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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von in ihrer Zusammensetzung einheitlichen, von Blutgruppensubstanzen und Histokompatibilitätsantigenen freien humanen Transfer-Faktorpräparaten zur Stimulation des zellulären Immunsystems aus einem Pool peripherer Blutleukozyten von 500- 1000 gesunden Blutspendern, gekennzeichnet durch Zentrifuga tion von Frischblutkonserven bei 1800 - 2000 Ulmin bei + 8 C bis + 15 ^C für 10 bis 40 min und nachfolgende Zentrifugation des gepoolten Plasmas bei 1800 bis 2000 Ulmin bei + 8 C bis + 15 C für 20 bis 60 min, durch Abtrennen des Überstandsplasmas unter Erhalt der buffy-coats,
durch Entfernung von unerwünschten Begleitsubstanzen von den buffy-coats durch Wasch- und Zentrifugationsschritte bei 800-1000 U/min und +4 'C für 5 bis 15 min sowie anschliessend bei 1800 - 2000 U/min + 4 C für 30 bis 60 min, durch Aufschliessen der erhaltenen Leukozyten durch mindestens 1 0-maliges langsames Einfrieren und schnelles Auftauen, durch Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 1800 bis 2000 U/min bei +4 C für 30 bis 60 min,
und durch Ultrafiltration der Überstandslösung mit anschliessender Sterilfiltration und durch Portionieren des so erhaltenen sterilen und pyrogenfreien Präparates sowie Lyophilisieren beginnend bei -10 bis -15 'C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa über 24 h bis +4 C.
2. Verfahren zur Herstellung von in ihrer Zusammensetzung einheitlichen, von Blutgruppensubstanzen und Histokompatibilitätsantigenen freien humanen Transfer-Faktorpräparaten zur Stimulation des zellulären Immunsystems aus einem Pool peripherer Blutleukozyten von 500 - 1000 gesunden Blutspendern, gekennzeichnet durch Entfernung von unerwünschten Begleitsubstanzen von buffy-coats, die als Nebenprodukt bei industriellen Blutfraktionierungsverfahren anfallen, durch Wasch- und Zentrifugationsschritte bei 800 - 1000 U/min und + 4 C für 5 bis 15 min sowie anschliessend bei 1800 bis 2000 U/min und + 4 C für 30 bis 60 min, durch Aufschliessen der erhaltenen Leukozyten durch mindestens 1 0-maliges langsames Einfrieren und schnelles Auftauen,
durch Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 18002000 U/min bei +4 C für 30 bis 60 min, und durch Ultrafiltration der Überstandslösung mit anschliessender Sterilfiltration und durch Portionieren des so erhaltenen sterilen und pyrogenfreien Präparates sowie Lyophilisieren beginnend bei - 10 bis - 15 C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa über 24 h bis +4 C.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Entfernung von Plasmaeiweissbestandteilen und Erythrozyten die buffy-coats in isotonischer NaC1-Injektionslösung resuspendiert werden.
4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Begleitsubstanzen befreiten buffy-coats in aqua ad injektionem resuspendiert und aufgeschlossen werden.
5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Sterilfiltration sofort eine Portionierung unter aseptischen Bedingungen in Behältnisse stattfindet, die dann den Leukozytenextrakt von 10 mal 400 ml Blut entsprechend 5 Transfer-Faktor-Einheiten enthalten.
6. Transfer-Faktor-Präparat, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2.
7. Präparat gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Behältnis als lyophilisiertes Präparat à 5 Transfer-Faktor-Einheiten, das einen Peptid-Gehalt von 1,0 bis 10,0 mg, vorzugsweise von 1,0 bis 3,0 mg, einen Ribose Gehalt von 1,0 bis 5,0 mg, vorzugsweise von 1,2 bis 2,5 mg aufweist und dessen Verhältnis der optischen Dichte bei 260 nm und 280 nm nach dem Lösen in destilliertem Wasser 2,21 + 0,20 beträgt, vorliegt.
8. Präparat gemäss Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es bei der in vitro-Testung der immunologischen Wirksamkeit im Mikro-Lymphozytentransformationstest die PHA-induzierte Lymphozytenstimulation bei Zugabe von 1 111 PHA Ansatz auf mindestens das 1,4-fache verstärkt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Blutleukozyten gesunder, unausgewählter Blutspender, wobei sich die erhaltenen Präparate durch eine hohe immunbiologische Wirksamkeit bei der Stimulation des zellulären Immunsystems auszeichnen.
