CH623807A5

CH623807A5 - Process for the preparation of a peptide

Info

Publication number: CH623807A5
Application number: CH1336476A
Authority: CH
Inventors: Yoshikazu Isowa; Muneki Ohmori; Hideaki Kurita; Tetsuya Ichikawa; Masanari Sato; Kaoru Mori; Kiyotaka Oyama
Original assignee: Sagami Chem Res
Priority date: 1975-04-29
Filing date: 1976-10-22
Publication date: 1981-06-30
Also published as: FR2328695B1; DE2647189C2; NL7611569A; FR2328695A1; DE2647189A1; GB1523546A; NL172462C; US3972773A; NL172462B; CA1059051A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids unter Einsatz eines spezifischen En-50 zyms als Katalysator.

Herkömmlicherweise wurden Peptide nach der Azidme-thode hergestellt oder nach der Methode der gemischten Säureanhydride, der Carbodiimidmethode oder der Methode der aktiven Ester oder nach der Säurechloridmethode od.dgl. 55 Diese herkömmlichen Verfahren sind jedoch mit verschiedensten industriellen Problemen verbunden. So tritt z. B. eine Ra-zemisierung der Carboxylkomponente des C-terminalen Aminosäurerests ein. Andere Probleme betreffen Nebenreaktionen, die Temperaturregelung, die Auswahl des Lösungsmittels, 60 die Eigenschaften der Aminoschutzgruppen und der Carboxyl-schutzgruppen und die Effekte von funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren.

Man kann ferner Peptide nach der Fragmentkondensationsmethode herstellen. Ein Peptid kann nämlich jeweils in 65 Fragmente zerteilt werden. Dabei ist der Schaden, welcher durch einen zufälligen Fehler hervorgerufen wird, minimal. Dieses Verfahren hat daher erhebliche industrielle Vorteile. Die Fragementkondensationsmethode kann vorteilhafterweise

3

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bei Verbindungen angewandt werden, welche an der C-termi- vom Problem der Razemisierung. Aus diesem Grund war die nalen Gruppe Glycin aufweisen (die einzige Aminosäure, wel- Azidmethode bisher bevorzugt. Da jedoch die Azidmethode che nicht razemisiert werden kann). Allerdings kann auch bei komplizierte Reaktionsschritte umfasst, und da im Wege einer diesem Verfahren eine Razemisierung nicht verhindert wer- Nebenreaktion ein Harnstoffderivat gebildet wird, (was zu ei-den, wenn die C-terminale Gruppe von einer anderen Amino- s ner Senkung der Ausbeute führt), ist auch die Azidmethode säure gebildet wird. Tatsächlich ist bei jeder Peptidsynthese unbefriedigend.

das Razemisierungsproblem gravierend. Wenn eine Razemisie- Zusätzlich zu den verschiedenen organisch-chemischen rung eintritt, so sinkt die Reinheit des Produkts und es ist er- Verfahren zur Peptidherstellung wurde eine spezielle Peptid-

forderlich, das verunreinigende Isomere vom angestrebten synthese bekannt, welche von dem Enzym Papain oder dem Produkt abzutrennen. Dies ist bei jeder industriellen Durch- io Enzym Chymotrypsin Gebrauch macht (z. B. J. S. Fruton «Ad-

führung eines Verfahrens äusserst nachteilig. vances in Protein Chemistry», 5, Academic Press Inc., New

Unter den herkömmlichen Verfahren zur Ausbildung von York, N. Y. 1949). Die mit diesem Verfahren durchführbaren

Peptidbindungen ist lediglich die Azidmethode weitgehend frei Reaktionen sind im folgenden zusammengestellt:

(1) BZ-Leu-OH + H-Leu-NH Qf

(i) to)

4

PaPain ^ Bz-Leu-Leu-NH 0

(III)

(2) Bz-Leu-OH + H-Gly-NH 0

(I) (II)

—paPain > Bz-Leu-Gly-NH 0

(III)

(3) Bz-Tyr-OH + H-Gly-NH 0

(I) (II)

Chymotrypsii^ BZ_TyI_Qly_m 0

(III)

(4) Z-Phe-Gly-OH + H-Tyr-NHg

(I) (II)

?aPain y Z-Phe-Gly-Tyr-NH2

(III)

Bei den Reaktionen (1) bis (3) jedoch ist es erforderlich, 45 Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver-Phenylaminogruppen vom gebildeten Peptid (III) unter drasti- fahren zur Synthese der gewünschten Oligopeptide oder Poly-schen Bedingungen zu entfernen, da die an die C-terminale peptide zu schaffen, welches bei einfacher Verfahrensführung Gruppe der Aminkomponente (II) gebundene Phenylamino- zu hohen Ausbeuten führt.

gruppe nicht leicht vom Peptid abgetrennt werden kann. Es Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch ein Verfahren tritt daher nachteiligerweise leicht eine Spaltung der Peptid- so zur Herstellung eines Peptids der folgenden allgemeinen Forkette ein. Wegen dieser Schwierigkeit kann dieses Verfahren mei gelöst der Peptidsynthese praktisch nicht angewendet werden. An- X—A—B—Y

derseits wird die Reaktion (4) von einer Transamidierung und einer Transpeptisierung begleitet, so dass auch diese Reaktion wobei A und B gleich oder verschieden sind und einen Amino-praktisch nicht verwendbar ist [R.B. Johnston et al., J. Biol. 55 säurerest oder einen Peptidrest bedeuten, wobei X eine Ami-Chem., 185, 629 (1950) und J.S. Fruton et al; J. Biol. Chem., noschutzgruppe bedeutet und wobei Y eine Carboxylschutz-204, 891 (1953)]. In Reaktion (4) fördert die primäre Amino- gruppe bedeutet, bei dem eine Aminosäure oder ein Peptid gruppe des Säureamids, welche an die terminale Gruppe der mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben Aminkomponente gebunden ist, die papainkatalysierte Amida- der Formel sereaktion. Daher haben diese bekannten Verfahren nur theo- 60 X-A-OH

retisches Interesse zur Demonstration der Tatsache, das Papain und Chymotrypson als Katalysatoren zur Synthese von mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit C-terminaler Peptidbindungen geeignet sind, wenn die terminale Carboxyl- Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formel gruppe der Aminkomponente mit einer Phenylaminogruppe oder einer primären Aminogruppe geschützt ist. Möglichkeiten 65 H-B-Y

zur praktischen Synthese gewünschter Oligopeptide oder Polypeptide werden durch diese bekannten Verfahren nicht eröff- in Gegenwart von Metalloproteinase umgesetzt wird, und zwar net. in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert, bei dem die en-

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zymatische Aktivität der Metalloproteinase erhalten bleibt.

