CH485018A - Procédé de préparation d'un antibiotique - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    d'un     antibiotique       La présente invention     concerne    la préparation de  l'antibiotique désigné ci-après par le No 11837     R.P.     



  Dans le brevet principal     N     437640, on a décrit  l'antibiotique 11837     R.P.    et sa préparation par culture  dans des milieux artificiels d'un micro-organisme dési  gné par l'appellation   Streptomyces     viridans        DS    9466         (N.R.R.L.    3087). L'abréviation     N.R.R.L.    désigne le       Northern        Regional    Research     Laboratory,        Peoria,    Ill.,  U.S.A.  



  On a trouvé depuis, par examen     chromatographique     sur papier et sur couche mince, ainsi que par électro  phorèse, suivies de révélation     microbiologique,    que le  11837     R.P.    est en fait un mélange de plusieurs consti  tuants ayant des propriétés biologiques et     physicochimi-          ques    très voisines.  



  La présente invention concerne la préparation de  l'antibiotique 11837     R.P.    par culture dans des conditions  aérobies de deux nouveaux micro-organismes, identifiés  plus complètement ci-après. Ces deux nouveaux micro  organismes, qui montrent des caractères très voisins l'un  de l'autre, appartiennent au genre<I>Streptomyces</I> et, dans  ce genre,     appartiennent    à l'espèce<I>Streptomyces</I>     venezue-          lae,    dont ils constituent une variété à laquelle on a donné  l'appellation<I>Streptomyces</I>     venezuelae,   <I>variété</I>     fulvo-          furvescens.    On désignera respectivement ces deux micro  organismes par les dénominations   S.

       venezuelae,    var.       fulvofurvescens        DS    7103       (NRRL    3354) et   S.     vene-          zuelae,    var.     fulvofurvescens        DS    11355       (NRRL    3355).  



    Streptomyces     venezuelae,    var,     fulvofurvescens        DS     7103   a été isolé à partir d'un échantillon de terre pré  levé en Algérie à Alger et   Streptomyces     venezuelae,     var.     fulvofurvescens        DS    11355   a été isolé à partir d'un  échantillon de terre prélevé en Angleterre dans la région  de Gloucester.  



  Leur isolement a été réalisé en utilisant la méthode  classique suivante    - le prélèvement de terre     est    mis en suspension dans  de l'eau distillée stérile, puis la suspension est diluée  à différentes concentrations ; un petit volume de  chaque dilution est étalé sur la surface de boîtes de  Pétri contenant un milieu nutritif     gélosé.     



  Après une incubation de quelques jours à     260C,    les  colonies de micro-organismes que l'on veut isoler sont  repiquées sur des géloses inclinées dans le but d'obtenir  des cultures plus abondantes.  



  Les nouveaux micro-organismes producteurs de  11837     R.P.    constituent donc une variété de l'espèce  Streptomyces     venezuelae    à laquelle     les    rattachent leurs  caractères essentiels.  



  L'ensemble des caractères suivants qu'ils présentent  est en effet en accord avec ceux de l'espèce S.     venezue-          lae    décrits, d'une part, dans   The     Actinomvcetes       vol. 2 (S.A. Waksman, The Williams and Wilkins  Company, Baltimore,<B>1961)</B> pages 280-281 et, d'autre  part, dans le       Bergey's        Manual    of     Determinative        Bac-          teriology      (7e édition - The Williams and Wilkins Com  pany, Baltimore, 1957) pages 780-78l :

   production de  pigment mélanique noir sur milieu approprié à la tyro  sine et production de pigment soluble brun noirâtre sur  la plupart des milieux organiques, coloration jaune brun  à brun foncé du mycélium aérien sporulé, organisation  de l'appareil sporifère qui consiste en la production de       sporophores    très allongés, droits ou légèrement flexueux.  