Der ständig steigende Bedarf an Blutkonserven und die Durchsetzung einer optimalen Hämotherapie bei minimalem Risiko für die Patienten hat seit längerer Zeit zu einer zunehmend effektiveren Ausnutzung des gespendeten Blutes in den Einrichtungen des Blutspende- und Transfusionsdienstes der DDR geführt. Gegenwärtig konzentrieren sich die Bemühungen auf die Entwicklung neuer Präparate aus menschlichem Vollblut insbesondere unter Ausnutzung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes und auf die sinnvolle Kombination verschiedener Präparationsverfahren bei Erhöhung der Qualität und der Ausbeute.
Durch die in den letzten Jahren gewonnenen neuen Erkenntnisse über Immundefektzustände und die noch immer unbefriedigende Situation der therapeutischen Beeinflussbarkeit dieser oft lebensbedrohlichen Erkrankungen ergibt sich die Notwendigkeit zur Entwicklung entsprechend wirksamer Medikamente.
Ein solches, die T-zellabhängigen Immunreaktionen stimulierend beeinflussendes Therapeutikum stellt der Transfer-Faktor dar. Transfer-Faktor beeinflusst in vivo und in vitro Korrelate der zellulären Immunität, ohne dass dessen wirksame Komponenten und deren Wirkungsweise im einzelnen bekannt wäre. Er setzt sich aus einem Gemisch niedermolekularer Polypeptide (MG < 10 000 Dalton) mit bis zu 12 Aminosäuren und einem Ribonukleinsäureanteil mit 2-3 Nukleotidbasen zusammen. Transfer-Faktor ist hitzestabil bei 37-C für 6 h und unempfindlich gegen Behandlung mit RNAse, DNAse und Chymotrypsin, dagegen wird er bei einer Hitzebehandlung > 90-C und durch Pronase zerstört.
Als Indikationen für die therapeutische Anwendung von Transfer-Faktor gelten primäre Immundefekte z. B. bei Agammaglobulinämie vom Schweizer Typ, Di-Giorgio Syndrom, Nezelof-Krankheit, Wiskott-Aldrich-Syndrom, Ataxia teleangiectasia, erworbene Immundefekte bei unterschiedlichen Grundkrankheiten z. B. bei Sarkoidose, Morbus Hodgkin, malignen Lymphomen, Karzinomen, bei immunsupressiver oder zytostatischer Therapie sowie bakterielle, virale und mykotische Infekte, z. B. Vacc. generalisata, Pseudomonas- und Candidainfektionen. Kontraindikationen sind gegenwärtig nicht bekannt und nicht zu erwarten.
Bisher wurden Transfer-Faktor-Präparate nur als Einzelpräparationen oder in geringen Poolgrössen von 10-20 Blutspendern durch Zellseparation am Blutspender bzw.
durch die auf die ausschliessliche maximale Gewinnung der Leukozyten orientierte Fraktionierung des Vollblutes gewonnen. Diese Art der Herstellung des Transfer-Faktors ist in Hinsicht auf die optimale Ausnutzung des wertvollen biologischen Rohstoffs Vollblut nicht effektiv. technisch sehr aufwendig und kostenintensiv. Auch können dadurch gerin
ge Poolgrössen nicht überschritten werden, was sich für eine gezielte, langfristige Therapie mit einem in höherem Masse standardisierten und einheitlichen Präparat für unerlässlich erweist. Für alle bisher bekannten Transfer-Faktor-Präparate konnten infolge der geringen Poolgrössen keine einheitliche Zusammensetzung bzw. keine Parameter, die die immunologische in vitro-Wirksamkeit hinreichend charakterisieren, angegeben werden.
Die buffy-coats der Blutkonserven, ein Gemisch aus Leukozyten und Thrombozyten, sind zur Zeit unerwünschte Störfaktoren in Erythrozytenkonzentraten, da sie zu Immunisierungen im HLA-System und durch die Bildung von Mikro- und Makroaggregaten zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Transfusionserfolges führen können. Eine therapeutische Nutzung dieser buffy-coats war bisher nicht möglich. Für die Herstellung von Leukozyten- bzw. Thrombozytenkonzentraten sind diese Nebenprodukte nicht geeignet. Für diese vitalen Zellkonzentrate sind HLA-idente Einzelpräparationen mit Hilfe von Zellseparationen erforderlich.
