanolamino)-4,8-dipiperidino (5,4-dipyrimidin)] 


 Periphere Vasodilatoren 
 
 



  Cinepazid [4-(-3,4,5-Trimethoxy-cinnamoyl)-1-piperazin-essigsäure-pyrrolidid]
 Cyclandelat [3,3,6-Trimethyl-cyclohexylmandelat]
 Cinnazarin [1-trans-Cinnamyl-4-diphenylmethyl-piperazin]
 Pentoxyfyllin [3,7-Dimethyl-1-(5-oxo-hexyl)-xanthin] 


 Antirythmica 
 
 



  Procainamid [4-Aminobenzoesäure- beta -diethylaminoethylamid]
 Disopyramid [4-Diisopropylamino-2-phenyl-2-(2-pyridyl)-butyramid] 


 Antigichtmittel 
 
 



  Allopurinol [1H-Pyrazolo-(3,4-d)-pyrimidin-4-ol] 


 Antiepileptica 
 
 



  Phenytoin  DiphenylhydantoinÜ; (5,5-Diphenyl-2,4-imidazolidin-dion]
 Carbamazepin [5-Carbamoyl-5H-dibenz(b,f)azepin] 


 Antihistaminica 
 
 



  Chlorphenamin [ 3-(p-Chlorphenyl)-3-(2-pyridyl)-propyldimethyl-amin] 
 Clemastin  HydrogenfumaratÜ; [1-Methyl-2- 2-( alpha -methyl-p-chlor-diphenylmethoxy) ethylÜpyrrolidin]
 Mequitazin [10-(3-Chinuclidinylmethyl) phenothiazin]
 Alimemazin [10-(3-Dimethylamino-2-methyl-propyl)-phenothiazin] 


 Mittel gegen Übelkeit und Schwindel 
 
 



  Domperidon [5-Chlor-1- 1-(3-(2-oxo-1-benzimidazolinyl]-propyl)-4-piperidylÜ2-benzimidazolinon]
 Betahistin [2- 2-MethylaminoethylÜpyridin]
 Metoclopramid [4-Amino-5-chlor-N-(2-diethylaminoethyl)-2-methoxy-benzamid] 


 Blutdrucksenkende Mittel 
 
 



  Reserpin [3,4,5-Trimethoxybenzoyl-methylreserpat]
 Rescinnamin [3,4,5-Trimethoxy-methylreserpat]
 Methyldopa  L- alpha -MethyldopaÜ; [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin]
 Clomidinhydrochlorid [2,6-Dichlor-N-2-imidazoidinyliden-benzamin hydrochlorid] 


 Sympathomimetica 
 
 



  Isoproterenol [N-Isopropyl-nor-adrenalin]
 Etilefrin [DL-1-  alpha -EthylaminomethylÜ-m-hydroxy-benzylalkohol] 


 Expectorantien 
 
 



  Carbocystein [(S-Carboxymethyl) cystein]
 Bromhexin[N-Cyclohexyl-N-methyl-(2-amino-3,5-dibrom-benzyl) amin HCL]
 L-Ethylcystein
 L-Methylcystein 


 Orale Antidiabetica 
 
 



  Glibenclamid [N-4-2-(5-Chlor-2-methoxy-benzamido)-ethyl-phenylsulfonyl-N min -cyclohexyl-harnstoff]
 Tolbutamid [N-(4-Tolylsulfonyl)-N min -n-butyl-harnstoff] 


 Cardiovasculäre Mittel 
 
 



  Ubidecarenon
 Adenosin [6-Amino-9- beta -D-ribo-furanosyl-9H-purin] 


 Immunsuppressivum 
 
 



  Cyclosporin A 


 Antitumormittel 
 
 



  Taxol (Paclitaxel)
 Baccatin-III
 10-Deacetylbaccatin-III
 14-OH-10-Deacetylbaccatin-III
 Cyclosporin D-oxyd 


 Antivirale Mittel (AIDS) 
 
 



  4-Isoleucin-Cyclosporin
 Cyclosporin G
 3 beta -Stigmast-5-en-3-laurat ( beta -Sitosteryl-laurat)
 3 beta -Stigmast-5-en-3-palmitat ( beta -Sitosteryl-palmitat)
 3 beta -Stigmast-5-en-3-stearat ( beta -Sitosteryl-stearat)
 3 beta -Stigmast-5-en-3-arachidat ( beta -Sitosteryl-arachidat) 
 3 beta -Stigmast-6-en-3-behenat ( beta -Sitosteryl-behenat)
 3 beta -Stigmast-5-en-3-10-undecenoat ( beta -Sitosteryl-10-undecenoat) 
 3 beta -Stigmast-5-en-3-oleat ( beta -Sitosteryl-oleat)
 3 beta -Stigmast-5-en-3-all trans-retinat ( beta -Sitosteryl-all-trans-retinat).
 (3 beta , 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-valeriansäureester [Ergosteryl-n-valerat, Provitamin D2-n-valerat]
 (3 beta , 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-10-undecensäureester [Ergosteryl-10-undecenoat, Provitamin D2-undecenoat]
 (3 beta , 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-laurinsäureester [Ergosteryl-laurat,

   Provitamin D2-laurat]
 (3 beta , 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-all-trans-retinsäureester [Ergosteryl-retinat, Provitamin D2-retinat]
 9,10-Secoergosta-5,7,10,(19),22-tetra-en-3-yl-valeriansäureester [Ergocalciferyl-n-valerat, Vitamin D2-n-valerat]
 9,10-Secoergosta-5,7,10,(19),22-tetra-en-3-yl-10-undecensäureester [Ergocalciferyl-10-undecenoat, Vitamin D2-undecenoat]
 9,10-Secoergosta-5,7,10,(19),22-tetra-en-3-yl-laurinsäureester [Ergocalciferyl-laurat, Vitamin D2-laurat]
 9,10-Secoergosta-5,7,10,(19),22-tetra-en-3-yl-all trans-retinsäureester [Ergocalciferyl-retinat, Vitamin D2-retinat]
 9,10-Secocholesta-5,7,10,(19),-trien-3-yl-valeriansäureester [Cholecalciferyl-n-valerat, Vitamin D3-n-valerat]
 9,10-Secocholesta-5,7,10,(19),-trien-3-yl-10-undecensäureester [Cholecalciferyl-undecenoat, Vitamin D3-undecenoat] 
 9,10-Secocholesta-5,7,10,(19),

  -trien-3-yl-laurinsäureester [Cholecalciferyl-laurat, Vitamin D3-Iaurat]
 9,10-Secocholesta-5,7,10,(19),-trien-3-yl-all trans-retinsäureester (Cholecalciferyl-retinat, Vitamin D3-retinat]
 Morin-Tri-Undecanoat
 Morin-Tri-Laurat
 Quercetin-Penta-Undecenoat
 Quercetin-Penta-Laurat 



  Die erfindungsgemäss einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhältnis (d.h. eine "hydrophilic-lipophilie balance") zwischen 2 und 18; vorzugsweise liegt es für Gemische zwischen 2 und 6 einerseits und 10 und 15 anderseits. HLB-Werte geben Auskunft über die hydrophilen und lipophilen Eigenschaften eines Emulgators. Vgl. dazu "Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments" von Paul Becher im Journal of Dispersion Science and Technology 5 (1), 81-96 (1984). 



