CA2491235A1 - Genes des chromosomes 3,5 et 11 impliques dans la canitie precoce - Google Patents

Abstract

Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gè ne du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNAID, ARHGEF 3 et AL133097, ou dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFR B, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, ou dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCYIA2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à l'une de ces régions, utilisation des produits d'expression de l'une de ces régions et utilisation d'agents capabl es de modifier la fonction de ces produits d'expression, à des fins cosmétiques , thérapeutiques ou diagnostiques.

Description

G~NES DES CHROMOSOMES 3, 5 et 11 IMPLI(,~UÉS DANS LA
CANITIE PRÉCOCE
Annuler ou atténuer autant que faire se peut les effets du vieillissement est une préoccupation qui ne cesse de croître. Dans ce contexte, faire disparaître des cheveux blancs jugés disgracieux grâce à des shampoings traitants colorants est désormais une activité très répandue. Il est clair cependant que, même si cette technique permet effectivement d'annuler les effets du phénomène, elle n'en.affecte nullement les causes. De ce fait; cette solution est temporaire et doit être fréquemment renouvelée.
Dans ce contexte, les inventeurs ont choisi d'explorer l'apparition des cheveux blancs, ou canitie, sous un angle totalement noûveau, celui de la génétique.
En effet, explorer la canitie de par son aspect génétique permet de mettre en évidence les mécanismes profonds de la dépigrnentation. Cela.permet aussi d'identifier les gènes qui sont impliqués dans la canitie. Cette identification ouvre Ia porte à de très nombreuses applications, dans le domaine du soin ~ des cheveux, tant cosmétiques que thérapeutiques ou dignostiques.
Il est hautement novateur de chercher à connaître les régions génomiques de la canitie par analyse de liaison génétique alors que d'autres études visent plutôt à décrypter la biochimie de la canitie.
Les inventeurs ont choisi de tirer partie de l'hypothèse proposée depuis bien longtemps du caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie. Le caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains est en effet aisément observable.
Le deuxième obstacle de la mise en oeuvre des méthodes de génétique inverse concerne la définition exacte du phénotype. Une parfaite définition du phénotype étudié est en effet nécessaire. Afm de garantir les meilleures chances de succès pour cette identification de gènes, le choix et Ia composition de l'échantillon utilisé
dans la présente invention se sont déroulés selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype « canitie précoce » fut attribué aux.
seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans.

2 De plus, il est vraisemblable que d'une part la canitie précoce ait une origine multigénique et non monogënique, et que d'autre part, des facteurs environnementaux aient une influence sur le phénotype. Il s'agit de fait de définir un ensemble de causes prédisposant à la canitie prëcoce plutôt qu'une mutation unique responsable du phénotype.
Dans ce contexte, la génétique inverse n'est pas, habituellement, une technique recommandée par les généticiens. Il est donc original de la part des inventeurs d'avoir utilisé cette méthode.
Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs de définir des zones chromosiques et/ou génomiques comprenant des gènes impliquées avec une forte IO prôbabilité dans la canitie. Dans la présente demande, les régions des chromosomes ou' les sous-parties de ces régions,. identifiées par les inventeurs comme comprenant des gènes statistiquement impliqués dans la canitie, seront dénommées indifféremment "régions chromôsomiques de l'invention" ôu "régions génomiques de l'invention" ou "zones chromosômiques de l'invention" ou "zones génomiques de l'invention". Quant aux gènes identifiés dans le cadre de la présente invention au sein desdites régions, ils seront dénommés « gènes de l'invention ». .
L'objet de la présente invention concerne d'une pari les gènes des régions chromosomiques identifiés et d'autre part l'utilisation de produits dérivés, tels que des produits de transcription ou de traduction, dans les domaines de Ià
cosmétique, de la thérapeutique et du cliagnostic.
Pour les domaines de la thérapie et de la cosmétique, la présente invention concerne successivement l'utilisation de polynucléotides dérivant gène compris dans une région chromosomique de l'invention, I'uülisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à ce gène, l'utilisation des produits d'expression de ce gène et l'utilisation d'agents capables de modifier Ia fonction de ces produits d'expression.
L'utilisation conjointe ou combinëe d'au moins deux des produits précédents peut s'avérer judicieuse, en particulier dans le domaine thérapeutique.
La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic d'une canitie précoce basé sur les variations alléliques au sein des gènes compris dans les régions chromosomiques de l'invention. En matière de diagnostic, il peut être, de plus, parüculièrement pertinent de combiner les renseignements provenant de différents gènes au sein des zones chromosomiques de l'invention.

3 GLOSSAIRE
Dans le cadre de la présente invention, les termes énoncés revêtent la signification suivante Par fragment polynucléotidique, on entend toute molécule résultant de l'enchaînement linéaire d'au moins deux nucléotides, cette molécule pouvant être monocaténaire, bicaténaire ou tricaténaire. Il peut donc s'agir d'une molécule d'ADN
double-brin, d'un ADN simple brin, d'un ARN, d'un duplex ADN simple brin-ARN, d'un triplez ADN-ARN ou de toute auire combinaison. Le fragment polynucléotidique peut être naturel isolé, recombinant ou bien synthétique. Lorsque le fragment polynucléotidique cômporte des brins complémentaires, la complémentarité n'est pas nécessairement parfaite, mais l'affinitë entre les différents brins est suffisante pour permettre l'établissement de liaison stable de type Watson Crick entre les deux brins.
Bien que l'appariement des bases soient de préférence de type Watson-Crick, d'autres types ne sont pas exclus, tels qu'un appariement de type Hoogsteen ôu Htiogsteen inverse.
On considère que la séquence S d'une molécule « correspond » à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire l'enchaînement des bases de S
de celui de Ia molécule d'ADN donnée par l'un des processus suivants 1. par identité, ou bien 2. par identité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile, ou bien 3. par complémentarité, ou bien

