CH615223A5

CH615223A5 -

Info

Publication number: CH615223A5
Application number: CH400875A
Authority: CH
Inventors: Judith Margaret Kelly; John Laurence Meers
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1974-03-29
Filing date: 1975-03-27
Publication date: 1980-01-15
Also published as: GB1451273A; US4053361A; DE2513903A1; DK137175A; NL7503703A; IT1034712B; NZ177026A; AU7947675A; FR2265859B1; ZA751898B; JPS50132176A; FR2265859A1; CA1047425A; BE827348A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Glucose-Isomerase-Enzyms oder eines ein solches Enzym enthaltenden Präparates auf das nach dem Verfahren erhaltene Glucose-Isomerase-Enzym oder ein solches Enzym enthaltende Präparat und auf die Verwendung des erhaltenen Enzyms oder Enzympräparates für die Isomerisierung von Glucose zu Fructose.

In den letzten Jahren wurde ein beträchtlicher Forschungsaufwand betrieben, um Enzyme herzustellen, die zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose befähigt sind. Oft wurden als Quellen für geeignete Enzyme Mikroorganismen vom Genus Streptomyces vorgeschlagen. Die von Streptomyces-Stämmen erzeugten Enzyme zeigen oft beträchtliche Wirksamkeit für die Isomerisierung von Glucose zu Fructose, jedoch oft auch ein für ein in industriellen Verfahren einzusetzendes Enzym unerwünschtes Ausmass von Unstabilität.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, wobei ein zur Erzeugung des Enzyms oder Enzympräparates befähigter Mikroorganismus vom Genus Curtobacterium in einer entsprechende Nährstoffe enthaltenden Nährlösung gezüchtet wird.

Für die Ausführung des beschriebenen Verfahrens geeignete Mikroorganismen vom Genus Curtobacterium sind beispielsweise der Stamm NCIB 11072 (NRRL B-8069), der Stamm NCIB 11073 (NRRL B-8068) sowie Varianten und Mutationen davon. Beide Stämme wurden am 12. November 1973 unter den Nummern NCIB 11072 und 11073 in der «National Collection of Industriai Bacteria» hinterlegt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein nach dem beschriebenen Verfahren hergestelltes Glucose-Isomerase-Enzym oder ein solches Enzym enthaltendes Präparat, und ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung dieses Enzyms oder Enzympräparates für die Isomerisierung von Glucose zu Fructose.

Der Genus Curtobacterium umfasst Stämme, die bisher als zu den Genera Brevibacterium und Corynebacterium gehörig klassifiziert wurden.

Dieser Genus wurde durch K. Yamada und K. Komagata in J. Gen. Appi. Microbiol., 18,417-431 (1972), S. 424-425, definiert. Die allgemeinen Eigenschaften dieses Genus sind: Kleine kurze Stäbchen. In alten Kulturen werden Coccoidzellen gefunden. Schwach gram-positiv, wobei alte Zellen ihre gram-Positivität oft verlieren. Im allgemeinen beweglich. Bewegliche Species zeigen seitliche Flagellation. Die Zellen vermehren sich durch Zellteilung der Biegungsart. Metachromatische Körner können nicht festgestellt werden. Es zeigt sich geringfügiger Pleomorphismus. Als hauptsächliche Aminosäure in der Zellwand wird Ornithin gefunden. Die Verteilung des Guanin-Cytosin-Gehalts in der DNA beträgt 66-71%. Erzeugt aus verschiedenen Zuckerarten langsam und schwach Säure. Assimiliert verschiedene Arten von organischen Säuren in Addition zu Acetat, Pyruvat und Lactat. Gelatine wird langsam hydroly-siert. Chemoheterotroph. Lebensraum: Weitverbreitet in pflanzlichen Materialien, Erde usw.

