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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von in ihrer Zusammensetzung einheitlichen, von Blutgruppensubstanzen und Histokompatibilitätsantigenen freien humanen Transfer-Faktorpräparaten zur Stimulation des zellulären Immunsystems aus einem Pool peripherer Blutleukozyten von 500- 1000 gesunden Blutspendern, gekennzeichnet durch Zentrifuga tion von Frischblutkonserven bei 1800 - 2000 Ulmin bei + 8 C bis + 15 ^C für 10 bis 40 min und nachfolgende Zentrifugation des gepoolten Plasmas bei 1800 bis 2000 Ulmin bei + 8 C bis + 15 C für 20 bis 60 min, durch Abtrennen des Überstandsplasmas unter Erhalt der buffy-coats,
durch Entfernung von unerwünschten Begleitsubstanzen von den buffy-coats durch Wasch- und Zentrifugationsschritte bei 800-1000 U/min und +4 'C für 5 bis 15 min sowie anschliessend bei 1800 - 2000 U/min + 4 C für 30 bis 60 min, durch Aufschliessen der erhaltenen Leukozyten durch mindestens 1 0-maliges langsames Einfrieren und schnelles Auftauen, durch Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 1800 bis 2000 U/min bei +4 C für 30 bis 60 min,
und durch Ultrafiltration der Überstandslösung mit anschliessender Sterilfiltration und durch Portionieren des so erhaltenen sterilen und pyrogenfreien Präparates sowie Lyophilisieren beginnend bei -10 bis -15 'C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa über 24 h bis +4 C.
2. Verfahren zur Herstellung von in ihrer Zusammensetzung einheitlichen, von Blutgruppensubstanzen und Histokompatibilitätsantigenen freien humanen Transfer-Faktorpräparaten zur Stimulation des zellulären Immunsystems aus einem Pool peripherer Blutleukozyten von 500 - 1000 gesunden Blutspendern, gekennzeichnet durch Entfernung von unerwünschten Begleitsubstanzen von buffy-coats, die als Nebenprodukt bei industriellen Blutfraktionierungsverfahren anfallen, durch Wasch- und Zentrifugationsschritte bei 800 - 1000 U/min und + 4 C für 5 bis 15 min sowie anschliessend bei 1800 bis 2000 U/min und + 4 C für 30 bis 60 min, durch Aufschliessen der erhaltenen Leukozyten durch mindestens 1 0-maliges langsames Einfrieren und schnelles Auftauen,
durch Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 18002000 U/min bei +4 C für 30 bis 60 min, und durch Ultrafiltration der Überstandslösung mit anschliessender Sterilfiltration und durch Portionieren des so erhaltenen sterilen und pyrogenfreien Präparates sowie Lyophilisieren beginnend bei - 10 bis - 15 C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa über 24 h bis +4 C.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Entfernung von Plasmaeiweissbestandteilen und Erythrozyten die buffy-coats in isotonischer NaC1-Injektionslösung resuspendiert werden.
4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Begleitsubstanzen befreiten buffy-coats in aqua ad injektionem resuspendiert und aufgeschlossen werden.
5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Sterilfiltration sofort eine Portionierung unter aseptischen Bedingungen in Behältnisse stattfindet, die dann den Leukozytenextrakt von 10 mal 400 ml Blut entsprechend 5 Transfer-Faktor-Einheiten enthalten.
6. Transfer-Faktor-Präparat, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2.
7. Präparat gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Behältnis als lyophilisiertes Präparat à 5 Transfer-Faktor-Einheiten, das einen Peptid-Gehalt von 1,0 bis 10,0 mg, vorzugsweise von 1,0 bis 3,0 mg, einen Ribose Gehalt von 1,0 bis 5,0 mg, vorzugsweise von 1,2 bis 2,5 mg aufweist und dessen Verhältnis der optischen Dichte bei 260 nm und 280 nm nach dem Lösen in destilliertem Wasser 2,21 + 0,20 beträgt, vorliegt.
