DD211443A3 - Verfahren zur herstellung von humanen transfer-faktor-praeparaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Praeparationen aus peripheren Blutleukozyten gesunder, unausgewaehlter Blutspender, wobei sich die erhaltenen Praeparate durch eine einheitliche Zusammensetzung und eine hohe immunologische Wirksamkeit bei der Stimulation des zullulaeren Immunsystems auszeichnen. Dabei finden als Ausgangsmaterial die bei anderen Fraktionierungsverfahren des Vollblutes als unerwuenschte und nicht genutzte Blutbestandteile anfallenden "buffy coats" Verwendung, so dass sich dieses Verfahren in die bestehende Aufgabenstellung des Blutspende- und Transfusionsdienstes einordnen laesst, ohne auf die ausschliessliche maximale Gewinnung der Leukozyten zu orientieren. Durch diese Einordnung in bereits praktizierte Fraktionierungsverfahren werden Ausgangspoolgroessen von 500 bis 1000 Blutspendern erreicht und damit ein einheitliches und in seiner immunologischen in vitro-Wirksamkeit standardisiertes Praeparat gewonnen, das den strengen Massstaeben der Arzneimittelgesetzgebung entspricht und dadurch guenstige Voraussetzungen fuer eine laengerfristige Therapie von Immunerkrankungen bietet.

Description

Erfinder: Plauen, am 28.07.1981

Franke, Dr. Wilfried Karl, Doz. Dr. Manfred Däger, Prof. Dr. Lothar Metzner, Dr. Gerhard

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten

Anwendungsgebiet der Erfindung '

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Blutleukozyten gesunder, unausgewählter Blutspender, wobei sich die erhaltenen Präparate durch eine hohe immunbiologische Wirksamkeit bei der Stimulation des zellulären Immunsystems auszeichnen.

Der ständig steigende Bedarf an Blutkonserven und die Durchsetzung einer optimalen Hämotherapie bei minimalem Risiko für die Patienten hat seit längerer Zeit zu einer zunehmend effektiveren Ausnutzung des gespendeten Blutes in den Einrichtungen des Blutspende- und Transfusionsdienstes der DDR geführt. Gegenwärtig konzentrieren sich die Bemühungen auf die Entwicklung neuer Präparate aus menschlichem Vollblut insbesondere unter Ausnutzung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes und auf die sinnvolle Kombination verschiedener Präparationsverfahren bei Erhöhung der Qualität und der Ausbeute.

Durch die in den letzten CJahren gewonnenen neuen Erkenntnisse über Immundefektzustände und die noch immer unbefriedigende Situation der therapeutischen Beeinflußbarkeit dieser oft lebensbedrohlichen Erkrankungen ergibt sich die Notwendigkeit zur Entwicklung entsprechend wirksamer Medikamente,

Ein solches, die T-zellabhängigen Immunreaktionen stimulierend beeinflussendes Therapeutikum stellt der Transfer-Faktor dar. Transfer-Faktor beeinflußt in vivo und in vitro Korrelate der zellulären Immunität, ohne daß dessen wirksame Komponenten und deren Wirkungsweise im einzelnen bekannt wäre. Er setzt sich aus einem Gemisch niedermolekularer Polypeptide (MG <10 000 Dalton) mit bis zu 12 Aminosäuren und einem Ribonukleinsäureanteil mit 2-3 Nukleotidbasen zusammen. Transfer-Faktor ist hitzestabil bei 37 C für 6 h und unempfindlich gegen Behandlung mit RNAse, DNAse und Chymotrypsin, dagegen wird er bei einer Hitzebehandlung >90 C und durch Pronase zerstört.