4. par complémentarité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile.
De plus, on considère que deux séquences restent « correspondantes » s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans l'un des processus précédents (complémentarité ou bien identité, avec ou sans échange T,U), de préférence moins d'une erreur sur 100. Par conséquent, les deux molécules ont aussi nécessairement des longueurs voisines, la variation maximale de longueur étant de 10% d'après le taux d'erreur accepté, elles ont de préférence une différence de longueur inférieure à 1 %.
Cette définition ne suppose pas que les deux molécules soient de même nature, en particulier pour ce qui est de leur squelette, il s'agit d'une correspondance entre leur séquence uniquement.
Par exemple, deux séquences d'ADN identiques « correspondent » l'une à
l'autre.
De même, si ces deux séquences sont substantiellement identiques, c'est-à-dire identiques à plus de 90%, elles correspondent l'une à l'autre. Une séquence d'A.RN, issue de Ia traduction d'une molêcule d'ADN quelconque, « correspond » à la séquence de cette molécule d'ADN. De même, une séquence synthétique, par exemple hybride ADN-A12N, peut correspondre à une sëquence d'ADN. Il en va de même entre une séquence d'ADN et l'ARN anti-sens ayant pour cible cette séquence.
Sur le même schéma, on considère que la séquence S d'une molécule d'ADN
« correspond » à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire la séquence S de celle de Ia molécule d'ADN donnée par le processus 1 ou 3 uniquement. La même latitude est autorisée concernant la possibilité d'introduction d'erreurs dans ces pïocessus, c'ést-à-dire que l'on considère que deux séquences d'ADN restent correspondantes » s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans les processus de complémentarité ou bien d'identité; de préférence moins d'une erreur ur 100.
Les produits d'expression d'un fragment d'ADN englobent toutes Ies molécules ., traduisant l'infôrmation génétique portée par ce fragment. Les ARN
correspondant à la transcription du fragment d'ADN, à tous les stades de maturation, sont donc des produits d'expression ; il en est de même pour les polypeptides, à tous les stades de maturation, résultant de la traduction des ARN. Si des clivages interviennent au sein du polypeptide, comme par exemple le clivage de signaux d'adressage, tous les polypeptides résultants sont aussi considérës comme des produits d'expression du fragment d'ADN inüial.
Dans le contexte de l'invention, la « fonction » primaire d'un fragment d'ADN
est de préférence d'être transcrite puis traduite en protéine. La fonction secondaire de l'ADN peut être assimilée à la fonction de la protéine résultant de la traduction de cet ADN. La fonction d'un fragment d'ADN revêt aussi d'autres significations dans la présente invention. En particulier, un fragment d'ADN peut appartenir à une région régulatrice d'un gène, sa fonction est alors, ou bien d'êire Ie site de fixation d'enhancers ou d'inhibiteurs, ou bien d'être le site de fixation de l'ARN polymérase, ou bien d'être un site de reconnaissance pour le positionnement de TARN polymérase, ou bien toute autre fonction généralement assimilée à une séquence régulatrice.
D'autres fonctions sont envisageables pour les fragments d'ADN. En particulier, leur simple présence au sein d'un gène peut faciliter les recombinaisons. De même, une fonction selon l'invention peut être celle des téloméres et avoir irait à la dégénérescence.
D'autres fonctions particulières attribuées à des fragments d'ADN sont bien connues par les biologistes.