Ziel der Erfindung ist es, ein zur Zeit nicht zur Verfügung stehendes wirksames immunobiologisches Therapeutikum zur Beeinflussung der T-zellabhängigen Reaktionsfähigkeit unter Verwendung bisher nicht genutzter Bestandteile des Blutes in Form der sogenannten buffy-coats auf sehr rationelle Art und Weise herzustellen, das infolge der sehr hohen Ausgangspoolgrösse einheitlich und in seinen Wirksubstanzen standardisiert ist und damit günstige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Therapie bietet. Dabei muss das auf die erfindungsgemässe Weise hergestellte Transfer-Faktor Präparat hinsichtlich seiner Einheitlichkeit in der Zusammensetzung und seiner quantifizierbaren immunologischen in vitro-Wirksamkeit den strengen Massstäben der Arzneimittelgesetzgebung Rechnung tragen.
Desweiteren muss sich das Verfahren zur Transfer Faktor-Präparation nahtlos in die bestehende Aufgabenstellung des Blutspende- und Transfusionsdienstes einordnen lassen unter Einbeziehung in bereits praktizierte Fraktionierungsverfahren des Vollblutes.
Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mängel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen:
Die bisher durchgeführte Einzelpräparation des Transfer-Faktors durch Zellseparation am Blutspender bzw. die Verwendung geringer Poolgrössen führte zu keinem einheitlichen und standardisierbaren Präparat, was für eine planmässige und zielgerichtete Therapie unerlässlich ist. Desweiteren zielten alle bisher bekannten Verfahren auf eine maximale Gewinnung der Leukozyten als Hauptziel der Fraktionierung des Vollblutes ohne dabei die bei anderen Fraktionierungsverfahren als nicht genutzte Blutbestandteile anfallenden buffy-coats der Verwendung als Ausgangsmaterial für die Transfer-Faktor-Präparation zuführen zu können.
Um diese Ursachen zu beseitigen liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Einordnung in den technologischen Prozess der Verarbeitung von frischem Human-Zitratblut, Human-Zitratblut AG oder Human-Heparinblut zu klinisch einsetzbaren Erythrozytensedimenten, Kryopräzipitat und Plasma die bisher als unerwünscht verworfenen buffy-coats in vertretbarer Ausbeute und hoher Reinheit als Nebenprodukt und Ausgangsmaterial zur Transfer-Faktor-Präparation zu gewinnen. Durch die Integration in die gegenwärtig praktizierten Fraktionierungsprozesse des Vollblutes werden die Leukozyten nicht als ausschliessliches, sondern als Nebenprodukt gewonnen und es gelingt damit, den Transfer-Faktor auf technologisch überraschend einfache und wenig kostenintensive Weise herzustellen.
Gegenstand der Erfindung sind demzufolge die in den Ansprüchen 1 und 2 definierten Verfahren.
Erfindungsgemäss kann ein Transfer-Faktorpräparat beispielsweise folgendermassen hergestellt werden:
Die Frischblutkonserven werden bei 1800 - 2000 U/min 10 bis 40 min lang bei + 8 'C bis + 15"C zentrifugiert. so dass sich nur die Erythrozyten in einer ausreichenden Packungsdichte sedimentieren und kein buffy-coat -Saum auf den Erythrozyten gebildet wird. Die Plasmen von zwei Konserven werden mittels der Stickstoff-Überdruck-Technik gepoolt und 20 bis 60 min lang bei 1800 bis 2000 U/min und +8"C bis + 15"C zentrifugiert, so dass ein zellfreies Überstandsplasma erhalten wird. Pro Pool werden ca. 4. 108 bis 2. 109 Leukozyten im buffy-coat zur Transfer-Faktor Herstellung gewonnen.
Nach Abtrennung des Frischplasmas zur Kryopräzipitatherstellung werden die buffy-coats in einem Plasmasaum unter aseptischen Bedingungen aufbewahrt, bis die Befunde der Au/SH-Überwanderungselektrophorese, der SGPT-Bestimmung und des CMT erhoben sind. Diese Aufbewahrungszeit darf 24 h nicht überschreiten, um Aktivitätsverluste zu vermeiden. Positive Laborbefunde werden aussortiert, ebenso bei eventuellen späteren Befunderhebungen.
Die buffy-coats werden mit 30 bis 50 ml isotonischer NaC1-Injektionslösung resuspendiert und die Resuspensionen von 15 bis 20 Pools vereinigt. Anschliessend werden die Pools kurzzeitig bei 800 bis 1000 U/min bei 4"C zentrifugiert, um den grössten Teil der mitgeschleppten Erythrozyten zu sedimentieren. Dabei darf sich nach der Zentrifugation keine buffy-coats -Schicht auf den Erythrozyten bilden. Um störende Plasmaeiweisse zu entfernen, werden die Suspensionen 30 bis 60 min bei 1800 bis 2000 U/min zentrifugiert und die überstehende Waschlösung verworfen. Die Leukozytensedimente werden in 50 bis 100 ml aqua ad injektionem resuspendiert und bei - 40"C eingefroren.
