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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Blutleukozyten gesunder, unausgewählter Blutspender, wobei sich die erhaltenen Präparate durch eine hohe immunbiologische Wirksamkeit bei der Stimulation des zellulären Immunsystems auszeichnen.
Der ständig steigende Bedarf an Blutkonserven und die Durchsetzung einer optimalen Hämotherapie bei minimalem Risiko für die Patienten hat seit längerer Zeit zu einer zunehmend effektiveren Ausnutzung des gespendeten Blutes in den Einrichtungen des Blutspende- und Transfusionsdienstes der DDR geführt. Gegenwärtig konzentrieren sich die Bemühungen auf die Entwicklung neuer Präparate aus menschlichem Vollblut, insbesondere unter Ausnutzung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes und auf die sinnvolle Kombination verschiedener Präparationsverfahren bei Erhöhung der Qualität und der Ausbeute.
Durch die in den letzten Jahren gewonnenen neuen Erkenntnisse über Immundefektzustände und die noch immer unbefriedigende Situation der therapeutischen Beeinflussbarkeit dieser oft lebensbedrohlichen Erkrankungen ergibt sich die Notwendigkeit zur Entwicklung entsprechend wirksamer Medikamente.
Ein solches, die T-zellabhängigen Immunreaktionen stimulierend beeinflussendes Therapeutikum stellt der Transfer-Faktor dar. Transfer-Faktor beeinflusst in vivo und in vitro Korrelate der zellulären Immunität, ohne dass dessen wirksame Komponenten und deren Wirkungsweise im einzelnen bekannt wäre. Er setzt sich aus einem Gemisch niedermolekularer Polypeptide (MG < 10000 Dalton) mit bis zu 12 Aminosäuren und einem Ribonukleinsäureanteil mit 2 bis 3 Nukleotidbasen zusammen.
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900Czerstört.
Als Indikationen für die therapeutische Anwendung von Transfer-Faktor gelten primäre Immumdefekte z. B. bei Agammaglobulinämie vom Schweizer Typ, Di-Giorgio-Syndrom, Nezelof-Krankheit, Wiskott-Aldrich-Syndrom, Ataxia teleangiectasia, erworbene Immundefekte bei unterschiedlichen Grundkrankheiten z. B. bei Sarkoidose, Morbus Hodgkin, malignen Lymphomen, Karzinomen, bei immunsupressiver oder zytostatischer Therapie sowie bakterielle, virale und mykotische Infekte, z. B. Vacc. generalisata, Pseudomonas-und Candidainfektionen. Kontraindikationen sind gegenwärtig nicht bekannt und nicht zu erwarten.
Bisher wurden Transfer-Faktor-Präparate nur als Einzelpräparationen oder in geringen Poolgrössen von 10 bis 20 Blutspendern durch Zellseparation am Blutspender bzw. durch die auf die ausschliessliche maximale Gewinnung der Leukozyten orientierte Fraktionierung des Vollblutes gewonnen. Diese Art der Herstellung des Transfer-Faktors ist in Hinsicht auf die optimale Ausnutzung des wertvollen biologischen Rohstoffs Vollblut nicht effektiv, technisch sehr aufwendig und kostenintensiv. Auch können dadurch geringe Poolgrössen nicht überschritten werden, was sich für eine gezielte, langfristige Therapie mit einem in höherem Masse standardisierten und einheitlichen Präparat für unerlässlich erweist.
Für alle bisher bekannten Transfer-Faktor-Präparate konnten infolge der geringen Poolgrössen keine einheitliche Zusammensetzung bzw. keine Parameter, die die immunologische in vitro-Wirksamkeit hinreichend charakterisieren, angegeben werden.
Die"buffy-coats" (Leukozyten-Thrombozyten-Schicht) der Blutkonserven, ein Gemisch aus Leukozyten und Thrombozyten, sind zur Zeit unerwünschte Störfaktoren in Erythrozytenkonzentraten, da sie zu Immunisierungen im HLA-System und durch die Bildung von Mikro- und Makroaggregaten zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Transfusionserfolges führen können. Eine therapeutische Nutzung dieser"buffy-coats"war bisher nicht möglich. Für die Herstellung von Leukozyten-bzw. Thrombozyenkonzentraten sind diese Nebenprodukte nicht geeignet. Für diese vitalen Zellkonzentrate sind HLA-idente Einzelpräparationen mit Hilfe von Zellseparatoren erforderlich.