S
Un marqueur génétique est une séquence d'ADN détectable. En génétique humaine, les marqueurs sont des séquences particulières de l'ADN pouvant prendre différentes formes selon les individus. Cette polymorphie des marqueurs permet de suivre leur transmission dans le cadre des arbres généalogiques.
Parmi Ies marqueurs classiques, on peut citer deux grandes catégories qui sont les marqueurs microsatellites et Ies SNP (Single nucleotide polymorphism).
Un microsatellite est une séquence d'ADN répétée, constituée d'un motif relativement simple : un di, un tri ou un tétra nucléotide le plus souvent. Le nombre de répétitions change pour un méme motif selon les individus et peut varier de quelques unités (une douzaine au minimum pour un dinucléotide), jusqu'à plus d'une centaine.
Ces séquences sont dispersées .un peu partout dans le génome, de façon presque aléatoire, mais à des endroits identiques d'un individu à un autre. Elles sont très abondantes (environ une tous les 10000 nucléotides = 10 kb) et elles sont .très polymorphes. C'est la variation de longueur de la répétition en tandem qui constitue .le ~-narqueur.~.. Ces séquences microsatellites sont donc très utilisées comme marqueurs génétiques Normalement, il n'y a pas de lien explicite entre un marquëur inicrosatellite et un gène, sinon une co-localisation. La longueur d'une répétition en tandem n'a pas, selon Ies connaissances actuelles, et en dehors de quelques rares cas de marqueurs intragéniques associés à certaines pathologies, de lien avec le rôle d'un géne. Dans le cadre de la présente invention, les marqueurs microsatellites sont des outils pour localiser les gènes impliqués dans la canitie précoce. Comme il existe beaucoup moins de polymorphisme dans les gènes que dans les marqueurs, un allèle génique sera représenté par plusieurs allèles d'un même marqueur microsatellite.
Il existe différentes méthodes pour définir la localisation de séquences particulières d'ADN le long des chromosomes. L'unité de mesure physique est le nombre de paires de bases. Toutefois, le centimorgan est souvent utilisé, c'est une unitë de recombinaison donc une unité de mesure génétique et non physique. Deux séquences particulières d'un même chromosome sont distantes d'un centirnorgan si elles recombinent une fois sur cent lors de la méiose. Un centirnorgan équivaut approximativement à 106 paires de bases.
Une autre méthode pour localiser des séquences particulières d'ADN le long des chromosomes consiste à définir leur position relativement à des marqueurs jalonnant les chromosomes et dont la position est parfaitement dëterminée et connue. Des marqueurs très utilisés sont les marqueurs microsatellites dont il existe des cartographies très.
complètes. En particulier le GDB « Genome Database » est une banque de données, connue mondialement pour répertorier entre autres les STSs (Sequence tagged sites), bornes spécifiques et uniques de l'ADN dont font partie les microsatellites.
Les codes DxSxxxx (par exemple D6S257), servant à identifier ces marqueurs, sont leur numéro d'accession dans GDB. Ces codes sont un moyen d'identification non ambigu et universel car seul GDB attribue ce type de code. Comme on peut trouver de tels marqueurs microsatellites environ tous les 10 kb, il est donc possible de définir 1a position de toute séquence à l Okb près, en indiquant les marqueurs microsatellites l'encadrant.
Un SNP (Single Nucleotide Pholymorphism) est .un polymorphisme qui touche une uniquë base de l'ADN. C'est la forme de polymorphisme la plus répandue dans le génome hiunain, et elle se caractérise également par; une grande stabilité
lors de la.
transmissïôn. ~ La 'plupart de ces polymorphismes n'ont. pas d'implications fonctionnelles.
On compte envirën 1 SNP sur 100 paires de bases. La connaissance de~ ces SNPs permet d'établir une cartographie du génome humain et Ies SNPs servent alors de véritables marqueurs du génome, d'autant plus qu'ils mutent lentement et ont peu de chance de réapparaître de façon récurrente.
Par région chromosomique entre deux marqueurs, on entend toute la séquence comprise entre ces deux marqueurs, les bornes étant comprises, donc Ia séquence des marqueurs y compris.
En génétique inverse, les indices permettant de localiser un gène proviennent de la comparaison de la transmission d'un phénotype, supposé induit par un gène muté ou par un allèle donné, avec la transmission de marqueurs connus, au sein d'une même famille.
Ces données de co-ségrégation d'un phénotype et d'un marqueur permettent d'établir une analyse de liaison génétique.
La co-transmission d'un phénotype et d'un marqueur suggère que le gène responsable du phénotype et le marqueur sont physiquement proches l'un de l'autre sur le chromosome. La liaison est déterminée par l'analyse du schéma de transmission d'un gèné
et d'un marqueur dans des familles qui s'y prêtent.
L'analyse de liaison repose sur la co-transmission de certaines formes de marqueurs avec la forme défectueuse, ou modifiée d'un gène. Mais c'est une analyse indirecte dans le sens où d'une part, lors d'une première étape, un phénotype est associé à
la forme défectueuse ou modifiëe du gène. Une erreur dans l'assignation de certains phénotypes fausse l' étude. D' autre part, cette étude est basée sur des statistiques, ces statistiques reposant sur l'analyse d'un échantillon de la population, il s'agit donc d'un sondage. Enfin, il faut noter que lorsqu'il est possible d'associer un allèle particulier du marqueur avec un allèle du gène (en fait un phénotype), cette association n'est a priori S valable que pour les échantillons inter-familiaux.
Le résultat des analyses de liaison dépend évidemment du degré de liaison entre le marqueur et le locus de la maladie. Cinq centimorgans (S cM) est considéré
comme un minimum de liaison pour un diagnostic. Une liaison à S cM signifie que l'on a 9S% de chances d'arnver à une conclusion correcte et seulement 1 chance sur 20 qu'une recombinaison soit survenue entre le marqueur et le locus de la maladie.
Par le terme gène, dans le.cadre de la présente invention, on entend non seulement la partie strictement codante, mais également les. parties non codantes telles que les introns, et les parties régulatrices, en S' et 3', les UTR (ITnTranslated Region), notamment le ou les promoteurs, <e enhancers ~>, etc...associés. ,_ ., , ., 1S .
Les inventeurs ont identifié 3 régions chromosomiques ;distinctes, appartenant aux chromosomes 3, S et 11 et qui sont impliquées dans la canitie précoce. Ces 3 régions sont chacune des régions ou zones chromosomiques de l'invention. Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence l'implication de certains gènes appartenant à
ces régions chromosomiques, appelés gènes de l'invention.
Selon un premier aspect, l'invention concerne les gènes KIA.A1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097 du chromosome 3 humain, identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de ces gènes, tels que les produits de transcription ou d'expression.
Ces gènes 2S appartiennent à la première zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 3 par les marqueurs microsatellites D3S1277 et D3S1285. Cette zone sera plus particulièrement dénommée « première zone chromosomique de l'invention ».
Les 5 gènes mentionnés seront plus particulièrement dénommés les S gènes de l'invention du chromosome 3.
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC2SC, EGRl, CSorf6, CSorf7, LOCS1308, ETF1, HSPA9B, PCDHAl à PCDHAl3, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRAl, CSorf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ1171S1 du chromosome S humain identifiés par les .$
inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et les utilisations des pxoduits dérivés de ces gènes, tels que des produits de transcription ou d'expression.
Ces gènes appartiennent à la deuxième zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 5 par les marqueurs microsatellites DSS2115 et DSS422. Cette zone sera plus particulièrement dénommée <e deuxième zone chromosomique de l'invention ». Les gènes mentionnës seront plus particulièrement dénommés les gènes de l'invention du chromosome 5.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne les gènes GUCYlA2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, ~TAGLN, PCSK7 et ENS300650 du ' chromosome 11 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans~la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de ces gènes, ,tels que des produits de transcription ou d'.expression. Ces gènes appartiennent à la troisième zone chromosomique de l'invention qui;, est délimitée sur le chromosome 11 par les.marqueurs microsatellites D115898 et D115925. Cette zone sera plus particulièrement dénommée «
iroisièrne zone chromosomique de l'invention ». Les 18 gènes mentionnés seront plus particulièrement dénommés les 28 gènes de l'ïnvention du chromosome I 1.
Les gènes KTAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3, AL133097, KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGRl, CSorf6, CSorfl, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAl à
PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLR.Al, CSorf3, MFAP3, GALNT10, FLJ1I715, GUC~1A2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOCS 1092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650 seront dénommés gènes de l'invention.
Pour les trois zones chromosomiques identifiées ci-dessus, la présente invention couvre des fragments polynucléotidiques ayant une longueur minimale de 18 nucléotides, correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention, ces fragments d'ADN ayant la caractéristique fonctionnelle d'être impliqués dans la canitie, ou bien dans la canitie précoce, et éventuellement dans les deux phénomènes.
Selon une possibilité envisagée par la présente invention, un fragment impliqué
dans la canitie ou la canitie précoce et possédant une sëquence répondant aux exigences mentionnées plus haut peut être utilisé en thérapie.

Plus particulièrement, le premier aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 3 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097. Ces gènes sont compris dans la première zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 3 par les marqueurs microsatellites D3S1277 et D3S1285.
Le deuxième aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 5 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans Ia canitie précoce.
Selon cet aspect, uri'fragnient tel qûe couvert par l'invention a une séquence côrrespondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C,r'EGRI, CSorf6, CSorf7, LOC51308, ETFI, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R~ RPL7; PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP; GLR.Al, C5orF3, MFAP3GALNT~10 et FLJ11715. Ces gènes sont compris dans la deuxième zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 5 par les marqueurs microsatellites DSS2115 et DSS422.
Le troisième aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 11 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce.
Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome I1 humain choisi parmi les gènes GUCYlA2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. Ces gènes sont compris dans la troisième zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 11 par les marqueurs microsatellites D11S898 et D11S925.
Le fragment polynucléotidique dont iI est fait référence dans le cadre de l'invention correspond à un fragment d'un chromosome. Ce fragment a une longueur minimale de 18 nudéotides, et une Ionglie»r maximale qui peut aller jusqu'à la longueur totale du gène en question, ou de plusieurs gènes de l'invention. De préférence, le fragment a un nombre de nucléotides supérieur à 18. Une longueur particulièrement préférée est comprise entre 18 et 10000 nucléotides, de préférence entre 30 et 8000 nucléotides.
Selon des variantes préférées de l'invention, il est fait référence à des fragments dont Ia longueur est comprise entre 30 et 5000 nucléotides, de préférence entre 50 et 3000 nucléotides, par exemple entre 100 et 2000 nucléotides, ou entre 200 et 1000 nucléotides.

