Procédé de dédoublement de la DL-hydroxy-proline Dans son brevet No 327724, la titulaire a décrit un procédé de dédoublement de la DL-proline, de formule (I), par l'intermédiaire des sels N-3,5-dinitrobenzoyliques des prolines <I>D</I> et<I>L,</I> de formule (II), et des<I>D(-)</I> et L(-I-)- thréo-1-p -nitrophényl-2 - amino-propane -1,3- diols, de formule (III).
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Le D(-)-thréo-1-p-nitrophényl-2-amino- propane-1,3-diol présente la propriété de don ner avec la N-3,5-dinitrobenzoyl-L-proline un sel peu soluble dans l'eau ou les solvants orga niques tandis que le sel correspondant de la N-3,5-dinitrobenzoyl-D-proline reste dissous. Inversement, et dans les mêmes conditions, la base LU-) donne avec la forme D de l'amino- acide N-3,5-dinitrobenzoylé un sel peu soluble, tandis que le sel correspondant de la forme L reste en solution.
Dans chacun de ces cas, le traitement alcalin de l'insoluble, suivi d'acidi- fication, conduit, après récupération du réactif de dédoublement, à la forme optiquement active recherchée de la N-3,5-dinitrobenzoyl- proline ; le traitement similaire du filtrat conduit à l'énantiomorphe correspondant. L'hy drolyse de la N-3,5-dinitrobenzoylproline dé doublée fournit, sans racémisation, la D- ou L- proline correspondante.
En poursuivant l'étude du dédoublement par les D(-) et L(-I-)-thréo-1-p-nitrophényl- 2-amino-propane-1,3-diols, on a maintenant trouvé que la DL-hydroxy-proline (IV), peut être aussi dédoublée par l'intermédiaire de son dérivé N-3,5-dinitrobenzoylé (V), en utilisant ces agents de dédoublement.
La présente invention a donc pour objet un procédé de dédoublement de la DL-hydroxy- proline par l'intermédiaire de son dérivé N-3,5-dinitrobenzoylé, caractérisé en ce qu'on fait réagir le D(-) ou le L(-I-)-thréo-1-p-nitro- phényl-2-amino-propane-1,3-diol sur la N-3,5- dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline au sein d'un solvant, l'un des deux énantiomorphes donnant un sel peu soluble avec le réactif de dédouble ment, on sépare les sels des deux énantiomor- phes par leur différence de solubilité,
on libère les N-3,5-dinitrobenzoyl-D- et L-hydroxy-pro- lines de leurs sels par traitement alcalin suivi d'acidification et on saponifie les N-3,5-dinitro- benzoyl-D- et L-hydroxy-prolines pour obtenir, respectivement, les hydroxy-prolines <I>D</I> et<I>L.</I> Les réactifs eux-mêmes sont obtenus sous leurs formes optiquement actives selon la méthode décrite par Velluz, Amiard et July <I>(Bull.
Soc.</I> Chim., 1953, p. 342).
Dans ce procédé et à l'inverse de la pro hne, le sel peu soluble de la N-3,5-dinitro- benzoyl-D-hydroxy-proline est fourni par la base D ; celui de l'énantiomorphe L par la base L.
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On peut obtenir ainsi la N-3,5-dinitro- benzoyl-L-hydroxy-proline à partir de N-3,5- dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline avec un rendement de 90 0/0, ce qui représente un avan tage considérable sur les méthodes connues de dédoublement de cet aminoacide.
C'est ainsi que Leuchs et Bormann<I>(Ber.</I> dtsch. chem. Ges. 1919, 52, 2086) dédoublent le N-phényl-isocyanate de la DL-hydroxy-proline par l'intermédiaire de son sel de quinine avec un rendement qui ne dépasserait pas 30 %. De plus, la N-3,
5-dinitrobenzoylation de l'hy- droxy-proline est pratiquement quantitative et l'hydrolyse du produit dédoublé conduit à l'hydroxy-proline correspondante pure sans ra- cémisation.