Die erfindungsgemäss eingesetzten Metalloproteinase-En-zyme umfassen Enzyme, welche von Mikroorganismen gebildet werden, wie Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteoliticus, Streptomyces caespitosus, Bacillus megaterium, Bacillus poly-myxa, Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, Streptomyces fradiae, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus oryzae, Chlostridium histolyticum, Proteus aeruginosa usw. (Prolisin, Thermolysin, Collagenase, Thermoase, Tacynase N, Pronase). Es wurde bereits berichtet, dass diese Enzyme Peptidbindungen zu hydrolysieren vermögen, welche Aminogruppen von hydrophoben Aminosäureresten wie Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Valin umfassen [H. Matsubara et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21, 242 (1965)].

Die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel

X-A-OH

wobei X eine Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe bedeutet und wobei A einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeutet, wird im folgenden als Säurekomponente bezeichnet. Die Gruppe A bedeutet einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest in dem geeignete Aminosäuren aliphatische Aminosäuren sind, wie Monoaminomonocarbonsäuren, z. B. Glycin (Gly), Alanin (Ala), Valin (Val), Norvalin (nor-Val), Leucin (Leu), Isoleucin (Iso-Leu), Norleucin (nor-Leu); oder Oxyaminosäuren, wie Serin (Ser), Threonin (Thr), Homo-serin (homo-Ser); schwefelhaltige Aminosäuren, wie Methionin (Met) oder Cystin (CysS) und Cystein (CysH); oder Aminodi-carbonsäuren, z. B. Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (Glu), Asparagin (Asn) und Glutamin (Gin); Diaminomono-carbonsäuren, z. B. Ornithin (Orn), Lysin (Lys), Arginin (Arg); aromatische Aminosäuren, wie Phenylalanin (Phe), Ty-rosin (Tyr) und heterocyclische Aminosäuren, wie Histidin (His), Tryptophan (Trp). Diese Aminosäuren werden durch Symbole bezeichnet, welche allgemein üblich sind. Die Peptide werden durch Kombinationen dieser Symbole bezeichnet.

Im folgenden seien einige geeignete Schutzgruppen für die freie terminale Aminogruppe der Säurekomponente genannt (N-terminale Schutzgruppe): tertiäre Alkoxycarbonylgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (BOC-), t-Amyloxycarbonyl (t-Aoc); Benzyloxycarbonylgruppen, welche mit einem inerten Substi-tuenten substituiert sein können, wie Benzyloxycarbonyl (Z-), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ-), 3,5-Dimethoxybenzyl-oxycarbonyl (Z(OMe)2-), 2,4,6-Trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ-), p-Phenylazobenzylocycarbonyl (PZ-); p-Toluolsulfo-nyl (tos-); o-Nitrophenylsulfenyl (Nps-) od.dgl.

Die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel

H-B-Y

werden im folgenden als Aminkomponente bezeichnet. In der Formel bedeutet B einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, welcher in gleicher Weise definiert wie der Rest A. Die Schutzgruppen für die Carboxylgruppe (C-terminale Schutzgruppen) der Aminkomponente umfassen Alkoxygruppen wie Methoxy (-OMe), Äthoxy (-OEt); tertiäre Alkoxygruppen wie t-Butoxy (-O-t-Bu); Benzyloxygruppen, welche substituiert sein können, wie Benzyloxy (-OBzl), p-Nitrobenzyloxy (-0Bzl(p-N02)), Benzhydryloxy (-OBzh), Benzylamino (-NHBzl), 2,4-Dimethoxybenzylamino (-NHDMB), Benzhy-drylamino (-NHBzh) oder die unsubstituierte Aminogruppe (-NH2) od.dgl.

Die Säurekomponente und die Aminkomponente, welche als Reaktanten des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzt werden, umfassen Aminosäurereste und Peptidreste, welche funktionelle Gruppen in den Seitenketten aufweisen. In den meisten Fällen ist es bevorzugt, die funktionellen Gruppen mit einer Schutzgruppe zu schützen. Geeignete Schutzgruppen für ai-Aminogruppen (N'") umfassen N"'-Benzyloxycarbonyl (N"'-Z), t-Butoxycarbonyl (N"'-BOC) undTosyl (N'"-Tos). Geeignete Schutzgruppen für N-Guanidinogruppen (NG) von Arg umfassen Nitro (Ng-N02), NG-Benzyloxycarbonyl (NG-Z) und NG,N°-DibenzyloxycarbonyI (N°-Z-Z). Geeignete Schutzgruppen für den Imizadolring (Nim) umfassen Nim-Benzyl (N'm-Bzl) und Tosyl (N,m-tos). Geeignete Schutzgruppen für m-Carboxylgruppen umfassen cu-Benzyloxy (-OBzl). Als geeignete Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen von aliphatischen oder aromatischen Oxyaminosäuren kommen Aralkylgruppen in Frage, wie Benzyl (Bzl). Als geeignete Schutzgruppen für die Mercaptogruppe von CysH kommen Benzylgruppen (Bzl) in Frage. Die verwendeten Schutzgruppen sollten unter den Bedingungen der Hauptreaktion stabil sein und leicht vom Produkt ablösbar sein, ohne dabei zu Nebenreaktionen zu führen. Die als Ausgangsmaterial eingesetzte Säurekomponente und Aminkomponente können Schutzgruppen aufweisen und die Na-Aminogruppe der Aminkomponente kann frei sein oder in Form eines anorganischen oder organischen Salzes vorliegen, z. B. eines Hydrochlorids, eines Hydrobromids, eines Oxalats, eines p-Toluolsulfonats oder eines Acetats. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Kondensationsreaktion, bei der die Peptidbindung ausgebildet wird, in einer wässrigen Lösung durchgeführt, welche einen pH-Wert aufweist, bei dem die Enzymaktivität aufrechterhalten bleibt. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert etwa 6 bis 8.

Man kann zwei Methoden anwenden, um den richtigen pH-Wert für die Erhaltung der Enzymaktivität einzustellen. Eine Methode besteht darin, die Kondensationsreaktion in ei-ner Pufferlösung durchzuführen, z. B. in einer Zitronensäure-Pufferlösung, einer Mcflvaine-Pufferlösung, einer Kolt-hoff-Pufferlösung, einer Michaelis-Pufferlösung, einer Tris-Pufferlösung oder einer Clark-Lub-Pufferlösung. In dieser Pufferlösung wird die Säurekomponente und die Aminokom-ponente aufgelöst und dann wird das Enzym hinzugefügt. Das andere Verfahren während der Kondensationsreaktion den pH-Wert der Reaktionsmischung innerhalb des für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität geeigneten Bereichs zu halten, besteht in der Zugabe der Säure oder der Base zum Reaktionsgemisch in einer Menge, welche von dem gemessenen pH-Wert abhängt.