Zur Zerstörung der Zellen werden die Leukozytensuspensionen mindestens 10 bis 15 mal langsam bei - 20"C im shell-freezing Verfahren eingefroren und bei + 30"C schnell aufgetaut.
Diese langsamen Einfrier- schnellen Auftauprozesse begünstigen die Freisetzung des Transfer-Faktors aus den Zellen.
Nach der Zerstörung der Zellen werden durch eine 30 bis 60 minütige Zentrifugation bei 1800 bis 2000 U/min bei +4 C die Zelltrümmer sedimentiert und die klare oder leicht getrübte Uberstandslösung, die den gepoolten Leukozytenextrakt von 500 bis 1000 Blutkonserven enthält, einer Ultrafiltration unterzogen, um höhermolekulare Bestandteile abzutrennen. Das farblose oder leicht gelblich tingierte Ultrafiltrat wird über einen Bakterienfilter (0,2 m Porenweite) sterilfiltriert und unter aseptischen Bedingungen portioniert.
Die Lyophilisation der im shell-freezing-Verfahren eingefrorenen Präparate erfolgt beginnend bei -15 bis 1 0C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0 Pa bis zu einer Endtemperatur von 4"C über 24 h.
Eine Abpackung des lyophilisierten Präparates enthält 5 Einheiten Transfer-Faktor, entsprechend dem Leukozytenextrakt von 10 x 400 ml Vollblut. Der auf diese Art hergestellte Transfer-Faktor ist steril und pyrogenfrei und wird zur intramuskulären und subcutanen Applikation in jeweils 5 ml und zur intravenösen Applikation in 30 ml isotonischer NaC1-Injektionslösung gelöst. Das Präparat ist frei von Blutgruppensubstanzen, Histokompatibilitätsantigenen und weist das hepatitis-assoziierte Antigen nicht auf.
Eine Aufbewahrung des lyophilisierten Präparates von 6 Monaten bis zur Freigabe garantiert die Unbedenklichkeit in Hinsicht auf die Ubertragung einer Serumhepatitis entsprechend der vorgeschriebenen gesetzlichen Meldepflicht beim Auftreten einer Hepatitis bei Blutspendern.
Jede Charge des Transfer-Faktors wird entsprechend den vorgesehenen staatlichen Prüfungen auf die physiko- und biochemischen Parameter und auf seine immunologische Wirksamkeit geprüft. Die Restfeuchte der lyophilisierten Substanz darf bei einer Verwendbarkeitsdauer von 12 Monaten 5 Ma-% betragen. Der pH-Wert des in isotonischer NaC1-Injektionslösung gelösten Transfer-Faktors muss im Bereich von 5,8 bis 6,5 liegen. Nach Lösen in aqua dest.
muss das Verhältnis der optischen Dichte bei 260 nm und 280 nm 2,21 + 0,20 betragen. Der Ribose-Gehalt einer Abpackung muss im Bereich von 1,0 bis 5,0 mg, vorzugsweise von 1,2 bis 2,5 mg und der Peptidgehalt im Bereich von 1,0 bis 10,0 mg, vorzugsweise von 1,0 bis 3,0 mg liegen. Die immunologische Wirksamkeit jeder Transfer-Faktor-Charge wird im Mikro-Lymphozytentransformationstest (LTT) und im E-Rosetten-Recovery-Test untersucht. Der Verstärkungsindex als Mass für die durch den Transfer-Faktor erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten gegenüber Phytohämagglutinin (PHA) muss bei Zugabe von 1 yl PHA/ Ansatz mindestens 1,4 betragen. Im E-Rosetten-Recovery Test muss bei Transfer-Faktor-Zusatz eine signifikante Erhöhung des Anteils der rosettenbildenden Lymphozyten feststellbar sein.
Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1
ACD-AG-Frischblut-Konserven (nicht älter als 4 h) werden 15 min lang mit 2000 U/min bei + 8'C zentrifugiert. Die leukozytenreichen Plasmen von zwei Konserven werden gepoolt und bei 2000 U/min 40 min lang zentrifugiert, wobei die Erythrozytensedimente nach Resuspension in Konservierungslösung zum klinischen Einsatz kommen. Nach Abtrennung des Frischplasmas, das zur Kryopräzipitatherstellung weiterverwendet wird, werden jeweils 15 buffy-coats am nächsten Tag nach Resuspension in 30 ml isotonischer NaCl-Injektionslösung vereinigt und zur Abtrennung noch vorhandener Erythrozyten 5 min lang bei 1000 U/min zentrifugiert.