On peut effectuer la dinitrobenzoylation par toutes les méthodes connues ou encore faire réagir le chlorure de 3,5-dinitrobenzoyle sur un ester ou un autre dérivé de la proline, d'où l'on peut, ensuite, régénérer facilement l'amino- acide N-acylé. On peut également, lors de la préparation des sels de D(-) ou L(-I-)-thréo- 1-p-nitrophényl-2-aminopropane-1,3-diol, faire varier la nature du solvant, les températures de dissolution et de cristallisation et le temps de refroidissement, sans s'éloigner pour cela du cadre de la présente invention.
Les hydroxy-prolines <I>D</I> et<I>L</I> obtenues par le présent procédé servent à synthétiser des peptides ou d'autres molécules plus complexes à activité physiologique.
L'exemple qui suit illustre l'invention. Exemple <I>Préparation de la</I> N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline On dissout 10 g de DL-hydroxy-proline dans 200 ems de soude N, refroidit à 01> C et ajoute en une minute, sous vive agitation, 22 g de chlorure de 3,5-dinitrobenzoyle fraîchement pulvérisé. On enlève le bain réfrigérant et agite pendant quinze minutes à la température am biante. Après filtration, on chauffe à 50,) C et introduit 21 ce d'acide chlorhydrique concen tré.
On obtient ainsi, après refroidissement, 24 g (96%) de N-3,5-dinitrobenzoyl-DL- hydroxy-proline, F = 205-207 C. Ce produit est nouveau. <I>Dédoublement et préparation des</I> <I>D- et</I> L-hydroxy-prolines <I>a) Formation du sel de la</I> N-3,5-dinitro- benzoyl-L-hydroxy-proline <I>avec le</I> L(-I-)- thréo <I>-1- p -</I> nitrophényl <I>-2 -</I> amino <I>-</I> propnrie - 1,3-diol On dissout,
à 80 C, 20 g de N-3,5-dinitro- benzoyl-DL-hydroxy-proline dans 160 cm'j de dioxane contenant 5 % d'eau, et ajoute 13,5 g de L(+)-thréo-1-p-nitrophényl-2-amino-pro- pane-1,
3-diol. On refroidit à<B>250C</B> en agitant et essore le sel formé qu'on lave avec deux fois 10 cm-' de dioxane contenant 5 % d'eau. Ce sel hydraté fond à 140-141 C, [a] _ - 780 2 (c = 10/0, eau). Le sel de la N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline avec le L(+) -thréo -1-p -nitrophényl-2-amino-propane- 1,3-diol n'a pas encore été décrit. Rendement en produit sec : 14,7 g (89 0/0).
<I>b) Obtention de la</I> N-3,5-dinitrobenzoyl-L- hydroxy-proline On traite 14,7 g du sel ci-dessus par 32 ce de soude N. On observe la dissolution du pro duit puis la cristallisation du L(-I-)-thréo-1-p- nitrophényl-2-amino-propane-1,3-diol qu'on essore et lave avec un peu d'eau. On récupère ainsi 4,8 g (35,5 0/0) du réactif de dédouble ment. On acidifie le filtrat obtenu ci-dessus, saturé de chlorure de sodium, par 3,5 ce d'acide chlorhydrique concentré et extrait en quatre fois par 15, 10, 5 et 5 ce d'acétate d'éthyle. On lave la solution organique avec un peu d'eau, sèche sur sulfate de magnésium et évapore.
On obtient 8,3 g de N-3,5-dinitro- benzoyl-L-hydroxy-proline (83,% par rapport à la N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline de départ). [U120 = -147o 2 (c = 1 éthanol à 50 0/0). Ce produit est nouveau. <I>c) Séparation de la</I> L-hydroxy-proline On chauffe quarante minutes au reflux une solution de 2,5 g de N-3,5-dinitrobenzoyl-L- hydroxy-proline dans 25 ce d'acide chlor hydrique 5 N.