Die Ausgangsmaterialien werden gewöhnlich in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen und vorzugsweise 1 bis 1,5 Molen der Säurekomponente pro Mol der Aminkomponente eingesetzt. Wenn die Ausgangsmaterialien in dem wässrigen Medium nicht allzu löslich sind, so kann man die Löslichkeit der Reaktanten durch Zusatz eines Lösungsmittels, wie z. B. eines Alkohols, z. B. Methanol oder Äthanol, Dimethylformamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid od.dgl. zu der wässrigen Lösung verbessern. Die Menge des zugesetzten Lösungsmittels sollte beschränkt sein, so dass die Aktivität des Enzyms für die erfindungsgemässe Reaktion nicht inhibiert wird. Wenn man ein Lösungsmittel anwendet, so wird dieses gewöhnlich in einer Menge von weniger als 1 Gewichtsteil und vorzugsweise 0,2 bis 1,0 Gewichtsteilen pro 1 Gewichtsteil Wasser eingesetzt. Die erfindungsgemässe Reaktion wird in einem wässrigen Medium durchgeführt, und es ist erforderlich, die relative Löslichkeit des Reaktionsprodukts zu senken, vorzugsweise so weit, dass das Reaktionsprodukt in dem System nur schwach löslich oder unlöslich ist.

Bei der erfindungsgemässen Reaktion wird eine katalyti-sche Menge des Enzyms eingesetzt, und zwar vorzugsweise 10 bis etwa 500 mg des Enzyms pro 1 mmol der Aminkomponente. Wenn ein gereinigtes Enzym verwendet wird, so kann die Enzymmenge 5 bis 30 mg betragen. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 80° C und vorzugsweise im Bereich von 20 bis 50° C, da in diesem Temperaturbereich

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5

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15

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25

30

35

40

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60

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die Enzymaktivität erhalten bleibt. Unter diesen Bedingungen schreitet die Reaktion glatt vonstatten, und zwar während 1 bis 24 h. Das Reaktionsprodukt fällt aus dem Reaktionssystem aus und kann daher leicht isoliert werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren, bei dem als Enzymkatalysator Dimetalloproteinase eingesetzt wird, kann durch folgende Reaktionen exemplifiziert werden:

Wenn ein Dipeptid erzeugt wird, so folgt das Verfahren der folgenden Reaktion:

BOC-Tyr(Bzl)-OH + H-Val-NHDMB

>BOC-Tyr(Bzl)-Bal-NHDMB

BOG—His(Bzl)-OH + H-Leu-NHDMB >BOC-His(Bzl)-Leu-NHDMB

Dabei wurde das Amidderivat von Val und Leu als Aminkomponente eingesetzt und das BOC-Derivat von Tyr und His mit geschützter Seitenkette als Säurekomponente. Die Kondensationsprodukte werden in Ausbeuten von etwa 60% erhalten. Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren und Aminosäureamiden sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren mit Dipeptid-amiden sind in Tabelle 2 angegeben. Beispiele der Kondensation von Acyldipeptiden und Aminosäureamiden sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Beispiele der Kondensation von Acyldipeptiden und Dipeptidamiden finden sich in der Tabelle 4 und Beispiele der Kondensation von Acylaminosäuren und Dipeptidestern finden sich in Tabelle 5.

Wenn die Metalloproteinase als Enzymkatalysator verwendet wird, so sind die Aminosäuren mit speziellen Eigenschaften äusserst reaktiv als Aminkomponente und verschiedene Aminosäuren können in Form einer Acylaminosäure oder eines Acylpeptids als Säurekomponente eingesetzt werden, wie die Tabellen zeigen. Man erkennt, dass die Metalloproteinase bei der Synthese von Peptiden unter Verwendung von hydrophoben Aminosäuren, wie Leu, iso-Leu, Val, Phe und dgl. als N-terminale Aminosäure der Aminkomponente eingesetzt werden kann.

Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann ein Protein-Proteinase-Inhibitor, z. B. aus Kartoffeln, eingesetzt werden. Handelsübliche rohe Metallo-proteinasen enthalten gewöhnlich alkalische Proteinasen, deren optimaler pH-Wert auf der alkalischen Seite liegt und welche nichtsubstituierte Amide und Aminosäuren oder Peptid-ester aus einem primären Alkohol hydrolysieren. Zum Beispiel umfasst Prolisin eine Metalloproteinase ohne Esterase- oder Amidaseaktivität und eine alkalische Proteinase im Verhältnis 7:3. Weiterhin umfasst das Prolisin als weitere Komponenten eine geringe Menge Amylase, Protein und etwa 65% Stärke. Wenn nun Prolisin als Katalysator zur Bildung von Peptidbindungen verwendet wird, so sind die Ester, welche bei der Reaktion einer Carboxylgruppe und eines primären Alkohols gebildet werden, z. B. der Methylester oder der Äthylester, als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe nicht geeignet, noch ist ein unsubstituiertes Amid geeignet. Es sind daher kompliziertere Schutzgruppen erforderlich, sowie komplizierte Verfahrensstufen und teure Reagenzien (Alkohole und Amine). Die Entfernung der alkalischen Proteinase aus Prolisin erfordert ebenfalls komplizierte Verfahrensschritte. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass die Ausbeute an den angestrebten Produkten wesentlich verbessert werden kann, wenn man einen Inhibitor für das proteolytische Enzym (Proteinase) bei der Synthese der Peptide unter Verwendung der Metalloproteinase, und isnbesondere einer rohen Metalloproteinase, einsetzt.

Somit besteht eine wichtige Ausführungsform der Erfindung darin, in Gegenwart eines Inhibitors für das proteolytische Enzym zu arbeiten. Mit diesem Inhibitor wird die Aktivität der alkalischen Proteinase, welche in handelsüblichem Enzym, das als Hauptkomponente Metalloproteinase enthält, auftritt, herabgesetzt, während die Metalloproteinase bei der 5 Kondensationsreaktion unter Bildung von Peptidbindungen seine katalytische Wirkung entfaltet. Geeignete Inhibitoren für das proteolytische Enzym können aus Hafer, Fava, Bohnen und Kartoffeln extrahiert werden. Die Methode der Extraktion ist in Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 31, Seite 38 (1957) belo schrieben. Der erfindungsgemäss eingesetzte Inhibitor muss nicht rein sein. Man kann einen Rohextrakt einsetzen. Bei Verwendung eines solchen Inhibitors kann man eine Aminkomponente mit einer primären Alkoxygruppe, z. B. einer Me-thoxygruppe (O-Me), einer Äthoxygruppe (-OET) oder einer ls unsubstituierten Aminogruppe als Schutzgruppe der Carboxylgruppe einsetzen.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Säurekomponente (I) mit einer Aminkomponente (II) in einer der folgenden Kombinationen umgesetzt werden: 20 (a) In Kombination von L-I und DL-II;

(b) Kombination von DL-I und L-II oder

(c) Kombination von DL-I und DL-II.

