Procédé de préparation d'un antibiotique La présente invention concerne la préparation de l'antibiotique désigné ci-après par le No 11837 R.P.
Dans le brevet principal N 437640, on a décrit l'antibiotique 11837 R.P. et sa préparation par culture dans des milieux artificiels d'un micro-organisme dési gné par l'appellation Streptomyces viridans DS 9466 (N.R.R.L. 3087). L'abréviation N.R.R.L. désigne le Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill., U.S.A.
On a trouvé depuis, par examen chromatographique sur papier et sur couche mince, ainsi que par électro phorèse, suivies de révélation microbiologique, que le 11837 R.P. est en fait un mélange de plusieurs consti tuants ayant des propriétés biologiques et physicochimi- ques très voisines.
La présente invention concerne la préparation de l'antibiotique 11837 R.P. par culture dans des conditions aérobies de deux nouveaux micro-organismes, identifiés plus complètement ci-après. Ces deux nouveaux micro organismes, qui montrent des caractères très voisins l'un de l'autre, appartiennent au genre<I>Streptomyces</I> et, dans ce genre, appartiennent à l'espèce<I>Streptomyces</I> venezue- lae, dont ils constituent une variété à laquelle on a donné l'appellation<I>Streptomyces</I> venezuelae, <I>variété</I> fulvo- furvescens. On désignera respectivement ces deux micro organismes par les dénominations S.
venezuelae, var. fulvofurvescens DS 7103 (NRRL 3354) et S. vene- zuelae, var. fulvofurvescens DS 11355 (NRRL 3355).
Streptomyces venezuelae, var, fulvofurvescens DS 7103 a été isolé à partir d'un échantillon de terre pré levé en Algérie à Alger et Streptomyces venezuelae, var. fulvofurvescens DS 11355 a été isolé à partir d'un échantillon de terre prélevé en Angleterre dans la région de Gloucester.
Leur isolement a été réalisé en utilisant la méthode classique suivante - le prélèvement de terre est mis en suspension dans de l'eau distillée stérile, puis la suspension est diluée à différentes concentrations ; un petit volume de chaque dilution est étalé sur la surface de boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé.
Après une incubation de quelques jours à 260C, les colonies de micro-organismes que l'on veut isoler sont repiquées sur des géloses inclinées dans le but d'obtenir des cultures plus abondantes.
Les nouveaux micro-organismes producteurs de 11837 R.P. constituent donc une variété de l'espèce Streptomyces venezuelae à laquelle les rattachent leurs caractères essentiels.
L'ensemble des caractères suivants qu'ils présentent est en effet en accord avec ceux de l'espèce S. venezue- lae décrits, d'une part, dans The Actinomvcetes vol. 2 (S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore,<B>1961)</B> pages 280-281 et, d'autre part, dans le Bergey's Manual of Determinative Bac- teriology (7e édition - The Williams and Wilkins Com pany, Baltimore, 1957) pages 780-78l :
production de pigment mélanique noir sur milieu approprié à la tyro sine et production de pigment soluble brun noirâtre sur la plupart des milieux organiques, coloration jaune brun à brun foncé du mycélium aérien sporulé, organisation de l'appareil sporifère qui consiste en la production de sporophores très allongés, droits ou légèrement flexueux.
Ils diffèrent de l'espèce-type de<I>S.</I> venezcielae en ce qu'ils montrent quelques différences dans les sources de carbone qu'ils sont susceptibles d'utiliser pour assurer leur développement, ne donnent pas comme production antibiotique du chloramphénicol mais du 11837 R.P., et surtout produisent abondamment un pigment soluble sombre, de couleur brun orangé, qui devient rapide ment de plus en plus sombre pour aller jusqu'au noir, et pouvant colorer à la fois le mycélium végétatif et le milieu de culture.<I>S.</I> venezuelae produit un pigment assez semblable dans un certain nombre de cas,
mais en général le fait en quantité plus modérée et même manque à le faire dans un certain nombre de cas où le produisent les nouveaux micro-organismes (en particu lier sur certains milieux synthétiques). C'est pourquoi ces derniers ont été dénommés Streproinyces ver?ezuelae, <I>variété f</I> ul <I>vo f</I> urvescens.