lo L'invention concerne également l'utilisation en cosmétique ou en thérapie ~
d'un fragment polynucléotidique ou du produit d'expression d'un fragment ou d'un agent modulant la fonction d'un fragment, ou bien d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment, où Ie fragment en question correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 choisi parmi les gènes GUCYlA2, CULS, ACATl, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS3o394I, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, ou tout ou partie d'un gène du chromosome 5 choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGRI, CSorf6, CSorf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHAl3, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPSI4, NDST1, G3BP, GLRAl, CSorf3,1V1FAP3, GALNTIO
et FLJl 1715, ou tout ou partie d'un gène du chromôsome 3 choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK; CACNAID, ARHGEF3 et AL133097.~Selon un cas préféré, le fragment .
corresponel plus particulièrement à tout ou partie d'un exon de l'un de ces gènes.
D'ans ~cé' qui sûit; seront désignés « produits de l'invention », le fragment, le IS produit d'éxpression d'un~fragment, l'agent modulant la fonction d'un fragment, et l'agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique correspondant à tout ou partie de l'un des gènes de l'invention.
Pour les gènes identifiés par les inventeurs, la prësente invention concerne tout d'abord des utilisations dans le domaine de la cosmétique. On entend par cosmétique ~ toute application qui ne tend à modifier que l'esthétique et n'a aucune visée thérapeutique.
Pour toutes les utilisations selon l'invention dans le domaine de la cosmétique, le produit de l'invention peut être conditionné sous différentes formes appropriées, seul ou en combinaison avec d'autres agents. En particulier, des formes préfërées sont destinées à des applications locales et elles concernent les crèmes, les lotions, les gels, les émulsions, les pommades et les shampoings. D'autres formes sont aussi envisageables pour des utilisations selon l'invention, en particulier sous forme de pilules pour une administration orale.
Parmi les différentes visées cosmétiques dans le cadre de la présente invention, un domaine particulièrement préféré est celui de la pigmentation. La pigmentation peut être celle de la peau ou bien des phanères. Il peut s'agir de la couleur de la pigmentation comme de l'absence de pigmentation ; les problèmes touchant à Ia qualité et à
l'intensité
de Ia pigmentation sont aussi concernés par la présente invention.

En particulier, (objet de (invention se rapporte à (utilisation d'au moins un produit de (invention pour prévenir et/ou limiter et/ou arrêter le développement de la canitie.
L'objet de l'invention se rapporte aussi à (utilisation d'au moins un produit de l'invention pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique de la canitie caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à
traiter une composition comprenant au moins un produit de (invention.
L'invention se rapporte aussi à un procédé traitement cosmétique destiné à
favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des 'poils gris ou blancs caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une composition comprenant au moins un produit de (invention. ~ .
Les zones à traiter peuvent être, par exemple et . sans aucune limitation, Ie cuir chevelu, lës sourcils, la moustache et/ou la barbe. , > . .
Plus particulièrement, les procédés de traitement de la. canitie .et de pigmentation naturelle des cheveux et/ou poils gris ou blancs consistent à appliquer une composition comprenant au moins un produit de (invention.
Les procédés de traitement pour lutter contre la canitie et/ou pour stimuler la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs peuvent par exemple consister à appliquer la composition sur les cheveux et le cuir chevelu, le soir, garder la composition toute la nuit au contact et éventuellement effectuer un shampooing le matin ou laver les cheveux à l'aide de cette composition et à laisser à nouveau en contact quelques minutes avant de rincer. La composition conforme à (invention s'est révélée particulièrement intéressante lorsqu'elle est appliquée sous forme de lotion capillaire, éventuellement rincée ou même sous forme d'un shampooing.
Pour les gènes identifiés dits « gènes de l'invention », la présente invention concerne ensuite des utilisations thérapeutiques dans le domaine de ta pigmentation.
Les affections touchant le système de pigmentation, que ce soit celui de la peau ou celui des phanères, peuvent avoir de graves conséquences sur la santé des personnes atteintes. En effet, la pigmentation de la peau joue le rôle de barnère protectrice face aux agressions lumineuses en particulier, les personnes souffrant d'albinisme sont dépourvues de protection faces aux rayons du soleil qui constituent pour eux un danger important.

D'autres affections mettant en jeu la pigmentation sont aussi concernées par la présente invention.
Dans le cadre des utilisations thérapeutiques et cosmêtiques tendant à
modifier une caractéristique de la pigmentation, il s'agit de préférence de la pigmentation de la peau. Selon d'autres cas envisagés par la présente invention, le type de pigmentation qui doit être modifiée concerne la pigmentation des phanères, en particulier les ongles ou les poils.
Selon un cas particulier préférë de la présente invention, la pigmentation dont on cherche à modifier les caractéristiques est celle du système pileux en général et de la chevelure, moustache et sourcils en particulier. La présente.invention permet de modifier le phénomène d'arrêt de -la pigmentation des cheveux, c'est-à-dire la canitie, en particulier lorsque celle-ci survient de manière prématurée chez une personne et que l'on parle de canitie précoce:
Pour, toutes les:.utilisations en thérapeutique, les produits actifs entrant dans la composition :: d'un mëdicament sont de préférence associés. à des excipients pharmaceutiquement acceptables. Toutes les voies d'administration considérées comme acceptables peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention, en particulier voie intradermique, intraveineuse, musculaire, orale, otique, nasale, optique. La formulation est de préférence adaptée à la voie d'administration choisie.
20. Les utilisations pour la fabrication d'un médicament selon l'invention peuvent faire entrer dans leur formulation d'autres principes actifs. De même, l'administration d'un médicament comme défini dans l'invention peut être combinée avec l'administration d'un autre médicament, que cette administration soit simultanée, séquentielle ou séparëe.
De même, les différents produits dont il est fait usage dans le cadre des utilisations en thérapie, peuvent être combinés et entrer dans Ia composüion d'un unique médicament ou bien peuvent servir à la fabrication de différents médicaments.
En particulier, s'ils entrent dans la composition de médicaments distincts, ils peuvent être administrés à des fréquences différentes.
Les caractéristiques et les variantes préférëes des produits dont il est fait usage dans les utilisations selon l'invention peuvent être identiques dans le cadre des utilisations en cosmétologie et pour des utilisations du même produit dans la fabrication d'un médicament.