  In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsäureestertenside, wie z.B.: das Tristyrylphenotpolyoxyethylen-18-phosphorsäureester TEA-Salz (Triethanolaminsalz) mit Formel: 
EMI17.1
 
 



  (Soprophor TM  FL, Rhône-Poulence); 



  Diphasol TM  3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul TM EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50% der beiden Verbindungen mit den Formeln: 
EMI18.1
 
 



  Diphasol TM  3873 (CIBA-GEIGY), ein Alkylphenolpolyglycolether-Phosphat-Tensid
 Tensid 508 (CIBA-GEIGY) 
EMI18.2
 
 



  (Tensid 508, CIBA-GEIGY);
 Tinovetin TM  JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-ethoxy-phosphorsäureester 



  Butyl-mono-4-ethoxy-Phosphorsäureester (Zerostat TM  AT, CIBA-GEIGY), bzw. 
EMI18.3
 
 



  (Zerostat TM  AN, CIBA-GEIGY)
 und anderseits Betainverbindungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B.: 
EMI18.4
 
 



  worin Me[<+>] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und Rx für C1-32-Alkyl oder C2-32-Alkenylgruppen stehen. 



  Verwendung finden auch sog. "multi-functional glucose derivatives", wie z.B. Glucate TM  SS (Methyl-Glucose-Sesquistearat) und Glucamate TM  SSE-20 (PEG-20  Methyl-Glucose-Sesquistearat, in der CTFA Classification) von Amerchol, Edison, N.J., U.S.A. Gute Ergebnisse sind fallweise auch zu erzielen unter Mitverwendung von nicht-ionogenen Verbindungen aus der "Tween TM "-Reihe (Atlas Chem. Ind., Inc.; bzw. ICI Speciality Chemicals), sog. Polyoxyethylen-Sorbitan-Estern oder "Polysorbate" 20 bis 85-Verbindungen in der CTFA Classification [Fluka 93773 bis 931783]. 



  Als Hydrotrop, bzw. als Co-Emulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungsmittel lassen sich einsetzen, z.B.:
 Ester eines aliphatischen Alkohols (C3-18) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C10-22), wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Isopropylmyristat, lsopropylpalmitat und Laurylmyristat; Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C12-32), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen. 



  Mono-Ester aus Ethylenglykol oder Propylenglykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6-22), wie etwa Propylenglykolmonolaurat und Propylenglykolmonomyristat. 



  Ester aus einem aliphatischen Alkohol (C12-22) mit Milchsäure, wie z.B. Myristyl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Glycerins mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6-22), wie z.B. Glyceryl-Caprylat, oder Miglyol TM  812 Neutralöl (Oleum neutrale). 



  Ester aus einem Poly(2-7)ethylenglykolglyzerinether mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6-22), wie z.B. aliphatische Alkohole (C12-22), somit u.a. Dodecanol, Tetradecanol, Oleyfalkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol. 



  Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6-22), Monoether aus einem Polyethylenglykol mit einem aliphatischen Alkohol (C12-18), wie z.B. Polyoxyethylen (C10)-octylether. 



  Heterocyclische Verbindungen, wie z.B. 1-Methyl-2-Pyrrolidon. 



  CHAPS (FLUKA 26 680; Merck-Index 11.2034): 3-[(3-Cholamido-propyl)-dimethylammoniol-propansulfonat. 



  Biotenside Ester der allgemeinen Formel (VII)
 



  R<5>-COO-R<6> (VII)
 



  worin R<5> eine C2-31-Alkyl-, eine C3-31-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe und R<6> Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten. 



  Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dispergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Chromatographie über neutralem Aluminiumoxyd mit einem inerten Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofuran, Ethylalkohol oder Methylenchlorid gereinigt. 



  Als Zusätze in die erfindungsgemässen spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitamin A-Säure, Retinol, Tocopherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Flux enhancers") und Radikalfänger. 



  Zusammensetzungsbeispiele von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten, welche Wirkstoffe der Formeln (I) bis (III) enthalten und welche, wenn sie mit Wasser oder 5%-Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt werden, thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm ergeben. 



  a) 0,1 bis 10 Gew.-% einer oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (III),
 0 bis 10 Gew.-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe,
 1 bis 25 Gew.-% Isopropylmyristat, lsopropylpalmitat oder Neutralöl, wie z.B. Miglyol TM  812 (Dynamit Nobel oder Hüls),
 0 bis 45 Gew.-% eines Phosphorsäureester-Tensides, wie z.B. Diphasol TM  3873 (CIBA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat TM  AN oder AT (CIBA-GEIGY), Tinovetin TM  JU (CIBA-GEIGY), Soprophor TM  FL (Rhône-Poulenc),
 5 bis 90 Gew.-% Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY) und/oder Polysorbate 20-85 (ICI Speciality Chemicals),
 0 bis 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins,
 0 bis 10 Gew.-% eines Penetrationsverbesserers, eines Stabilisators und/ oder Hilfsstoffe. 



  b) 0,5 bis 2 Gew.-% eines oder mehrerer Wirkstoffe laut (I) bis (II),
 0 bis 2 Gew.-% CHAPS oder DMSO,
 5 bis 25 Gew.-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (VII)
 



  R<5>-COO-R<6> (VII)
 



  worin R<5> eine C2-31-Alkyl-, eine C3-31-Alkenyl- oder eine Alkapolyengruppe und R<6> Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten, 
 30 bis 45 Gew.-% Invadin TM  JFC 800% und/oder Tween TM -20 
 30 bis 45 Gew.-% Soprophor TM  FL oder Diphasol TM  3873. 



  c) 1 Gew.-% eines Wirkstoffes laut Formel (I), (II) oder (III),
 7 Gew.-% Ethylalkohol (C2H5OH), oder 2-Pentanol, und/oder DMSO,
 20 Gew.-% Citronellyl-10-Undecenoat (C11:1-Citronellylester) oder Citronellyl-10-Laurat (C12:0-Citronellylester)
 30 Gew.-% Invadin TM  JFC 800% und/oder Tween TM -20,
 42 Gew.-% Soprophor TM  FL. 



  N.B.: Invadin TM  JFC 800% (CIBA-GEIGY) ist ein wasserfreies tert. Octylphenylpolyoxyethylenether-Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen.
 Soprophor TM  FL (Rhône-Poulenc) ist ein Tristyrylphenolpolyoxyethylen18-phorsäureester, TEA-Salz-Tensid,
 Tween TM -20 (ICI Speciality Chemicals) ist eine nicht-ionogene Polyoxyethylen-Sorbitan-Ester-Verbindung: "Polysorbate"-20. 


 3.1 Beispiel für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von "multiple units". 
 
<tb><TABLE> Columns=2 a) Granulierung
<tb><SEP>Metolose TM  90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical)<SEP>90.0 g
<tb><SEP>Avicel TM  PH-101<CEL AL=L>80.3 g
<tb><SEP>Erfindungsgemässes Marigenol TM -Konzentrat<SEP>139.4 g
<tb><SEP>Aerosil TM  200<SEP>80.3 g
<tb><CEL AL=L> SIGMA <SEP>390.0 g 
<tb></TABLE> 



  Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40 DEG C. 



  b) MSR- und Retard-Ausrüstung im Rotationsbett mit Aqoat TM AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk 



  c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Kernmaterial<SEP>44%
<tb><SEP>Erfindungsgemässes Konzentrat<SEP>25%
<tb><CEL AL=L>MSR-Beschichtung<CEL AL=L>31%
<tb><SEP> SIGMA <SEP>100% 
<tb></TABLE> 



  N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemäss a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus Aqoat TM  (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1:1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern. 


 4.0 Biologische Prüfungen 
 



  Die antitumorale Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wirkstoffen gemäss den Herstellungsbeispielen, sowie den Aufarbeitungsbeispielen für ihre Bildung a) bis c) wird anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt: 


 4.1 In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien 
 



  Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiterplatten und Verdünnungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 10<4>/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, dass sie während des Assays wachsen können, in sog. nichtkonfluenten Monolayers. Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden, mit 100  mu l pro Reihe, die man im 1. Loch mit 100  mu l Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch eingebracht, wieder mit 100  mu l Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdünnungsreihe n1/4 . 