Les caractères culturaux et les propriétés biochimi ques de<I>S.</I> venezuelae, <I>var.</I> fulvofurvescens <I>souche</I> DS <B><I>7103</I></B> ont été examinés sur un certain nombre de géloses nutritives et de bouillons nutritifs habituellement utilisés pour examiner l'aspect des souches de streptomyces. Les observations sont notées dans le tableau suivant ; sauf indications précisées, elles concernent des cultures de deux à quatre semaines à 260 C, arrivées à un bon stade de développement. Un certain nombre des mi lieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans The Actinomycetes , S.A.
Waksman, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A.,<B>1950;</B> dans ce cas, ils sont indiqués par la lettre W suivie du numéro qui leur a été attribué dans The Actinomycetes .
Les références ou compositions des autres milieux de culture sont les suivantes - Réf. A - K.L. Jones - Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949.
- Réf. B - Formule W. 23 additionnée de 2 % de gélose.
- Réf. C - Hickey and Tresner's Agar - T.G. Pridham et col. - Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950.
- Réf. D - Yeast Extract Agar - T.G. Prid- ham et col. - Antibiotics Annual, 1956 1957, p. 950.
- Réf. E - Tomato Paste Oatmeal Agar TG - Pridham et col. - Antibiotics Annual. 1956-1957, p. 950.
- Réf. F - The Actinomycetes, vol. 2, p. 333 - No 42 - S. A. Waksman - The Williams and Wilkins Company, Balti more, 1961.
- Réf. G - W.E. Grundy et col. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952.
- Réf. H - Inorganic Salts - Starch Agar - T.G. Pridham et col. - Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 951.
- Réf. 1 - correspond à la formule W 1, où<B>30g</B> de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose.
- Réf. J - correspond à la formule W<B>],</B> où 30g de saccharose sont remplacés par<B>15g</B> de glycérine.
- Réf. K - Plain gelatin - préparé suivant les in dications du Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria de la Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., II,;@-18.
- Réf. L - correspond à la formule W 18, où le saccharose est supprimé et remplacé par de petites bandes de papier filtre immer gées partiellement dans le liquide.
- Réf. M - H.D. Tresner et F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958.
- Réf. N - Lait écrémé en poudre commercial, re constitué selon les indications du fabri cant.
EMI0002.0091
EMI0003.0001
EMI0004.0001
<I>S.</I> venezuelae, <I>var.</I> fulvofurvescens, <I>souche</I> DS <I>l1355</I> présente des caractères semblables à ceux de<I>S.</I> venezctelae, <I>var.</I> fulvofurvescens, <I>souche</I> DS <I>7103</I> sur les milieux qui ont été cités dans le tableau ci-dessus.