Dabei erhält man in allen Fällen L,L-Acyldipeptid. Als Säurekomponente (I) kann man z. B. eine Verbindung der fol-25 genden Formel

R

I

30

R'HH-CHCOOH

einsetzen, wobei R' eine Acylgruppe bedeutet und wobei R2 eine Seitenkettengruppe einer a-Aminosäure bedeutet. Die Aminkomponente (II) kann eine Verbindung der folgenden 35 Formel sein

40

?3

_riiT_nr(Tj4-

H2»-CH-C0R

wobei R3 eine Seitenkettengruppe einer a-Aminosäure bedeutet und wobei R4 eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeutet. Bei dieser Ausführungsform kann die Säurekompo-45 nente (I) und/oder die Aminkomponente (II) als razemische Komponente eingesetzt werden und dennoch erhält man das L,L-Acyldipeptid bei Verwendung der Metalloproteinase selektiv. Vorzugsweise wird auch dabei ein Inhibitor für das proteolytische Enzym zugesetzt. Diese Reaktion kann folgender-50 massen dargestellt werden r

r

55

60

E'HHOHOOOH + H,N-CHC0R (I) 2 (II)

R2 rV

î f

—ä££22—5» R'HHCHCOHHCHCOR* 7 (III)

Dabei bedeutet R' eine Acylgruppe, R2 eine Seitenkettengruppe einer a-Aminosäure, R3 eine Seitenkettengruppe einer a-Aminosäure und R4 eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe. Somit führen drei verschiedene Kombinationen der

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6

Säurekomponente (I) und der Aminkomponente (II) zum Erfolg:

LL—III

(a) L—I + DLII

(b) DL-I + L—II

(c) DL-I + DL-II

(Das Molverhältnis wird dabei auf der Grundlage der L-Kom-ponenten festgelegt.)

Man erhält als Produkt LL-ÏII, da die Reaktion selektiv ist. Verbindungen der Formel I und II können leicht erhalten werden. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann man Aspargylphenylalanin-methylester, welcher als Süssstoff bekannt ist, leicht herstellen, indem man den N-Benzyloxycarbo-nyl-(/3-benzyl)-aspargyl-phenylalanin-methylester reduziert, welcher durch Reaktion der N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)--asparaginsäure mit Phenylalaninmethylçster erhalten wird. Katalytische Mengen des Enzyms sind ausreichend und das Enzym kann wiederholt eingesetzt werden. Die Reaktion schreitet unter milden Reaktionsbedingungen in einer gepufferten Lösung oder in einer Lösung mit einem gewünschten pH-Wert glatt voran. Die Ausbeuten sind relativ hoch und die Reinheit des Produktes ist ausserordentlich gross. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur stufenweisen Verlängerung einer Peptidkette und auch für die Kondensation von Fragmenten. Solche Fragmëntkondensationsreaktionen sind für industrielle Zwecke äusserst vorteilhaft. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren setzt keine Razemisierung ein.

Diese Vorteile können mit den herkömmlichen Verfahren nicht erzielt werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

In den Beispielen wird gereinigte Thermoase hergestellt durch Auflösung roher Thermoase in einer wässrigen Lösung von Vso M-Calciumacetat und durch Trennung des unlöslichen Materials mit der Zentrifuge und durch Dialyse der überstehenden Flüssigkeit, und zwar zweimal mit einer wässrigen Lösung von Vioo M-Calciumacetat. Sodann gibt man zu der dialy-sierten Lösung das 0,8fache an Aceton, worauf der Niederschlag abfiltriert wird. Sodann gibt man Aceton zu dem Filtrat bis zu der 2,5fachen Menge des Filtrats, worauf der Niederschlag durch Zentrifugentrennung abgetrennt und bei Normaltemperatur unter vermindertem Druck getrocknet wird.

Beispiel 1

40 ml einer Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 werden zu 817 mg (2,20 mmol) BOC-Tyr(Bzl)-OH und 606 mg (2,00 mmol) H-Val-NHDMB • HCl gegeben und dann gibt man noch 2,0 ml In NaOH zu der Lösung. Sodann wird die Mischung unter Rühren bei 38° C mit 200 mg neutraler Proteinase versetzt (Streptomyces; Titer: 100 Einheiten/mg; hergestellt durch Kyowa Hakko K.K.). Die Reaktion wird

10

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während 24 h bei 38° C durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7% Ammoniakwasser und wiederum Wasser gewaschen. Man erhält 1,08 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml heissem Äthanol aufgelöst und die heisse Lösung wird während 30 min mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird mit Wasser versetzt. Dabei erhält man das kristalline Produkt der Formel BOC-Tyr(Bzl)-Val-NHDMB. Ausbeute: 700 mg (56%)

Schmelzpunkt: 183 bis 185° C [a]D2S = -1,6° (C = 1,0 Chloroform)

Elementar-Analyse :

berechnet: C 67,83 H 7,32 N 6,78%

gefunden: C 67,71 H 7,35 N 6,60%

Beispiel 2

40 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 7,5 werden zu 760 mg (2,20 mmol) BOC-His(Bzl)-OH und 634 mg 20 (2,00 mmol) H-Leu-NHDMB • HCl gegeben und dann fügt man noch In NaOH zu der Lösung. Weiterhin gibt man zu der erhaltenen Mischung unter Rühren bei 38° C 200 mg neutrale Proteinase (Streptomyces) und die Mischung wird während 24 h bei 38° C umgesetzt. Der erhaltene farblose Niederschlag 25 wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniakwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 1,01 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml heissem Äthanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle während 30 min zur Entfernung des Proteins behandelt. 30 Die Lösung wird eingeengt und dann mit Wasser versetzt. Man erhält ein kristallines Produkt der Formel BOC-His(Bzl)-Leu-NHDMB • H20.

Ausbeute: 800 mg (64%)

Schmelzpunkt: 144 bis 146° C 35 [«]d2S = 0,69° (C = 1,0 Chloroform)

Elementaranalyse:

berechnet: C 63,34 H 7,57 N 11,19%

gefunden: C 63,37 H 7,45 N 11,17%

40 Beispiele 3 bis 37

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man jedoch die Säurekomponenten und die Aminkomponenten gemäss den Tabellen 1 bis 5 einsetzt. In Tabelle 1 ist die Säurekomponente eine Na-Acylaminosäure und die Aminkompo-45 nente ein Aminosäureamid. In Tabelle 2 ist die Säurekomponente eine Na-Acylaminosäure und die Aminkomponente ein Dipeptidamid. In Tabelle 3 ist die Säurekomponente ein Na-Acyldipeptid und die Aminkomponente hat die Formel H-Leu-NHBzh. Gemäss Tabelle 4 sind die Säurekomponenten so N«-Acyldipeptide und die Aminkomponenten sind Dipeptid-amide der Formel H-Phe-Ala-NHBzh. Gemäss Tabelle 5 setzt man als Säurekomponente eine Na-Acylaminosäure ein und als Aminkomponente einen Dipeptidester.

Tabelle 1

Bsp. Acidkomponente Aminkomponente Nr.