  Ils diffèrent de l'espèce-type de<I>S.</I>     venezcielae    en ce  qu'ils montrent quelques différences dans les sources  de carbone qu'ils sont susceptibles d'utiliser pour assurer  leur développement, ne donnent pas comme production  antibiotique du     chloramphénicol    mais du 11837     R.P.,     et     surtout    produisent abondamment un pigment soluble  sombre, de couleur brun orangé, qui devient rapide  ment de plus en plus sombre pour aller jusqu'au noir,  et pouvant colorer à la fois le mycélium végétatif et le  milieu de culture.<I>S.</I>     venezuelae    produit un pigment      assez semblable dans un certain nombre de cas,

       mais     en général le fait en quantité plus modérée et même  manque à le faire dans un certain nombre de cas où le  produisent les nouveaux micro-organismes (en particu  lier sur certains milieux synthétiques). C'est pourquoi  ces derniers ont été dénommés     Streproinyces        ver?ezuelae,     <I>variété f</I>     ul   <I>vo f</I>     urvescens.     



  Les caractères culturaux et les propriétés biochimi  ques de<I>S.</I>     venezuelae,   <I>var.</I>     fulvofurvescens   <I>souche</I>     DS     <B><I>7103</I></B> ont été examinés sur un certain nombre de géloses  nutritives et de bouillons nutritifs habituellement utilisés  pour examiner l'aspect des souches de     streptomyces.     Les observations sont notées dans le tableau suivant ;  sauf indications précisées, elles concernent des cultures  de deux à quatre semaines à 260 C, arrivées à un bon  stade de développement. Un certain nombre des mi  lieux de culture employés ont été préparés d'après les  formules indiquées dans   The     Actinomycetes     , S.A.

    Waksman, p. 193-197,     Chronica        Botanica        Company,          Waltham,    Mass., U.S.A.,<B>1950;</B> dans ce cas, ils sont  indiqués par la lettre W suivie du numéro qui leur a été  attribué dans   The     Actinomycetes     .  



  Les références ou compositions des autres milieux de  culture sont les suivantes  -     Réf.    A -     K.L.    Jones - Journal of     Bacteriology,     57, 142, 1949.  



  -     Réf.        B    -     Formule        W.        23        additionnée        de    2     %        de     gélose.  



  -     Réf.    C -       Hickey    and     Tresner's        Agar      -     T.G.          Pridham    et col. -     Antibiotics        Annual,     1956-1957, p. 950.  



  -     Réf.    D -       Yeast        Extract    Agar   -     T.G.        Prid-          ham    et col. -     Antibiotics        Annual,    1956  1957, p. 950.  



  -     Réf.    E -       Tomato        Paste        Oatmeal    Agar   TG     -          Pridham    et col. -     Antibiotics        Annual.     1956-1957, p. 950.  



  -     Réf.    F - The     Actinomycetes,    vol. 2, p. 333     -          No    42 - S. A. Waksman - The  Williams and Wilkins Company, Balti  more, 1961.  



  -     Réf.    G -     W.E.        Grundy    et col. -     Antibiotics    and       Chem.    2, 401, 1952.  



  -     Réf.    H -       Inorganic        Salts    -     Starch        Agar          -          T.G.        Pridham    et col. -     Antibiotics          Annual,    1956-1957, p. 951.  



  -     Réf.    1 - correspond à la formule W 1, où<B>30g</B>  de saccharose sont remplacés par 15 g  de glucose.  



  -     Réf.    J - correspond à la formule W<B>],</B> où 30g  de saccharose sont remplacés par<B>15g</B>  de glycérine.  



  -     Réf.    K -  Plain     gelatin    - préparé suivant les in  dications du       Manual    of     Methods    for  Pure Culture     Study    of     Bacteria      de la  Society of     American        Bacteriologists,          Geneva,        N.Y.,        II,;@-18.     



  -     Réf.    L - correspond à la formule W 18, où le  saccharose est supprimé et remplacé par  de petites bandes de papier filtre immer  gées partiellement dans le liquide.  