Dans les deux cas, l'utilisation de produits selon l'invention peut nécessiter que Ie produit soit introduit dans un fluide corporel, ou bien dans des tissus, ou dans des cellules.
Pour l'introduction dans des cellules, l'utilisation peut prévoir que le produit soit actif dans le cytoplasme des cellules, ou bien dans Ie noyau cellulaire.
La première utilisation, cosmétique ou thérapeutique, envisagée dans le cadre de l'invention est l'utilisation d'un fragment polynucléotidique dont la séquence correspond, au moins en partie, à l'un des gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, le fragment polynucléotidique entre dans la fabrication d'un médicament.
Concernant la nature chimique de ce fragment polynucléotidique, il peut s'agir d'une molëcule d'ADN, simple ou double brin, circulaire ou Linéaire, d'une molécule d'ARN ôu de toute autre molécule envisagée dans la définition de fragment polynuclé'otidique donnée plus haut.
Concérnant son environnement, ce fragment' peutv être ow faire partie d'uw plasmide'd'uri 'génome viral ou d'un autre type de vectéur. Il péixt, dans d'autres cas, faire partie dü gériôme d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour comporter ce fragment dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant ce fragment, il est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si Ie fragment est inséré dans un vecteur, le dit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement Ia traduction du fragment. Ce fragment peut aussi être entouré
par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique, conduisant éventuellement à l'insertion du fragment de l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
Le fragment polynucléotidique tel que décrit peut se trouver sous forme naturelle ou bien être de nature synthétique, ou bien être en partie l'un et en partie l'autre, en particulier s'il s'agit d'une molécule « duplex » constitué de deux brins aux origines différentes. Selon différents cas envisagés par la présente invention, le fragment polynucléotidique peut êire isolé, il peut avoir subi une étape de purification. Il peut s'agir aussi d'un fragment recombinant, par exemple synthëtisé dans un autre organisme. Selon un exemple préféré, il s'agit d'un fragment d'ADN ayant été amplifié par PCR
(Polymerisation Chain Reaction) puis purifié.
Selon d'autres constructions envisagées par la présente invention, la première utilisation fait usage d'un fragment polynucléotidique associé à une sonde.
Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation du fragment, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. La sonde peut aussi permettre de suivre la dégradation du fragment. La nature de la sonde est de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. L'homme du métier saura quelle sonde est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Le fragment polynuclëotidique, dont il est fait usage dans le cadre de cette premiëre utilisation selon l'invention, peut être utilisé dans un test d'hybridation, un séquençage, un microsëquençage ou bien un test de détection de mésappariement.
Ce ~ fragment selon l'invention contient au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides constituant une séquence qui correspond~.à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou à toutou partie de l'un des gènes de I'inventiôn du' chromosome 5 ou tout ou partie de l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11. ~ En particulier, un fragment selon l'invention peut ne contenir que 18 IS bases complémentaires de 18 bases successives de l'un des gènes de l'invention.
Selon un autre cas particulier, le fragment décrit peut être l'ADNc ou l'ARN
de l'un des gènes précédemment décrits. Il peut correspondre à un ou plusieurs exons de l'un des gènes de l'invention, il peut correspondre à une séquence de régulation de l'un de ces gènes identifiés sur les chromosomes 3, 5 et 1 I.
Dans le cadre de cette première utilisation, le nombre de , fragments polynucléotidiques tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul.
En particulier, il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à l'un des gènes de l'invention au sein des régions chromosomiques de l'invention. De préférence, les séquences des différents fragments correspondent à des gènes de l'invention distincts ou à des exons distincts.
Cette première utilisation selon I'invenüon est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.

Selon un cas particulier envisagé, la première utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un fragment nucléotidique tel que décrit ou non.
Dans le cas oû un gène responsable de la pigmentation est défectueux car muté,

5 cette première utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un fragment polynucléotidique qui représente une nouvelle copie sauvage du gène endogène défectueux.
Dans le cas oû l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette première utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant 10 un ARN antisense qui va bloquer la traduction dudit gène.
IJne deuxième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à un gène choisi parmi les gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la 15 fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
IJn tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'un des gènes de l'invention identifiés par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction d'une séquence endogène comprise dans l'un de ces gènes de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette deuxième utilisation selon l'invention module non seulement la fonction d'un fragment d'ADN exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN
endogène correspondant.
Le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement â l'un des 5 gênes de l'invention du chromosome 3. Alternativement, le fragment d'ADN
dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à l'un des gène de l'invention du chromosome 5, ou bien à l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11.
En particulier, il peut s'agir d'un plasmide ayant uniquement une courte séquence correspondante à l'un des gènes mentionnés. De préférence, Ia correspondance des séquences est établie sur au moins 18 nucléotides successifs.
Toutes les remarques qui précèdent, dans la partie définition, sur ce qu'il faut entendre par « fonction d'mi fragment d'ADN » sont valables pour envisager toutes les utilisations correspondant à une deuxième utilisation selon l'invention.

Etant donné la pluralité de fonctions des fragments d'ADN, la modulation de ces fonctions comprend des aspects très différents. Dans Ie cas particulier où la fonction dudit fragment est d'être transcrite, moduler une telle fonction consïste à
favoriser ou inhiber la capacité dudit fragment à être transcrit. Cela peut aussi consister à modifier le site d'initiation et de terminaison de la transcription, ou bien à modifier le taux d'initiation de Ia transcription. Selon un autre cas, moduler la fonction peut aussi consister à modifier l'épissage de l'ARN, par exemple en modifiant des signaux de reconnaissance de l'ADN
responsables Ia répartition entre introns et exons.
Quand le fragment d'ADN appartient à une séquence régulatrice, modifier sa IO fonction peut consister à inhiber la fixation des enhancers ou dés inhibiteurs. Elle peut consister au contraire à favoriser leur fixation, ou bien à favoriser Ia fixation d'autres facteurs de transcription. Il en est de même lorsqu'il s'agit de séquences utilisées par l'ARN polymérase. . , .
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, comme dans .le cadre de toutes les autres utilisations selon l'invention, le nombre de produits, a.en l'occurrence d'agents modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à.
l'un des gènes de l'invention, n'est pas limité et peut être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette deuxième utilisation, les diffêrents agents dont il est fait usage ont en commun de tous moduler Ia fonction de fragments d'ADN
dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'une même région chromosomique de l'invention. Selon Ie premier aspect de l'invenüôn, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 11 respectivement. Les différents agents peuvent moduler le même gène d'une des régions, ou bien différents gènes au sein d'une région de l'invention.
Des agents selon l'invention sont par exemple des molécules d'ADN simple brin capable de se fixer à des sous-régions définies de l'un des gènes de l'invention, pour former des triples hëlices. Dans ces conditions, des agents selon l'invention abolissent la fonction de la sous-région à laquelle ils s'hybrident.
D'autres agents selon l'invention sont de préférence des polypeptides capables d'interagir avec des sous-régions définies de l'un des gènes de l'invention.
De préférence, des agents selon l'invention sont des enhancers ou des inhibiteurs se fixant sur des régions régulatrices de l'un des gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou de l'un de ceux du chromosome 5 humain, ou de l'un de ceux du chromosome 11.
Une autre catégorie d'agents selon l'invention concerne des molécules capables d'interagir avec des régions précises de l'ADN pour en changer sa conformation. Une autre catégorie concerne des molécules interagissant avec des inhibiteurs ou des enhancers pour en modifier Ieur fonction, les inhibiteurs ou enhancers ayant la fonction initiale de modifier l'expression de fragments d'ADN appartenant à l'un des gènes de l'invention.
Un agent dont iI est fait usage selon cette deuxième utilisation de l'invention peut en particulier moduler la fonction d'un fragment d'ADN correspondant à 18 bases successives de l'un des gènes précédemment décrits.
Cette deixxième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique. Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapéutique, dans le domaine de la pigmentation. : , .
Selon utï cas particulier envisagé, la seconde utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction d'un fragment d' ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est xesponsable de Ia dëpigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, par exemple, à
sa région promotrice.
Dans le cas où l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va activer Ia transcription dudit gène, par exemple en se fixant à
sa région promotrice, ou bien en se fixant à un éventuel inhibiteur qui cessera de ce fait d'inactiver ledit gène.
Une troisième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à
l'un des gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
En particulier, un tel agent selon l'invention module la fonction d'un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3. Selon un autre cas, un agent selon l'invention module la fonction d'un polypeptide issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés.
Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée, peut correspondre au moins en partie à un gène de l'invention du chromosome 5, ou bien à un gène. de l'invention du chromosome 11.
Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à
l'un des gènes de l'invention identifiés par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'une séquence endogène de l'un de ces gènes de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette troisième utilisation selon l'invention module non. seulement la fonction d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN.endogène correspondant.
Moduler la fonction d'un polypeptide peut être réalisë dë différentes manières. En particulier, il est possible, de croître ou décroître son activité, son xendérnent, sa spécificité, son avidité pour itn antiçorps~ il est possible de modifier son substrat pour une enzyme, son taux de conversion.
Des agents selon l'invention sont de prëfêrence des molécules d'ARN, dites ARN
antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN
corréspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention. D'autres agents remplissant les mêmes rôles peuvent être des molécules d'ADN simple brin, ou bien des molécules hybrides ADN-ARN. Le rôle de ces agents selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit.
D'autres agents préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables de se fixer sur ledit transcrit et ainsi d'en moduler sa traduction. De tels agents de la classe des polypeptides peuvent être d'origine naturelle ou synthétique (synthétisés chimiquement ou par voie biotechnologique). Notamment il peut s'agir d'anticorps. Comme mentionné plus haut, cette modulation peut se traduire par l'action de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit. En particulier, l'interaction entre le polypeptide et ledit transcrit peut constituer un obstacle à la fixation normale des ribosomes.