Produkt

Ausbeute Schmelz- Elementar-Analyse (%) punkt (1) berechnet (%)

(°C) (2) gefunden (%)

C

H

N

3

Z-Leu-OH

H-Phe-NHBzh

Z-Leu-Phe-NHBzh

69

233-224

(1)

74,84

6,80

7,27

(2)

74,72

6,79

7,30

4

Z-Phe-OH

H-Phe-NHBzh

Z-Phe-Phe-NHBzh

48

204-205

(1)

76,57

6,10

6,87

(2)

76,32

6,05

6,93

5

Z-Gln-OH

H-Phe-NHBzh

Z-Gln-Phe-NHBzh • 72H20

91

260-263

(1)

69,86

6,20

9,31

(2)

69,64

6,00

9,14

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Tabelle 1

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Bsp. Nr.

Acidkomponente

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute (%)

Schmelzpunkt (8C)

Elementar-Analyse

(1) berechnet (%)

(2) gefunden (%)

C H

N

6

Z-Arg(NQ2)-OH

H-Phe-NHBzh

Z-Arg(N02)-Phe-NHBzh

48

214-216

(1)

64,95

5,90

14,73

(2)

64,61

5,71

14,78

7

Z-Trp-OH

H-Phe-NHBzh

Z-Trp-Phe-NHBzh • V2H20

34

191-194

(1)

74,63

5,96

8,49

(2)

75,04

5,91

8,59

8

Z-Pro-OH

H-Phe-NHBzh

Z-Pro-Phe-NHBzh

44

186-189

(1)

74,84

6,28

7,43

(2)

74,74

6,25

7,55

9

Z-Phe-OH

H-Val-NHBzh

Z-Phe-Val-NHBzh

51

230-233

(1)

74,54

6,62

7,46

(2)

74,65

6,67

7,49

10

Z-Phe-OH

H-Leu-NHBzh

Z-Phe-Leu-NHBzh

57

203-207

(1)

74,84

6,80

7,27 '

(2)

74,62

6,78

7,27

11

Z-Phe-OH

H-Ile-NHBzh

Z-Phe-Ile-NHBzh • H20

30

207-212

(1)

72,58

6,94

7,05

(2)

72,99

6,70

7,17

Tabelle 2

Bsp.

Acidkomponente

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute

Schmelz

Elementar-Analyse

Nr.

(%)

punkt

(°C)

(1) berechnet (%)

(2) gefunden (%)

C

H

N

12

Z-Phe-OH

H-Phe-Arg(N02)-

Z-Phe-Phe-Arg(N02)-

78

172-176

(1) 65,04

6,07

13,49

NHBzh

NHBzhH20

(2) 65,03

5,82

13,55

13

Z-Leu-OH

H-Ala-Phe-NHBzh

Z-Leu-Ala-Phe-NHBzh ■ H20

33

162-165

(1) 70,05

(2) 70,21

6,95 6,80

8,40 8,23

14

Z-Phe-OH

H-Ala-Phe-NHBzh

Z-Phe-Ala-Phe-NHBzh • H20

23

173-175

(1) 71,98

(2) 71,65

6,33 6,38

8,00 7,82

15

Z-Phe-OH

H-Phe-Ala-NHBzh

Z-Phe-Phe-Ala-NHBzh •

v2h2o

25

205-209

(1) 72,91

(2) 72,89

6,26 6,18

8,10 8,18

16

Z-Phe-OH

H-Leu-Gly-NHBzh

Z-Phe-Leu-Gly-NHBzh • V2H20

31

207-208

(1) 70,89

(2) 70,84

6,73 6,60

8,70 8,82

Tabelle 3

Bsp. Nr.

Acidkomponente

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute (%)

Schmelzpunkt

(°C)

Elementar-Analyse

(1) berechnet (%)

(2) gefunden ( %)

C H

N

17

Z-Trp-Gly-OH

H-Leu-NHBzh

Z-Trp-Gly-Leu-NHBzh

19

183-185

(1)

71,30

6,43

10,40

(2)

70,92

6,39

10,45

18

PMZ-Ala-Ala-OH H-Leu-NHBzh

PMZ-Ala-Ala-Leu-NHBzh

51

236-239

CD

67,75

7,02

9,30

(2)

68,02

7,05

9,42

19

Z-Leu-Ala-OH

H-Leu-NHBzh

Z-Leu-Ala-Leu-NHBzh

46

228-232

(1)

70,33

7,54

9,11

(2)

70,52

7,48

8,93

20

Z-Phe-Ala-OH

H-Leu-NHBzh

Z-Phe-Ala-Leu-NHBzh

51

240-241

(1)

72,20

6,84

8,64

(2)

72,14

6,84

8,85

21

Z-Ala-Leu-OH

H-Leu-NHBzh

Z-Ala-Leu-Leu-NHBzh

38

225-226

(1)

70,33

7,54

9,11

(2)

70,14

7,52

9,33

22

Z-Ala-Phe-OH

H-Leu-NHBzh

Z-Ala-Phe-Leu-NHBzh

87

202-205

(1)

72,20

6,84

8,64

(2)

72,27

6,82

8,88

623 807

8

Tabelle 4

Bsp.

Acidkomponente

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute

Schmelz

Elementar-Analyse

Nr.

(%)

punkt

( 1 ) berechnet ( %)

(°C)

(2) gefunden {%)

C

H

N

23

Z-Trp-Gly-OH

H-Phe-Ala-NHBzh

Z-Trp-Gly-Phe-Ala-NHBzh

58

245-247

(1)

70,93

5,95

10,79

(2)

70,51

5,91

10,75

24

Z-Leu-Ala-OH

H-Phe-Ala-NHBzh

Z-Leu-Ala-Phe-Ala-NHBzh

38

259-262

(1)

70,07

6,86

9,73

(2)

69,82

6,78

9,73

25

Z-Pro-Leu-OH

H-Phe-Ala-NHBzh

Z-Pro-Leu-Phe-Ala-

39

210-213

(1)

70,00

6,94

2,28

NHBzh • r/2H20

(2)

69,44

6,72

9,20

26

Z-Ala-phe-OH

H-Phe-Ala-NHBzh

Z-Ala-Phe-Phe-Ala-

57

256-259

(1)

70,84

6,34

9,18

NHBzh-72H20

(2)

70,65

6,19

9,14

27

Z-Ala-Tyr-OH

H-Phe-Ala-NHBzh

Z-Ala-Tyr-Phe-Ala-

34

252-253

(1)

68,59

6,27

8,89

NHBzhH20

(2)

68,17

6,00

9,11

Tabelle 5

Bsp.

Acidkomponente

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute

Schmelz

Elementar-Analyse

Nr.

