CH641963A5 - Process for the production of a porous collagen skin dressing material - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung eines porösen Kollagen-Hautverbandsmaterials, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Kollagengel gebildet, das Kollagengel extrudiert, aus dem extrudierten Gel ein Kollagenblatt gebildet, das extrudierte Kollagen vernetzt und das vernetzte Blatt der Gefriertrocknung unterworfen wird.
Solubilisiertes Kollagen besitzt in seinem Gerüst viele NH2- und COOH-Gruppen. Chemische Modifikationen des Moleküls können gut ausgeführt werden; z.B. können alle oder einige der Aminogruppen durch Umsetzen mit einem Gemisch aus Acetanhydrid und Essigsäure acyliert werden. Ähnlich reagiert Bernsteinsäureanhydrid mit Kollagen unter Ersatz der Aminogruppen durch Carboxylgruppen. Die im Molekül enthaltenen Carboxylgruppen sind einer Veresterung nach der Standardumsetzung mit azidifiziertem Alkohol, z.B. Umsetzung mit wasserfreiem Methanol, das mit HCl angesäuert ist, zugänglich. In den obigen Reaktionen kann der reine isoelektrische Punkt von Kollagen gesteuert werden und entweder negativ oder positiv oder vollständig neutralisiert eingestellt werden.
Alle bekannten Typen von Kollagen und chemisch modifiziertem Kollagen können bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung verwendet werden, z.B. natives Kollagen; denaturiertes Kollagen (neutraler isoelektrischer Punkt); verestertes Kollagen (alkalischer isoelektrischer Punkt); und in Form modifizierter Aminogruppen, z.B. als Anhydridderivate (saurer isoelektrischer Punkt), Bei Herstellung von Verbandsmaterialien des Geltyps dieser Erfindung wird die Verwendung von Anhydridderivaten des Kollagens (saurer isoelektrischer Punkt), z.B. Bernsteinsäureanhydridderivaten, bevorzugt.
Bei der Herstellung des Kollagengels wird Haut oder Fell in einer Enzymlösung bei saurem pH solubilisiert. Das erhaltene Gel ist ein viskoses Material, das durch Filtrieren, z.B. durch ein Seihtuch und/oder ein Milliporfilter, gewonnen wird. Die viskose Lösung wird durch Zugabe von Alkali bis zu einem pH von etwa 10 alkalisch gemacht. In diesem Stadium wird das Material stehengelassen, um restliches Enzym zu inaktivieren. Das Material wird dann neutralisiert, das Kollagen über eine Zentrifuge gesammelt und mit Wasser gewaschen. Es folgt ein zweiter Reinigungsschritt, nämlich das erneute Lösen in wässriger Säure (pH 2,0-5,0), erneute Fällen durch Neutralisieren bis zu einem pH von 6 bis 7 und Reinigen zwecks Entfernung von Säure durch Dialyse gegen Wasser. Das neutrale Gel wird gewonnen, und in dieser Stufe können Antibiotika oder Bakterizide oder beide vor Aufbewahrung des Gelmaterials zugesetzt werden.
Das bei der Herstellung des Gels verwendete Kollagenmaterial ist vorzugsweise kein Multimer; daher wird dieses Material während seiner Herstellung keiner Gerbung unterworfen.