  -     Réf.    M -     H.D.        Tresner    et F.     Danga    - Journal of       Bacteriology,    76, 239-244, 1958.  



  -     Réf.    N - Lait écrémé en poudre commercial, re  constitué selon les indications du fabri  cant.  
EMI0002.0091     
    
EMI0003.0001     
    
EMI0004.0001     
      <I>S.</I>     venezuelae,   <I>var.</I>     fulvofurvescens,   <I>souche</I>     DS     <I>l1355</I> présente des caractères semblables à ceux de<I>S.</I>       venezctelae,   <I>var.</I>     fulvofurvescens,   <I>souche</I>     DS   <I>7103</I> sur  les milieux qui ont été cités dans le tableau ci-dessus.

    La seule différence notable jusqu'ici constatée dans le  comportement de ces deux souches réside dans leur  capacité d'utilisation de certaines sources de carbone  ou d'azote, la souche     DS   <I>I1355</I> n'utilisant pas     l'ado-          nitol    qu'utilise la souche<I>DS7103</I> et, par contre,

   utili  sant la     sarcosine    que n'utilise pas la souche     DS   <B><I>7103.</I></B>  
EMI0005.0012     
  
    Utilisation <SEP> par <SEP> les <SEP> souches <SEP> Utilisation <SEP> par <SEP> les <SEP> souches
<tb>  Sources <SEP> de <SEP> carbone <SEP> essayées <SEP> DS <SEP> 7103 <SEP> DS <SEP> 11 <SEP> 355 <SEP> Sources <SEP> d'azote <SEP> essayées <SEP> DS <SEP> <B>7103</B> <SEP> DS <SEP> 11 <SEP> 355
<tb>  d-ribose <SEP> - <SEP> + <SEP> N03Na
<tb>  d-xylose <SEP> -- <SEP> No2Na <SEP> +
<tb>  1-arabinose <SEP> - <SEP> SO,(NH4)2
<tb>  I-rhamnose <SEP> PO,H(NH4)z <SEP> +
<tb>  d-glucose <SEP> - <SEP> -,

   <SEP> adénine <SEP>   d-galactose <SEP> -- <SEP> - <SEP> adénosine <SEP>   d-fructose <SEP> - <SEP> uracile <SEP> - <SEP>   d-mannose <SEP> - <SEP> + <SEP> urée
<tb>  1-sorbose <SEP> - <SEP> - <SEP> 1-asparagine <SEP> +
<tb>  lactose <SEP> - <SEP> + <SEP> glycocolle <SEP> -  maltose <SEP> - <SEP> -i- <SEP> sarcosine <SEP> - <SEP> -#  saccharose <SEP> + <SEP> dl-alanine <SEP>   tréhalose <SEP> - <SEP> - <SEP> dl-valine <SEP>   cellobiose <SEP> - <SEP> + <SEP> acide <SEP> dl-aspartique <SEP>   raffinose <SEP> + <SEP> acide <SEP> glutamique <SEP>   dextrine <SEP> + <SEP> 1-arginine <SEP>   inuline <SEP> - <SEP> - <SEP> 1-lysine <SEP>   amidon <SEP> + <SEP> dl-thréonine <SEP> -.
<tb>  glycogène <SEP> - <SEP> + <SEP> dl-méthionine <SEP> - <SEP>   glycérol <SEP> + <SEP> taurine <SEP> - <SEP>   érythritol <SEP> - <SEP> - <SEP> dl-phénylalanine <SEP> + <SEP> -i  adonitol <SEP> + 

  <SEP> - <SEP> 1-tyrosine <SEP>   dulcitol <SEP> - <SEP> - <SEP> dl-proline <SEP> + <SEP> -!  d-mannitol <SEP> + <SEP> <U>-@</U> <SEP> 1-hydroxyproline <SEP> + <SEP>   d-sorbitol <SEP> - <SEP> - <SEP> 1-histidine <SEP> +
<tb>  inositol <SEP> -r <SEP> - <SEP> 1-tryptophane <SEP> --       Les conditions générales dans lesquelles s'effectue  la culture de       Streptomyces        venezuelae,    var.     fulvofur-          vescens        DS    7103   et de   Streptomyces     venezuelae,    var.