(%)

punkt

(1) berechnet (%)

(° C)

(2) gefunden (%)

C

H

N

28

Z-Ala-OH

H-Phe-Phe-OBu'

Z-Ala-Phe-Phe-OBu'

71

160-163

(1)

69,09

6,85

7,32

(2)

69,05

6,87

7,36

29

Z-Gln-OH

H-Phe-Phe-OBu'

Z-Gln-Phe-Phe-OBu1

86

196-200

(1)

66,65

6,71

8,88

(2)

66,51

6,71

8,74

30

Z-Thr-OH

H-Phe-Phe-OBu'

Z-Thr-Phe-Phe-OBu'

63

63-68

(1)

67,64

6,85

6,96

(2)

67,24

6,70

6,88

31

Z-Met-OH

H-Phe-Phe-OBu'

Z-Met-Phe-Phe-OBu'

85

107-108

(1)

66,32

6,84

6,63

(2)

66,30

6,77

6,53

32

Z-Cys(Bzl)-OH

H-Phe-Phe-OBu'

Z-Cys(Bzl)-Phe-Phe-OBut

57

68-80

(1)

69,04

6,52

6,04

(2)

68,92

6,48

6,06

33

Z-Arg(N02)-0H

H-Phe-Val-OBu'

Z-Arg(N02)-Phe-Val-0But

83

oily

(1)

58,52

7,06

14,93

(2)

58,99

7,09

14,00

34

Z-Lys(Z)-OH

H-Phe-Val-OBu'

Z-Lys(Z)-Phe-Val-OBut

100

112-115

(1)

66,97

7,31

7,71

(2)

66,93

7,30

7,80

35

Z-Arg(N02)-0H

H-Leu-Phe-OBu'

Z-Arg(N02)-Leu-Phe-0But

57

88-92

(1)

57,63

7,18

14,26

(2)

57,50

6,97

13,99

36

Z-Lys(Z)-OH

H-Leu-Phe-OBu'

Z-Lys(Z)-Leu-Phe-OBut

76

103-106

(1)

67,38

7,45

7,67

(2)

67,40

7,43

7,73

37

Z-Lys(Tos)-OH

H-Leu-Phe-OBu'

Z-Lys(Tos)-Leu-Phe-OBut

87

103-106

(1)

63,97

7,25

7,46

(2)

61,02

7,20

7,45

Beispiel 38 so

In einen Kolben gibt man 280,2 mg (1 mmol) Z-Gln-OH und 268,5 g (1 mmol) H-Phe-Phe-OBu' und diese Stoffe werden in 10 ml Wasser suspendiert. Sodann führt man in die Suspension einer Glaselektrode eines pH-Messgerätes ein, worauf V10n NaOH in die Suspension eingetropft wird, um den 55 pH auf 6,5 bis 7,0 einzustellen, während man unter Rühren die Suspension mit 100 mg Thermoase versetzt. Dabei wird der Feststoff aufgelöst. Die Reaktion wird unter Rühren bei 38° C während 20 h fortgesetzt. Während der Reaktion gibt man zu der Reaktionsmischung unter ständiger Messung des pH-Wer- 60 tes des Reaktionsgemisches mit einem pH-Meter V10n NaOH, um den pH auf 6,5 bis 7,0 zu halten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser In HCl, Wasser, 7 % Ammoni akwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat um- 65 kristallisiert. Man erhält 330 mg (Ausbeute 52,3%) des angestrebten Produkts der Formel Z-Gln-Phe-Phe-O-Bu' mit einem Schmelzpunkt von 197 bis 200° C.

Beispiel 39

In einem Kolben suspendiert man in 10 ml Wasser 398,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Val-OH und 320,4 mg (1 mmol) H-Phe-Val-OBu'. In die Suspension taucht man eine Glaselektrode eines pH-Meters, worauf eine Vi0n NaOH in die Suspension eingetropft wird, um den pH auf 6,5 bis 7,5 einzustellen. Sodann gibt man 100 mg Thermoase unter Rühren zu der Suspension, wobei die Feststoffkomponente aufgelöst wird. Die Reaktion wird unter Rühren bei 38° C während 20 h durchgeführt. Während der Reaktion gibt man 710n NaOH zu dem Reaktionsgemisch, während der pH des Reaktionsgemischs mit einem pH-Meter verfolgt wird. Auf diese Weise wird der pH-Wert auf 6,5 bis 7,5 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, In HCl, Wasser, 7 % Ammoniakwasser und wieder mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 240 mg (Ausbeute 34,2%) des angestrebten Produkts der Formel Z-Phe-Val-Phe-Val-O-Bu1 mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 145° C.

9

623 807

Beispiel 40

0,1 g Prolisin und 0,1 g eines Inhibitors für das proteolytische Enzym (Proteinase), erhalten aus Kartoffeln, werden mit 3 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5) versetzt, wélche 2 x IO""3 M Calciumacetat enthält. Sodann wird die Stärke von s der Mischung abgetrennt. Die erhaltene Lösung wird zu 0,33 g (1 mmol) Z-Gln-Gly-OH und 0,26 g (1 mmol) H-Leu-Val-NH2 • HCl gegeben. Sodann fügt man zu dem Gemisch 1 ml In NaOH hinzu, worauf die Mischung noch während 20 h bei 38 bis 40° C gerührt wird. Der erhaltene Niederschlag wird abfil- io triert und der Reihe nach mit 7% Ammoniakwasser, 5% Zitronensäure und Wasser gewaschen. Man erhält 0,394 g rohe Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 237 bis 240° C [a]D23 = -22,0 (C = 0,5 AcOH). Das Produkt wird zu Methanol gegeben und die Mischung wird zum Sieden gebracht, worauf ts eine geringe Menge unlöslicher Verunreinigungen entfernt wird. Man erhält 0,38 g (70%) Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 244 bis 247° C und [a]D25 = -20,0 (C = 0,5 AcOH). Elementaranalyse : C26H4oN607

berechnet: C 56,92 H 7,34 N 15,32% 20

gefunden: C 56,89 H 7,30 N 15,26%

Beispiel 41

0,2 g Prolisin und 0,2 g eines Inhibitors für das proteolytische Enzym (Proteinase), erhalten aus Kartoffeln, werden mit 25 Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5) vermischt, welche 2 x IO-3 M Calciumacetat enthält. Danach wird die Stärke von dem Gemisch abgetrennt. Die erhaltene Lösung wird zu 0,43 g

(1 mmol) Z-Leu-Tyr-OH und 0,33 g (1 mmol) H-Leu-Val-OMe • HBr gegeben und dann gibt man zu der Lösung noch 1 ml In NaOH. Die Mischung wird bei 38 bis 40° C während 20 h gerührt. Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch unter Rühren mit Äthylacetat vermischt, worauf die wässrige Phase abgetrennt wird und die organische Phase wird der Reihe nach mit 7%igem Ammoniakwasser, In HCl und einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann mit Na2S04 getrocknet. Die Mischung wird eingeengt und man erhält 0,52 g (Ausbeute 78,8%) eines weissen schaumigen Pulvers. Das Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie aufgetrennt, wobei als Entwickler ein Gemisch aus sekundärem Butanol und 3%igem Ammoniakwasser (8:3) (Rf = 0,85) eingesetzt wird. Das Produkt wird aus Dio-xan/Wasser umkristallisiert. Man erhält Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 184 bis 190° C [a]D29 = -50,0 (C = 1,0 Methanol). Das gleiche Produkt, hergestellt nach der DCC1-HOBt-Methode hat einen Schmelzpunkt von 176 bis 181° C und [a]D2s = -48,6 (C = 1,0 Methanol).