Das poröse Kollagenblatt wird vorzugsweise wie folgt hergestellt:
Solubilisiertes Kollagengel (pH 2,0-3,5, Kollagenkonzentration 1-10%) wurde aus einer rohrförmigen Düse in ein Koagulierbad extrudiert (gesättigte NaCl-Lösung). Das koagulierte zylinderförmige Kollagen wurde längs zu Folien geschnitten und mit 1-5% Glutaraldehyd in gesättigtem NaCl, das 0,05 M Na2HP04 enthielt, 0,5 bis 3,0 Stunden gegerbt. Die gegerbte Kollagenfolie wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, dann auf einer Methylmethacrylatplatte gefriergetrocknet. Zwecks Herstellung eines semiporösen, filmartigen Blattes, in welchem die obere Oberfläche des Blattes konzentrierter an Kollagen ist (was zu einer oberen filmartigen Oberfläche führt) und die untere Oberfläche des Blattes weniger konzentriert an Kollagen (d.h. poröser) ist, wird das Blatt vor dem Gefriertrocknen einer teilweisen Lufttrocknung unterworfen. Das Kollagenblatt wurde durch Äthylenoxidgas sterilisiert und in einer typischen Grundlösung getränkt, die ein oder mehrere bakterizide Mittel, wie Silbernitrat (0,5 g/100 ml) oder Silberlactat (0,5 g/100 ml) oder lactierte Ringer-Lösung enthielt, die 25 mg/ml Gentamicin, 25 mg/ml Lincomycin, 25 mg/ml Colistimethat, 25 mg/ml Kanamycin und 5 mg/ml Amphotericin B aufwies, oder lactierte Ringer-Lösung enthielt, die 25 mg/ml Linomy-cin, 5 mg/ml Amphotericin B und 25 mg/ml Gentamicin aufwies.
Ein wirksames Hautverbandsmaterial sollte die folgenden Eigenschaften aufweisen:
1. gute Haftung an verwundeten Oberflächen
2. Vermeidung von Protein-, Flüssigkeits- und Elektrolytverlusten
3. Vermeidung von Infektionen
4. Schmerzstillung
5. keine Stimulation von lokalen Gewebereizungen und dgl.
Die hier beschriebenen Kollagenhautverbandsstoffe befriedigen die obigen Eigenschaften, sind einfach anzuwenden und weniger teuer. Poröse Blatt- und halbporöse Filmtyp-
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Verbandsmaterialien haften fest an der Wunde, geben wirksamen Schutz gegen Infektionen und ermöglichen eine gute Abheilung der Wunden. Es wurde ein ausgiebiges Zellwachstum in das poröse Kollagenblatt hinein beobachtet.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Frisches Kalbsfell (etwas 5 kg) wurde enthaart, durch Scheren gereinigt und in kleine Stücke geschnitten. Das Fell wurde wiederholt mit 10% NaCl, die 0,2% Natriumazid-Bakterizid enthielt, gewaschen und mit Wasser sterilisiert. Das Fell wurde in 10 Litern Wasser (pH 2,5, HCl), das 30 mg/ml Gentamicin enthielt, durch Zugabe von 1 g Pepsin (ungefähres Verhältnis von Enzym zu Kollagen betrug 1/ 400) bei 20 °C 4 Tage unter zwischenzeitlichem Rühren solubilisiert. Das erhaltene viskose solubilisierte Kollagen wurde durch ein Seihtuch filtriert, das pH auf 10 durch NaOH angehoben und 24 Stunden bei 20 °C stehengelassen, um das Pepsin zu inaktivieren. Das pH des Kollagens wurde dann auf 7-8 (HCl) eingestellt, das Kollagenpräzipitat durch Zen-trifugieren gesammelt und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wurde erneut in saurer Lösung gelöst und wieder bei pH 7-8 zur weiteren Reinigung gefällt.
Das Kollagen wurde in verdünnter HCl-Lösung (End-pH 2,5, Kollagenkonzentration 3%) gelöst und unter Vakuum entgast. Saures Kollagengel wurde in ein Koagulier-bad (gesättigtes NaCl) durch eine geeignete Düse extrudiert. Das koagulierte «Rohr»material wurde isoliert und der Länge nach zu Blättern aufgeschnitten und mit 3% Glutaraldehyd in gesättigtem NaCl, die 0,05 M Na2HP04 enthielt, 1 Stunde gegerbt. Nach wiederholtem Waschen mit Wasser wurde das Kollagenblatt auf einer Platte aus Methylmeth-acrylat gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Blätter (10 cm x 10 cm) wurden durch Behandeln mit Äthylenoxidgas sterilisiert und durch Tränken in 0,5% Silbernitratlösung konserviert. Die Endstärke des Blattes betrug 3 mm. Dieses Hautverbandsmaterial war ausgezeichnet hinsichtlich der Haftung an der Wunde, des Schutzes gegen Flüssigkeitsver-5 lust und Infektion und bei der Wundheilung.