         fulvofurvescens        DS    11 355   pour la production de  l'antibiotique 1 l 837     R.P.,    ainsi que les méthodes d'iso  lement de cet antibiotique à partir des moûts de fermen  tation, sont identiques à celles qui sont décrites dans le  brevet principal pour la préparation du 11 837     R.P.    à  partir de   Streptomyces     viridans        DS    9466       (N.R.R.L.     3087).  



  L'antibiotique 11 837     R.P.    produit par les souches       DS   <B>7103</B> et     DS    11 355 est un mélange dont la nature des  constituants est identique à celle des constituants de  l'antibiotique 11 837     R.P.    produit par la souche     DS     9466 ; seules les proportions relatives des constituants    La capacité des deux souches à utiliser diverses  sources de carbone et d'azote pour assurer leur déve  loppement a été déterminée suivant le principe de la  méthode de     Pridham    et     Gottlieb    (J. of     Bact.    56, 107  114, 1948) ;

   le degré de développement a été observé  sur le milieu de base indiqué par ces auteurs en rem  plaçant soit le glucose par les diverses sources de car  bone respectivement essayées, soit     SO,(NHa).=    par les  diverses sources d'azote respectivement essayées. Les  résultats sont indiqués dans le tableau suivant    les uns par rapport aux autres peuvent varier d'une sou  che à l'autre, ou même pour une même souche, d'un lot  de produit à l'autre.  



  La mise en évidence des constituants des mélanges  peut être réalisée par les méthodes classiques d'analyse  de mélanges d'antibiotiques, par exemple par chromato  graphie sur papier et sur couche mince ainsi que par  électrophorèse suivies de révélation     microbiologique,     par     exemple    par application sur plaques de gélose ense  mencées.  



  Les spectres infrarouges des produits obtenus par  culture des nouvelles souches, s'ils ne sont pas stricte  ment identiques au spectre figurant dans le brevet prin  cipal, présentent pratiquement les mêmes bandes d'ab  sorption avec simplement quelques différences d'intensi-      tés relatives résultant des proportions variables des  constituants les uns par rapport aux autres.  



  Les exemples suivants montrent comment l'inven  tion peut être mise en pratique. Dans ce qui suit, l'acti  vité est partout déterminée par dosage biologique par  la méthode de diffusion en utilisant     Bacillus        subtilis     comme germe sensible et par rapport à un échantillon  de 11 837     R.P.    pur pris comme étalon.

   Cette activité est  exprimée en unités (u) par mg pour les produits solides  et en unités par     cm3    pour les solutions (l'unité est défi  nie comme la plus petite quantité de produit qui, dis  soute dans 1     cm@    d'un milieu de culture approprié,  inhibe la croissance de     Staphylococcus        aureus    209 P  dans des conditions déterminées).  



       Fxentple   <I>l:</I>  On charge dans un fermenteur de 170 litres  - corn     steep    4,800 kg  - glucose hydraté 2,400 kg  - chlorure de sodium 0,600 kg  - sulfate de magnésium 0.120 kg  - eau, complément pour 110 litres.  



  Après avoir ajusté le pH du mélange à 7,30 avec  535     cms    de lessive de soude (d = 1,33). on ajoute en  core  - carbonate de calcium 0,600 kg  Le milieu de culture à pH 7,30 est alors stérilisé par  barbotage de vapeur à 1220 C pendant 40 minutes.  Après refroidissement, le volume du bouillon est de  120 litres et le pH de 6,90. Le milieu est ensemencé par  200 ml d'une culture, en     erlenmeyer    agité, de la souche  Streptomyces     venezuelae    var.     fulvofurvescens        DS    7103.  La culture est développée à 300 C pendant 28 heures en  agitant et en aérant avec de l'air stérile ; elle est alors  convenable pour l'ensemencement de la culture produc  trice.  