Elementaranalyse: C3sHsoN408 • V2H20

berechnet: C 63,33 H 7,74 N 8,44%

gefunden: C 63,36 H 7,70 N 8,15%

Beispiele 42 bis 45 Das Verfahren des Beispiels 40 wird wiederholt, wobei man jedoch die Säurekomponenten und Aminkomponenten der Tabelle 6 einsetzt.

Tabelle 6

Beispiel Säurekomponente Aminkomponente Ausbeute Schmelz- [a]D

Nr. (%) punkt (°C)

42 ZLeuPheOH HLeuLeuOMe 65 190-192 -57,2

(C = 0,5 MeOH)

43 pMZMetGlyOH HPheNH2 82 226-229 -1,0

(C = 0,25 DMF)

44 ZPheOH HIleuOMe 79 104-106 -10,0

(C = 0,5 EtOH)

45 ZMetOH HLeuPheOBut 82 160-163 -39,0

(C = 1 MeOH)

45

Beispiel 46

Eine Mischung von 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycar-bonyl-(/5-benzyl)-D,L-asparaginsäure, 215 mg (1,00 mmol) L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid und 20 mg gereinigter Thermoase und 20 mg Inhibitor für das proteolytische Enzym, so hergestellt aus Kartoffeln, werden mit 10 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) vermischt, welche 2,0 = 10-2 M Calciumacetat enthält und dann gibt man zu dem Gemisch In NaOH, um den pH auf 7,5 einzustellen. Die Reaktion wird unter Rühren während 17 h bei 39° C durchgeführt. Der er- ss haltene weisse Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit 5%igem Ammoniakwasser, 5%iger wässriger Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält 413 mg N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspar-gyl-L-phenylalanin-methylester. Das Produkt wird aus Äthyl- «o acetat/Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute: 79,6%

Schmelzpunkt: 116 bis 117° C

[cc]D20 = —12,2 (C = 1,0 Dimethylformamid) 65

Elementaranalyse: C29H30N2O7

berechnet: C 67,17 H 5,83 N 5,40%

gefunden: C 67,35 H 5,81 N 5,28%

Beispiel 47

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 715 mg N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-D,L-asparaginsäure und 431 mg D,L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid einsetzt sowie 20 mg Thermolysin, jedoch ohne Inhibitor. Man erhält 244 mg (Ausbeute 47,0% des gleichen Produkts.

Beispiel 48

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 357 mg (1,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspa-raginsäure und 431 mg (2,00 ml) D,L-Phenylalaninmethyl-esterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 426 mg (Ausbeute 82,1 %) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspargyl-L-phe-nylalaninmethylester mit [a]D25 = —12,5 (C = 1,0 Dimethylformamid).

Beispiel 49

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-D,L--asparaginsäure und 413 mg (2,00 mmol) D,L-Phenylalanin-methylesterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 410 mg (Ausbeute 79,0%) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethylester mit [a]D20 = -12,0 (C = 1,0 Dimethylformamid).

623 807

10

Beispiel 50

100 mg Thermoase und 100 mg eines Inhibitors für das proteolytische Enzym, hergestellt aus Kartoffeln, werden mit 10 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) mit 2,0 x 10"2 M Calciumacetat vermischt. Die Mischung wird während 10 min bei 30° C gerührt. Das unlösliche Material wird durch Filtrieren der Lösung über ein Glasfilter (G-3) entfernt. Das Filtrat wird mit 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-ben-zyl)-D,L-asparaginsäure und 215 mg (1,00 mmol) L-Phenyl-alaninm,ethylester vermischt und dann gibt man In NaOH zu dem Filtrat, um den pH auf 7,5 einzustellen. Die Reaktion wird unter Rühren bei 39° C während 17 h durchgeführt. Der erhaltene weisse Niederschlag wird nach dem Verfahren des Beispiels 1 behandelt, wobei man 411 mg (Ausbeute 79,2%) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylala-nin-methylester erhält mit [a]D23 = -12,5 (C = 1,0 Dimethyl-formamid.

Beispiel 51

Das Verfahren des Beispiels 50 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-D,L-asparaginsäure und 215 mg L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid einsetzt, sowie 200 mg Prolisin und 200 mg des Inhibitors. Man erhält 110 mg (Ausbeute 21,2%) N-Benzyl-

oxycarbonyl-(j(3-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethyIester mit [a]D22 = —12,8 (C = 1,0 Dimethylformamid).

Beispiel 52

s Das Verfahren des Beispiels 51 wird wiederholt, wobei man 357 mg (1,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L--asparaginsäure und 431 mg (2,00 mmol) D,L-Phenylalanin-methylesterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 238 mg (Ausbeute 45,8%) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspargyl-

10 L-phenylalaninmethylester mit [a]D20 = —13,2 (C = 1,0 Dimethylformamid).

Beispiel 53

Das Verfahren des Beispiels 51 wird wiederholt, wobei man 715 mg (2,00 mmol) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-

15 D,L-asparaginsäure und 431 mg (2,00 mmol) D,L-Phenylal-aninmethylesterhydrochlorid einsetzt. Man erhält 121 mg (Ausbeute 23,3%) N-Benzyloxycarbonyl-(/3-benzyl)-L-aspargyl-L-phenylalaninmethylester mit [a]D26 = —12,4 (C = 0,5 Dimethylformamid).

20

Beispiele 54 bis 60 Das Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, wobei man die Bedingungen gemäss Tabelle 7 wählt. Man erhält das Produkt gemäss Beispiel 46.

25

Tabelle 7

Bsp.

N-Benzyloxycarbonyl-

Phenylalanin-methylester

Proteinase

Inhibitor

Ausbeute

Nr.

(/3-benzyl)-asparaginsäure

(Menge mg)

(%)

54

D,L-Verbindung (715)

L-Verbindung (215)

Thermolysin (20)

-

47,0

55

L-Verbindung (357)

D,L-Verbindung (413)

Thermolysin (20)

86,1

56

L-Verbindung (357)

D,L-Verbindung (431)

rohe

Thermoase (100)

Kartoffelinhibitor (100)

75,5

57

D,L-Verbindung (715)

D,L-Verbindung (431)

rohe

Thermoase (100)

Kartoffelinhibitor (100)

48,4

58

D,L-Verbindung (715)

L-Verbindung (215)

gereinigte Thermoase

—

63,6

59

L-Verbindung (357)

D,L-Verbindung (431)

gereinigte Thermoase

—

36,2

60

D,L-Verbindung (715)

D,L-Verbindung (431)

gereinigte Thermoase

21,8

Beispiele 61 bis 74

Das Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, wobei man die Acylaminosäuren und die Aminosäurederivate gemäss Tabelle 8 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt. Alle Produkte sind L,L-Produkte.