La seule différence notable jusqu'ici constatée dans le comportement de ces deux souches réside dans leur capacité d'utilisation de certaines sources de carbone ou d'azote, la souche DS <I>I1355</I> n'utilisant pas l'ado- nitol qu'utilise la souche<I>DS7103</I> et, par contre,
utili sant la sarcosine que n'utilise pas la souche DS <B><I>7103.</I></B>
EMI0005.0012
Utilisation <SEP> par <SEP> les <SEP> souches <SEP> Utilisation <SEP> par <SEP> les <SEP> souches
<tb> Sources <SEP> de <SEP> carbone <SEP> essayées <SEP> DS <SEP> 7103 <SEP> DS <SEP> 11 <SEP> 355 <SEP> Sources <SEP> d'azote <SEP> essayées <SEP> DS <SEP> <B>7103</B> <SEP> DS <SEP> 11 <SEP> 355
<tb> d-ribose <SEP> - <SEP> + <SEP> N03Na
<tb> d-xylose <SEP> -- <SEP> No2Na <SEP> +
<tb> 1-arabinose <SEP> - <SEP> SO,(NH4)2
<tb> I-rhamnose <SEP> PO,H(NH4)z <SEP> +
<tb> d-glucose <SEP> - <SEP> -,
<SEP> adénine <SEP> d-galactose <SEP> -- <SEP> - <SEP> adénosine <SEP> d-fructose <SEP> - <SEP> uracile <SEP> - <SEP> d-mannose <SEP> - <SEP> + <SEP> urée
<tb> 1-sorbose <SEP> - <SEP> - <SEP> 1-asparagine <SEP> +
<tb> lactose <SEP> - <SEP> + <SEP> glycocolle <SEP> - maltose <SEP> - <SEP> -i- <SEP> sarcosine <SEP> - <SEP> -# saccharose <SEP> + <SEP> dl-alanine <SEP> tréhalose <SEP> - <SEP> - <SEP> dl-valine <SEP> cellobiose <SEP> - <SEP> + <SEP> acide <SEP> dl-aspartique <SEP> raffinose <SEP> + <SEP> acide <SEP> glutamique <SEP> dextrine <SEP> + <SEP> 1-arginine <SEP> inuline <SEP> - <SEP> - <SEP> 1-lysine <SEP> amidon <SEP> + <SEP> dl-thréonine <SEP> -.
<tb> glycogène <SEP> - <SEP> + <SEP> dl-méthionine <SEP> - <SEP> glycérol <SEP> + <SEP> taurine <SEP> - <SEP> érythritol <SEP> - <SEP> - <SEP> dl-phénylalanine <SEP> + <SEP> -i adonitol <SEP> +
<SEP> - <SEP> 1-tyrosine <SEP> dulcitol <SEP> - <SEP> - <SEP> dl-proline <SEP> + <SEP> -! d-mannitol <SEP> + <SEP> <U>-@</U> <SEP> 1-hydroxyproline <SEP> + <SEP> d-sorbitol <SEP> - <SEP> - <SEP> 1-histidine <SEP> +
<tb> inositol <SEP> -r <SEP> - <SEP> 1-tryptophane <SEP> -- Les conditions générales dans lesquelles s'effectue la culture de Streptomyces venezuelae, var. fulvofur- vescens DS 7103 et de Streptomyces venezuelae, var.
fulvofurvescens DS 11 355 pour la production de l'antibiotique 1 l 837 R.P., ainsi que les méthodes d'iso lement de cet antibiotique à partir des moûts de fermen tation, sont identiques à celles qui sont décrites dans le brevet principal pour la préparation du 11 837 R.P. à partir de Streptomyces viridans DS 9466 (N.R.R.L. 3087).
L'antibiotique 11 837 R.P. produit par les souches DS <B>7103</B> et DS 11 355 est un mélange dont la nature des constituants est identique à celle des constituants de l'antibiotique 11 837 R.P. produit par la souche DS 9466 ; seules les proportions relatives des constituants La capacité des deux souches à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer leur déve loppement a été déterminée suivant le principe de la méthode de Pridham et Gottlieb (J. of Bact. 56, 107 114, 1948) ;
le degré de développement a été observé sur le milieu de base indiqué par ces auteurs en rem plaçant soit le glucose par les diverses sources de car bone respectivement essayées, soit SO,(NHa).= par les diverses sources d'azote respectivement essayées. Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant les uns par rapport aux autres peuvent varier d'une sou che à l'autre, ou même pour une même souche, d'un lot de produit à l'autre.
La mise en évidence des constituants des mélanges peut être réalisée par les méthodes classiques d'analyse de mélanges d'antibiotiques, par exemple par chromato graphie sur papier et sur couche mince ainsi que par électrophorèse suivies de révélation microbiologique, par exemple par application sur plaques de gélose ense mencées.
Les spectres infrarouges des produits obtenus par culture des nouvelles souches, s'ils ne sont pas stricte ment identiques au spectre figurant dans le brevet prin cipal, présentent pratiquement les mêmes bandes d'ab sorption avec simplement quelques différences d'intensi- tés relatives résultant des proportions variables des constituants les uns par rapport aux autres.