Kulturen der neuen Curtobacteriumstämme GS/4 und LW/3 sind deponiert bei der «National Collection of Industriai Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, Grossbritannien» und beim «US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois, USA», und tragen die folgenden NCIB und NRRL Nummerbezeichnungen: GS/4 - NCIB 11072 - NRRL B-8069 LW/3 - NCIB 11073 - NRRL B-8068

Die mikrobiologischen Kennzeichen dieser Stämme, bestimmt mittels mikrobiologischer Standardprüfungen, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

3

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Tabelle 1

Kennzeichen

Stamm GS/4

Stamm LW/3

Beschreibung der Kolonie

(Oxoid-CM3-N ährstoff, Agar, 25 °C, 3 Tage)

Gramfleck

(Oxoid-CM3-N ährstoff, Agar, 25 °C, 3 Tage)

Motilität

Physiologie bei 25 °C anaerobes Wachstum Gelatinehydrolyse Platte (7 Tage)

Stich (Tage) Caseinhydrolyse (Milchplatte, 7 Tage) Stärkehydrolyse (Platte, 7 Tage)

Urease nach Christensen 7 Tage Citratverbrauch nach

N03'-N02'(KN02-Nährbrühe)

Oxidase nach Kovacs Katalase

Säureerzeugung im Pepton/Wasser/Zuk-ker: Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose, Fructose, Glycerin, Stärke, Mannit Eigelbplatten-Reaktion VP, MR und Indol NH3 aus

Trypton/Wasser Zellwand-Analyse

Herkunft

1 mm, rund, vollständig, konvex, glatt, leicht gelblich, durchscheinend, weich, leicht dispergierbar, gleichmässig mit der Ausnahme von mehreren Flecken von ungefähr 4 mm Durchmesser auf zusammenfassendem Bewuchs (Bakteriophag?)

leicht pleomorph, dürftig, stäbchenförmig, kurze Stäbchen, Kokkobazillen und Kokken, einige v, einzeln bis kleine Gruppen, gelegentlich lange gewundene Ketten von kurzen Zellen, üblicherweise gramnegativ, einige grampositiv, letztere üblicherweise als

Kokken oder Kokkobazillen

+

+24

schwach + - oder Spur

+

langsam +

"b

Ornithin, Galactose, Spuren von

Rhamnose

Erde.

0,5 mm, rund, vollständig, konvex, glatt, gelblich, durchscheinend, schwach zusammenhängend, <leicht dispergierbar, gleichmässig eher kleine Stäbchen und Kokkobazillen, einige v, oft in Gruppen, grampositiv und -negativ, einige Zellen grampositiv mit gramnegativen Schwänzen

+

+7

+

schwach +

+

Ornithin, Galactose,

Rhamnose

Holzabfälle

Andere für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbare Stämme sind beispielsweise die Glucose-Isomerase erzeugenden Stämme von Curtobacterium citreum, wie NCIB 10702, Curtobacterium pusillum, wie NCIB 10354, Curtobacterium luteum, wie NCIB 11029, Curtobacterium helvolum, wie NCIB 10352 und 10353, Curtobacterium alvedum, wie NCIB 11030.

Diese Arten wurden früher als zum Genus Brevibacterium gehörend klassifiziert. Deren Umklassifizierung zum Genus Curtobacterium wurde im Artikel von K. Yamada und K. Komagata, in J. Gen. Appln. Microbiol., 18,417-431 (1972), S. 425 abgehandelt.

Im erfindungsgemässen Verfahren wird der Glucose erzeugende Mikroorganismus vorzugsweise in einer Nährlösung 60 gezüchtet, die eine zweckentsprechende Kohlenstoffquelle und andere geeignete Nährstoffe enthält und die Bildung eines Enzyms ermöglicht. Beispielsweise wird auf einem schrägen Agarboden ein Impfstoff erzeugt, der einen Glucose-Isomerase erzeugenden Stamm enthält, der dann für die Impfung eines 65 entsprechenden Züchtungsmediums benutzt wird, in welchem das Wachstum des Organismus und die Erzeugung von Glu-cose-Isomerase ermöglicht wird. Die Inkubationsdauer kann in Abhängigkeit des jeweils verwendeten Mikroorganismus und

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des Zuchtmediums in weitem Bereich variieren und liegt vorzugsweise in einem Bereich von 4-48 h. Die ganze erhaltene Kultur oder ein Teil davon kann danach für die Impfung einer grösseren Menge der Nährlösung verwendet werden, und dies kann einmal oder mehrere Male wiederholt werden.