On filtre, évapore à sec sous vide et cristallise dans l'acétone le chlorhydrate de L-hydroxy-prolïne obtenu. On reprend dans un volume d'eau, ajoute 0,7 ce d'aniline puis 12 cm-' d'alcool absolu bouillant. On obtient ainsi, après refroidissement, 0,87 g (87 0/0) de L-hydroxy-proline cristallisée, F = 273-274 C, [c7 D = -77o 1o (c = 1 0/0, eau). <I>d)
Séparation de la</I> D-hydroxy-proline On évapore à sec la solution d'où a cristal lisé le sel de N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy- proline avec le L(-', )-thréo-l-p-nitrophényl- 2-amino-propane-1,3-diol et reprend par un peu d'eau. En traitant cette solution aqueuse concentrée par 40 ce de soude N, on récu père, comme indiqué en b), 7,2 g (53 0/0) de réactif de dédoublement. Le filtrat saturé de chlorure de sodium et additionné de 5 ce d'acide chlorhydrique concentré est extrait à l'acétate d'éthyle comme en b).
On concentre la solution organique à 20 ce et récupère par refroidissement 1,5 g (7,5 0/0) de N-3,5-dinitro- benzoyl-DL-proline qui peut être adjoint à une nouvelle venue de racémique à dédoubler. On filtre, évapore à sec et obtient 9,5 g (95 0/0) de N-3,5-dimtrobenzoyl-D-hydroxy-proline amorphe souillée par une faible quantité de racémique ; [a]'20 = -I- 1150 2 (c = 1 %, éthanol à 50 0/0).
On obtient la D-hydroxy- proline correspondante par hydrolyse chlor hydrique ménagée comme il est indiqué en c) pour la L-hydroxy-prohne.
<I>Préparation de la</I> N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline <I>à l'aide du</I> D(-)-thréo-1-p-nitrophényl- 2-amino-propane-1,3-diol La N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline impure obtenue selon d) est traitée par le D (-) -thréo-1-p,nitrophényl-2-amino-propane- 1,3-diol comme il est indiqué en a) pour le L(+) -thréo-1-p -nitrophényl-2-amino-propane- 1,3-diol. On obtient ainsi le sel hydraté de la N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline avec le D (-)
-thréo-1-p-nitrophényl-2-amino-propane- 1,3-diol, F = 140-141 C, [(xjD = -h 780 2 (c = 1;%, eau). Ce produit est nouveau. Il conduit comme en 1 b), à la N-3,5-dinitro- benzoyl-D-hydroxy-proline amorphe, [a]2 = -I- 147o 2 (c = 10/0, éthanol à 50,0/0, puis, suivant l'exemple 1 c) à la D-hydroxy-proline optiquement pure, [ajD = -i- 770 10 (c = 1'%,
eau). La N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy- proline n'a pas encore été décrite.
Process for resolving DL-hydroxy-proline In its patent No. 327724, the patentee described a process for resolving DL-proline, of formula (I), via the N-3,5-dinitrobenzoyl salts of prolines <I> D </I> and <I> L, </I> of formula (II), and <I> D (-) </I> and L (-I -) - threo-1- p -nitrophenyl-2-amino-propane -1,3-diols, of formula (III).
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D (-) - threo-1-p-nitrophenyl-2-amino-propane-1,3-diol has the property of giving, with N-3,5-dinitrobenzoyl-L-proline, a salt which is sparingly soluble in water or organic solvents while the corresponding salt of N-3,5-dinitrobenzoyl-D-proline remains dissolved. Conversely, and under the same conditions, the base LU-) gives, with the D form of the N-3,5-dinitrobenzoyl amino acid, a sparingly soluble salt, while the corresponding salt of the L form remains in solution.
In each of these cases, the alkaline treatment of the insoluble material, followed by acidification, leads, after recovery of the resolution reagent, to the desired optically active form of N-3,5-dinitrobenzoyl-proline; similar treatment of the filtrate results in the corresponding enantiomorph. Hydrolysis of the doubled N-3,5-dinitrobenzoylproline provides, without racemization, the corresponding D- or L-proline.