  Die Proben werden im Plaque Assay während 3 bis 5 Tagen bei 37 DEG C mit 31/4 % CO2 inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0,1% Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70% Methanol, 1% Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen, Vergrösserung 300fach. Man bestimmt die grösste zytotoxische Verdünnung.

   Die quantitative Auswertung lässt sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessung am Spektrophotometer vornehmen. 


 4.2 Prüfung auf Zelltoxizität 
 
<tb><TABLE> Columns=5 4.21 Zelltoxizität der Marigenol TM -Konzentrate 
 geprüft an Py6-Zellen (Polyoma-Virus infizierten 3T3 Maus-Fibroblasten 
<tb>Head Col 1: Geprüftes Konzentrat 
 mit 1%-Wirksubstanz- 
<tb>Head Col 2: Gehalt 
<tb>Head Col 3: Mikroemulsion 
 ME 1:100 
 Aktivsubstanz 
 A.S. 
<tb>Head Col 4: Exposition 24 h, 
 in Verdünnung 
 wirksam bis zu 1: 
<tb>Head Col 5: Exposition 48 h,
 in Verdünnung 
 wirksam bis zu 1: 
<tb>Head Col 6:

   Exposition 72 h,
 in Verdünnung 
 wirksam bis zu 1:
<tb><SEP>Taxol-W.S.<SEP>ME 1:100 
 A.S.<SEP>64 000 
 6.4 Mio.<SEP>256 000 
 25.6 Mio.<SEP>256 000 
 26.6 Mio.
<tb><SEP>Baccatin-III-W.S.<SEP>ME 1:100 
 A.S.<SEP>128 000 
 12.8 Mio.<SEP>128 000 
 12.8 Mio.<SEP>1 Mio. 
 100 Mio.
<tb><SEP>Baccatin-III-7,13-
 Diundecenoat<SEP>ME 1:100 
 A.S.<SEP>128 000 
 12.8 Mio.<SEP>256 000 
 25.6 Mio.<SEP>1 Mio. 
 100 Mio.
<tb><SEP>Baccatin-III-7,13-
 Dilaurat<SEP>ME 1:100 
 A.S.<SEP>128 000 
 12.8 Mio.<SEP>128 000 
 12.8 Mio.<SEP>256 000 
 25.6 Mio.
 Verdünnungen: 
 Erste Zeile auf Mikroemulsion berechnet
 Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet
  
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=5 4.22 Zelltoxizität der Marigenolo-konzentrate (Fortsetzung) geprüft an Py6-Zellen (Polyoma-Virus infizierten 3T3 Maus-Fibroblasten) 
<tb>Head Col 1:

   Geprüftes Konzentrat 
 mit 1%-Wirksubstanz-
 Gehalt 
<tb>Head Col 2: Mikroemulsion 
 ME 1:100 
 bzw. 1:1000 
 Aktivsubstanz 
 A.S. 
<tb>Head Col 3: Exposition 48 h, 
 in Verdünnung wirksam bis zu 1: 
<tb>Head Col 4: Exposition 
 72/96 h, in 
 Verdünnung 
 wirksam bis zu 1: 
 * = 96 h 
<tb>Head Col 5: W.S.

   Anfangs-
 konzentration im 
 Konzentrat in mMol End-Konzentration
 in der M.E. in pMol
<tb><SEP>Taxol-W.S.<SEP>ME 1:100 
 A.S.<SEP>256 000 
 25.6 Mio.<SEP>256 000
 25.6 Mio.<SEP>0.0117 
 45.7
<tb><SEP>Baccatin-III-W.S.<SEP>ME 1:100 
 A.S.<SEP>80 000 
 8 Mio.<SEP>160 000 
 16 Mio.<SEP>0.0171
 106.9
<tb><SEP>10-Dab-Baccatin-III-
 W.S.<SEP>ME 1:1000 
 A.S.<SEP>640 000 
 64 Mio.<SEP>1 280 000* 
 128 Mio.<SEP>0.0190 
 14.8
<tb><SEP>14-OH-10-Dab-
 Baccatin-III-W:S.<SEP>ME 1:1000 
 A.S.<SEP>640 000 
 64 Mio.<SEP>1 280 000*
 128 Mio.<SEP>0.0184 
 14.4
<tb><SEP>Baccatin-III-
 Monolaurat<SEP>ME 1:1000  
 A.S. <SEP>160 000 
 16 Mio.<SEP>640 000* 
 640 Mio.<SEP>0.0130 
 20.3
<tb><SEP>Baccatin-III-
 Monopalmitat<SEP>ME 1:1000  
 A.S. <SEP>320 000 
 32 Mio.<SEP>640 000* 
 64 Mio.<SEP>0.0124 
 19.4
<tb><SEP>Baccatin-III-7,13-
 Dilaurat<SEP>ME 1:

  100  
 A.S.<SEP>40 000 
 4 Mio.<SEP>80 000 
 8 Mio.<SEP>0.0105 
 131.2 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 1: Geprüftes Konzentrat 
 mit 1%-Wirksubstanz-
 Gehalt 
<tb>Head Col 2: Mikroemulsion 
 ME 1:1000 
 Aktivsubstanz 
 A.S. 
<tb>Head Col 3: Exposition 48 h, 
 in Verdünnung 
 wirksam bis zu 1: 
<tb>Head Col 4: Exposition 96 h, 
 in Verdünnung 
 wirksam bis zu 1: 
<tb>Head Col 5: W.S.

   Anfangs-
 konzentration im 
 Konzentrat in mMol End-Konzentration 
 in der M.E. in pMol
<tb><SEP>10-Deacetyl-Baccatin-
 III-7,10-Dilaurat<SEP>ME 1:1000 
 A.S:<SEP>32 000 
 32 Mio.<SEP>32 000 
 32 Mio.<SEP>0.0130 
 40.6
<tb><SEP>14-OH-10-Deacetyl-
 Baccatin-III-7,10,14-
 Trilaurat<SEP>ME 1:1000 
 A.S.<SEP>16 000 
 16 Mio.<SEP>32 000 
 32 Mio.<SEP>0.0092 
 28.8
 Verdünnungen: 
 Erste Zeile auf Mikroemulsion berechnet
 Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet Konzentrations-Angaben für das Konzentrat:
 in mMol (Anfangskonzentration), bzw. in pMol (höchste noch zelltoxische Verdünnung)
  
<tb></TABLE> 
 



  N.B.: 
 Zusammensetzung der 1%-Konzentrate:
 1 Gew.-% Wirksubstanz
 12 Gew.-% C11:1-Citronellyl-Ester
 87 Gew.-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL 1:1 


 5.0 Analytischer Nachweis 
 


 5.1 Identifikation von Baccatin-III-Doppelester-Wirksubstanz Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerät P/ACE 2100 von Beckman Instruments, bzw. einem BioFocus Integrator von Bio-Rad Laboratories. 
 
<tb><TABLE> Columns=2 Bedingungen:
<tb><SEP>Puffer pH = 7.0<SEP>50 mM Na-phosphat 100 mM Borsäure 50 mm SDS filtriert 0.2  mu m
<tb><SEP>Zu 20 ml Puffer werden 5 ml Methanol gegeben
<tb><SEP>Kapillare: HP bubble cell 15  mu m DIAMETER  37 cm
<tb><SEP>Injektion: 20 psi*sec. Run 15 kV, Messung bei 192 nm
<tb><SEP>Druckinjektion 10 sec.
<tb><CEL CB=2 AL=L>Detektionsgrenze 0.5 ppm, sehr hohe Auflösung 
<tb></TABLE> 



  Der Peak erscheint für das Konzentrat nach 22 Minuten (Tensidwirkung!), für die reine Taxol-Substanz, bzw. den Ester nach 44 Minuten. 