Die das Enzym enthaltenden Mikrobenzellen können aus dem schlussendlichen Zuchtmedium auf jede beliebige der bekannten Arten abgetrennt werden. Vorzugsweise werden für die Isomerisierung von Glucose zu Fructose die ganzen Zellen eingesetzt. Gewünschtenfalls kann jedoch das Enzym auf eine beliebige der bekannten Arten aus den Zellen extrahiert oder das schlussendliche Medium selbst, ohne Abtrennung der Zellen, für die Umsetzung von Glucose zu Fructose eingesetzt werden.

Die Nährlösung im erfindungsgemässen Verfahren enthält als Kohlenstoffquelle vorzugsweise ein Kohlenhydrat, wie Glucose und/oder Xylose, eine organische Säure oder ein Salz davon, beispielsweise ein Acetat, oder einen Alkohol, beispielsweise Äthanol. Sie kann auch komplexe organische Nährstoffe enthalten, wie eine vitaminreiche Brühe, die Hefeextrakt, Fleischextrakt und dergleichen enthält.

Die Stickstoffquelle ist zweckmässig Ammoniak, ein Nitrat, eine Aminosäure oder Harnstoff und die Phosphorquelle zweckmässig ein Phosphat. Weitere, vorzugsweise vorhandene Elemente sind beispielsweise Magnesium, Kalium, Schwefel, z. B. in Form von Kalium- und Magnesiumsulfat, sowie Spurenelemente, wie Eisen, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Calcium und dergleichen.

Die bevorzugten Mengenanteile der verschiedenen Nährstoffe in der Nährlösung zur Herstellung des Enzyms sind in gewissem Ausmass abhängig vom jeweils verwendeten Mikroorganismus und anderen Faktoren und können für jeden einzelnen Fall vom zuständigen Mikrobiologen leicht ermittelt werden.

Für die Herstellung von Glucose-Isomerase wird die Nährlösung vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 20-40 °C, insbesondere 28-32 °C, gehalten. Die optimale Züchtungstemperatur mit dem Stamm NCIB 11073 (NRRL B-8068) ist 30 °C. Vorzugsweise wird der pH-Wert der Nährlösung bei 4,5-8,0, insbesondere 6,5-7,0, gehalten.

Für die erfindungsgemässe Isomerisierung von Glucose zu Fructose variiert die zur Erzielung einer maximalen Ausbeute an Fructose benötigte Zeitdauer in Abhängigkeit von einer Anzahl Faktoren, wie Mengenanteil des eingesetzten Enzyms oder Enzympräparates, Art der Herstellung und Form des Enzyms, wie Pillen, extrudiert, Quelle der Glucose-Isomerase oder des Enzympräparates, Konzentration der Glucose, Temperatur, An- oder Abwesenheit von Enzym-Cofaktoren, wobei jedoch üblicherweise innert 1-36 h eine zweckentsprechende Ausbeute erzielt werden kann. Während der Isomerisierung wird die Temperatur vorzugsweise bei 20-90 °C, insbesondere 50-75 °C, gehalten. Der pH-Wert des Glucose enthaltenden Mediums wird während der Isomerisierung vorzugsweise im Bereich von 5-9, insbesondere 7-8,5 gehalten, nötigenfalls unter Einsatz eines zweckentsprechenden Puffersystems, wie einem Phosphatpuffer. Bei Ausführung des Verfahrens in grossem Massstab sollte jedoch Pufferung nach Möglichkeit vermieden werden. Es können zusätzliche Aktivierungsmittel, wie Magnesium-, Kobalt-, Manganionen, vorhanden sein. Die Enzymwirkung kann durch Einsatz eines Enzym-Cofaktors, wie in Form eines Kobaltsalzes, z. B. Kobaltchlorid, zugegebenen Kobaltionen, auf ein Maximum erhöht werden. Sehr zweckmässig kann das Enzym oder Enzympräparat immobilisiert und als Teil eines kontinuierlichen Säulenverfahrens eingesetzt werden.