By continuing the study of the resolution by D (-) and L (-I -) - threo-1-p-nitrophenyl-2-amino-propane-1,3-diols, it has now been found that DL-hydroxy -proline (IV), can also be resolved via its N-3,5-dinitrobenzoyl derivative (V), using these resolving agents.
The subject of the present invention is therefore a process for resolving DL-hydroxyproline via its N-3,5-dinitrobenzoyl derivative, characterized in that the D (-) or L ( -I -) - threo-1-p-nitro-phenyl-2-amino-propane-1,3-diol on N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline in a solvent, the one of the two enantiomorphs giving a salt which is not very soluble with the resolution reagent, the salts of the two enantiomorphs are separated by their difference in solubility,
the N-3,5-dinitrobenzoyl-D- and L-hydroxy-pro- lines are freed from their salts by alkali treatment followed by acidification and the N-3,5-dinitro-benzoyl-D- and L- are saponified. hydroxy-prolines to obtain, respectively, the hydroxy-prolines <I> D </I> and <I> L. </I> The reagents themselves are obtained in their optically active forms according to the method described by Velluz, Amiard and July <I> (Bull.
Soc. </I> Chim., 1953, p. 342).
In this process and unlike pro hne, the sparingly soluble salt of N-3,5-dinitro-benzoyl-D-hydroxy-proline is provided by base D; that of the enantiomorph L by the base L.
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N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline can thus be obtained from N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline with a yield of 90%, which represents an advantage. considerable work on the known methods of resolving this amino acid.
Thus Leuchs and Bormann <I> (Ber. </I> dtsch. Chem. Ges. 1919, 52, 2086) split the N-phenyl-isocyanate from DL-hydroxy-proline through its quinine salt with a yield which would not exceed 30%. In addition, the N-3,
Hydroxy-proline 5-dinitrobenzoylation is virtually quantitative and hydrolysis of the resolved product results in the corresponding pure hydroxy-proline without racemization.
The dinitrobenzoylation can be carried out by any of the known methods or alternatively the 3,5-dinitrobenzoyl chloride can be reacted with an ester or another derivative of proline, from which the amino acid can then be easily regenerated. N-acylated. It is also possible, during the preparation of the salts of D (-) or L (-I -) - threo-1-p-nitrophenyl-2-aminopropane-1,3-diol, to vary the nature of the solvent, the temperatures dissolution and crystallization and the cooling time, without departing for this from the scope of the present invention.
The <I> D </I> and <I> L </I> hydroxy-prolines obtained by the present process serve to synthesize peptides or other more complex molecules with physiological activity.
The following example illustrates the invention. Example <I> Preparation of </I> N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline 10 g of DL-hydroxy-proline are dissolved in 200 ems of N sodium hydroxide, cooled to 01> C and added in a minute, with vigorous stirring, 22 g of freshly pulverized 3,5-dinitrobenzoyl chloride. The cooling bath is removed and stirred for fifteen minutes at room temperature. After filtration, the mixture is heated to 50 ° C. and 21 cc of concentrated hydrochloric acid is introduced.
Thus obtaining, after cooling, 24 g (96%) of N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline, Mp = 205-207 C. This product is new. <I> Splitting and preparation of </I> <I> D- and </I> L-hydroxy-prolines <I> a) Salt formation of </I> N-3,5-dinitro-benzoyl- L-hydroxy-proline <I> with </I> L (-I -) - threo <I> -1- p - </I> nitrophenyl <I> -2 - </I> amino <I> - </I> propnrie - 1,3-diol We dissolve,
at 80 C, 20 g of N-3,5-dinitro-benzoyl-DL-hydroxy-proline in 160 cm'j of dioxane containing 5% water, and add 13.5 g of L (+) - threo- 1-p-nitrophenyl-2-amino-propane-1,
3-diol. The mixture is cooled to <B> 250C </B> while stirring and the salt formed is filtered off and washed with twice 10 cm 3 of dioxane containing 5% water. This hydrated salt melts at 140-141 C, [a] _ - 780 2 (c = 10/0, water). The salt of N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline with L (+) -threo -1-p -nitrophenyl-2-amino-propane-1,3-diol has not yet been described. . Yield of dry product: 14.7 g (89%).