Ziel der Erfindung ist es, ein zur Zeit nicht zur Verfügung stehendes wirksames immunbiologisches Therapeutikum zur Beeinflussung der T-zellabhängigen Reaktionsfähigkeit unter Verwendung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes in Form der sogenannten"buffy-coats"auf sehr rationelle Art und Weise herzustellen, das infolge der sehr hohen Ausgangspoolgrösse einheitlich und in seinen Wirksubstanzen standardisiert ist und damit günstige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Therapie bietet. Dabei muss das auf die erfindungsgemässe Weise hergestellte Trans-
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fer-Faktor-Präparat hinsichtlich seiner Einheitlichkeit in der Zusammensetzung und seiner quantifizierbaren immunologischen in vitro-Wirksamkeit den strengen Massstäben der Arzneimittelgesetzgebung Rechnung tragen.
Desweiteren muss sich das Verfahren zur Transfer-Faktor-Präparation nahtlos in die bestehende Aufgabenstellung des Blutspende- und Transfusionsdienstes einordnen lassen unter Einbeziehung in bereits praktizierte Fraktionierungsverfahren des Vollblutes.
Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mängel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen :
Die bisher durchgeführte Einzelpräparation des Transfer-Faktors durch Zellseparation am Blutspender bzw. die Verwendung geringer Poolgrössen führte zu keinem einheitlichen und standardisierbaren Präparat, was für eine planmässige und zielgerichtete Therapie unerlässlich ist.
Desweiteren zielten alle bisher bekannten Verfahren auf seine maximale Gewinnung der Leukozyten als Hauptziel der Fraktionierung des Vollblutes ohne dabei die bei andern Fraktionierungsverfahren als nicht genutzte Blutbestandteile anfallenden"buffy-coats"der Verwendung als Ausgangsmaterial für die Transfer-Faktor-Präparation zuführen zu können.
Um diese Ursachen zu beseitigen, liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Einordnung in den technologischen Prozess der Verarbeitung von frischem Human-Zitratblut, Human-Zitratblut-AG oder Human-Heparinblut zu klinisch einsetzbaren Erythrozytensedimenten, Kryopräzipitat und Plasma die bisher als unerwünscht verworfenen "buffy-coats"in vertretbarer Ausbeute und hoher Reinheit als Nebenprodukt und Ausgangsmaterial zur Transfer-Faktor-Präparation zu gewinnen. Durch die Integration in die gegenwärtig praktizierten Fraktionierungsprozesse des Vollblutes werden die Leukozyten nicht als ausschliessliches, sondern als Nebenprodukt gewonnen und es gelingt damit, den Transfer-Faktor auf technologisch überraschend einfache und wenig kostenintensive Weise herzustellen.
Erfindungsgemäss wird das dadurch erreicht, dass die Frischblutkonserven bei 1800 bis 2000 Umdr/min 10 bis 40 min lang bei +8 bis +15OC zentrifugiert werden, so dass sich nur die Erythrozyten in einer ausreichenden Packungsdichte sedimentieren und kein "buffy-coat"-Saum auf den Erythrozyten gebildet wird. Die Plasmen von zwei Konserven werden mittels der Stickstoff-Überdruck-Technik gepoolt und 20 bis 60 min lang bei 1800 bis 2000 Umdr/min und +8 bis
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in einem Plasmasaum unter aseptischen Bedingungen aufbewahrt, bis die Befunde der Au/SH-Überwanderungselektrophorese, der SGPT-Bestimmung und des CMT erhoben sind. Diese Aufbewahrungszeit darf 24 h nicht überschreiten, um Aktivitätsverluste zu vermeiden. Positive Laborbefunde werden aussortiert, ebenso bei eventuellen späteren Befunderhebungen.
Die"buffy-coats"werden mit 30 bis 50 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung resuspendiert und die Resuspensionen von 15 bis 20 Pools vereinigt. Anschliessend werden die Pools kurzzeitig
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auf den Erythrozyten bilden.
Um störende Plasmaeiweisse zu entfernen, werden die Suspensionen 30 bis 60 min bei 1800 bis 2000 Umdr/min zentrifugiert und die überstehende Waschlösung verworfen. Die Leukozytensedimente werden in 50 bis 100 ml aqua ad injektionem resuspendiert und bei-40 C eingefroren. Zur Zerstörung der Zellen werden die Leukozytensuspensionen mindestens 10 bis 15mal langsam bei - 20 C im shell-freezing-Verfahren eingefroren und bei +30 C schnell aufgetaut. Diese langsamen Einfrier-schnellen Auftauprozesse begünstigen die Freisetzung des Transfer-Faktors aus den Zellen.