Les exemples suivants montrent comment l'inven tion peut être mise en pratique. Dans ce qui suit, l'acti vité est partout déterminée par dosage biologique par la méthode de diffusion en utilisant Bacillus subtilis comme germe sensible et par rapport à un échantillon de 11 837 R.P. pur pris comme étalon.
Cette activité est exprimée en unités (u) par mg pour les produits solides et en unités par cm3 pour les solutions (l'unité est défi nie comme la plus petite quantité de produit qui, dis soute dans 1 cm@ d'un milieu de culture approprié, inhibe la croissance de Staphylococcus aureus 209 P dans des conditions déterminées).
Fxentple <I>l:</I> On charge dans un fermenteur de 170 litres - corn steep 4,800 kg - glucose hydraté 2,400 kg - chlorure de sodium 0,600 kg - sulfate de magnésium 0.120 kg - eau, complément pour 110 litres.
Après avoir ajusté le pH du mélange à 7,30 avec 535 cms de lessive de soude (d = 1,33). on ajoute en core - carbonate de calcium 0,600 kg Le milieu de culture à pH 7,30 est alors stérilisé par barbotage de vapeur à 1220 C pendant 40 minutes. Après refroidissement, le volume du bouillon est de 120 litres et le pH de 6,90. Le milieu est ensemencé par 200 ml d'une culture, en erlenmeyer agité, de la souche Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 7103. La culture est développée à 300 C pendant 28 heures en agitant et en aérant avec de l'air stérile ; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture produc trice.
La culture productrice est effectuée dans un fer menteur de 800 litres chargé avec les substances sui vantes - corn steep 20 kg - amidon 7,500 kg - huile de soja<B>7,500</B> litres - phosphate monopotassique 1 kg - sulfate de magnésium 1 kg - chlorure de cobalt hydraté 0,010 kg - eau, complément pour 460 litres Après avoir ajusté le pH du mélange à 7,15 avec 2800m] de soude concentrée (d =<B>1,33).</B> on ajoute en core - carbonate de calcium 5 kg Le milieu de culture à pH 7,35 est stérilisé par bar botage de vapeur à 122 C pendant 40 minutes. Après refroidissement. le volume est de 490 litres et le pH de 7,05.
On ensemence alors avec 50 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est effectuée à 30,1 C pendant 96 heures en agitant à l'aide d'une turbine tournant à 285 t/mn et en aérant avec un débit d'air stérile de 25 m3/h. Le pH du milieu est alors de 8,55 et le volume du moût de 420 litres.
La quantité d'antibiotique présente est de 1820 u/cmq. Les 420 litres de moût de culture de Streptomvces venezuelae, var. fulvofurvescens DS 7103, préparé ainsi qu'il a été décrit ci-dessus, sont ajustés à pH 4 à l'aide d'acide phosphorique dans une cuve agitée. .Après une demi-heure d'agitation, 20 kg de Clarcel DIC sont ajou tés au moût et la suspension est envoyée sur filtre presse. Après filtration, le gâteau mycélien est lavé sur filtre par 200 litres d'eau. Le filtrat et le lavage réunis (volume total 550 litres) sont rejetés.
Le gâteau humide, dont le poids est de 113 kg, est mis en suspension dans un mélange de 250 litres de méthanol et 50 litres d'eau dans une cuve sous agitation. Le pH de la suspension est ajusté à 7 par de la soude (d = 1,33) et l'agitation est maintenue une heure. Après ce temps. la suspension est envoyée sur filtre presse et le gâteau est lavé par 50 litres de méthanol contenant 30% d'eau.
Le mycélium épuisé, dont le poids est de 96 kg, est rejeté. L'extrait méthylique du mycélium (volume total 360 litres) est concentré sous pression réduite' (40 mm de mercure) dans un appareil à recyclage continu, jus qu'à un volume de 6 litres. Le concentré est alors pré cipité, par un mélange de 30 litres d'éthanol et 40 litres d'acétone.