Der Mengenanteil der Glucose im Medium kann bis zu 70 Gew.-%, vorzugsweise 20-50 Gew.-%, betragen und kann dem Medium in Form von Glucose oder eines andere Zuckerarten,

wie Maltose, Maltotriose Dextrine, enthaltenden Glucosesi-rups, zugesetzt werden.

Der Mengenanteil des Glucose-Isomerase-Enzyms oder -Enzympräparats im Medium beträgt vorzugsweise 4-20 Glu-cose-Isomerase-Einheiten (GIU) pro g der im Medium vorhandenen Glucose. Bei Erhöhung des Mengenanteils des Enzyms bis zu mehreren Tausend GIU pro g der vorhandenen Glucose steigt das Ausmass der Isomerisierungsreaktion an.

Die Wirksamkeit des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Glucose-Isomerase-Enzyms oder Enzympräparats in bezug auf die Erzeugung von Fructose kann nach der folgenden Prüfmethode ermittelt werden, wobei das nachstehende Reaktionsgemisch eingesetzt wird:

0,2 Mol Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,5 0,5 ml

2 Mol Glucose 0,5 ml

0,1 Mol MgS04- 7HzO 0,1 ml

0,2 Mol C0CI2 0,1ml

Enzymlösung 0,3 ml.

Die Lösung wird mit dest. Wasser auf 2 ml gestellt und bei 70 ÖC während 1 h inkubiert! Die Reaktion wird durch Zusatz von 4 ml 0,5 Mol Perchlorsäure abgebrochen und die Fructose nach der Cystein-Carbazol-Methode, beschrieben von Z. Dische und E. Barenfreund in J. Beai Chemi, 192,583 (1951), bestimmt.

Unter Standard-Prüfbedingungen wurden Aktivitätswerte von mindestens 64 Einheiten/ml Kultur beobachtet.

Der zur Erzeugung von 1 mg Fructose aus Glucose pro h bei 70 °C unter den vorstehenden Versuchsbedingungen benötigte Mengenanteil Enzym wird als eine Einheit des Enzyms bezeichnet.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Enzym oder Enzympräparat ist wirksam zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose und zeigt bei allen für die Isomerisierung zum Einsatz gelangenden Temperaturen eine befriedigende Stabilität.

Beispiel 1

Glucose-Isomerase wurde durch Züchtung der nachstehenden Mikroorganismen hergestellt:

Curtobacterium citreum - NCIB 10702 Curtobacterium helvolum, Stamm 9-8 - NCIB 10352 Curtobacterium, Stamm LW/3 - NCIB 11073 (NRRL B-8068) Curtobacterium, Stamm GS/4 - NCIB 11072 (NRRL B-8069) Curtobacterium helvolum, Stamm 129 - NCIB 10353 Curtobacterium pusillum, Stamm 100 - NCIB 10354 Curtobacterium luteum, Stamm 2Y12 - NCIB 11029.

Die Stammkulturen wurden auf schräg gestellten Agar-Nährböden bei 4 °C gehalten.

Mit jedem der genannten Mikroorganismen wurde ein vorher sterilisiertes Medium der nachstehenden Zusammensetzung geimpft:

Fleischextrakt 5 g/1

Hefeextrakt 2,5 g/1

Pepton 10 g/1

NaCl 5 g/1

MgSC>4 0,5 g/I

C0CI2 0,05 g/1

D-Xylose 10 g/1

Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Impfung auf 7,2 gestellt.