  Als Alternative kann auch eine sog. "fused silica capillary": FS 75  mu m, 50 cm, eingesetzt werden. 
 Run 15 kV - 70  mu A, Messung bei 195/220 nm
 Der klare Peak erscheint nach 57 Minuten! 


 5.2 Identifikation der Konzentrat-Mizellen in der wässrigen Mikroemulsion/bzw. im gereinigten und hochzentrifugierten Überstand des Zellplasmas der Tumorzellen. Gleiche Methodik wie 5.1. Der charakteristische Peak erscheint nach ca. 45-60 Minuten. 
 


 5.3 Nachweis der Membran-Penetration an der Tumorzelle 
 



  Am Lichtmikroskop (wie auch am Elektronenmikroskop) lässt sich aufzeigen, dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel Py6-Zellen = Polyoma-Virus transformierte 3T3-Mausfibroblasten; dünn ausgesät, mittlere Verdünnung der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern herum ausbildet. Als Markiersubstanz kann dem Konzentrat eine kleine Menge Canthaxanthin beigegeben werden, das eine deutliche Fluoreszenz besitzt. Es eignen sich auch Phenosafranin, Tinopal TM GS oder Uvitex TM  CF, bzw. EBF (CIBA-GEIGY). Der analytische Nachweis, dass diese Vakuolen die Baccatin-III-Ester als Wirksubstanz enthalten, erfolgt ebenfalls mittels mizellarer Kapillar-Zonen-Elektrophorese "MECC", (Beckman Instruments, P/ACE System 2100 oder dem BioFocus Integrator von Bio-Rad). 



  Vgl. im übrigen: Koji Otsuka et al.: Separation of lipophile compounds by micellar electrokinetic chromatography with organic modifiers, Electrophoresis, 1994, 15, 1280-83 (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim). 



  Zusätzliche Kontrolle mittels Messung mit UV-Maldi-Ms-Spektroskopie, unter Verwendung von 2,6-Dihydroxyacetophenon als Matrix. 


 6.0 Vergleichsprüfungen mit humanen Tumor-Zell-Linien 
 
<tb><TABLE> Columns=7 Vitalitätstest/1%-Marigenol-Konzentrate Leukämie K 562/Kontrollen 50 037 cpm
 1 x 10<4> Zellen pro Loch
 Proliferationstest (Tritium: 1  mu Ci/well H<+>) 
<tb>Head Col 1:

   Präparat 
<tb>Head Col 2: 10<-><3> 
<tb>Head Col 3: 
<tb>Head Col 4: 10<-><4> 
<tb>Head Col 6 AL=L: 10<-5> 
<tb>Head Col 5: mit 
<tb>Head Col 6: cpm 
<tb>Head Col 7: % 
<tb>Head Col 8: cpm 
<tb>Head Col 9: % 
<tb>Head Col 10: cpm 
<tb>Head Col 11: %
<tb><SEP>Taxol-W.S.<SEP>679<SEP>1.3<SEP>830<SEP>1.6<SEP>3553<CEL AL=L>7.1
<tb><CEL AL=L>Baccatin-III-W.S.<SEP>680<SEP>1.3<SEP>757<SEP>1.5<SEP>3188<SEP>6.3
<tb><CEL AL=L>Baccatin-III-Diundecenoat<SEP>466<SEP>0.9<SEP>665<SEP>1.3<SEP>4770<SEP>9.5
<tb><CEL AL=L>Baccatin-III-Dilaurat<SEP>585<SEP>1.1<SEP>651<SEP>1.3<SEP>3060<SEP>6.1 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=7 Vitalitätstest/1%-Marigenol-Konzentrate Leukämie Daudi-Linie/Kontrollen 23 090 cpm 
<tb>Head Col 1:

   Präparat 
<tb>Head Col 2: 10<-><3> 
<tb>Head Col 4 AL=L: 10<-><4> 
<tb>Head Col 6 AL=L: 10<-><5> 
<tb>Head Col 3: mit 
<tb>Head Col 4: cpm 
<tb>Head Col 5: % 
<tb>Head Col 6: cpm 
<tb>Head Col 7: % 
<tb>Head Col 8: cpm 
<tb>Head Col 9: %
<tb><SEP>Taxol-W.S.<SEP>552<SEP>2.3<SEP>672<SEP>2.9<SEP>16 090<CEL AL=L>69.6
<tb><CEL AL=L>Baccatin-III-W.S.<SEP>708<SEP>3.0<SEP>795<SEP>3.4<SEP>14 190<SEP>61.4
<tb><CEL AL=L>Baccatin-III-Diundecenoat<SEP>293<SEP>1.2<SEP>653<SEP>2.8<SEP>9636<SEP>41.7
<tb><CEL AL=L>Baccatin-III-Dilaurat<SEP>346<SEP>1.4<SEP>455<SEP>1.9<SEP>8851<SEP>38.3 
<tb></TABLE> 



  Arbeiten durchgeführt von Dottoressa Anna Rita GUARINI, Università degli Studi di Torino, Clinica medica, 21.-24.8.1995. 


 7.0 Allgemeine Verträglichkeit der Marigenol TM -Präparate 
 
<tb><TABLE> Columns=7 Auswirkung auf das Blutbild Toxizität von Marigenol TM -Konzentraten an der Balb/c-Maus %-Anteil der Blutkörperchen 
<tb>Head Col 1: Präparat 
<tb>Head Col 2: L 
<tb>Head Col 3: M 
<tb>Head Col 4: N 
<tb>Head Col 5: E 
<tb>Head Col 6:

   B
<tb><SEP>G17<SEP>10<-><7> 
 10<-><5> 
 10<-><3><SEP>70 +/- 6 
 77 +/- 6 
 69 +/- 10<SEP>11 +/- 3
 6 +/- 3
 7 +/- 5<SEP>13 +/- 4 
 11 +/- 4
 22 +/- 8<SEP>6 +/- 4
 5 +/- 4
 2 +/- 2<SEP>0
 1 +/- 1 
 0
<tb><SEP>G41<SEP>10<-><7> 
 10<-><5> 
 10<-><3> <SEP>77 +/- 6 
 78 +/- 4 
 80 +/- 6<SEP>6 +/- 3 
 10 +/- 2 
 8 +/- 2<SEP>13 +/- 5 
 10 +/- 4 
 10 +/- 6<SEP>3 +/- 3 
 1 +/- 1 
 12 +/- 1<SEP>0 
 1 +/- 1 
 0
<tb><SEP>G44<SEP>10<-><7> 
 10<-><5> 
 10<-><3> <SEP>74 +/- 17 
 74 +/- 6 
 76 +/- 5<SEP>10 +/- 1 
 9 +/- 4 
 6 +/- 4<SEP>20 +/- 9 
 14 +/- 7 
 16 +/- 8<SEP>1 +/- 1 
 4 +/- 3 
 2 +/- 1<SEP>0<SEP>0
 0
<tb><SEP>G55<SEP>10<-><7> 
 10<-><5> 
 10<-><3> <SEP>78 +/- 4 
 69 +/- 10 
 77 +/- 5<SEP>10 +/- 4 
 11 +/- 3 
 6 +/- 4<SEP>10 +/- 4 
 18 +/- 4 
 14 +/- 2<SEP>2 +/- 1 
 1 +/- 1 
 2 +/- 1<SEP>0
 0
 1 +/- 1
<tb><SEP>Kontrollen (Phys.Puffer)