Nach der Zerstörung der Zellen werden durch eine 30 bis 60minütige Zentrifugation bei 1800 bis 2000 Umdr/min bei +4 C die Zelltrümmer sedimentiert und die klare oder leicht getrübte Überstandslösung, die den gepoolten Leukozytenextrakt von zirka 500 bis 1000 Blutkonserven enthält, einer Ultrafiltration unterzogen, um höhermolekulare Bestandteile abzutrennen. Das farblose oder leicht gelblich tingierte Ultrafiltrat wird über einen Bakterienfilter (0, 2 jim Porenweite) sterilfiltriert und unter aseptischen Bedingungen portioniert.
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Die Lyophilisation der im shell-freezing-Verfahren eingefrorenen Präparate erfolgt beginnend bei-15 bis-10 C unter einem Vakuum von 13, 3 bis 40, 0 Pa bis zu einer Endtemperatur von 40C über 24 h.
Eine Abpackung des lyphilisierten Präparates enthält 5 Einheiten Transfer-Faktor, entsprechend dem Leukozytenextrakt von 10 x 400 ml Vollblut. Der auf diese Art hergestellte Transfer-Faktor ist steril und pyrogenfrei und wird zur intramuskulären und subcutanen Applikation in jeweils 5 ml und zur intravenösen Applikation in 30 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung gelöst. Das Präparat ist frei von Blutgruppensubstanzen, Histokompatibilitätsantigenen und weist das hepatitisassoziierte Antigen nicht auf.
Eine Aufbewahrung des lyophilisierten Präparates von 6 Monaten bis zur Freigabe garantiert die Unbedenklichkeit in Hinsicht auf die Übertragung einer Serumhepatitis entsprechend der vorgeschriebenen gesetzlichen Meldepflicht beim Auftreten einer Hepatitits bei Blutspendern.
Jede Charge des Transfer-Faktors wird entsprechend den vorgesehenen staatlichen Prüfungen auf die physiko- und biochemischen Parameter und auf seine immunologische Wirksamkeit geprüft.
Die Restfeuchte der lyophilisierten Substanz darf bei einer Verwendbarkeitsdauer von 12 Monaten 5 Ma-% betragen. Der pH-Wert des in isotonischer NaCl-Injektionslösung gelösten Transfer-Faktors muss im Bereich von 5, 8 bis 6, 5 liegen. Nach Lösen in aqua dest. muss das Verhältnis der optischen Dichte bei 260 und 280 nm 2, 21 0, 20 betragen. Der Ribose-Gehalt einer Abpackung muss im Bereich von 1, 0 bis 5, 0, vorzugsweise von 1, 2 bis 2, 5 mg und der Peptid-Gehalt im Bereich von 1, 0 bis 10, 0, vorzugsweise 1, 0 bis 3, 0 mg liegen. Die immunologische Wirksamkeit jeder Transfer-Faktor-Charge wird im Mikro-Lymphozytentransformationstest (LTT) und im E-Rosetten- - Recovery-Test untersucht.
Der Verstärkungsindex als Mass für die durch den Transfer-Faktor erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten gegenüber Phytohämagglutinin (PHA) muss bei Zugabe von 1 11 l PHA/Ansatz mindestens 1, 4 betragen. Im E-Rosetten-Recovery-Test muss bei Transfer- - Faktor-Zusatz eine signifikante Erhöhung des Anteils der rosettenbildenden Lymphozyten feststellbar sein.
Ausführungsbeispiel : Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1 : ACD-AG-Frischblut-Konserven (nicht älter als 4 h) werden 15 min lang mit 2000 Umdr/min bei +8 C zentrifugiert. Die leukozytenreichen Plasmen von zwei Konserven werden gepoolt und bei 2000 Umdr/min 40 min lang zentrifugiert, wobei die Erythrozytensedimente nach Resuspension in Konservierungslösung zum klinischen Einsatz kommen. Nach Abtrennung des Frischplasmas, das zur Kryopräzipitatherstellung weiterverwendet wird, werden jeweils 15"buffy-coats" am nächsten Tag nach Resuspension in 30 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung vereinigt und zur Abtrennung noch vorhandener Erythrozyten 5 min lang bei 1000 Umdr/min zentrifugiert.