Anschliessend wird die Leukozytensuspension bei 2000 U/min 40 min lang scharf zentrifugiert und das Sediment nach Entfernung der Waschlösung in 100 ml aqua ad injektionem resuspendiert und eingefroren. Insgesamt 16 Poolflaschen (; 480 TE Vollblut) werden 10 x bei 30 C im Thermostaten aufgetaut und anschliessend langsam eingefroren.
Nach Zentrifugation bei 2000 U/min für 30 min wird die Lösung ultrafiltriert. sterilfiltriert und in 48 Behältnisse zu je 5 TF-Einheiten portioniert. Nach der Lyophilisation werden Steril- und Pyrogenuntersuchungen vorgenommen.
Die auf diese Art und Weise hergestellten Präparate sind steril und pyrogenfrei und weisen die folgenden physikochemischen und immunologischen Parameter auf: pH-Wert 5,9
Restfeuchte 4,4 %
Verhältnis OD260/OD280 2,12
Peptid-Gehalt 2,3 mg
Ribose-Gehalt 1,1 mg
Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von 1 ,ul PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2,9-fache verstärkt.
Beispiel2
Die Herstellung erfolgte analog der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise.
Als Ausgangsmaterial dienten 820 TE Vollblut. Dementsprechend wurden nach den verschiedenen Zentrifugations-, Reinigungs- und Waschvorgängen, sowie nach der Ultraund Sterilfiltration 82 Behältnisse zuje 5 TF-Einheiten erhalten.
Dabei erhält man ein steriles und pyrogenfreies Präparat mit den folgenden physiko-chemischen und immunologischen Parametern: pH-Wert 6,2
Restfeuchte 3,4%
Verhältnis OD260/OD280 2,33
Peptid-Gehalt 1,1 mg
Ribose-Gehalt 1,6 mg
Die PHA-induzierte Stimulation der Lymphozyten im Mikro-LTT wird bei einer Zugabe von 1 pl PHA/Ansatz durch den Transfer-Faktor auf das 2,1-fache verstärkt.
Aus den Ausführungsbeispielen geht die besondere Eignung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung eines standardisierten und immunologisch wirksamen Transfer-Faktor-Präparates hervor, das charakterisiert wird durch die Kombination mit anderen Verfahrensschritten zur Fraktionierung des Vollblutes. Durch diese Verbindung gelingt eine weitaus rationellere und sehr kostengünstige Ausnutzung des im begrenzten Umfang zur Verfügung stehenden wertvollen Vollbluts, wobei gegenüber bereits bekannten herkömmlichen Verfahren der Vorteil besteht, dass ausser den klinisch vollwertig einsetzbaren Hauptprodukten wie Erythrozytensedimente, Kryopräzipitat und Plasma ein bisher verworfenes Nebenprodukt zu einem hochwertigen Immuntherapeutikum umgewandelt wird.
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PATENT CLAIMS
1. Process for the preparation of human transfer factor preparations which are uniform in their composition and free of blood group substances and histocompatibility antigens for stimulating the cellular immune system from a pool of peripheral blood leukocytes from 500-1000 healthy blood donors, characterized by centrifugation of fresh blood supplies at 1800-2000 rpm at + 8 C to + 15 ^ C for 10 to 40 min and subsequent centrifugation of the pooled plasma at 1800 to 2000 rpm at + 8 C to + 15 C for 20 to 60 min, by separating off the supernatant plasma to obtain the buffy coats,
by removing unwanted accompanying substances from the buffy coats by washing and centrifugation steps at 800-1000 rpm and +4 'C for 5 to 15 minutes and then at 1800 - 2000 rpm + 4 C for 30 to 60 minutes, by disrupting the leukocytes obtained by slowly freezing and thawing them at least 10 times, by separating the cell debris by centrifugation at 1800 to 2000 rpm at +4 C for 30 to 60 min,
and by ultrafiltration of the supernatant solution with subsequent sterile filtration and by portioning the sterile and pyrogen-free preparation thus obtained and lyophilizing beginning at -10 to -15 'C under a vacuum of 13.3 to 40.0 Pa over 24 h to +4 C.