Als Indikationen für die therapeutische Anwendung von Transfer-Faktor gelten primäre Immundefekte z. B. bei Agammaglobulinämie vom Schweizer Typ, Di-Giorgio-Syndrom, Nezelof-Krankheit, Wiskott-Aldrich-Syndrom, Ataxia teleangiectasia, erworbene Immundefekte bei unterschiedlichen Grundkrankheiten z. B. bei Sarkoidose, Morbus Hodgkin, malignen Lymphomen, Karzinomen, bei immunsupressiver oder zytostatischer Therapie sowie bakterielle, virale und mykotische Infekte, z. B. Vacc. generalisata, Pseudomonas- und Candidainfektionen. Kontraindikationen sind gegenwärtig nicht bekannt und nicht zu erwarten.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisher wurden Transfer-Faktor-Präparate nur als Einzelpräparationen oder in geringen Poolgrößen von 10 - 20 Blutspendern durch Zellseparation am Blutspender bzw; durch die auf die ausschließliche maximale Gewinnung der Leukocyten orientierte Fraktionierung des Vollblutes gewonnen. Diese

Art der Herstellung des Transfer-Faktors ist in Hinsicht auf die optimale Ausnutzung des wertvollen biologischen Rohstoffs Vollblut nicht effektiv, technisch sehr aufwendig und kostenintensiv. Auch können dadurch geringe Poolgrößen nicht überschritten werden, was sich für eine gezielte, langfristige Therapie mit einem in höherem Maße standardisierten und einheitlichen Präparat für unerläßlich erweist. Für alle bisher bekannten Transfer-Faktor-Präparate konnten infolge der geringen Poolgrößen keine einheitliche Zusammensetzung bzw. keine Parameter, die die immunologische in vitro-Wirksamkeit hinreichend charakterisieren, angegeben werden.

Die "buffy-coats" der Blutkonserven, ein Gemisch aus Leukozyten und Thrombozyten, sind zur Zeit unerwünschte Störfaktoren in Erythrozytenkonzentraten, da sie zu Immunisierungen im HLA-System und durch die Bildung von Mikro- und Makroaggregaten zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Transfusionserfolges führen können. Eine therapeutische Nutzung dieser "buffy-coats" war bisher nicht möglich. Für die Herstellung von Leukozyten- bzw. Thrombozytenkonzentraten sind diese Nebenprodukte nicht geeignet. Für diese vitalen Zellkonzentrate sind HLA-idente Einzelpräparationen mit Hilfe von Zellseparatoren erforderlich.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein zur Zeit nicht zur Verfügung stehendes wirksames immunbiologisches Therapeutikum zur Beeinflussung der T-zellabhängigen Reaktionsfähigkeit unter Verwendung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes in Form der sogenannten "buffy-coats" auf sehr rationelle Art und Weise herzustellen, das infolge der sehr hohen Ausgangspoolgröße einheitlich und in seinen Wirksubsta'nzen standardisiert ist und damit günstige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Therapie bietet. Dabei muß das auf die erfindungsgemäße Weise hergestellte Transfer-Faktor-Präparat hinsichtlich seiner Einheitlichkeit in der Zusammensetzung

und seiner quantifizierbaren immunologischen in vitro-Wirksamkeit den strengen Maßstäben der Arzneimittelgesetzgebung Rechnung tragen.

Desweiteren muß sich das Verfahren zur Transfer-Faktor-Präparation nahtlos in die bestehende Aufgabenstellung des Blutspende- und Transfusionsdienstes einordnen lassen unter Einbeziehung in bereits praktizierte Fraktionierungsverfahren des Vollblutes.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mängel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen:

Die bisher durchgeführte Einzelpräparation des Transfer-Faktors durch Zellseparation am Blutspender bzw. die Verwendung geringer Poolgrößen führte zu keinem einheitlichen und standardisierbaren Präparat, was für eine planmäßige und zielgerichtete Therapie unerläßlich ist. Desvveiteren zielten alle bisher bekannten Verfahren auf eine maximale Gewinnung der Leukozyten als Hauptziel der Fraktionierung des Vollblutes ohne dabei die bei anderen Fraktionierungsverfahren als nicht genutzte Blutbestandteile anfallenden "buffy coats" der Verwendung, als Ausgangsmaterial für die Transfer-Faktor-Präparation zuführen zu können.