  <SEP>76 +/- 5<SEP>8 +/- 2<SEP>15 +/- 4<SEP>1 +/- 1<CEL AL=L>0 
<tb></TABLE> 
 



  G 17 2%-Konzentrat mit C5:0-iso-Cholesteryl-Ester (Cholesteryl-iso-Valerat) 
 G 41 2%-Konzentrat mit C11:1-Ergosteryl-Ester (Ergosteryl-10-Undecenoat)
 G 44 2%-Konzentrat mit C18:2-Cholecalciferyl-Ester (C18.2-D3; Vitamin-D3-Linolat)
 G 55 2%-Konzentrat mit C4:1-Cholecalciferyl-Ester (C4:1-D3; Vitamin-D3-Crotonat)
 Verdünnungen: 
 10<-><7> = 0,1 ppm Konzentrat; 0,002 ppm Wirksubstanz
 10<-><5> = 10 ppm Konzentrat; 0,200 ppm Wirksubstanz
 10<-><3> = 1000 ppm Konzentrat; 20,000 ppm Wirksubstanz (auf die wässrige Mikroemulsion berechnet) 
 Legende:
 L = Lymphocyten
 M = Monocyten (Makrophagen)
 N = Neutrophile Granulocyten
 E = Eosinophile Granulocyten
 B = Basophile Granulocyten 



  Durchführung der Proben: Prof. Dott. Guido FORNI, Dott<a> Stefania VAI, Università di Torino, Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche, Ospedale San Luigi Gonzaga, I-10 043 ORBASSANO (TO), August/September 1993. 



  Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mäusen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Während 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i.v. von je 0,250 ml wässriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiologischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grünwald-Giemsa.
 



  Zeit der Behandlung: 28 Tg
 Blutanalyse: nach der letzten Injektion
 Anzahl Tiere: 13 Gruppen zu 5 je Tieren 



  Resultat: Es treten keine signifikanten Unterschiede auf zu den Kontrollen. Es konnte keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche. 


 7.1 Untersuchung des Blutbildes 
 
<tb><TABLE> Columns=5 Auswirkung der Marigenol TM -Konzentrate auf normale humane Lymphomonocyten
 Zellen: normale humane phagozytische weisse Blutzellen (Macrophagen); 
 2 x 10<5> Zellen pro well Stimulation der Kontrollen: 1% PHA (Phytohemagglutinin) 
<tb>Head Col 1: Präparat 
<tb>Head Col 2: Verdünnung 
<tb>Head Col 3: Test 1 
<tb>Head Col 4: Test 2 
<tb>Head Col 5: Test 3 
<tb>Head Col 6: Kontrollen PHA 1% 
<tb>Head Col 7:

   (stimuliert) 
<tb>Head Col 8: cpm 
 2682 
 80 981 
<tb>Head Col 9: cpm 
 3386 
 61 966 
<tb>Head Col 10: cpm 
 3386 
 61 966
<tb><SEP>Konzentrate als wässrige 
 Mikroemulsionen<SEP>10<-><1> 
 10<-><2> 
 10<-><3>  
 10<-><4> 
 10<-><5> 
 10<-><6> <SEP>1076 
 1396
 1431
 1386
 1656
 2536<SEP>3826
 3726
 2141
 3221
 2888
 2105<SEP>3936
 3845
 2939
 2752
 3093
 3046
 Test 1: 2%iges Konzentrat enthaltend C12:0-Cholesteryl Ester
 Test 2: 2%iges Konzentrat enthaltend C16:0-Ergosteryl Ester
 Test 3: 2%iges Konzentrat enthaltend C5:0-Cholecalciferyl Ester (Vitamin D3-iso-Valerat) 
  
<tb></TABLE> 



  Tests durchgeführt von Dottoressa Anna GUARINI, Università di Torino, Clinica medica, I-10 26 TORINO, 21. bis 24. März 1994. 


 7.2 Vergleichsprüfungen bei verschiedener Aufarbeitung 
 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>A<SEP>Taxol-W.S., als spontan dispergierbares Marigenol TM -Konzentrat formuliert, das eine wässrige Ultramikroemulsion bildet
<tb><SEP>B<SEP>Taxol-W.S., als herkömmliches Konzentrat formuliert, das nur eine wässerige Makroemulsion bildet
<tb><SEP>C<SEP>Baccatin-III-W.S., als spontan dispergierbares Marigenol TM -Konzentrat formuliert, das eine wässrige Ultramikroemulsion bildet
<tb><SEP>D<SEP>Baccatin-III-W.S., als herkömmliches Konzentrat formuliert, das nur eine wässerige Makroemulsion bildet 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 1: Geprüftes Konzentrat 
 mit 1%-Wirksubstanz 
<tb>Head Col 2:

   Mikoro-Makro-
 Emulsion 1:100 
 Aktivsubstanz A.S. 
<tb>Head Col 3: Exposition 24 h, 
 in Verdünnung 
 wirksam bis zu 1 
<tb>Head Col 4: Exposition 48 h, 
 in Verdünnung wirksam bis zu 1
<tb><SEP>A: Taxol-W.S.<SEP>EM 1:100 
 A.S.<SEP>128 000 
 12.8 Mio<SEP>512 000 
 51.2 Mio
<tb><SEP>B: Taxol-W.S.<SEP>EM 1:100 
 A.S:<SEP>< 4000 
 < 400 000<SEP>< 4000 
 < 400 000
<tb><SEP>C: Baccatin-III-W.S.<SEP>EM 1:100 
 A.S.<SEP>128 000 
 12.8 Mio.<SEP>256 000 
 25.6 Mio.
<tb><SEP>D: Baccatin-III-W.S.<SEP>EM 1:100 
 A.S.<SEP>< 4000 
 < 400 000<SEP>< 4000 
 < 400 000 
<tb></TABLE> 



  Man beachte, dass die erfindungsgetreue Konzentratbildung der herkömmlichen Formulierung weit überlegen ist in der Wirkung. So beträgt deren Bioreaktivität schon in der kurzen Expositionszeit von  24 h das 30fache und bei 48 h Exposition das über 125fache des bislang Üblichen und Erreichbaren. 



  Marigenol TM -Konzentrate mit C11:1-Citronellylester als Coemulgator und mit einer 1:1 Tensid-Mischung Invadin JFC 800%/Soprophor FL formuliert. 

 

  Herkömmlich formulierte Konzentrate mit Isopropylmyristat als Coemulgator und mit Cremophor TM  EL (BASF), aber ohne Ethylalkohol aufgebaut. 



  In beiden Fällen gleiches anteiliges Verhältnis W.S.: Coemulgator: Tenside angenommen. 



  Die analytische Nachprüfung der unterschiedlichen Formulierungen am Institut für Polymere an der E.T.H. in Zürich ergab die nachfolgenden Messdaten: 
<tb><TABLE> Columns=2 Mizellare Grösse 
<tb>Head Col 1: Präparat 
<tb>Head Col 2: Mizellgrösse in nm
<tb><SEP>A: Taxol-W.S.<SEP>2.2-2.3 ohne Filter
<tb><SEP>B: Taxol-W.S.<CEL AL=L>5-6 60-100 starke Streuung breite Verteilung 10%-Filter
<tb><SEP>C: Baccatin-III-W.S.<SEP>2.2-3.0 ohne Filter, aber 75 DEG -Winkel
<tb><SEP>D: Baccatin-III-W.S. <SEP>4-12 starke Streuung breite Verteilung 10%-Filter
<tb><CEL AL=L>Ester-Verbindungen:
<tb><SEP>Q: Quercetin-Penta-Undecenoat<SEP>2-3
<tb><SEP>QE:  beta -Oestradiol-Di-oleat<CEL AL=L>2-3
<tb><SEP>F: Apigenin-Trilaurat<SEP>2-3
<tb><SEP>L: Genistein-Trilaurat<SEP>2-3 
<tb></TABLE> 



  Gemessen wurde die wässerige Emulsion 1:100 (CMC-Grenzwert für die homogene Verteilung der Tenside) der 1%igen Konzentrate mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) in je 3 Winkelstellungen (60 DEG , 90 DEG  und 120 DEG ), mit je 10 Einzelmessungen, an einem speziell ausgerüsteten "Fiberoptic Spectrometer" des Instituts für Polymere, E.T.H., Zürich. Für die Beschreibung der Methodik und des Gerätes vgl. "Mode-selective dynamic light scattering: theory versus experimental realization". Thomas Gisler et al., Applied Optics/Vol. 34, No. 18120, June 1995. 


