CH455336A - Verfahren zum Nachweis von immunologischem Material in Flüssigkeiten - Google Patents

Description

  Verfahren zum Nachweis von immunologischem Material in Flüssigkeiten    Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nach  weis von immunologischem Material in Flüssigkeiten.  Insbesondere     betrifft    die Erfindung den Nachweis von       Antikörpern,    die infolge der     Antigenbildung    im Ver  laufe     gewisser    pathologischer Zustände erzeugt wurden.  



  Das     erfindungsgemässe    Verfahren ist dadurch ge  kennzeichnet, dass man eine Flüssigkeit, in welcher man  immunologisches Material vermutet, mit     einem    ange  färbten     immunologischen    Material, das zu dem nach  zuweisenden immunologischen Material homolog ist,  zusammenbringt und die Entstehung eines gefärbten  Niederschlages beobachtet.  



  Bei den meisten Viren-, Bakterien-, Pilz- und       Autoimmunerkrankungen    verhält sich der Erreger im  allgemeinen wie ein Fremdkörper und stimuliert die  Erzeugung von Substanzen, die die Wirkung solcher  Fremdkörper in dem Wirtsorganismus neutralisieren  sollen. Der Fremdkörper kann als Antigen bezeichnet  werden. Das Antigen verursacht die     Erzeugung    homo  loger Antikörper. Die Menge Antikörper, die infolge  der Stimulierung durch das Antigen erzeugt wird und  durch den     Wirtsorganismus    in verschiedenen Körper  flüssigkeiten, z. B. Serum, zirkuliert, ist bei jeder Er  krankung oder jedem pathologischen Zustand     und    in  Abhängigkeit von der Dauer der Erkrankung oder des  Zustandes verschieden.

   Das Auftreten von     Antikörpern     in verschiedenen Körperflüssigkeiten ist ein positiver  Hinweis auf die Anwesenheit eines homologen Antigens.  Der Antikörper reagiert in der Regel spezifisch     mit     einem homologen Antigen in dem Wirtsorganismus und  neutralisiert so die Wirkung des Antigens. Am häufig  sten treten Antikörper in der     y-Globulinfraktion    des  Serums auf, jedoch können sie auch in verschiedenen  anderen Körperflüssigkeiten, wie anderen     Serumsfrak-          tionen,    Urin, Speichel u. ä. auftreten.     Antikörper    reagie  ren mit homologen Antigenen nicht nur in     vivo    sondern  auch in     vitro.     



  Zum Nachweis von Antikörpern wurden schon ver  schiedene immunologische Tests entwickelt, z. B. wur  den     Hämagglutinations-,        Complementfixierungs-    und         Geldiffusionstets    zum Nachweis verschiedener Anti  körper angewendet. Jeder der bekannten Tests ist je  doch kompliziert und zeitraubend und daher schwierig  durchzuführen.  



  Die Erfindung     betrifft    und     eine    Vorrichtung zur  Durchführung des Verfahrens zum Nachweis von  immunologischem Material in Flüssigkeiten. Diese Vor  richtung ist gekennzeichnet durch einen Behälter, der  ein     mit    einem     Azinfarbstoff    angefärbtes     immunologi-          sches    Material enthält, welches zu dem nachzuweisen  den immunologischen,     fällbaren    Material homolog ist.  



  Im erfindungsgemässen Verfahren arbeitet man unter  Verwendung von angefärbtem immunologischem Mate  rial.  



  Das immunologische Material kann ein Antigen sein,  das die Antikörperproduktion in einem Wirtsorganismus  stimulieren kann, oder ein zu einem solchen Antigen  homologer Antikörper. Zum Beispiel können infektiöse  Antigene, wie     Mycobacterium        tuberculosis,        Bacillus          anthracis,        Coccidioides        immitis,        C-reaktives    Protein und       ),-Globulin    verwendet werden und ferner jeder zu die  sen Antigenen homologe Antikörper.     Nachstehend    wer  den als Beispiele für das     immunologische    Material  Antigene angeführt.

   Jedoch kann jedes immunologische  Material verwendet werden.  