  La culture productrice est effectuée dans un fer  menteur de 800 litres chargé avec les substances sui  vantes  - corn     steep    20 kg  - amidon 7,500 kg  - huile de soja<B>7,500</B> litres  - phosphate     monopotassique    1 kg  - sulfate de magnésium 1 kg  - chlorure de cobalt hydraté 0,010 kg  - eau, complément pour 460 litres  Après avoir ajusté le pH du mélange à 7,15 avec       2800m]    de soude concentrée (d =<B>1,33).</B> on ajoute en  core  - carbonate de calcium 5 kg  Le     milieu    de culture à pH 7,35 est stérilisé par bar  botage de vapeur à     122     C pendant 40 minutes. Après  refroidissement. le volume est de 490 litres et le pH de  7,05.

   On ensemence     alors    avec 50 litres de la culture       inoculum    en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus.  La culture est effectuée à     30,1    C pendant 96 heures en  agitant à l'aide d'une turbine tournant à 285     t/mn    et  en aérant avec un débit d'air stérile de 25     m3/h.    Le pH  du milieu est alors de 8,55 et le volume du moût de 420  litres.

   La quantité d'antibiotique présente est de  1820     u/cmq.       Les 420 litres de moût de culture de     Streptomvces          venezuelae,    var.     fulvofurvescens        DS    7103, préparé ainsi  qu'il a été décrit ci-dessus, sont ajustés à pH 4 à l'aide  d'acide phosphorique dans une cuve agitée. .Après une  demi-heure d'agitation, 20 kg de     Clarcel        DIC    sont ajou  tés au moût et la suspension est envoyée sur filtre  presse. Après filtration, le gâteau     mycélien    est lavé sur       filtre    par 200 litres d'eau. Le filtrat et le lavage réunis  (volume total 550 litres) sont rejetés.

   Le gâteau humide,  dont le poids est de 113 kg, est mis en suspension dans  un mélange de 250 litres de méthanol et 50 litres d'eau  dans une cuve sous agitation. Le pH de la suspension  est ajusté à 7 par de la soude (d = 1,33) et l'agitation  est maintenue une heure. Après ce temps. la     suspension     est envoyée sur filtre presse et le gâteau est lavé par       50        litres        de        méthanol        contenant        30%        d'eau.     



  Le mycélium épuisé, dont le poids est de 96 kg, est  rejeté. L'extrait méthylique du mycélium (volume total  360 litres) est concentré sous pression     réduite'    (40 mm  de mercure) dans un appareil à recyclage continu, jus  qu'à un volume de 6 litres. Le concentré est alors pré  cipité, par un mélange de 30 litres d'éthanol et 40 litres  d'acétone.  



  Le précipité est essoré, lavé et séché en étuve sous  vide et on obtient ainsi 780g d'un produit dont le titre  est de 515     u/mg.     



  <I>Purification</I>  Les 780g de l'antibiotique obtenu ci-dessus et ti  trant 515     u/mg    sont dissous dans 10 litres d'eau dis  tillée.  



  La solution est filtrée sur un lit de silice fossile puis  passée sur une colonne (diamètre intérieur = 9 cm)  contenant 6 litres de résine     Dowex    1 X 2 en cycle  chlore. La colonne est lavée successivement par :   - eau distillée, jusqu'à ce que l'effluent  soit incolore 6 litres  - mélange acide formique-eau (l0-90  en volumes) 20 litres  - mélange acide     formique-eau-métha-          nol    (10-10-80 en volumes) 20 litres  - mélange méthanol-eau (80-20 en vol.) 20 litres  L'antibiotique est alors élue' par le mélange     métha-          nol-eau    (80-20 en volumes) additionné de 10     e/1    de chlo  rure de potassium.  