8. Präparat gemäss Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es bei der in vitro-Testung der immunologischen Wirksamkeit im Mikro-Lymphozytentransformationstest die PHA-induzierte Lymphozytenstimulation bei Zugabe von 1 111 PHA Ansatz auf mindestens das 1,4-fache verstärkt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Blutleukozyten gesunder, unausgewählter Blutspender, wobei sich die erhaltenen Präparate durch eine hohe immunbiologische Wirksamkeit bei der Stimulation des zellulären Immunsystems auszeichnen.
Der ständig steigende Bedarf an Blutkonserven und die Durchsetzung einer optimalen Hämotherapie bei minimalem Risiko für die Patienten hat seit längerer Zeit zu einer zunehmend effektiveren Ausnutzung des gespendeten Blutes in den Einrichtungen des Blutspende- und Transfusionsdienstes der DDR geführt. Gegenwärtig konzentrieren sich die Bemühungen auf die Entwicklung neuer Präparate aus menschlichem Vollblut insbesondere unter Ausnutzung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes und auf die sinnvolle Kombination verschiedener Präparationsverfahren bei Erhöhung der Qualität und der Ausbeute.
Durch die in den letzten Jahren gewonnenen neuen Erkenntnisse über Immundefektzustände und die noch immer unbefriedigende Situation der therapeutischen Beeinflussbarkeit dieser oft lebensbedrohlichen Erkrankungen ergibt sich die Notwendigkeit zur Entwicklung entsprechend wirksamer Medikamente.
Ein solches, die T-zellabhängigen Immunreaktionen stimulierend beeinflussendes Therapeutikum stellt der Transfer-Faktor dar. Transfer-Faktor beeinflusst in vivo und in vitro Korrelate der zellulären Immunität, ohne dass dessen wirksame Komponenten und deren Wirkungsweise im einzelnen bekannt wäre. Er setzt sich aus einem Gemisch niedermolekularer Polypeptide (MG < 10 000 Dalton) mit bis zu 12 Aminosäuren und einem Ribonukleinsäureanteil mit 2-3 Nukleotidbasen zusammen. Transfer-Faktor ist hitzestabil bei 37-C für 6 h und unempfindlich gegen Behandlung mit RNAse, DNAse und Chymotrypsin, dagegen wird er bei einer Hitzebehandlung > 90-C und durch Pronase zerstört.
Als Indikationen für die therapeutische Anwendung von Transfer-Faktor gelten primäre Immundefekte z. B. bei Agammaglobulinämie vom Schweizer Typ, Di-Giorgio Syndrom, Nezelof-Krankheit, Wiskott-Aldrich-Syndrom, Ataxia teleangiectasia, erworbene Immundefekte bei unterschiedlichen Grundkrankheiten z. B. bei Sarkoidose, Morbus Hodgkin, malignen Lymphomen, Karzinomen, bei immunsupressiver oder zytostatischer Therapie sowie bakterielle, virale und mykotische Infekte, z. B. Vacc. generalisata, Pseudomonas- und Candidainfektionen. Kontraindikationen sind gegenwärtig nicht bekannt und nicht zu erwarten.
Bisher wurden Transfer-Faktor-Präparate nur als Einzelpräparationen oder in geringen Poolgrössen von 10-20 Blutspendern durch Zellseparation am Blutspender bzw.
durch die auf die ausschliessliche maximale Gewinnung der Leukozyten orientierte Fraktionierung des Vollblutes gewonnen. Diese Art der Herstellung des Transfer-Faktors ist in Hinsicht auf die optimale Ausnutzung des wertvollen biologischen Rohstoffs Vollblut nicht effektiv. technisch sehr aufwendig und kostenintensiv. Auch können dadurch gerin
ge Poolgrössen nicht überschritten werden, was sich für eine gezielte, langfristige Therapie mit einem in höherem Masse standardisierten und einheitlichen Präparat für unerlässlich erweist. Für alle bisher bekannten Transfer-Faktor-Präparate konnten infolge der geringen Poolgrössen keine einheitliche Zusammensetzung bzw. keine Parameter, die die immunologische in vitro-Wirksamkeit hinreichend charakterisieren, angegeben werden.