  Zum Anfärben des Antigens kann jeder Farbstoff  verwendet werden, der mit dem Antigen     eine    Verbin  dung oder einen Komplex bildet, die oder der in Gegen  wart eines zu dem Antigen homologen Antikörpers eine  sichtbare Anzeige der erwarteten immunologischen  Reaktion gibt. Für diesen Zweck wurden z. B.     Azin-          farbstoffe    als zweckmässig befunden. Insbesondere kön  nen Farbstoffe der     Indulin-    und     Nigrosinreihe    mit  guten Ergebnissen verwendet werden.  



  Manchmal erweist sich     eine    Reinigung des handels  üblichen Farbstoffes als zweckmässig, um     eine    Zube  reitung zu erhalten, mit welcher eine möglichst gute       Anfärbung    erzielt wird. Zum Beispiel     kann    handels  übliches     Nigrosin    durch Behandlung mit      Sephadex      oder     Silikagel    gereinigt werden.

        Sephadex     ist ein ver-           netztes        Dextran,    das von der Firma     Pharmacia    in       Uppsala,    Schweden, zur     Verwendung    bei der     Gelfiltra-          tion    vertrieben wird.  



  Das gewünschte Antigen und der Farbstoff können  in einer in geeigneter Weise     gepufferten,    meist annä  hernd neutralen Lösung, z. B. einer solchen mit einem       pH-Wert    von etwa 7,1 bis etwa 7,4, vermengt wer  den. Häufig werden für diesen Zweck     gepufferte    Koch  salzlösungen verwendet. Die Reaktion     zwischen    dem  Antigen und dem Farbstoff verläuft in     verhältnismässig     kurzer Zeit, z. B. in etwa 30 Minuten bis etwa 3 Stun  den. Die Reaktion erfolgt zweckmässig bei     Umgebungs-          oder    Raumtemperatur, z. B. bei etwa 20 bis etwa  30  C.

   Jedoch     können    auch andere Temperaturen ge  gebenenfalls angewendet werden. Wenn jedoch die Ge  fahr einer Denaturierung von Proteinen besteht, emp  fiehlt es sich, das Reaktionsgemisch nur sehr vorsichtig  oder überhaupt nicht zu erwärmen. Das angefärbte  Antigen kann in wässriger Lösung, wie oben beschrie  ben, oder aber     lyophüisiert        und    in Pulverform geliefert  werden.  



  Das angefärbte Antigen     kann    in einem Kapillar  rohr     verwendungsfertig    geliefert werden. Das angefärbte  Antigen,     in        einem        physiologisch    sterilen,     wässrigen,    auf  einen     pH-Wert    von etwa 7,1 bis etwa 7,4     gepufferten     Medium, wird vorzugsweise bis zur gewünschten Höhe  in ein kapillares     Glasrohr    von etwa 7,5 cm     Länge.    und  etwa 1 bis etwa 2 mm Durchmesser eingebracht.

   Um  genaue Resultate zu erzielen, wird das     Kapillarrohr    ge  wöhnlich höchstens zu etwa     3/4        gefüllt.    Das gefüllte       Kapillarrohr        kann        sofort    verwendet, in einem     Kühl-          schrank    zur späteren Verwendung     aufbewahrt    oder vor  der     Aufbewahrung        lyophilisiert    werden.

   Das     lyophili-          sierte,    angefärbte Antigen     ist    als     überzug    auf dem       Kapillarrohr    vorhanden. Es kann durch Vermengen mit  Wasser oder mit     einer    Probe der zu prüfenden Flüssig  keit wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht  werden.  



  Bei der     Verwendung    wird im allgemeinen die zu  prüfende Flüssigkeit in das     Kapillarrohr    aufgezogen  und mit dem angefärbten Antigen vermengt, und     wenn     die zu prüfende Probe einen zu dem Antigen homologen  Antikörper     enthält,    so entsteht bei der     Inkubierung    in  dem     Kapillarrohr    ein Niederschlag. Die     Inkubierung     kann etwa 2     bis    etwa 24 Stunden dauern. Eine     In-          kubierung    von 18 Stunden ergibt z. B. ausgezeichnete  Ergebnisse.