2. Process for the production of human transfer factor preparations which are uniform in their composition and free of blood group substances and histocompatibility antigens for stimulating the cellular immune system from a pool of peripheral blood leukocytes from 500-1000 healthy blood donors, characterized by removal of undesirable accompanying substances from buffy coats which are considered as By-product in industrial blood fractionation processes, by washing and centrifugation steps at 800-1000 rpm and + 4 C for 5 to 15 min and then at 1800 to 2000 rpm and + 4 C for 30 to 60 min, by disintegrating the obtained Leukocytes by slow freezing and rapid thawing at least 10 times,
by separating the cell debris by centrifugation at 18002000 rpm at +4 C for 30 to 60 min, and by ultrafiltration of the supernatant solution with subsequent sterile filtration and by portioning the sterile and pyrogen-free preparation thus obtained and lyophilizing starting at - 10 to - 15 C below a vacuum of 13.3 to 40.0 Pa over 24 h to +4 C.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that to remove plasma protein components and erythrocytes, the buffy coats are resuspended in isotonic NaC1 injection solution.
4. The method according to any one of claims 1-3, characterized in that the buffy coats freed from the accompanying substances are resuspended and digested in aqua ad injections.
5. The method according to any one of claims 1-4, characterized in that immediately after the sterile filtration, portioning takes place under aseptic conditions in containers which then contain the leukocyte extract of 10 times 400 ml of blood corresponding to 5 transfer factor units.
6. Transfer factor preparation, produced by the method according to one of claims 1 or 2.
7. Preparation according to claim 6, characterized in that it is in a container as a lyophilized preparation of 5 transfer factor units, which has a peptide content of 1.0 to 10.0 mg, preferably from 1.0 to 3.0 mg, has a ribose content of 1.0 to 5.0 mg, preferably 1.2 to 2.5 mg and its ratio of the optical density at 260 nm and 280 nm after dissolving in distilled water 2.21 + 0, 20 is present.
8. Preparation according to claim 6 or 7, characterized in that it increases the PHA-induced lymphocyte stimulation with the addition of 1 111 PHA approach to at least 1.4-fold in the in vitro test of the immunological effectiveness in the micro-lymphocyte transformation test.
The invention relates to a process for the production of human transfer factor preparations from peripheral blood leukocytes of healthy, unselected blood donors, the preparations obtained being distinguished by a high immunobiological effectiveness in stimulating the cellular immune system.
The constantly increasing need for blood supplies and the implementation of optimal hemotherapy with minimal risk for the patient has for a long time led to an increasingly effective use of the donated blood in the facilities of the blood donation and transfusion service of the GDR. At present, efforts are focused on the development of new preparations from whole human blood, in particular using previously unused components of the blood, and on the sensible combination of different preparation processes while increasing the quality and the yield.
The new knowledge about immune deficiency states and the still unsatisfactory situation regarding the therapeutic influence of these often life-threatening diseases, which has been gained in recent years, necessitates the development of correspondingly effective drugs.
The transfer factor represents such a therapeutic agent which stimulates the T cell-dependent immune reactions. Transfer factor influences correlates of cellular immunity in vivo and in vitro, without its effective components and their mode of action being known in detail. It is composed of a mixture of low molecular weight polypeptides (MW <10,000 daltons) with up to 12 amino acids and a ribonucleic acid component with 2-3 nucleotide bases. Transfer factor is heat stable at 37-C for 6 h and insensitive to treatment with RNAse, DNAse and chymotrypsin, on the other hand it is destroyed by heat treatment> 90-C and by pronase.
Indications for the therapeutic use of transfer factor are primary immunodeficiencies e.g. B. Agammaglobulinemia of the Swiss type, Di-Giorgio syndrome, Nezelof disease, Wiskott-Aldrich syndrome, Ataxia teleangiectasia, acquired immune defects in various underlying diseases such. B. in sarcoidosis, Hodgkin's disease, malignant lymphoma, carcinoma, in immunosuppressive or cytostatic therapy as well as bacterial, viral and mycotic infections, e.g. B. Vacc. generalisata, Pseudomonas and Candida infections. Contraindications are currently unknown and are not expected.
So far, transfer factor preparations have only been used as single preparations or in small pool sizes of 10-20 blood donors by cell separation on the blood donor or
by the fractionation of whole blood based on the exclusive maximum recovery of the leukocytes. This type of production of the transfer factor is not effective in terms of the optimal use of the valuable biological raw material whole blood. technically very complex and expensive. This can also help
ge pool sizes are not exceeded, which proves essential for a targeted, long-term therapy with a more standardized and uniform preparation. Due to the small pool sizes, no uniform composition or parameters that adequately characterize the immunological in vitro effectiveness could be given for all previously known transfer factor preparations.