<I> b) Obtaining </I> N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline 14.7 g of the above salt are treated with 32 cc of N soda. Dissolution of the product is observed. then crystallization of L (-I -) - threo-1-p-nitrophenyl-2-amino-propane-1,3-diol which is filtered off and washed with a little water. 4.8 g (35.5%) of the resolution reagent are thus recovered. The filtrate obtained above, saturated with sodium chloride, is acidified with 3.5 cc of concentrated hydrochloric acid and extracted four times with 15, 10, 5 and 5 cc of ethyl acetate. The organic solution is washed with a little water, dried over magnesium sulphate and evaporated.
8.3 g of N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline are obtained (83% relative to the starting N-3,5-dinitrobenzoyl-DL-hydroxy-proline). [U120 = -147o 2 (c = 1 50 0/0 ethanol). This product is new. <I> c) Separation of the </I> L-hydroxy-proline A solution of 2.5 g of N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline in 25 cc of acid is heated for forty minutes under reflux. hydrochloric acid 5 N.
Filtered, evaporated to dryness under vacuum and crystallized in acetone the hydrochloride of L-hydroxy-proline obtained. The residue is taken up in a volume of water, 0.7 cc of aniline and then 12 cm 3 of boiling absolute alcohol are added. There is thus obtained, after cooling, 0.87 g (87 0/0) of crystallized L-hydroxy-proline, F = 273-274 C, [c7 D = -77o 1o (c = 1 0/0, water). <I> d)
Separation of the </I> D-hydroxy-proline The solution is evaporated to dryness from which the salt of N-3,5-dinitrobenzoyl-L-hydroxy-proline has crystallized with the L (- ',) -thréo -lp-nitrophenyl-2-amino-propane-1,3-diol and takes up with a little water. By treating this concentrated aqueous solution with 40 cc of N sodium hydroxide, as indicated in b), 7.2 g (53%) of resolving reagent are recovered. The filtrate saturated with sodium chloride and added with 5 cc of concentrated hydrochloric acid is extracted with ethyl acetate as in b).
The organic solution is concentrated to 20 cc and 1.5 g (7.5 0/0) of N-3,5-dinitro-benzoyl-DL-proline which can be added to a new arrival of racemic to be resolved by cooling. . It is filtered and evaporated to dryness and 9.5 g (95%) of amorphous N-3,5-dimtrobenzoyl-D-hydroxy-proline soiled with a small amount of racemate is obtained; [a] '20 = -I- 1150 2 (c = 1%, 50% ethanol).
The corresponding D-hydroxyproline is obtained by controlled hydrochloric hydrolysis as indicated in c) for L-hydroxy-prohne.
<I> Preparation of </I> N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline <I> using </I> D (-) - threo-1-p-nitrophenyl- 2- amino-propane-1,3-diol Impure N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline obtained according to d) is treated with D (-) -threo-1-p, nitrophenyl-2-amino-propane - 1,3-diol as indicated in a) for L (+) -threo-1-p -nitrophenyl-2-amino-propane-1,3-diol. This gives the hydrated salt of N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline with D (-)
-threo-1-p-nitrophenyl-2-amino-propane- 1,3-diol, M = 140-141 C, [(xjD = -h 780 2 (c = 1;%, water). This product is new It leads, as in 1 b), to amorphous N-3,5-dinitro-benzoyl-D-hydroxy-proline, [a] 2 = -I-147o 2 (c = 10/0, ethanol at 50.0 / 0, then, according to Example 1 c) with optically pure D-hydroxy-proline, [ajD = -i- 770 10 (c = 1 '%,
water). N-3,5-dinitrobenzoyl-D-hydroxy-proline has not yet been described.