   Die     Inkubierungstemperatur    liegt in der  Regel nahe der Temperatur der Umgebung, vorzugs  weise bei etwa 30 bis etwa 37  C. Enthält die zu  prüfende Probe     keinen    homologen Antikörper, so ent  steht     kein    Niederschlag.  



  Das     angefärbte    Antigen kann nach dem erfindungs  gemässen Verfahren auch mit der zu prüfenden Flüssig  keit vermengt und das     Gemisch    sofort auf     ein        Zellu-          loseacetatpapier    gebracht werden, auf welchem die  Reaktion stattfindet.  



  Das     Zelluloseacetatpapier    wird vorzugsweise für den       immunologischen    Test durch Befeuchten     mit        einer          physiologisch    sterilen,     wässrigen,    auf einen     pH-Wert    von  etwa 7,1 bis etwa 7,4     gepufferten    Lösung vorbereitet.  Vor der Verwendung soll überschüssige Feuchtigkeit  aus dem Papier entfernt werden. Die auf einen homo  logen Antikörper zu     prüfende    Probe wird z. B. mit  einem gleichen Volumen des angefärbten Antigens ver  mengt, und eine kleine Menge, etwa 0;005 ml dieses       Gemisches    werden auf das Papier gebracht.

   Enthält  die Probe einen zu dem angefärbten Antigen homo-    logen     Antikörper,    so erscheint ein dunkler     Ring    in  etwa 10 bis etwa 30 Minuten. In Abwesenheit eines  homologen Antikörpers tritt kein Ring auf. Zur Er  leichterung der     immunologischen    Reaktion kann z. B.  das zur     Durchführung    des Verfahrens verwendete Papier  während eines für den Ablauf der Reaktion ausreichen  den Zeitraumes in eine feuchte Kammer gebracht wer  den,     und    nach dem Trocknen stellt das den     immuno-          logischen    Niederschlag enthaltende Papier einen dauern  den Versuchsbeleg für das Verfahren dar.

   Die Dauer  haftigkeit des Versuchsbeleges ist ein Vorzug, der durch  die     Verwendung    von     Zelluloseacetatpapier    zur Durch  führung der     immunologischen    Reaktion erzielt wird.  



  Bisher wurde das     erfindungsgemässe    Verfahren be  schrieben, bei welchem ein angefärbtes Antigen zum  Nachweis     eines    homologen     Antikörpers    verwendet  wurde. Gegebenenfalls     kann    jedoch auch ein Antikörper  angefärbt     und    zum Nachweis eines homologen Anti  gens verwendet werden. In der Praxis wird meistens  der Antikörper, der in viel höherem Masse als das  Antigen beim     Beginn    verschiedener     pathologischer    Zu  stände auftritt, bestimmt und hierzu ein angefärbtes  Antigen     verwendet,    doch kann man auch umgekehrt  verfahren.  



  Die     Erfindung    wird     hanhand    nachstehender Bei  spiele näher erläutert:  <I>Beispiel 1</I>  Durchführung des Verfahrens in     einem        Kapillarrohr.     Mit     0,05-m-Phosphatlösung        gepufferte    Kochsalzlösung,       pH-Wert    7,4  Zu 10,3 ml einer     0,5-m-Kaliumdihydrogenphosphat-          lösung    und 30,0     ml    einer     0,5-m-Dinatriumhydrogen-          phosphatlösung    wurden 8,7 g     Natriumchlorid    hinzu  gefügt.

   Die     entstandene    Lösung wurde mit destillier  tem Wasser auf 1000     ml    verdünnt.  



  Mit     0,05-m-Tris(hydroxymethyl)aminomethanlösung        ge-          pufferte        Kochsalzlösung,        pH-Wert    7,1  50     ml    einer     1-m-Chlorwasserstoffsäurelösung    und  55,7     ml    einer     1-m-Tris(hydroxymethyl)aminomethan-          lösung    wurden 8,7 g     Natriumchlorid        hinzugefügt.    Die  entstandene Lösung wurde mit destilliertem Wasser auf  1000 ml verdünnt.  



  3     %iges        wässriges        Nigrosin     3 g wasserlösliches     Nigrosin    wurden in 100 ml  destilliertem Wasser gelöst.  