Beispiel 2
Ein Kollagenblatt wurde hergestellt durch Extrusion, Gerben und Waschen nach der in Beispiel 1 beschriebenen io Methode mit der Ausnahme, dass 5% saures Kollagengel verwendet wurde. Das gewaschene Kollagenblatt wurde dann auf einer Platte aus Methylmethacrylat teilweise (partiell) luftgetrocknet, bis die Stärke des Blattes die halbe Originaldicke erreichte. Dieses teilweise Trocknen reduzierte die 15 Porosität (Kollagenkonzentration höher) der oberen Oberfläche des Blattes. Es wurde dann gefriergetrocknet, um die untere Oberfläche porös zu machen (Kollagenkonzentration geringer) und mit Äthylenoxidgas sterilisiert. Das sterilisierte Blatt wurde in steriler 0,5%iger Silberlactatlösung konser-20 viert (pH 7,4). Die Endstärke des Blattes betrug 2 mm. Dieses Hautverbandsmaterial hatte eine feinere Porosität und grössere Festigkeit als das Blatt des Beispiels 1. Es war ausgezeichnet hinsichtlich des Schutzes gegen Protein-, Flüssig-keits- und Elektrolytverlust, des Schutzes gegen Infektion 25 und bei Heilung der Wunden.
Beispiel 3
Ein steriles gefriergetrocknetes Kollagenblatt wurde hergestellt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode mit 30 der Ausnahme, dass die Kollagenkonzentration 5% betrug. Das Blatt wurde durch Tränken in steriler lactierter Ringer-Lösung (pH auf 7,4 eingestellt), die die folgenden Antibiotika enthielt, konserviert: 25 mg/ml Gentamicin, 25 mg/ml Lincomycin, 25 mg/ml Colistimethat, 25 mg/ml Kanamycin 35 und 5 mg/ml Amphotericin B. Die Endstärke des Blattes betrug 4 mm. Dieses Blatt zeigte gleichfalls ausgezeichnete Hautverbandseigenschaften.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung eines porösen Kollagen-Hautverbandsmaterials, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kollagengel gebildet, das Kollagengel extrudiert, aus dem extrudierten Gel ein Kollagenblatt gebildet, das extrudierte Kollagen vernetzt und das vernetzte Blatt der Gefriertrocknung unterworfen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vernetzung durch Gerben mit Glutaraldehyd ausgeführt wird.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem extrudierten Gel oder dem Kollagenblatt mindestens ein Antibiotikum und/oder Bakterizid zugefügt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das vernetzte Blatt vor der Gefriertrocknung teilweise luftgetrocknet wird.
Die National Fire Protection Association berichtete 1962, dass jährlich annähernd 1 800 000 Personen Brände erleiden und über 11 000 Hospitalbetten pro Tag beanspruchen. Es besteht daher ein grosser Bedarf an einem rasch verfügbaren, leicht zu lagernden und temporären Ersatz für menschliche Haut zur effektiven Behandlung von Hitzebränden oder anderen Formen des Hautverlustes, Es ist allgemein üblich, Bereiche mit Hautverlust mit schichtstarken Autotransplantaten, Eigentransplantaten und Heterotrans-plantaten, abzudecken. Solche Behandlungen schützen gegen Infektion sowie Protein-, Körperflüssigkeits- und Elektrolytverlust aus offenliegendem Gewebe. Diese Behandlungen haben jedoch die folgenden Nachteile: Transplantate sind schwierig zu erhalten und über längere Zeiträume aufzubewahren, zudem auch sehr teuer. Diese Schwierigkeiten könnten durch die Entwicklung von künstlichen Hautverbandsmaterialien vermindert werden, die weniger teuer sind und schnell zur Anwendung zur Verfügung stehen.
Kollagen ist ein Hauptprotein des Bindegewebes, wie der Haut, Hornhaut und dgl., und kann durch die Behandlung mit proteolytischen Enzymen (anderen als Collagenase), z.B. Proctase, Pepsin, Trypsin und Pronase, solubilisiert, abgetrennt und gereinigt werden. Solubilisiertes Kollagen ist arm an Telopeptiden, verhältnismässig billig und als Material für die Verarbeitung zu einem Hautwundverbandsmaterial ideal geeignet.
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