Die buffy-coats der Blutkonserven, ein Gemisch aus Leukozyten und Thrombozyten, sind zur Zeit unerwünschte Störfaktoren in Erythrozytenkonzentraten, da sie zu Immunisierungen im HLA-System und durch die Bildung von Mikro- und Makroaggregaten zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Transfusionserfolges führen können. Eine therapeutische Nutzung dieser buffy-coats war bisher nicht möglich. Für die Herstellung von Leukozyten- bzw. Thrombozytenkonzentraten sind diese Nebenprodukte nicht geeignet. Für diese vitalen Zellkonzentrate sind HLA-idente Einzelpräparationen mit Hilfe von Zellseparationen erforderlich.
Ziel der Erfindung ist es, ein zur Zeit nicht zur Verfügung stehendes wirksames immunobiologisches Therapeutikum zur Beeinflussung der T-zellabhängigen Reaktionsfähigkeit unter Verwendung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes in Form der sogenannten buffy-coats auf sehr rationelle Art und Weise herzustellen, das infolge der sehr hohen Ausgangspoolgrösse einheitlich und in seinen Wirksubstanzen standardisiert ist und damit günstige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Therapie bietet. Dabei muss das auf die erfindungsgemässe Weise hergestellte Transfer-Faktor Präparat hinsichtlich seiner Einheitlichkeit in der Zusammensetzung und seiner quantifizierbaren immunologischen in vitro-Wirksamkeit den strengen Massstäben der Arzneimittelgesetzgebung Rechnung tragen.
Desweiteren muss sich das Verfahren zur Transfer Faktor-Präparation nahtlos in die bestehende Aufgabenstellung des Blutspende- und Transfusionsdienstes einordnen lassen unter Einbeziehung in bereits praktizierte Fraktionierungsverfahren des Vollblutes.
Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mängel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen:
Die bisher durchgeführte Einzelpräparation des Transfer-Faktors durch Zellseparation am Blutspender bzw. die Verwendung geringer Poolgrössen führte zu keinem einheitlichen und standardisierbaren Präparat, was für eine planmässige und zielgerichtete Therapie unerlässlich ist. Desweiteren zielten alle bisher bekannten Verfahren auf eine maximale Gewinnung der Leukozyten als Hauptziel der Fraktionierung des Vollblutes ohne dabei die bei anderen Fraktionierungsverfahren als nicht genutzte Blutbestandteile anfallenden buffy-coats der Verwendung als Ausgangsmaterial für die Transfer-Faktor-Präparation zuführen zu können.
Um diese Ursachen zu beseitigen liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Einordnung in den technologischen Prozess der Verarbeitung von frischem Human-Zitratblut, Human-Zitratblut AG oder Human-Heparinblut zu klinisch einsetzbaren Erythrozytensedimenten, Kryopräzipitat und Plasma die bisher als unerwünscht verworfenen buffy-coats in vertretbarer Ausbeute und hoher Reinheit als Nebenprodukt und Ausgangsmaterial zur Transfer-Faktor-Präparation zu gewinnen. Durch die Integration in die gegenwärtig praktizierten Fraktionierungsprozesse des Vollblutes werden die Leukozyten nicht als ausschliessliches, sondern als Nebenprodukt gewonnen und es gelingt damit, den Transfer-Faktor auf technologisch überraschend einfache und wenig kostenintensive Weise herzustellen.
Gegenstand der Erfindung sind demzufolge die in den Ansprüchen 1 und 2 definierten Verfahren.
Erfindungsgemäss kann ein Transfer-Faktorpräparat beispielsweise folgendermassen hergestellt werden:
Die Frischblutkonserven werden bei 1800 - 2000 U/min 10 bis 40 min lang bei + 8 'C bis + 15"C zentrifugiert. so dass sich nur die Erythrozyten in einer ausreichenden Packungsdichte sedimentieren und kein buffy-coat -Saum auf den Erythrozyten gebildet wird. Die Plasmen von zwei Konserven werden mittels der Stickstoff-Überdruck-Technik gepoolt und 20 bis 60 min lang bei 1800 bis 2000 U/min und +8"C bis + 15"C zentrifugiert, so dass ein zellfreies Überstandsplasma erhalten wird. Pro Pool werden ca. 4. 108 bis 2. 109 Leukozyten im buffy-coat zur Transfer-Faktor Herstellung gewonnen.