  0,3     %iges        wässriges        Nigrosin     Eine Glaskolonne von 30 cm Höhe und 1 cm  Durchmesser wurde 22 cm hoch     mit    reinem      Sephadex      gefüllt und 1 ml des 3     %igen        wässrigen        Nigrosins    auf  die Kolonne aufgegeben.

   Die Kolonne wurde mit destil  liertem Wasser     eluiert    und die ersten 10 ml des     Eluats,     die eine gereinigte Lösung von     Nigrosin    waren, ge  sammelt und     lyophilisiert.    Das getrocknete     Nigrosin     wurde in     destilliertem    Wasser zu einer Konzentration  von 0,3 % wieder suspendiert.  



  Mit     Nigrosin    angefärbtes     Mycobacterium        Tuberculosis-          Antigen     Es wurden Reihenverdünnungen von     Mycobacterium          tuberculosis-Antigen    (H37 Ra     Difco    Nr. 2252-62,  oder     Brooks        Mycobacterium        tuberculosis    -     polyvalentes     Antigen Nr.

       VX    25 300 von 10-1,     10-2,10-3,10-4,10-5,     10-6, 10-7 und     10-$    in der mit     Tris(hydroxymethyl)-          aminomethanlösung    auf einen     pH-Wert    von 7,1     gepuf-          ferten        Kochsalzlösung        und    in der mit Phosphat auf  einen     pH-Wert    von 7,4     gepufferten    Kochsalzlösung her  gestellt.

   Ein Teil 0,3     %igen        wässrigen        Nigrosins    wurde      9     Teilen    der     Antigenverdünnung    zugegeben und gründ  lich vermengt. Man liess den Farbstoff und das Antigen  60 Minuten bei<B>25'</B> C aufeinander einwirken.  



  Mit Antigen beschichtete     Kapullarröhchen     Gläserne     Kapillarröhrchen    von 7,5 cm Länge und  1 mm Durchmesser wurden bis zur Hälfte mit jeder  Verdünnung des     mit        Nigrosin    angefärbten     M.tubercu-          losis-Antigens        gefüllt    und bis zu vollständigen Trock  nung des Antigens     lyophilisiert.     



       Kaninchen-Antiserum     3 Kaninchen wurden 1     ml    von     Brooks    M.     Tubercu-          losis-Polyvalentem    Antigen an drei aufeinanderfolgenden  Tagen i. v. injiziert. Die Impfungen wurden am 7.,  8., 14., 15., 21. und 22. Tag wiederholt. 5 Tage  nach der letzten Injektion wurde den Kaninchen Blut  abgenommen und das Serum vereinigt.  



  Serumproben  Eine 10     %ige    Serumlösung wurde hergestellt,     indem     man 1 Teil Serum mit 9 Teilen der mit     Tris(hydroxy-          methyl)aminomethanlösung        gepufferten        Kochsalzlösung     vom     pH-Wert    7,1 oder der mit Phosphat     gepufferten          Kochsalzlösung    vom     pH-Wert    7,4 vermengte.  



  Leistungsfähigkeit des Tests  Durch Fingerpunktion erhaltene Serumproben wur  den, wie oben beschrieben, vorbereitet. Die Serum  proben wurden in die mit Antigen beschichtete Kapillar  röhre durch     Kapillarwirkung    aufgezogen. Die Röhrchen  wurden zwecks guten     Mischens    20- bis 30mal um  gekehrt und anschliessend vertikal in Ton gestellt und  18 Stunden bei 30  C     irrkubiert.    Positive Reaktionen  zeigten sich durch die Anwesenheit eines dunklen Nie  derschlages, der im ganzen Röhrchen oder am unteren       Miniskus    gesehen werden konnte. Im Falle negativer  Reaktionen war kein Niederschlag zu beobachten.  



  Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei man  jedoch zusätzlich die Röhrchen nach sechsstündigem       Inkubieren    mit 500     UpM    3 Minuten zentrifugierte.  Nach dem Zentrifugieren konnten am Boden jener  Röhrchen, in welchen eine positive Reaktion erfolgt  war, Niederschläge beobachtet werden.  