Anschliessend wird die Leukozytensuspension bei 2000 Umdr/min 40 min lang scharf zentrifugiert und das Sediment nach Entfernung der Waschlösung in 100 ml aqua ad injektionem resuspendiert und eingefroren. Insgesamt 16 Poolflaschen (2, 480 TE Vollblut) werden 10 x bei 30 C im Thermostaten aufgetaut und anschliessend langsam eingefroren. Nach Zentrifugation bei 2000 Umdr/min für 30 min wird die Lösung ultrafiltriert, sterilfiltriert und in 48 Behältnisse zu je 5 TF-Einheiten portioniert. Nach der Lyophilisation werden Steril- und Pyrogenuntersuchungen vorgenommen.
Die auf diese Art und Weise hergestellten Präparate sind steril und pyrogenfrei und weisen die folgenden physikochemischen und immunologischen Parameter auf :
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<tb> PH-Wert <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Restfeuchte <SEP> 4, <SEP> 4% <SEP>
<tb> Verhältnis <SEP> OD26o/0D280 <SEP> 2, <SEP> 12 <SEP>
<tb> Peptid-Gehalt <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> mg
<tb> Ribose-Gehalt <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> mg
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Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von 1 ti l PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2, 9fache verstärkt.
Beispiel 2 : Die Herstellung erfolgte analog der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise.
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Als Ausgangsmaterial dienten 820 TE Vollblut. Dementsprechend wurden nach den verschiedenen Zentrifugations-, Reinigungs-und Waschvorgängen, sowie nach der Ultra- und Sterilfiltration 82 Behältnisse zu je 5 TF-Einheiten erhalten.
Dabei erhält man ein steriles und pyrogenfreies Präparat mit den folgenden physikochemi- schen und immunologischen Parametern :
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<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Restfeuchte <SEP> 3, <SEP> 4% <SEP>
<tb> Verhältnis <SEP> OD260/OD260 <SEP> 2, <SEP> 33
<tb> Peptid-Gehalt <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Ribose-Gehalt <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> mg
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Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von 1 lui 1 PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2, lfache verstärkt.
Aus den Ausführungsbeispielen geht die besondere Eignung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung eines standardisierten und immunologisch wirksamen Transfer-Faktor-Präparates hervor, das charakterisiert wird durch die Kombination mit andern Verfahrensschritten zur Fraktionierung des Vollblutes. Durch diese Verbindung gelingt eine weitaus rationellere und sehr kostengünstige Ausnutzung des im begrenzten Umfang zur Verfügung stehenden wertvollen Vollblutes, wobei gegenüber bereits bekannten herkömmlichen Verfahren der Vorteil besteht, dass ausser den klinisch vollwertig einsetzbaren Hauptprodukten wie Erythrozytensedimente, Kryopräzipitat und Plasma ein bisher verworfenes Nebenprodukt zu einem hochwertigen Immuntherapeutikum umgewandelt wird.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Blutleukozyten gesunder, unausgewählter Blutspender, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial zur Präparation eines in seiner Zusammensetzung einheitlichen, von Blutgruppensubstanzen und Histokompatibilitätsantigenen freien und auf seine immunologische in vitro-Wirksamkeit geprüften T-zellstimulierenden Immuntherapeutikums die bei der Verarbeitung von frischem Human-Zitratblut,
Human-Zitratblut-AG oder Human-Heparinblut zur Kryopräzipitatherstellung als
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60 min gewonnen werden und nach der Entfernung von unerwünschten Begleitsubstanzen wie Plasmaeiweissbestandteilen und Erythrozyten durch separate Wasch- und Zentrifugationsschritte bei
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Einfrieren und schnelles Auftauen aufgeschlossen und nach der Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 1800 bis 2000 Umdr/min bei +4 C für 30 bis 60 min einer Ultrafiltration mit anschliessender Sterilfiltration unterzogen werden und das so erhaltene sterile und pyrogenfreie Präparat, das einer Ausgangspoolgrösse von 500 bis 1000 Blutspendern entspricht und damit einschliesslich der notwendigen Qualitätskontrolle des Präparates längerfristige Behandlungen mit identischen Präparationen ermöglicht,
nach dem Portionieren und Einfrieren beginnend bei -10 bis -15OC unter einem Vakuum von 13, 3 bis 40, 0 Pa über 24 h bis +4 C lyophilisiert wird.