Le précipité est essoré, lavé et séché en étuve sous vide et on obtient ainsi 780g d'un produit dont le titre est de 515 u/mg.
<I>Purification</I> Les 780g de l'antibiotique obtenu ci-dessus et ti trant 515 u/mg sont dissous dans 10 litres d'eau dis tillée.
La solution est filtrée sur un lit de silice fossile puis passée sur une colonne (diamètre intérieur = 9 cm) contenant 6 litres de résine Dowex 1 X 2 en cycle chlore. La colonne est lavée successivement par : - eau distillée, jusqu'à ce que l'effluent soit incolore 6 litres - mélange acide formique-eau (l0-90 en volumes) 20 litres - mélange acide formique-eau-métha- nol (10-10-80 en volumes) 20 litres - mélange méthanol-eau (80-20 en vol.) 20 litres L'antibiotique est alors élue' par le mélange métha- nol-eau (80-20 en volumes) additionné de 10 e/1 de chlo rure de potassium.
On recueille des fractions de 10 litres : les fractions les plus actives (2 à 6) sont regroupées et concentrées sous pression réduite à température inférieure à 401, C jusqu'à obtenir un volume final de 3 litres.
Le concentrat est dialysé 48 heures contre 40 litres d'eau distillée renouvelée trois fois par l'intermédiaire d'une membrane de cellophane, pour éliminer les sels et diverses impuretés, puis lyophilisé.
On obtient ainsi 27 g d'antibiotique purifié, sous forme de sel de potassium, titrant 12 300 u/me et ayant les caractères physicochimiques suivants - Aspect : poudre amorphe beige rosé facilement solu ble dans l'eau.
- Spectre ultraviolet : détermination à partir d'une so lution à 50 mg/l dans l'eau : un maximum d'ab sorption à 255 nm (E1 '/m = l06,5). - Sa composition élémentaire est voisine de la sui vante C o/o = 46,9 H o/o = 6,65 O 0/'o = 36,9 (par différence) N o/o = 4,5 P o;0 = 2,1 K /o = 2,95. <I>Exemple 2</I> On prépare dans un fermenteur de 170 litres le mi lieu de culture inoculum comme il est dit dans l'exem ple 1.
Le milieu, dont le pH après stérilisation est de 7,0, est ensemencé par 200 ml d'une culture en erlen- meyer agité de la souche Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 11 355. La culture est développée pendant 30 heures dans les conditions d'agitation, d'aé ration et de température décrites à l'exemple 1.
La culture productrice est effectuée dans un fer menteur de 800 litres chargé avec 500 litres du milieu décrit à l'exemple 1. Ce milieu, dont le pH après stéri lisation est de 6,90, est ensemencé avec 50 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. Après 99 heures de culture dans les condi tions d'agitation, d'aération et de température em ployées pour la culture de l'exemple 1, le pH du milieu est de 8,45 et le volume du moût de 495 litres. La quantité d'antibiotique présente est de 1520 u/ml.
Les 495 litres de moût de culture de Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 11 355 sont traités ainsi qu'il a été décrit dans l'exemple 1.
On obtient 480 g d'antibiotique brut titrant 1000u/mg. 470 g de l'antibiotique brut préparé ainsi qu'il a été décrit ci-dessus et titrant 1000 u/mg sont traités comme à l'exemple 1.
On obtient alors 14,6 g d'antibiotique purifié sous forme de sel de potassium, titrant 19 400 u/mg et ayant les caractères physicochimiques suivants - Aspect : poudre amorphe blanchàtre facilement solu ble dans l'eau.
- Spectre ultraviolet : détermination à partir d'une so lution à 50 mg/1 dans l'eau : un maximum d'ab sorption à 256 nm (EÎ \ni )= 120).
- Sa composition élémentaire est la suivante C /o = 46,4 H o/o = 6,35 N % = 4,1 P o/o = 2,3 K % = 6,
9 <B>0</B> 11/o = 33,95 (par différence).