The buffy-coats of the preserved blood, a mixture of leukocytes and thrombocytes, are currently undesirable disturbing factors in red blood cell concentrates, since they can lead to immunizations in the HLA system and, through the formation of micro- and macro-aggregates, to a considerable impairment of the success of the transfusion. A therapeutic use of these buffy coats was previously not possible. These by-products are not suitable for the production of leukocyte or platelet concentrates. For these vital cell concentrates, HLA-identical single preparations with the help of cell separations are required.
The aim of the invention is to produce a currently unavailable effective immunobiological therapeutic agent for influencing the T-cell-dependent responsiveness using previously unused components of the blood in the form of the so-called buffy coats in a very rational manner, which is due to the very high initial pool size and standardized in its active substances and thus offers favorable prerequisites for successful therapy. The transfer factor preparation produced in the manner according to the invention must take into account the strict standards of pharmaceutical legislation with regard to its uniformity in composition and its quantifiable immunological effectiveness in vitro.
Furthermore, the procedure for transfer factor preparation must fit seamlessly into the existing task of the blood donation and transfusion service, including the whole blood fractionation procedure already in use.
The shortcomings described in the characteristics of the known solutions can be attributed to the following causes:
The previously performed individual preparation of the transfer factor by cell separation on the blood donor or the use of small pool sizes did not lead to a uniform and standardizable preparation, which is essential for a planned and targeted therapy. Furthermore, all previously known methods aimed at maximum recovery of the leukocytes as the main goal of fractionating the whole blood without being able to use the buffy coats that are not used in other fractionation processes as the starting material for the transfer factor preparation.
In order to eliminate these causes, the object of the invention is to develop a method in which, when classified into the technological process of processing fresh human citrate blood, human citrate blood AG or human heparin blood, into clinically usable erythrocyte sediments, cryoprecipitate and plasma hitherto rejected as undesired buffy coats in a reasonable yield and high purity as a by-product and starting material for transfer factor preparation. Through the integration into the fractionation processes of whole blood currently practiced, the leukocytes are not obtained as an exclusive product, but as a by-product, and the transfer factor can be produced in a technologically surprisingly simple and inexpensive manner.
The invention accordingly relates to the methods defined in claims 1 and 2.
According to the invention, a transfer factor preparation can be produced, for example, as follows:
The fresh blood preserves are centrifuged at 1800-2000 rpm for 10 to 40 minutes at + 8'C to + 15 "C. So that only the erythrocytes sediment in a sufficient packing density and no buffy-coat seam is formed on the erythrocytes The plasmas from two cans are pooled using the nitrogen overpressure technique and centrifuged for 20 to 60 minutes at 1800 to 2000 rpm and +8 "C to + 15" C, so that a cell-free supernatant plasma is obtained. Per pool approximately 4. 108 to 2. 109 leukocytes are obtained in the buffy coat for transfer factor production.
After the fresh plasma for cryoprecipitate preparation has been separated off, the buffy coats are stored in a plasma hem under aseptic conditions until the results of the Au / SH migration electrophoresis, the SGPT determination and the CMT are collected. This retention time must not exceed 24 hours to avoid loss of activity. Positive laboratory results are sorted out, as well as in the event of later findings.
The buffy coats are resuspended with 30 to 50 ml of isotonic NaC1 solution for injection and the resuspensions of 15 to 20 pools are combined. The pools are then briefly centrifuged at 800 to 1000 rpm at 4 "C in order to sediment the majority of the entrained erythrocytes. In the process, no buffy-coats layer must form on the erythrocytes after centrifugation. In order to remove disruptive plasma proteins , the suspensions are centrifuged at 1800 to 2000 rpm for 30 to 60 min and the supernatant wash solution is discarded. The leukocyte sediments are resuspended in 50 to 100 ml of aqua ad injection and frozen at -40 ° C.
To destroy the cells, the leukocyte suspensions are slowly frozen at least 10 to 15 times at - 20 "C in the shell-freezing process and thawed quickly at + 30" C.
These slow freezing-fast thawing processes favor the release of the transfer factor from the cells.
After the cells have been destroyed, the cell debris is sedimented by centrifugation at 1800 to 2000 rpm at +4 C for 30 to 60 minutes and the clear or slightly cloudy supernatant solution, which contains the pooled leukocyte extract from 500 to 1000 blood cells, is subjected to ultrafiltration, to separate higher molecular components. The colorless or slightly yellowish ultrafiltrate is sterile filtered through a bacterial filter (0.2 m pore size) and portioned under aseptic conditions.