Nach Abtrennung des Frischplasmas zur Kryopräzipitatherstellung werden die buffy-coats in einem Plasmasaum unter aseptischen Bedingungen aufbewahrt, bis die Befunde der Au/SH-Überwanderungselektrophorese, der SGPT-Bestimmung und des CMT erhoben sind. Diese Aufbewahrungszeit darf 24 h nicht überschreiten, um Aktivitätsverluste zu vermeiden. Positive Laborbefunde werden aussortiert, ebenso bei eventuellen späteren Befunderhebungen.
Die buffy-coats werden mit 30 bis 50 ml isotonischer NaC1-Injektionslösung resuspendiert und die Resuspensionen von 15 bis 20 Pools vereinigt. Anschliessend werden die Pools kurzzeitig bei 800 bis 1000 U/min bei 4"C zentrifugiert, um den grössten Teil der mitgeschleppten Erythrozyten zu sedimentieren. Dabei darf sich nach der Zentrifugation keine buffy-coats -Schicht auf den Erythrozyten bilden. Um störende Plasmaeiweisse zu entfernen, werden die Suspensionen 30 bis 60 min bei 1800 bis 2000 U/min zentrifugiert und die überstehende Waschlösung verworfen. Die Leukozytensedimente werden in 50 bis 100 ml aqua ad injektionem resuspendiert und bei - 40"C eingefroren.
Zur Zerstörung der Zellen werden die Leukozytensuspensionen mindestens 10 bis 15 mal langsam bei - 20"C im shell-freezing Verfahren eingefroren und bei + 30"C schnell aufgetaut.
Diese langsamen Einfrier- schnellen Auftauprozesse begünstigen die Freisetzung des Transfer-Faktors aus den Zellen.
Nach der Zerstörung der Zellen werden durch eine 30 bis 60 minütige Zentrifugation bei 1800 bis 2000 U/min bei +4 C die Zelltrümmer sedimentiert und die klare oder leicht getrübte Uberstandslösung, die den gepoolten Leukozytenextrakt von 500 bis 1000 Blutkonserven enthält, einer Ultrafiltration unterzogen, um höhermolekulare Bestandteile abzutrennen. Das farblose oder leicht gelblich tingierte Ultrafiltrat wird über einen Bakterienfilter (0,2 m Porenweite) sterilfiltriert und unter aseptischen Bedingungen portioniert.
Die Lyophilisation der im shell-freezing-Verfahren eingefrorenen Präparate erfolgt beginnend bei -15 bis 1 0C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa bis zu einer Endtemperatur von 4"C über 24 h.
Eine Abpackung des lyophilisierten Präparates enthält 5 Einheiten Transfer-Faktor, entsprechend dem Leukozytenextrakt von 10 x 400 ml Vollblut. Der auf diese Art hergestellte Transfer-Faktor ist steril und pyrogenfrei und wird zur intramuskulären und subcutanen Applikation in jeweils 5 ml und zur intravenösen Applikation in 30 ml isotonischer NaC1-Injektionslösung gelöst. Das Präparat ist frei von Blutgruppensubstanzen, Histokompatibilitätsantigenen und weist das hepatitis-assoziierte Antigen nicht auf.
Eine Aufbewahrung des lyophilisierten Präparates von 6 Monaten bis zur Freigabe garantiert die Unbedenklichkeit in Hinsicht auf die Ubertragung einer Serumhepatitis entsprechend der vorgeschriebenen gesetzlichen Meldepflicht beim Auftreten einer Hepatitis bei Blutspendern.
Jede Charge des Transfer-Faktors wird entsprechend den vorgesehenen staatlichen Prüfungen auf die physiko- und biochemischen Parameter und auf seine immunologische Wirksamkeit geprüft. Die Restfeuchte der lyophilisierten Substanz darf bei einer Verwendbarkeitsdauer von 12 Monaten 5 Ma-% betragen. Der pH-Wert des in isotonischer NaC1-Injektionslösung gelösten Transfer-Faktors muss im Bereich von 5,8 bis 6,5 liegen. Nach Lösen in aqua dest.