Des agents tels que définis dans la présente invention peuvent moduler la fonction de Ia protéine codée par un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à
l'uri des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 ou l'un des gènes de l'invention du chromosome 5 ou l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11. Ces agents sont ou non de nature protéique. Un agent selon l'invention peut intervenir à un stade précoce en empêchant le repliement correct de la protéine. Un agent selon l'invention peut aussi modifier la fonction de ladite protéine en modifiant sa structure tridimentionnelle après le repliement. Il est aussi envisageable que cet agent soit un inhibiteur de la protéine, en particulier un inhibiteur compétitif.
Les agents qui peuvent convenir dans le cadre de la présente invention ne sont pas limités à ceux cités précédemment. - . , Dans le,~ cadre de cette troisième utilisation, le nombre d'agents modifiant la fonction d'un prtiduit d'expression tels que définis précédemment n'èst pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul.
Cependant, dans le cadre de cette troisième utilisation, les différents agents dont il est fait usage ont en commun de tous moduler la fonction de produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un gène d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs.
Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et respectivement.
Cette troisième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de Ia cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une açtion thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la troisième utïlisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette troisième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN antisens qui va bloquer la traduction dudit gène en empêchant le passage A RN-protéine. Une autre situation préférée consiste à choisir pour agent uu anticorps capable de se fixer sur la protéine résultant de la traduction dudit gène.
Une quatrième utilisation envisagée par Ia présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un produit d'expression 5 d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invenüon.
Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. Dé prëférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
En particulier, un tel produit d'expression est le transcrit ARN issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des 5 gènes de l'invention du 10 chromosome 3, ou bien l'un des gènes de l'invention u chromosome ~5, ou bien l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11, quelque soit Ie stade de matiwation dudit transcrit.
En cas d'épissage, le transcrit peut donc être de taille inférieure au fragment d'ADN dont il est issu. De préférence, si le produit d'expression est wne iriolécule d'ARN, elle comporte au moins 18 rlucléotides.
15 Selon un autre cas préféré, un produit d'expression selon l'invention est issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés. Un tel produit d'expression peut donc comporter moins de 6 acides aminés si le transcrit dont il est issu a subi des étapes d'épissage. De préférence, un produit d'expression peptidique contient au moins 6 acides aminés.
Le produit d'expression selon l'invention ne provient pas nécessairement des 20 ëtapes de transcription ou de traduction d'ADN génomique. En particulier, un produit d'expression utilisé selon l'invention peut être un produit d'expression issu d'ADN
exogène dont une partie de la séquence au moins correspond à une partie de l'un des gènes de l'invention.
Est aussi envisagée par la présente invention l'utilisation d'un agent parfaitement synthêtique mais semblable au produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène ou endogène correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention.
Des produits d'expression tels qu'utilisés par la présente invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention. En particulier, pour former des ARN anti-sens ayant pour cible un ARN
spécifique, il est envisageable d'utiliser des ARN issus de la transcription de la même séquence d'ADN que la cible mais non pas du brin leader, mais de sa séquence complémentaire portée par l'autre brin. On obtient ainsi des fragments d'ARN

complémentaires des fragments cibles normalement synthétisés par la cellule.
Le rôle attendu de ces produits d'expression selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction des transcrits normalement synthétisés par la cellule.
D'autres produits d'expression préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables d'introduire un changement dans le fonctionnement de la cellule dans laquelle elles agissent.
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, le nombre de produits d'expression d'un fragment d'ADN dont la séquence appartient ou correspond au moins en I0 partie à l'un des gènes de l'invention, n'est pas limité et peut'être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette quatrième utilisation, les différents produits dont il-est fait usage ont en commun d'être tous des, produits d'expression de fragments d'ADN, dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un gène d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième .aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 11 respectivement.
Cette quatrième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la quatrième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN anti-sens qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, au transcrit synthétisé par la cellule.
Dans le cas où l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant dans la cellule ou bien une molécule d'ARN permettant la synthèse de la protéine codée par le gène ou bien la protéine codée par le gène.