Um diese Ursachen zu beseitigen, liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Einordnung in den technologischen Prozeß der Verarbeitung von frischem Human-Zitratblut, Human-Zitratblut-AG oder Human-Heparinblut zu klinisch einsetzbaren Erythrozytensedimenten, Kryopräzipitat und Plasma die bisher als unerwünscht verworfenen "buffy coats" in vertretbarer Ausbeute und hoher Reinheit als Nebenprodukt und Ausgangsmaterial zur Transfer-Faktor-Präparation zu gewinnen. Durch die Integration in die gegenwärtig praktizierten Fraktionierungsprozesse des Vollblutes werden die Leukozyten nicht als ausschließliches,

sondern als Nebenprodukt gewonnen und es gelingt damit, den Transfer-Faktor auf technologisch überraschend einfache und wenig kostenintensive Weise herzustellen.

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß die Frischblutkonserven bei 1800 bis 2000 U/min 10 bis 40 min lang bei + 8° bis + 15° C zentrifugiert werden, so daß sich nur die Erythrozyten in einer ausreichenden Packungsdichte sedimentieren und kein "buffy coaf-Saura auf den Erythrozyten gebildet wird. Die Plasmen von zwei Konserven werden mittels der Stickstoff-Überdruck-Technik gepoolt und 20 bis 60 min lang bei 1800 bis 2000 U/min und + 8° bis + 15° C zentrifu- giert, so daß ein zellfreies Überstandsplasma erhalten wird.

8 9

Pro Pool werden ca. 4 · 10 bis 2 · 10 Leukozyten im "buffy coat" zur Transfer-Faktor-Herstellung gewonnen. Nach Abtrennung des Frischplasmas zur Kryopräzipitatherstellung werden die "buffy coats" in einem Plasmasaum unter aseptischen Bedingungen aufbewahrt, bis die Befunde der Au/SH-Oberwanderungselektrophorese, der SGPT-Bestimmung und des CMT erhoben sind. Diese Aufbewahrungszeit darf 24 h nicht überschreiten, um Aktivitätsverluste zu vermeiden. Positive Laborbefunde werden aussortiert, ebenso bei eventuellen späteren Befunderhebungen.

Die "buffy coats" werden mit 30 bis 50 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung resuspendiert und die Resuspensionen von 15 bis 20 Pools vereinigt. Anschließend werden die Pools kurzzeitig bei 800 bis 1000 U/min bei +4⁰C zentrifugiert, um den größten Teil der mitgeschleppten Erythrozyten zu sedimentieren. Dabei darf sich nach der Zentrifugation keine "buffy coat"-Schicht auf den Erythrozyten bilden. Um störende Plasmaeiweiße zu entfernen, werden die Suspensionen 30 bis 60 min bei 1800 bis 2000 U/min zentrifugiert und die überstehende Waschlösung verworfen. Die Leukozytensedimente werden in 50 bis 100 ml aqua ad iniektionem resuspendiart und bei - 40 C eingefroren, Zur Zerstörung der Zellen werden die Leukozytensuspenszonen mindestens 10 bis 15 mal langsam bei - 20 C im shell-freezing-Verfanren ein-

gefroren und bei + 30° C schnell aufgetaut. Diese langsamen Einfrier-1 schnellen Auftauprozesse begünstigen die Freisetzung des Transfer-Faktors aus den Zellen. Nach der Zerstörung der Zellen werden durch eine 30 bis 50 minütige Zentrifugation bei 1800 bis 2000 U/min bei +4⁰C die Zelltrümmer sedimentiert und die klare oder leicht getrübte Überstandslösung, die den gepoolten Leukozytenextrakt von ca. 500 bis 1000 Blutkonserven enthält, einer Ultrafiltration unterzogen, um höhermolekulare Bestandteile abzutrennen. Das farblose oder leicht gelblich ting^erte Ultrafiltrat wird über einen Bakterienfilter (0,2,UiJjPorenvveite) sterilfiltriert und unter aseptischen Bedingungen portioniert.

Die Lyophilisation der im shell-freezing-Verfahren eingefrorenen Präparate -erfolgt beginnend bei - 15 bis - 10° C unter einem Vakuum von 0,1 bis 0,3 Torr bis zu einer Endtemperatur von 4 C über 24 h.