  On recueille des fractions de 10 litres : les fractions  les plus actives (2 à 6) sont regroupées et concentrées  sous pression réduite à température inférieure à     401,    C  jusqu'à obtenir un volume final de 3 litres.  



  Le     concentrat    est dialysé 48 heures contre 40 litres  d'eau distillée renouvelée trois fois par l'intermédiaire  d'une membrane de cellophane, pour éliminer les sels et  diverses impuretés, puis lyophilisé.  



  On obtient ainsi 27 g d'antibiotique purifié, sous  forme de sel de potassium, titrant 12 300     u/me    et ayant  les caractères     physicochimiques    suivants  - Aspect : poudre amorphe beige rosé facilement solu  ble dans l'eau.  



  - Spectre ultraviolet : détermination à partir d'une so  lution à 50     mg/l    dans l'eau : un maximum d'ab  sorption à 255     nm    (E1     '/m    = l06,5).      - Sa composition élémentaire est voisine de la sui  vante  C     o/o    = 46,9 H     o/o    = 6,65 O     0/'o    = 36,9  (par différence)  N     o/o    = 4,5 P o;0 = 2,1 K      /o    = 2,95.  <I>Exemple 2</I>  On prépare dans un fermenteur de 170 litres le mi  lieu de culture     inoculum        comme    il est dit dans l'exem  ple 1.

   Le milieu, dont le pH après     stérilisation    est de  7,0, est ensemencé par 200 ml d'une culture en     erlen-          meyer    agité de la souche Streptomyces     venezuelae    var.       fulvofurvescens        DS    11 355. La culture est développée  pendant 30 heures dans les conditions d'agitation, d'aé  ration et de température décrites à l'exemple 1.  



  La culture productrice est effectuée dans un fer  menteur de 800 litres chargé avec 500 litres du milieu  décrit à l'exemple 1. Ce milieu, dont le pH après stéri  lisation est de 6,90, est ensemencé avec 50 litres de la  culture     inoculum    en fermenteur de 170 litres décrite  ci-dessus. Après 99 heures de culture dans les condi  tions d'agitation, d'aération et de température em  ployées pour la culture de l'exemple 1, le pH du milieu  est de 8,45 et le volume du moût de 495 litres. La  quantité d'antibiotique présente est de 1520     u/ml.     



  Les 495 litres de moût de culture de Streptomyces       venezuelae    var.     fulvofurvescens        DS    11 355 sont traités  ainsi qu'il a été décrit dans l'exemple 1.  



  On obtient 480 g d'antibiotique brut titrant     1000u/mg.       470 g de l'antibiotique brut préparé ainsi qu'il a été  décrit ci-dessus et titrant 1000     u/mg    sont traités comme  à l'exemple 1.  



  On obtient alors 14,6 g d'antibiotique purifié sous  forme de sel de potassium, titrant 19 400     u/mg    et ayant  les caractères     physicochimiques    suivants  - Aspect : poudre amorphe     blanchàtre    facilement solu  ble dans l'eau.  



  - Spectre ultraviolet : détermination à partir d'une so  lution à 50     mg/1    dans l'eau : un maximum d'ab  sorption à 256     nm        (EÎ         \ni        )=    120).  



  - Sa composition élémentaire est la suivante       C         /o        =        46,4        H        o/o        =        6,35        N        %        =        4,1          P        o/o        =        2,3        K        %        =        6,

  9   <B>0</B>     11/o        =        33,95     (par différence).

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé pour la préparation d'un antibiotique, ca ractérisé en ce qu'on cultive les nouvelles souches Streptomyces venezuelae, var. fulvofurvescens DS 7103 (NRRL 3354) ou Streptomyces venezuelae, var. fulvo- furvescens DS 11 355 (NRRL 3355), sur un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de substances inorganiques et dans des con ditions aérobies, puis en ce que l'on sépare l'antibioti que formé.