Tabelle 8

Bsp. Nr.

Acylaminosäure

Aminosäurederivat

Produkt

Ausbeute (%)

[al D

61

Z-L-AlaOH

D,L-H-PheOMe • HCl

Z-L-Ala-L-PheOMe

"23,2

-14,5

(C = 0,5, MeOH)

62

Z-D,L-AlaOH

L-H-PheOMe • HCl

Z-L-Ala-L-PheOMe

23,7

(C = 0,5, MeOH)

63

Z-D,L-AlaOH

D,L-H-PheOMe • HCl

Z-L-Ala-L-PheOMe

13,8

(C = 0,5, MeOH)

64

pmZ-L-TrpOH

D,L-H-PheOMe ■ HCl pmZ-L-Trp-L-PheOMe

52,3

-37,0

(C = 1, DMF)

11

Tabelle 8

623 807

Bsp. Nr.

Acylaminosäure

Aminosäurederivat

Produkt

Ausbeute ('■'<)

[«|D

65

pmZ-D,L-TrpOH

L-H-PheOMe HCl pmZ-L-Trp-L-PheOMe

67,4

(C = 1, DMF)

66

pmZ-D,L-TrpOH

D,L-H-PheOMe ■ HCl pmZ-L-Trp-L-PheOMe

39,7

(C = 1, DMF)

67

Boc-L-LeuOH

D,L-H-PheOMe • HCl

Boc-L-Leu-L-PheOMe

19,6

-26,4

(C = 0,5, MeOH)

68

Boc-D,L-LeuOH

L-H-PheOMe-HCl

Boc-L-Leu-L-PheOMe

.19,9

(C = 0,5, MeOH)

69

Z-L-PheOH

D,L-H-PheOMe • HCl

Z-L-Phe-L-PheOMe

71,2

-17,6

(C = 1, DMF)

70

Z-D,L-PheOH

. L-H-PheOMe HCl

Z-L-Phe-L-PheOMe

47,8

(C = 1, DMF)

71

Z-D,L-PheOH

D,L-H-PheOMe • HCl

Z-L-Phe-L-PheOMe

27,2

(C = 1, DMF)

72

Z-L-Asp(BZL*)OH

D,L-H-PheOEt • HCl

Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt

84,0

-12,2

(C = 1, DMF)

73

Z-D,L-Asp(BZL)OH

L-H-PheOEt • HCl

Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt

79,2

(C = 1, DMF)

74

Z-D,L-Asp(BZL)OH

D,L-H-PheOEt • HCl

Z-L-Asp(BZL)-L-PheOEt

70,3

(C = 1, DMF)

* BZL: /5-benzylester

Claims

623 807

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel

X-A-B-Y

wobei A und B gleich oder verschieden sind und jeweils einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten und wobei X eine Aminosäureschutzgruppe und Y eine Carboxylschutz-gruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Säurekomponente einer Aminosäure oder ein Peptid mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben der Formel

X-A-OH

mit einer Aminkomponente einer Aminosäure oder eines Pep- 15 tids mit einer C-terminalen Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formel

H-B-Y
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kombination der Säurekomponente (I) und der Aminkomponente (II) eine der folgenden Kombinationen einsetzt: L-I + DL-II; DL-I + L-II; DL-I +

s DL-II.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als Säurekomponente eine Acylaminosäure (I) und als Aminkomponente ein Aminosäurederivat (II) einsetzt und gemäss nachfolgendem Reaktionsschema umsetzt:

10

R

I

R'NHCHCOOH (I)

R

+ H2N-CHC0R'

Enzym in Gegenwart eines Metallproteinaseenzyms in einer wässrigen Lösung mit einem die Aktivität des Metalloproteinaseenzyms aufrechterhaltenden pH-Wert umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Metalloproteinase einsetzt, welche aus einem der folgenden Mikroorganismen erhalten wurde: Bacillus sub-tilis, Bacillus thermoproteoliticus, Streptomyces caespitosus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, Streptomyces fradiae, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus oryzae, Clostridium histolyticum und Proteus aeruginosa.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Lösung durch Zusatz einer Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 8 auf einem Wert gehalten wird, bei dem die Enzymaktivität bei der Reaktion der Aminosäure- oder Peptid-Reaktanten erhalten bleibt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der pH durch Zugabe einer Säure oder einer Base zu der Reaktionslösung je nach Messung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf dem gewünschten Wert gehalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ausgangsmaterialien in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen der Säurekomponente X-A-OH pro Mol der Aminkomponente H-B-Y einsetzt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion unter Zusatz von 10 bis 500 mg der Metalloproteinase pro mmol der Aminkomponente H-B-Y durchführt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die N-terminale Schutzgruppe der Säurekomponente X—A—OH tert.-Alkoxycarbonyl, Benzyloxycar-bonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyl-oxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl oder o-Nitrosulfenyl ist und dass die C-terminale Schutzgruppe der Aminkomponente H—B-Y unsubstituiertes Amino, primäres Alkoxy, tert.-Alkoxy, Benzyloxy, p-Nitrobenzyloxy, Benzhydryloxy, Benzylamino, 2,4-Dimethoxybenzylamino oder Benzhydrylamino ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten, wobei die Aminosäure eine aliphatische Aminosäure, eine schwefelhaltige Aminosäure, eine Monoaminodicarbonsäure, eine Diaminomonocarbonsäure, eine aromatische Aminosäure oder eine heterocyclische Aminosäure ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man der wässrigen Lösung einen Inhibitor für das proteolytische Enzym zusetzt, welcher aus Hafer, Fava, Bohnen oder Kartoffeln extrahiert wurde.

(II) 2 3 R R •

1 1 A

-y R'NHCHC0NHCHC0R

20

(III)

wobei R' eine Acylgruppe bedeutet, wobei R2 eine Seitenket-tengruppe einer a-Aminosäure bedeutet, wobei R3 eine Sei-25 tenkettengruppe einer a-Aminosäure bedeutet und wobei R4 eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeutet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die tert.-Alkoxycarbonylgruppe t-Butyloxycarbonyl oder t-Amyloxycarbonyl ist und dass die

30 primäre Alkoxygruppe Methoxy oder Äthoxy ist und dass die tert.-Alkoxygruppe t-Butoxy ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass man als aliphatische Aminosäure Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin oder Norleucin ein-

35 setzt und als Oxyaminosäure Serin, Threonin oder Homoserin; als schwefelhaltige Aminosäure Methionin, Cystin oder Cy-stein; als Monoaminodicarbonsäure Asparaginsäure oder Glutaminsäure; als Diaminomonocarbonsäure Ornithin, Lysin, Arginin; als aromatische Aminocarbonsäure Phenylalanin oder 40 Tyrosin und als hetereocyclische Aminosäure Histidin oder Tryptophan einsetzt.