Eine Abpackung des lyophilisierten Präparates enthält 5 Einheiten Transfer-Faktor, entsprechend dem Leukozytenextrakt von 10 χ .400 ml Vollblut. Der auf diese Art hergestellte Transfer-Faktor ist steril und pyrogenfrei und wird zur intramuskulären und subcutanen Applikation in jeweils 5 ml und zur intravenösen Applikation in 30 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung gelöst. Das Präparat ist frei von Blutgruppensubstanzen, Histokompatibilitätsantigenen und weist das hepatitisassoziierte Antigen nicht auf.

Eine Aufbewahrung des lyophilisierten Präparates von 6 Monaten bis zur Freigabe garantiert die Unbedenklichkeit in Hinsicht auf die Übertragung einer Serumhepatitis entsprechend der vorgeschriebenen gesetzlichen Meldepflicht beim Auftreten einer Hepatitis bei Blutspendern.

Jede Charge des Transfer-Faktors wird entsprechend den vorgesehenen staatlichen Prüfungen auf die physiko- und biochemischen Parameter und auf seine immunologische Wirksamkeit geprüft. Die Restfeuchte der lyophilisierten Substanz darf bei einer Verwendbarkeitsdauer von 12 Monaten 5 Ha-% betragen.

Der pH-Wert des in isotonischer NaCl-Injektionslösung gelösten Transfer-Faktors muß im Bereich von 5,8 bis 6,5 liegen. Nach Lösen in aqua dest. muß das Verhältnis der optischen Dichte bei 260 nm und 280 nm 2,21 - 0,20 betragen. Der Ribose-Gehalt einer Abpackung muß im Bereich von 1,0 bis 5,0 mg, vorzugsweise von 1,2 bis 2,5 mg und der Peptidgehalt im Bereich von 1,0 bis 10,0 mg, vorzugsweise von 1,0 bis 3,0 mg liegen. Die immunologische Wirksamkeit jeder Transfer-Faktor-Charge wird im Mikro-Lymphozytentransformationstest (LTT) und im E-Rosetten-Recovery-Tes^t untersucht. Der Verstärkungsindex als Maß für die durch den Transfer-Faktor erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten gegenüber Phytohämagglutinin (PHA) muß bei Zugabe von Iu1 PHA/Ansatz mindestens 1,4 betragen. Im E-Rosetten-Recovery-Test muß bei Transfer-Faktor-Zusatz eine signifikante Erhöhung des Anteils der rosettenbildenden Lymphozyten feststellbar sein.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden,

Beispiel 1

ACD-AG-Frischblut-Konserven (nicht älter als 4h) werden 15 min lang mit 2000 U/min bei + 8 C zentrifugiert. Die leukozytenreichen Plasmen von zwei Konserven werden gepoolt und bei 2000 U/min 40 min lang zentrifugiert, wobei die Erythrozytensedimente nach Resuspension in Konservierungslösung zum klinischen Einsatz kommen. Nach Abtrennung des Frischplasmas, das zur Kryopräzipitatherstellung weiterverwendet wird, werden jeweils 15 "buffy coats" am nächsten Tag nach Resuspension in 30 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung vereinigt und zur Abtrennung noch vorhandener Erythrozyten 5 min lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Anschließend wird die Leukozytensuspension bei 2000 U/min 40 min lang scharf zentrifugiert und das Sediment nach Entfernung der Waschlösung in 100 ml aqua ad injektionem re-

4,4	0/ /0
2,12
2,3	rag
1,1	mg

suspendiert und eingefroren. Insgesamt 16 Poolflaschen (S 480 TE Vollblut) werden 10 χ bei 30° C im Thermostaten aufgetaut und anschließend langsam eingefroren. Nach Zentrifugation bei 2000 U/min für 30 min wird die Lösung ultrafiltriert, sterilfiltriert und in 48 Behältnisse zu je 5 TF-Einheiten portioniert. Nach der Lyophilisation werden Steril- und Pyrogenuntersuchungen vorgenommen. Die auf diese Art und Weise hergestellten Präparate sind steril und pyrogenfrei und weisen die folgenden physikochemischen und immunologischen Parameter auf:

pH-Wert 5,9

Restfeuchte Verhältnis 0D_?(-_n / Peptid-Gehalt Ribose-Gehalt

Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von Iu. 1 PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2,9-fache verstärkt.