 8.0 Prüfung auf Schutz- und antivirale Wirkung gegenüber sensitiven MT4-Zellen, infiziert mit dem Aids-Virus HIV ("Human lmmunodeficiency Virus") 
 



  Tests wurden durchgeführt am Institut für Infektionskrankheiten der Universität Turin (Direktor: Prof.Dr. Paolo GIOANNINI), von Dott. Alberto BIGLINO, Leiter der Abteilung für Infektionskrankheiten am Ospedale Generale di Asti, U.S.L. 19, unter Mitarbeit von Dott<a>. Brunella FORNO und Dott<a>. Annamaria POLLONO. Juni/Juli 1994 und März/April 1995. 


 8.1 Schutzeffekt auf die Wirtzellen (MT4-Lymphozyten) 
 



  MT4-Zellen (eine eternalisierte T-Zelllinie, welche sehr empfindlich ist gegen den HIV-zytopathogenen Effekt "CEP", aus einer 24 h alten Kultur wurden bei einer Konzentration von 2 x 10<5>/ml suspendiert, in 1.2 ml aliquote Teile in Polypropylen Röhrchen aufgeteilt und mittels Zentrifugierung pelletiert. 



  Die Pellets wurden dann entweder infiziert mit 200  mu l einer Stammlösung von HIV III B Zellen (Titer: 600 CCID50/ml) oder scheininfiziert mit reinem Medium, für 90 Min. bei 37 DEG C inkubiert und anschliessend mit 1 ml reinem Medium versetzt, um die anfängliche Zellkonzentration wieder einzustellen und die HIV Konzentration auf 100 CCID50/ml zu bringen. [CCID50/ml = 50% cell culture infective dose]. 



  100  mu l Volumina der im Test eingesetzten MARIGENOL TM -Konzentrate, verdünnt zu wässerigen Ultramikroemulsionen 10<-><3> und dann zusätzlich verdünnt von 10<-><3> auf 10<-><5> mit Medium RPMI 1640, wurden dreifach eingebracht in flachbödige Mikrotiterplatten mit 96 Löchern. In jedes Loch wurden 100  mu l der HIV-infizierten oder der schein-infizierten MT4-Kultur eingegeben, um so 4 Versuchsreihen aufzustellen:
 - einfache Kultur (Kontrollen; Prüfung auf Lebensfähigkeit der MT-4 Zellen: 10<5> Zellen/ml oder 2 x   10<4>/Loch)
 - Kultur + HIV (Virus CPE-Kontrolle; Konzentration 50 CCID50/ml oder 10 CCID50/Loch)
 - Kultur + Wirksubstanz in Mikroemulsion
 - Kultur + HIV + Wirksubstanz-Mikroemulsion in den Verdünnungen 10<-><3> bis 10<-><5> (= 1000 ppm,      100 ppm und 10 ppm, bzw. 10 ppm, 1 ppm und 0.1 ppm W.S.-Gehalt) 



  Inkubation der Kulturen bei 37 DEG C in einer 5% CO2 + 95% luftfeuchte Atmosphäre. 5 Tage nach der Infektion werden 100  mu l der Überstandes in jedem Loch entfernt und die Lebensfähigkeit der Zellen mit Hilfe eines Methyltetrazolsalzes überprüft (MTT, Sigma, 25  mu /Loch in 5 mg/ml Lösung), in einem 2-h Inkubationstest, dem sich eine Solubilisierung mit 100  mu l DMSO/Loch und die photometrische Ablesung auf optische Dichte bei 550 nm anschliesst. Restwerte der Zell-Vitalität (Überlebenstest) werden ausgedrückt als %-Differenz gegenüber den HIV CPE-Kontrollen, das Mittel als Null gesetzt. Der gemessene Titer ist Dosis-abhängig. Er sinkt vom Anfangswert von 300% CCID50 auf 120% CCID50 und bis auf 2% CCID50. 



  Die beste Schutzwirkung auf die Wirtzeiten wurde bislang mit einem 1%-Konzentrat von  beta -Sitosteryl-Palmitat bei einer Konzentration von 10<-><4> (= 100  ppm Konzentrat in wässeriger Ultramikroemulsion) erzielt; sehr beachtenswert sind auch die Ergebnisse mit 1%-Konzentraten, enthaltend  beta -Sitosteryl-Caproylat,  beta -Sitosteryl-Laurat,  beta -Sitosteryl-Arachidat oder  beta -Sitosteryl-Behenat. 


 7.2 Wirkung auf die HIV-Infizierbarkeit (Virulenz, direkte antivirale, bzw. viruzide Wirkung gegen die erworbene Immunschwäche, das humane "Aquired lmmuno-Deficiency Syndrome: AIDS"). 
 



  Aliquote Mengen von 2 klinisch aufbereiteten Präparaten von Aids-Patienten ("Isolates" mit den Stämmen 21/4 und 4/5) wurden in vollständigem RPMI Medium bei einem Titer von 300 CCID50/ml resuspendiert und während 3 h bei +40 DEG C inkubiert mit einem Marigenol TM -Konzentrat, als Mikroemulsionen in komplettem Medium auf die Konzentrationen 10<-><2> bis 10<-><5> verdünnt, und sodann zusammen mit einem "leeren" Trägerkonzentrat und mit reinem Medium allein auf ihre Wirkung geprüft. 



  Nach der Vorinkubation wurde der HIV Titer mittels der CCID50-Methode erfasst (CCID50 = cell culture infective dose 50%). Von jeder der 6 Virus-Suspensionen wurden kurz zweifache Reihenverdünnungen angefertigt, wovon je 200  mu l während 90 Min. mit MT-4 Zellen Pellets inkubiert wurden, wie oben angegeben (Siehe 7.1). Am Schluss der Inkubierung werden die Pellets auf die ursprüngliche Zellkonzentration gebracht, indem man jeder Probe die nötige Menge Medium zufügt und sie anschliessend mit je 200  mu l in 8 Löcher einer Mikrotiterplatte einbringt. Nach der Inkubation während 5 Tagen wird die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen, wie oben dargestellt. Der HIV Titer wird als reziproker Wert jener Verdünnung angegeben, welche 4 von 8 Proben einer Reihe (50%) infiziert.

   Der Inhalt eines Lochs gilt als infiziert, wenn die Ablesung der O.D. bei 550 nm tiefer ausfällt als das Mittel der 8 Kontroll-Löcher minus 2.8 Mal die Standard-Abweichung (untere 95% Vertrauensgrenze). 