Pour les quatre types d'utilisations décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation.
Pour les quatre types d'utilisation décrits précédemment, le produit de (invention pourra être incorporé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique.
Une telle composition comprend, dans un milieu pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable, une quantité de produits de (invention comprise entre 0,001 et % en poids par volume.
La composition peut être administrée par voie orale ou appliquée sur la peau (sur 10 toute zône cutanée dû corps) et/ou Ie cuir chevelu ou les cheveux.
Par voie orale, la composition peut contenir le ou les produits de (invention en solution dans un liquide alimentaire tel qu'une solution aqueuse ou hydroalcoolique, éventuellement aromatisée. Ils peuvent également êtrè incorporés dans un excipient solide ingérable et se présenter par exemple sous forme de granulés, de pilules, de comprimés ou de dragées. Ils peuvent également être placés en solution dans un liquide alimentaire lui-même éventuellement conditionné dans des capsules ingérables.
Selon le mode d'administration, la composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées, particulièrement en cosmétologie.
Une composition préférée de (invention est une composition cosmétique adaptée à une application topique sur le cuir chevelu etlou la peau.
Pour une application topique, la composition utilisable peut être notamment sous Ia forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou serai-liquide du type Lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle du type crème ou gel aqueux ou anhydres, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elle peut ainsi se présenter sous forme d'onguent, de teinture, de crème, de pommade, de poudre, de timbre, de tampon imbibé, de solution, d'émulsion ou de dispersion vésiculaire, de lotion, de gel, de spray, de suspension, de shampooing, d'aérosol ou de mousse. Elles peuvent être anhydres ou aqueuses.
Elle peut également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.

La composition peut en particulier être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les S cheveux, de masque.
Lorsque (invention consiste en une utilisation à des fins cosmétiques, la composition sera préférentiellement une crème, une lotion capillaire, un shampoing ou un après-shampoing.
Les quantités des différents constituants des compositions utilisables sont celles classiquement utilisëes dans les domaines considérés.
Lorsque la composition est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5% à 80% en poids, et de préférence de 5%:~à SO% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les . émulsionnants et les co-émulsionnants utilisés dans là compo ition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. L'émulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% à 30% en poids, et de préférence de 0,5 à 20% en poids par rapport au poids total de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques.
Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus d Dans une variante, la composition sera telle que le ou les produits de (invention sont encapsulés dans un enrobage tel que des microsphères, des nanosphères, des oléosomes ou des nanocapsules, (enrobage sera choisi selon la nature chimique du produit de (invention.
A titre d'exemple, les microsphères pourront être préparées selon la méthode décrite dans la demande de brevet EP 0 375 520.
Les nanosphères pourront se présenter sous forme de suspension aqueuse et être préparées selon les méthodes décrites dans les demandes de brevet FR 0015686 et FR 0101438.
Les oléosomes consistent en une émulsion huile dans eau formée par des globules huileux pourvus d'un enrobage cristal liquide lamellaire dispersé dans une phase aqueuse (voir les demandes de brevet EP 0 641 557 et EP 0 705 593).

Les produits de (invention pourront aussi être encapsulés dans des nanocapsules consistant en un enrobage lamellaire obtenu à partir d'un tensio-actif siliconé (voir la demande de brevet EP 0 780 I15), les nanocapsules pourront également être préparées à
base de polyesters sulfonique hydrodispersibles (voir la demande de brevet FR
0113337).
Les produits de (invention pourront également être complexés à la surface de globules huileux cationiques, quelque soit leur taille (voir les demandes de ~
brevet EP 1 010 413, EP 1 010 414, EP 1 010 415, EP 1 010 416, EP 1 013 338, EP 1 016 453, EP 1 018 363, EP I 020 219, EP 1 025 898, EP 1 120 101, EP 1 120 102, EP 1 129 684, t EP 1 160 005 et EP 1 172 077).
Les produits de l'invention peuvent enfin être complëxés à ~ la surface de nanocapsules ou nanoparticules pourvues d'un enrobage lamellaire (Voir EP 0 447.318 et EP 0 557 489) et contenant un tensio-actif cationique à la surface (voir les références citées précédemment pour les tensio-actifs cationiques).:
En pârticulier, on préférera une composition tellë que, (enrobage du ou des produits de (invention a un diamètre inférieur ou égal à 10 p,m.
De façon connue, la composition peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique, et par exemple de 0,01% à 10% du poids total de Ia composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques.
Comme huiles ou cires utilisables, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffine. On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique).
Comme émulsionnants utilisables, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de Tefose~ 63 par la société Gattefosse.

Comme solvants utilisables, on peut citer les alcools inîérieurs, notamment féthanol et fisopropanol, le propylène glycol.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables, on peut citer Ies polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères 5 d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que fhydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et 1~, silice hydrophobe, éthylcellulose, polyéthylène.
IO Les çompositions peuvent associer au moins un produit de (invention à
d'autres agents actifs. Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exémple les agents modulant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation des cellules de la peau tels que le rétinol et ses esters, la .=vitamine D et ses dérivés, les oestrogènes tels que-foestradiol, les modulateurs de l'AMPc.tels:que les dérivés de POMC, 15 (adénosine, .ou la . forskoline et ses dérivés, les prostaglandines et .leurs dérivés, la triiodotrionine et ses dérivés ;
- des extraits de végétaux tels que ceux d'Iridacées ou de soja, extraits poûvant alors contenir ou non des isoflavones ;
- des extraits de micro-organismes ;
20 - les agents anti-radicaux libres tels que fa-tocophérol ou ses esters, les superoxyde dismutases ou ses mimétiques, certains chélatants de métaux ou (acide ascorbique et ses esters ;
- les anti-séborrhéiques tels que certains acides aminés soufrés, (acide 13-cis rétinoïque, (acétate de cyprotérone ;
25 - les autres agents de lutte contre les états desquarnatifs du cuir chevelu comme le zinc pyrithione, le disulfure de sélénium, le climbazole, (acide undécylénique, le Kétoconazole, la piroctone olamine (octopirox) ou la ciclopiroctone (ciclopirox) ;
en particulier, il pourra s'agir d'actifs stimulant la repousse et/ou favorisant le ralentissement de la chute des cheveux, on peut plus particulièrement citer à
titre non limitatif - les esters d'acide nicotinique, dont notamment Ie nicotinate de tocophérol, le nicotinate de benzyle et les nicotinates d'alkyles en C1-C6 comme les nicotinates de méthyle ou d'hexyle ;