The lyophilization of the preparations frozen in the shell-freezing process takes place starting at -15 to 10C under a vacuum of 13.3 to 40.0 Pa up to a final temperature of 4 "C over 24 h.
One package of the lyophilized preparation contains 5 units of transfer factor, corresponding to the leukocyte extract of 10 x 400 ml of whole blood. The transfer factor produced in this way is sterile and pyrogen-free and is dissolved in 5 ml each for intramuscular and subcutaneous administration and in 30 ml isotonic NaCl injection solution for intravenous administration. The preparation is free of blood group substances, histocompatibility antigens and does not have the hepatitis-associated antigen.
A storage of the lyophilized preparation from 6 months until release guarantees the harmlessness with regard to the transmission of serum hepatitis in accordance with the mandatory legal reporting obligation when hepatitis occurs in blood donors.
Each batch of the transfer factor is tested for its physico- and biochemical parameters and for its immunological effectiveness in accordance with the planned state tests. The residual moisture content of the lyophilized substance may be 5% by mass with a usability period of 12 months. The pH of the transfer factor dissolved in isotonic NaC1 solution for injection must be in the range of 5.8 to 6.5. After dissolving in aqua dest.
the ratio of the optical density at 260 nm and 280 nm must be 2.21 + 0.20. The ribose content of a package must be in the range from 1.0 to 5.0 mg, preferably from 1.2 to 2.5 mg and the peptide content in the range from 1.0 to 10.0 mg, preferably from 1.0 to 3.0 mg. The immunological efficacy of each transfer factor lot is examined in the micro-lymphocyte transformation test (LTT) and in the E-rosette recovery test. The gain index as a measure of the increased stimulability of the lymphocytes to phytohemagglutinin (PHA) by the transfer factor must be at least 1.4 when 1 μl of PHA / batch is added. If the transfer factor is added, a significant increase in the proportion of rosette-forming lymphocytes must be found in the E-rosette recovery test.
The invention will be explained in more detail below using a few exemplary embodiments.
example 1
ACD-AG fresh blood preserves (not older than 4 h) are centrifuged for 15 min at 2000 rpm at + 8'C. The leukocyte-rich plasmas from two preserves are pooled and centrifuged at 2000 rpm for 40 min, the erythrocyte sediments being used clinically after resuspension in preservation solution. After separation of the fresh plasma, which is used for the production of cryoprecipitate, 15 buffy coats are combined the next day after resuspension in 30 ml isotonic NaCl solution for injection and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm to remove any erythrocytes still present.
The leukocyte suspension is then sharply centrifuged at 2000 rpm for 40 min and, after removal of the washing solution, the sediment is resuspended in 100 ml of aqua ad injection and frozen. A total of 16 pool bottles (480 HP whole blood) are thawed 10 x at 30 C in the thermostat and then slowly frozen.
After centrifugation at 2000 rpm for 30 min, the solution is ultrafiltered. sterile filtered and portioned into 48 containers of 5 TF units each. After lyophilization, sterile and pyrogen examinations are carried out.
The preparations produced in this way are sterile and pyrogen-free and have the following physicochemical and immunological parameters: pH 5.9
Residual moisture 4.4%
OD260 / OD280 ratio 2.12
Peptide content 2.3 mg
Ribose content 1.1 mg
The PHA-induced stimulation of the lymphocytes in the micro-LTT is increased to 2.9 times by the addition of 1.1 μl of PHA / batch by the transfer factor.
Example2
The preparation was carried out analogously to the manner described in Example 1.
820 TE whole blood were used as starting material. Accordingly, after the various centrifugation, cleaning and washing processes, as well as after the ultra and sterile filtration, 82 containers of 5 TF units each were obtained.
This gives a sterile and pyrogen-free preparation with the following physico-chemical and immunological parameters: pH 6.2
Residual moisture 3.4%
OD260 / OD280 ratio 2.33
Peptide content 1.1 mg
Ribose content 1.6 mg
The PHA-induced stimulation of the lymphocytes in the micro-LTT is increased 2.1 times by the addition of 1 μl PHA / approach by the transfer factor.
The exemplary embodiments show the particular suitability of the method according to the invention for producing a standardized and immunologically effective transfer factor preparation, which is characterized by the combination with other method steps for fractionating the whole blood. This connection enables a far more rational and very cost-effective use of the valuable whole blood that is available to a limited extent, whereby there is the advantage over already known conventional methods that in addition to the clinically fully usable main products such as erythrocyte sediments, cryoprecipitate and plasma, a previously rejected by-product into one high-quality immunotherapy is converted.