  Mit den Wirksubstanzen Ergosteryl-10-Undecenoat und  beta -Sitosteryl-Palmitat lässt sich in-vitro als Folge der Vorbehandlung der Stämme eine sehr deutliche Replikationshemmung und eine eigentliche Elimination feststellen. Ihre Abwehrwirkung gegen eine Infektion ist Dosis-abhängig. Gar keine Hemmung trat nach der Behandlung mit reinem Carrier-Konzentrat allein ein. 
<tb><TABLE> Columns=2 Auswertung der Prüfergebnisse: 
<tb>Head Col 1: Testsubstrat 
<tb>Head Col 2:

   Restwerte im HIV-Titer (CCID50) 
 (Mittelwert aus 3 Kulturen)
<tb><SEP>HIV-Stamm 21/4 ("Clinical isolate") + Medium<SEP>300
<tb><SEP>HIV-Stamm 4/5 ("Clinical isolate") + Medium<SEP>200
<tb><SEP>HIV (2 Stämme) + Carrier-Konzentrat<SEP>200 (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)
<tb><SEP>HIV (2 Stämme) + Ergosteryl-10-Undecenoat<SEP>25 (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)
<tb><SEP>HIV (2 Stämme) +  beta -Sitosteryl-Palmitat 1000 ppm<SEP>2 (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)
<tb><SEP>HIV (2 Stämme) +  beta -Sitosteryl-Palmitat 100 ppm<SEP>50 (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)
<tb><SEP>HIV (2 Stämme) +  beta =Sitosteryl-Palmitat 50 ppm<SEP>76 (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)
<tb><SEP>HIV (2 Stämme) +  beta -Sitosteryl-Palmitat 10 ppm<SEP>120 (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen) 
<tb></TABLE> 



  Restwerte des HIV-1 Titers nach Vorinkubation während 3 h bei +4 DEG C. 



  Für die angewandte Prüfmethodik vgl. u.a.: Rudi Pauwels, Erik De Clercq et al.: "Sensitive and rapid assay on MT-4 cells for detection of antiviral compounds against the AIDS virus". Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science Publishers. 



  B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934/87/603.50); J.Virol.Methods, 1987; 16, 171-85 



  A. Bergamini, C.F. Perna et al., "A tetrazolium-based, colorimetric assay for quantification of HIV-induced catopathogenicicity in monocyte-macrophages, exposed to macrophage colony-stimulating factor". J.Virol.Methods, 1992, 40(3), 275-86. 



  Paul Wallerstein: Das AIDS-Dilemma; Forschung in der Sackgasse. Rombach aktuell, 1988, Freiburg i.Br. 



  Jay A. Levy: "HIV research: a need to focus on the right target", The Lancet, Vol. 345, June 24, 1995, pp. 1619-21. 



  Molecular Cell Biology, second Edition, by J. Darnell, H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5: Viruses, Structure and Functions, pp. 177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co.) 


 8.0 Andere Viren 
 


 8.1 Humaner Cytomegalie-Virus (CMV) 
 



  Die Prüfung wurde mit humanen, embryonalen Lungenfibroblasten als Wirtzellen vorgenommen, die dann mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert wurden. 



  Der Stamm "CVM umano AD169" wurde während 4h bei +4 DEG C mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz C16:0- beta -Sitosterylester, formuliert als 1%iges Konzentrat und dann verdünnt zu einer wässerigen Mikroemulsion 10<-><3>, 10<-><4> und 10<-><5>, inkubiert und daraufhin als vorbehandelte Virus-Suspensionen auf Kulturen von menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten überimpft. Ansatz als konfluente Kultur mit 120 000 Zellen pro shellvial. Die Infektion wurde mittels Zentrifugation während 45 Minuten bei 1500 rpm und bei RT vollzogen, worauf die Injektionssuspension entfernt und 1 ml Kulturmedium MEM mit 2% fötalem Kalbserum (wie bei der Anzucht) beigegeben wurde; die infizierten Zellen wurden sodann während 20 h bei 37 DEG C und unter 5%-CO2-Atmosphäre gehalten. 



  Am Schluss der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen gesammelt, mit 2% Aceton-Methanol (2:1) fixiert und 3 Mal mit PBS gewaschen. 



  Die Quantifizierung erfolgte mittels Immunofluoreszenz-Messung. Die Vials wurden mit dem monoklonalen Antikörper "Anti-P-72 CMV" (einem unmittelbaren Vorläuferprotein des CMV, das schon nach 6 h in den infizierten Zellen nachgewiesen werden kann) versetzt und während 30 Minuten bei 37 DEG C in feuchter Atmosphäre inkubiert. 



  Es folgten 3 Waschungen in PBS, eine zweite Inkubation mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper IgG Ziege anti-IgG Maus. Es schliesst sich eine nochmalige Inkubation während 30 Minuten bei 37 DEG C, wie oben angegeben,  an, gefolgt von einer 3maligen Waschung mit PBS. Die Proben werden dann mit 50% Glycerol in PBS auf Glasträger montiert. 



  Gleichzeitig wurden Kontrollen aufbereitet mit infizierten Zellen, die unter gleichen Bedingungen, aber ohne Vorbehandlung mit der Prüfsubstanz aufbereitet worden sind. 



  Gezählt werden die für das CMV-spezifische Antigen positiven Nuclei, mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskopes bei 25facher Vergrösserung in wässeriger Phase. 



  Es lässt sich ganz eindeutig eine Dosis-abhängige, direkt viruzide Wirkung feststellen. Das Virus ist nicht mehr virulent genug, um die empfindlichen Wirtzellen zu infizieren. 


 Ergebnis: 
 
<tb><TABLE> Columns=4 Viruzide Wirkung des  beta -Sitosteryl-Palmitates (als Marigenol TM -Konzentrat formuliert) 
<tb>Head Col 1: Kontrollen: Anzahl der 
 Antigene (anti P-72) 
<tb>Head Col 2: Konzentration 
 Mikroemulsion 
 1:1000 
<tb>Head Col 3: Konzentration 
 Mikroemulsion 
 1:10 000 
<tb>Head Col 4: Konzentration Mikroemulsion 1:100 000
<tb><SEP>115 000<SEP>0<SEP>2<SEP>82 000 
<tb></TABLE> 



  Anzahl der "Nuclei positivi per P-72" (der infizierten Fibroblasten) 



  Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Microbiologia, Università di Torino, Juli-November 1995. 


 8.2 Herpes-Virus (Herpes simplex, HSV) 
 



  Die antivirale/viruzide Wirkung einer wässerigen Mikroemulsion von geeigneten Marigenol TM -Konzentraten wird mit Hilfe einer konfluenten Monolayer-Kultur von Vero-Zellen (d.h. "African green monkey kidney cells") festgestellt. Die Wirtzellen werden während 3 h bei 4 DEG C mit der Mikroemulsion oder mit dem Kulturmedium allein vorbehandelt und dann mit einer konstanten Dosis von 10<4> Herpes simplex Viren, sog. "pIaque forming units" = PFU infiziert. Dauer der Virus-Absorption 1 h. Dann Zugabe von 2% Methylcellulose zur Verhinderung der Spreitung des Virus; es entsteht ein elastisches Vlies im Kulturmedium MEM + 2% Kalbserum. Anzüchtung während 48h, dann Fixieren und Färben der Monolayers mit 1% Kristallviolett in Methanol. 



  Die antivirale Wirkung korreliert mit der Zahl von "plaques" von lysierten Zellen, die sich im Kulturmedium MEM + 2% FCS noch bilden. Die Herabsetzung des viralen Titers wird im %-Verhältnis zu den Kontrollen (21 Plaques pro Zelle) angegeben. 