  Klinische Prüfung  Bei dieser Untersuchung wurden 61 Serumproben  von Patienten ohne Tuberkulose verwendet. Die meisten  dieser Serumproben stammten von Patienten mit ver  schiedenen chronischen Erkrankungen. Diese Serum  proben waren     hämolysiert,        lipämisch    und     in    manchen  Fällen     verunreinigt.    Die Proben wurden, wie oben be  schrieben, geprüft. Von 61 Proben gab nur eine eine  positive Reaktion. Der Rest war negativ.  



  Im zweiten Teil der Untersuchung wurden 49 Se  rumproben von einer     Tuberkuloseheilstätte    erhalten.  Hiebei wurden Patienten mit aktiver Tuberkulose bis  zu solchen     mit    beginnender Tuberkulose erfasst. 47  der 49 geprüften Seren ergaben eine positive und die  beiden restlichen eine negative Reaktion. Demnach wur  den weniger als 5 % falscher negativer Ergebnisse  erzielt.  



  <I>Beispiel 2</I>  Test auf     Zelluloseacetatpapier           Oxoid -Zelluloseacetatpapier    der     Colab        Laborato-          ries,    Chicago     Heights,    Illinois, USA wurde in quadra  tische Streifen von 2,5 cm     Seitenlänge    geschnitten, diese  mit einer Aufschrift versehen und angefeuchtet, indem    man sie auf der     mit    0,05 m     Tris(hydroxymethyl)amino-          methanlösung        gepufferten        Kochsalzlösung    vom     pH-Wert     7,1 schwimmen liess.  



  1 Tropfen jeder Verdünnung des angefärbten Anti  gens wurde mittels Pipette auf 8 verschiedene Vertiefun  gen in einer Platte aus plastischem Material gebracht.  In gleicher Weise wurde ein Tropfen     Kaninchen-Anti-          serum    auf jede     Antigenverdünnung    gebracht und gründ  lich vermengt.  



  Anschliessend wurden die     Zelluloseacetatstreifen    auf  gläserne     Mikroskopiorplättchen    gebracht und über  schüssige Feuchtigkeit mit Löschpapier entfernt. 5     A,     des     Antigen-Antiserumgemisches    wurden in die Mitte  eines     Zelluloseacetatstreifens    gebracht. Diese Streifen  wurden anschliessend 15 Minuten in eine feuchte Kam  mer bei 25  C gegeben.  



  Sichtbare Niederschläge erschienen auf den     Zellu-          loseacetatstreifen    als dunkelgefärbte Ringe von ver  schiedener Intensität, je nach der Verdünnung.  



  Die     Zelluloseacetatstreifen    wurden auch 2     Minuten     bei Raumtemperatur irrkubiert, ohne sie in eine feuchte  Kammer zu bringen. Die Ergebnisse waren ähnliche.  Klinische Prüfung  Die in dem 2. Teil der Untersuchung aus     Beispiel    1  erwähnten 49 Serumproben wurden, wie oben beschrie  ben, geprüft. Insgesamt ergaben 47 der 49 Proben  einen positiven und die beiden restlichen Proben     einen     negativen Test. Demnach erhielt man weniger als 5 %  falsche, negative Ergebnisse.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH I Verfahren zum Nachweis von immunologischem Material in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Flüssigkeit, in welcher man immunologisches Material vermutet, mit einem angefärbten immunolo gischen Material,_das zu dem nachzuweisenden immuno logischen Material homolog ist, zusammenbringt und die Entstehung eines gefärbten Niederschlages beob achtet. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch ge kennzeichnet, dass man das immunologische Material mit einem Azinfarbstoff anfärbt. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch ge kennzeichnet, dass man das immunologische Material mit einem Indulin- oder Nigrosinfarbstoff anfärbt. PATENTANSPRUCH II Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ge mäss Patentanspruch I, gekennzeichnet durch einen Be hälter, der ein mit einem Azinfarbstoff angefärbtes immunologisches Material enthält, welches zu dem nach zuweisenden immunologischen, fällbaren Material homo log ist. UNTERANSPRÜCHE 3.

   Vorrichtung nach Patentanspruch II, enthaltend ein mit einem Indulin- oder Nigrosinfarbstoff angefärb tes immunologisches Material. 4. Vorrichtung nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter eine Kapillarröhre ist.