muss das Verhältnis der optischen Dichte bei 260 nm und 280 nm 2,21 + 0,20 betragen. Der Ribose-Gehalt einer Abpackung muss im Bereich von 1,0 bis 5,0 mg, vorzugsweise von 1,2 bis 2,5 mg und der Peptidgehalt im Bereich von 1,0 bis 10,0 mg, vorzugsweise von 1,0 bis 3,0 mg liegen. Die immunologische Wirksamkeit jeder Transfer-Faktor-Charge wird im Mikro-Lymphozytentransformationstest (LTT) und im E-Rosetten-Recovery-Test untersucht. Der Verstärkungsindex als Mass für die durch den Transfer-Faktor erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten gegenüber Phytohämagglutinin (PHA) muss bei Zugabe von 1 yl PHA/ Ansatz mindestens 1,4 betragen. Im E-Rosetten-Recovery Test muss bei Transfer-Faktor-Zusatz eine signifikante Erhöhung des Anteils der rosettenbildenden Lymphozyten feststellbar sein.
Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1
ACD-AG-Frischblut-Konserven (nicht älter als 4 h) werden 15 min lang mit 2000 U/min bei + 8'C zentrifugiert. Die leukozytenreichen Plasmen von zwei Konserven werden gepoolt und bei 2000 U/min 40 min lang zentrifugiert, wobei die Erythrozytensedimente nach Resuspension in Konservierungslösung zum klinischen Einsatz kommen. Nach Abtrennung des Frischplasmas, das zur Kryopräzipitatherstellung weiterverwendet wird, werden jeweils 15 buffy-coats am nächsten Tag nach Resuspension in 30 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung vereinigt und zur Abtrennung noch vorhandener Erythrozyten 5 min lang bei 1000 U/min zentrifugiert.
Anschliessend wird die Leukozytensuspension bei 2000 U/min 40 min lang scharf zentrifugiert und das Sediment nach Entfernung der Waschlösung in 100 ml aqua ad injektionem resuspendiert und eingefroren. Insgesamt 16 Poolflaschen (; 480 TE Vollblut) werden 10 x bei 30 C im Thermostaten aufgetaut und anschliessend langsam eingefroren.
Nach Zentrifugation bei 2000 U/min für 30 min wird die Lösung ultrafiltriert. sterilfiltriert und in 48 Behältnisse zu je 5 TF-Einheiten portioniert. Nach der Lyophilisation werden Steril- und Pyrogenuntersuchungen vorgenommen.
Die auf diese Art und Weise hergestellten Präparate sind steril und pyrogenfrei und weisen die folgenden physikochemischen und immunologischen Parameter auf: pH-Wert 5,9
Restfeuchte 4,4 %
Verhältnis OD260/OD280 2,12
Peptid-Gehalt 2,3 mg
Ribose-Gehalt 1,1 mg
Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von 1 ,ul PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2,9-fache verstärkt.
Beispiel2
Die Herstellung erfolgte analog der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise.
Als Ausgangsmaterial dienten 820 TE Vollblut. Dementsprechend wurden nach den verschiedenen Zentrifugations-, Reinigungs- und Waschvorgängen, sowie nach der Ultraund Sterilfiltration 82 Behältnisse zuje 5 TF-Einheiten erhalten.
Dabei erhält man ein steriles und pyrogenfreies Präparat mit den folgenden physiko-chemischen und immunologischen Parametern: pH-Wert 6,2
Restfeuchte 3,4%
Verhältnis OD260/OD280 2,33
Peptid-Gehalt 1,1 mg
Ribose-Gehalt 1,6 mg
Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von 1 pl PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2,1-fache verstärkt.
Aus den Ausführungsbeispielen geht die besondere Eignung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung eines standardisierten und immunologisch wirksamen Transfer-Faktor-Präparates hervor, das charakterisiert wird durch die Kombination mit anderen Verfahrensschritten zur Fraktionierung des Vollblutes. Durch diese Verbindung gelingt eine weitaus rationellere und sehr kostengünstige Ausnutzung des im begrenzten Umfang zur Verfügung stehenden wertvollen Vollbluts, wobei gegenüber bereits bekannten herkömmlichen Verfahren der Vorteil besteht, dass ausser den klinisch vollwertig einsetzbaren Hauptprodukten wie Erythrozytensedimente, Kryopräzipitat und Plasma ein bisher verworfenes Nebenprodukt zu einem hochwertigen Immuntherapeutikum umgewandelt wird.