Bei jedem Versuch wurden die ganzen Zellen nach Inkubation bei ungefähr 30 °C in Luft auf einem Rotationsschüttler während 24 h für die Verwendung als Enzymquelle gewonnen.

Bei Prüfung der Aktivität der erhaltenen Enzyme nach der vorstehend beschriebenen Prüfmethode wurden nach 24 h pro ml die nachstehenden Resultate ermittelt:

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

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NCIB 10352

ca. 64 Einheiten

NCIB 11073

ca. 41 Einheiten

NCIB 11072

ca. 59 Einheiten

NCIB 10353

ca. 20 Einheiten

NCIB 10354

ca. 12 Einheiten s

NCIB 10702

ca. 12 Einheiten

NCIB 11029

ca. 5 Einheiten

Beispiel 2

Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Vorgehen durch Züchtung von Curtobacterium helvolum NCIB 10352 hergestelltes Zellmaterial wurde in einem 101 Ansatz-Fermentierer geimpft und bei 30 °C während 24 h gezüchtet. Dann wurde das Zellmaterial aus der Fermentiererlösung durch Zentrifugieren gewonnen, mit dest. Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. 15 Das das Enzym enthaltende, gefriergetrocknete Material wurde einem Medium der nachstehenden Zusammensetzung zugesetzt:

50 g Glucose

5 ml 0,1 Mol MgSQi* 7H2O

25 ml 0,2 Mol Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5

Das Gesamtvolumen wurde mit dest. Wasser auf 100 ml gestellt.

Das Gemisch wurde in einem Wasserbad von 65 °C unter Erhaltung des pH-Wertes bei 6,8-7,2 während 48 h inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde ausgefälltes Enzym durch Zentrifugation während 10 min bei 18 000 U/min entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde zur Entfernung von anorganischen Salzen und Protein mit einem Ionenaustauscherharz behandelt und danach im Vakuum verdampft. Es wurde ein durchsichtiger, süsser Sirup mit einem Gehalt von 58 Gew.-% Glucose und 42 Gew.-% Fructose erhalten.

G

Claims

615223 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Glucose-Isomerase-Enzyms oder eines ein solches Enzym enthaltenden Präparates, dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Erzeugung des Enzyms oder Enzympräparates befähigter Mikroorganismus vom Genus Curtobacterium in einer entsprechende Nährstoffe enthaltenden Nährlösung gezüchtet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vom Genus Curtobacterium der Stamm NCIB 11072 (NRRL B-8069) oder der Stamm NCIB 11073 (NRRL B-8068) oder eine Variante oder Mutation eines dieser Stämme verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Stamm von Curtobacterium citreum, Curtobacterium pusillum, Curtobacterium luteum, Curtobacterium helvolum oder Curtobacterium alvedum verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung als Kohlenstoff quelle ein Kohlenhydrat, vorzugsweise Glucose und/oder Xylose, eine organische Säure oder ein Salz davon, oder einen Alkohol enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung als Stickstoff quelle Ammoniak, ein Nitrat, eine Aminosäure oder Harnstoff enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung auf einer Temperatur von 20-40 °C und vorzugsweise auf einem pH-Wert von 4,5-8,0 gehalten wird.

7. Nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestelltes Glu-cose-Isomerase-Enzym oder ein solches Enzym enthaltendes Präparat.

8. Enzym oder Enzympräparat nach Anspruch 7, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 2.

9. Verwendung eines Enzyms oder Enzympräparates nach Anspruch 7 zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzympräparat eingesetzt wird, das ganze Zellen des Mikroorganismus enthält.

11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass während der Isomerisierung die Temperatur im Bereich von 20-90 °C und vorzugsweise der pH-Wert im Bereich von 5-9 gehalten wird.

12. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass im Medium, in welchem die Isomerisierung ausgeführt wird, der Mengenanteil der Glucose bis zu 70 Gew.-% und der Mengenanteil des Enzyms oder Enzympräparats 4-20 Glucose-Isomerase-Einheiten pro g der im Medium vorhandenen Glucose beträgt.