Beispiel 2

Die Herstellung erfolgte analog der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise.

Als Ausgangsmaterial dienten 320 TE Vollblut. 'Dementsprechend wurden nach den verschiedenen Zentrifugations-, Reinigungsund Waschvorgängen, sowie nach der Ultra- und Sterilfiltration 82 Behältnisse zu je 5 TF-Einheiten erhalten. Dabei erhält man ein steriles und pyrogenfreies Präparat mit den folgenden physiko-chemischen und immunologischen Parametern:

pH-Wert 6,2

Rest feuchte 3,4 %

Verhältnis OD₂₆₀ / 0D_oan 2,33

Peptid-Gehalt 1,1 mg

Ribose-Gehalt 1,6 mg

Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von I/4.I PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2,1-fache verstärkt.

Aus den Ausführungsbeispielen geht die besondere Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines standardisierten und immunologisch wirksamen Transfer-Faktor-Präparates hervor, das charakterisiert wird durch die Kombination mit anderen Verfahrensschritten zur Fraktionierung des Vollblutes. Durch diese Verbindung gelingt eine weitaus rationellere und sehr kostengünstige Ausnutzung des im begrenzten Umfang zur Verfugung stehenden wertvollen Vollbluts, wobei gegenüber bereits bekannten herkömmlichen Verfahren der Vorteil besteht, daß außer den klinisch vollwertig einsetzbaren Hauptprodukten wie Erythrozytensedimente, Kryopräzipitat und Plasma ein bisher verworfenes Nebenprodukt zu einem hochwertigen Immuntnerapeutikum umgewandelt wird.

Claims (5)

Erfindungsanspruch

1«. Verfahren zur Herstellung von in ihrer Zusammensetzung einheitlichen, von Slutgruppensubstanzen und Histokompatibilitätsantigenen freien und auf ihre immunologische in - vitro - Wirksamkeit geprüften Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Human-Blut-Leukozyten, die die immunologische in - vitro - Wirksamkeit der PHA - induzierten Lymphozytenstimulation bei Zugabe von 1 ,u 1 PHA / Ansatz auf mindestens das 1, 4-fache verstärken und einer Ausgangspoolgröße von 500 bis 1000 Blutspendern entstammen, gekennzeichnet dadurch, daß die bei der Kryopräzipitatherstellung aus frischem Humanblut anfallenden "buffy coats" nach der Entfernung von Plasmaeiweißbestandteilen und Erythrozyten durch separate Wasch- und Zentrifugationsschritte bei 800 bis 1000 U/min und + 4°C für 5 bis 15 min, sowie anschließend bei ISOO bis 2000 U/min und + 4⁰C für 30 bis 60 min durch mindestens 10-maliges, vorzugsweise 12- bis 15-maiiges, langsames Einfrieren und schnelles Auftauen aufgeschlossen und nach der Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 1800 bis 2000 U/min bei + 4⁰C für 30 bis 60 min einer Ultrafiltration mit nachfolaender Sterilfiltration unterzoosn werden und anschließend unter langsamer Temperaturerhöhung im Temperaturbereich zwischen - 15 C und + 4 C bei einem Druck von 0,1 bis 0,3 Torr lyophilisiert werden.

2. Verfahren gemäiS Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Entfernung unerwünschter Segleitsubstanzen unter Verwendung isotonischer NaCl-Iniektionslösung geschieht.

3. Verfahren gemäß Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zum Aufschluß der "buffy coats" aqua ad injektionem Verwendung findet.

4. Verfahren gemäß Punkt 1. bis 3, gekennzeichnet dadurch,, daß nach der Sterilfiltration sofort eine Portionierung unter aseptischen Bedingungen in Behältnisse stattfindet, die dann den Leukozytenextrakt von 10 mal 400 ml 3lut entsprechend

5 Transfer-Faktor-Einheiten enthalten.