  Als Prüfsubstanzen wurden folgende Konzentrate in wässeriger Verdünnung (ausgehend von einer Mikroemulsion 1:100) eingesetzt:
 1% C20:0- beta -Sitosteryl-Ester
 1% Quercetin-Penta-10-Undecenoat
 1% C16:0- beta -Sitosteryl-Ester
 1% C12:0-Ergosteryl-Ester 


 Auswertung: 
 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 1: Verdünnung 
<tb>Head Col 2: C20:0- beta -Sitoester:
 (Arachidat) 
<tb>Head Col 3: Quercetin-Penta-
 Undecenoat 
<tb>Head Col 4: C16:0- beta -Sitoester: 
 (Palmitat) 
<tb>Head Col 5: C-12:0-Ergoester (Laurat)
<tb><SEP>1:1000<SEP>Zell-Lysis<SEP>Zell-Lysis<SEP>Zell-Lysis<CEL AL=L>Zell-Lysis
<tb><SEP>1:10 000<SEP>76%<SEP>48%<SEP>24%<SEP>62%
<tb><SEP>1:100 000<SEP>5%<CEL AL=L>0%<SEP>0%<SEP>0% 
<tb></TABLE> 



  Die Ergebnisse zeigen eine deutliche direkte Wirkung auf die HS-Virus-infizierten Vero-Wirtzellen. Bei einer Konzentration von 10<-><4>- beta -Sitosterylarachidat erscheint die Zahl der Plaques, im Vergleich mit den Kontrollen, um 76% herabgesetzt. Der HSV-Titer ist deutlich vermindert. 



  Bei dieser Konzentration der geprüften Substanzen findet auch keine Lysierung von eternalisierten Lymphozyten vom Typus MT-4, noch der Vero-Zellen selber statt. (Siehe oben unter 8.0) 



  Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Microbiologia, Università di Torino, Juli 1995. 


 8.3 Herpes-Virus (Herpes simplex, HSV) 
 



  Wiederholung der Prüfung mit Fluoreszenz-Markierung wie beim CMV-Versuch. Vgl. oben 8.1 
<tb><TABLE> Columns=4 Viruzide Wirkung des  beta -Sitosteryl-Arachidates (als Marigenol TM -Konzentrat formuliert) 
<tb>Head Col 1: Kontrollen: Anzahl 
 der infizierten Zellen) 
<tb>Head Col 2: Konzentration 
 Mikroemulsion 
 1:1000 
<tb>Head Col 3: Konzentration 
 Mikroemulsion 
 1:10 000 
<tb>Head Col 4: Konzentration Mikroemulsion 1:100 000
<tb><SEP>38<SEP>0<SEP>0<SEP>20 
<tb></TABLE> 



  Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Microbiologia, Università di Torino, November-Dezember 1995. 

Claims (9)

1. Ein Ester von Baccatin-Ill, von 10-Deacetylbaccatin-III oder von 14-OH-10-Deacetylbaccatin-III laut einer der allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) EMI39.1 (I) = Baccatin-III; R<1> = R<3> = H, R<2> = COCH3, R<4> = H (II) = 10-Deacetylbaccatin-III; R<1> = R<2> = R<3> = R<4> = H (III) = 14-Hydroxy-10-Deacetylbaccatin-III; R<1> = R<2> = R<3> = H, R<4> = OH wobei in den Formeln (I) und (II) Mono- oder Diester an C(7) und/oder C(13) mit C6-32-Alkylcarbonyl, C6-32-Alkenylcarbonyl, C6-32-Alkapolyencarbonyl oder Retinoyl als Esterkomponenten und in der Formel (III) Ester an C(7), C(13) und/oder C(14) mit diesen Esterkomponenten beansprucht sind.

2.

Verfahren zur Herstellung eines Esters gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formeln (I) bis (III) gemäss dem Fettschwanzprinzip mit einer langkettigen, aktivierten, aliphatischen Fettsäure in abs. Pyridin und 1,2-Dichlorethan, sowie einem Zusatz von 4-Dimethylaminopyridin und AgCN unter Schutzgas verestert und das Produkt anschliessend filtriert, gewaschen und chromatographisch über zwei Stufen gereinigt wird.

3.

Spontan dispergierbares Konzentrat, welches mit Wasser, mit 5%iger Glucoselösung oder mit Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergibt, die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm aufweisen, dadurch bestimmt, dass folgende Bestandteile zu einem pharmazeutisch verwendbaren System zusammengefügt sind: 0,1 bis 10 Gew.-% eines Esters von Baccatin-Ill, 10-Deacetylbaccatin-III oder 14-OH-10-Deactylbaccatin-III laut einer der Formeln (I) bis (III) gemäss Anspruch 1, bzw. einer Kombination solcher Ester, 0 bis 10 Gew.-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe, 1 bis 40 Gew.-% eines als Hydrotrop, bzw.

Co-Emulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, 0,1 bis 90 Gew.-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemisches, 0 bis 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins, 0 bis 10 Gew.-% eines Stabilisators, eines Radikalfängers oder eines Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.

4. Spontan dispergierbares Konzentrat laut Anspruch 3, enthaltend eine Verbindung gemäss einer der Formeln (I) bis (III) gemäss Anspruch 1, als Mittel zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten mit verbesserter Bioverfügbarkeit für die Behandlung von Tumoren, Ekzemen und Psoriasis.

5.

Spontan dispergierbares Konzentrat laut Anspruch 3, enthaltend eine Verbindung gemäss einer der Formeln (I) bis (III) gemäss Anspruch 1, als Mittel zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten mit antiviraler und/oder viruzider Wirksamkeit und zur gesteigerten Aufnahme exogener Aktivatoren.

6.

Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 3, dadurch in seinen Merkmalen bestimmt, dass folgende Bestandteile vereinigt sind: 0,5 bis 5 Gew.-% eines oder mehrerer Ester von Baccantin-111 laut einer der Formeln (I) bis (III) gemäss Anspruch 1, 5 bis 30 Gew.-% lsopropylmyristat, lsopropylpalmitat, 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-propansulfonat oder Neutralöl (Oleum neutrale), oder eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (VII): R<5>-COO-R<6> (VII) worin R<5> eine C2-31-Alkyl-, eine C3-31-Alkenyl- oder eine C3-31-Alkapolyengruppe und R<6> Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten, 0 bis 45 Gew.-% eines pharmaverträglichen Phosphorsäureester-Tensides, 5 bis 90 Gew.-% des wasserfreien tert.

Octylphenylpolyoxyethylenether Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen und/oder von Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat.

7. Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Bestandteile zusammengefügt sind: 0,5 bis 5 Gew.-% eines oder mehrerer Ester von Baccatin-III laut den Formeln (I) bis (III) gemäss Anspruch 1, 0 bis 5 Gew.-% 3-[(3-Cholamido-propyl)-dimethylammonio]-propansulfonat-Tensid, 5 bis 30 Gew.-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (VII): R<5>-COO-R<6> (VII) worin R<5> eine C2-31-Alkyl-, eine C3-31-Alkenyl- oder eine C3-31-Alkapolyengruppe und R<6> Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten, 35 bis 45 Gew.-% des wasserfreien tert.

Octylphenylpolyoxyethylenether Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen, 35 bis 45 Gew.-% eines Alkylphenolpolyglykolether Phosphat-Tensides oder des Tristyrylphenol-polyoxyethylen-18-phosphorsäureester-triethanol-aminsalz-Tensides.

8. Therapeutisches Systempräparat, welches 1 bis 95 Gew.-% des spontan dispergierbaren Konzentrates gemäss einem der Ansprüche 6 oder 7 und bis zu 10 Gew.-% eines pharmaverträglichen Zusatzstoffes, Lösungsmittels oder Stabilisators oder eines Gemisches davon enthält und welches in Dosis-Einheitsform als Micropellets, Granulat, Dragées, Suppositorien, Ampullen oder als Kapseln vorliegt.

9. Therapeutisches Systempräparat gemäss Anspruch 8, welches 44 Teile Kernmaterial für die Granulat-, bzw.

Pellet-Bildung, 25 Teile eines erfindungsgemässen Konzentrates und 31 Teile magensaftresistente und retardierende Beschichtung mit Hydroxypropyl-Methylcellulose-Acetat-Succinat enthält.