- les dérivés de pyrimidine, comme le 2,4-diamino 6-piperidinopyrimidine 3-oxyde ou "Minoxidil" décrit dans les brevets US 4,139,619 et US 4,596,812 ;
- les agents inhibiteurs de lipoxygenase ou inducteur de cyclo-oxydase favorisant la repousse des cheveux comme ceux décrits par la Demanderesse dans la demande de S brevet européen EP 0 648 488 ;
les agents antibactériens tels que les macrolides, les pyranosides et les tétracyclines, et notamment fErythromycine ;
- les agents antagonistes de calcium, comme la Cinnarizine, la Nimodipine et la Nifedipine ;
- des hormones, telles que festriol ou des analogues, ou la thyroxine et ses sels ;
- des agents antiandrogènes, tels que foxendolone, la spironolactone et Ia flutamide ; ' ' - des inhibiteurs stéroïdiens ou non stéroïdiens des; S-a-réductases tels que ceux décrits par lâ 'Dériîânderessé dans les demandes de brevét etirôpéen 'ÉP O 964 8S2 et 1S EP 1 068 8S~ ou encore le fnastéride ;
- des agonistes des canaux potassiques dépendant de fATP tels que la cromakalim et le nicorandil.
Dans une autre possibilité de mise en aeuvre, la présente invention concerne des procédés pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu.
En effet, la canitie précoce est un phénotype qui a été défini par les inventeurs comme étant, entre autres, caractérisé par l'apparition des premiers cheveux blancs tôt dans la vie, et de préférence vers l'âge de 18 ans. Comme ce phénotype est transmis à la génération suivante, il peut s'avérer important, pour les individus dont un parent ou un proche est atteint, de déterminer, avant l'apparition des symptômes, s'ils seront ou non 2S sujets à cette atteinte. Le procédé de diagnostic selon l'invention est parfaitement adapté
aux individus âgés de moins de 18 ans.
Comme il est très probable que des facteurs environnementaux jouent un rôle dans le phénotype « canitie » comme dans celui « canitie précoce », il s'agit, grâce aux procédés de l'invention, d'évaluer les risques de développer un tel phënotype, c'est-à-dire une prédisposition à la canitie précoce.
Un procédé selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'un ou de plusieurs marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Par marqueur, on entend une séquence d'ADN dont les différentes variations alléliques sont porteuses d'informations. Un tel marqueur 'peut être une courte séquence d'un gène dont la mutation est source du phénotype. Il peut s'agir aussi d'un marqueur situé physiquement sur le chromosome dans une région très proche d'un gène impliqué dans la canitie précoce. De préférence, le marqueur est un SNP ('single nucleotide polymorphism').
Selon un premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 3 humain comprenant les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de l'un de ces gènes.
Selon un, 'deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome S humain comprenant les gènes KLHL3, HIVRPAO, CDC25C, EGRl, CSorf6, CSorf7, -LOC51308, ETF1, HSPA9B, P.CDHAl à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRAl, CSorf3, MFAP3, GALNT10 et,FLJ11.715. De ;préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de:l'un de ces gènes.
Selon un.~ troisième aspect d'un procédê de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome l1 humain comprenant les gènes GUC~lA2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la sëquence de l'un de ces gènes.
L'ëtape suivante de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour Ie ou les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents dans un échantillon de matériel génétique issu de l'individu qui subit le test diagnostique. Deux allèles différents, portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
L'échantillon contenant le matëriel génétique peut être le sang, une unique goutte étant suffisante pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention.
D'autres échantillons de fluides corporels peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Il est aussi envisageable d'utiliser quelques cellules issues de l'individu. L'homme de l'art saura déterminer quel échantillon pourra être utilisé dans le cadre de ce test, tout en minimisant le dësagrément pour l'individu le subissant. Ce test diagnostic pourra éventuellement être couplé avec d'autres tests génétiques.

Les techniques courantes, bien connues du biologiste moléculaire, peuvent être utilisées pour effectuer la détermination des allèles du ou des marqueurs choisis ; des tests d'hybridation sont en particulier très courants dans ce genre d'étapes.
Divers marqueurs sont potentiellement préférés dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de l'invention. En particulier, des marqueurs bi-alléliques peuvent s'avërer particulièrement adéquats si une forme allélique traduit une prédisposition à
la canitie précoce alors que l'autre forme .allélique reflète au contraire l'absence d'une telle prédisposition. D'autres marqueurs plus courants sont polymorphiques et peuvent être trouvés sous au moins deux formes alléliques et généralement plus de deux.
Parnii les marqueurs qui peuvent être sélectionnés à la première étape du procédé
de l'invention, des marqueurs particulièrement bien connus sont les SNPs. Lors de la sélection du° marqueur, il est très important de se baser ~ sur la valeur informative du polymorphisme du marqueur. Une situation: particulièrément. privilëgiée consiste à
sélectionner ün marqueur dbnt certains variants alléliques traduisent une prédisposition à la canitie précoce alors que tous les autres variants reflètent au contraire l'absence d'une telle prédisposition. Dans de nombreuses situations, le marqueur ne remplit pas entièrement une telle condition, c'est-à-dire que par exemple certains allèles sont présents préférentiellement mais non exclusivement chez les individus prédisposës à la canitie.
Dans ces situations, il peut être très judicieux de sélectionner plusieurs marqueurs, afin d'établir un test diagnostic aussi fiable que possible.
Lorsque les marqueurs sélectionnés sont des SNP, les différents variants allëliques correspondent à la modification d'une base. Une situation particulièrement avantageuse à
rechercher lors de la sélection du marqueur, correspond à la situation où
certains allèles (modification d'une base) sont caractéristiques d'une prédisposition à la canitie précoce.
Selon le premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les SNPs du chromosome 3 mentionnés dans le tableau récapitulaüf de l'exemple 2.
Selon le deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les SNPs du chromosome 5 mentionnés dans le tableau récapitulatif de l'exemple 2.
Selon le troisième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les SNPs du chromosome 11 mentionnés dans le tableau récapitulatif de l'exemple 2.

Les procédés de l'invention ne sont pas limités aux deux étapes décrites et peuvent contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique du ou des marqueurs sélectionnés à la forme allélique de ce ou de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'établir le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
IO Etant donné que la canitie . précoce est 'une atteinte vraisemblablement multigénique, les causes de prédisposition sont nombreuses et peuvent difficilement être .
toutes envisagées de manière exhaustive. Par contre, au sein d'une même famille dont certains membres ont:~été précocement atteints de canitie, il est très probable que la cause de la susceptibilité est unique. De- ce fait, lors de l'étape de comparaison, mentionnée comme éventuelle troisième ëtape des procédés de l'invention, une comparaison particulièrement riche en information est la comparaison des allèles du marqueur de l'individu subissant le test aux allèles du même marqueur pour les personnes de sa famille dont le phénotype est connu. Si plusieurs marqueurs ont été sélectionnés, il faut de préférence répéter cette opêration pour tous les marqueurs.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules ayant un effet particulier. En particulier, l'invention concerne un procédé
d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique.
Selon le premier aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on chercha à
moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond â tout ou partie d'un géne du chromosome 3 humain choisi parmi , les gènes KIAA1042, CCK, CACNAlD, ARHGEF3 et AL133097. Selon le deuxième aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, IiNRPAO, CDC25C, EGRl, CSorf6, CSorf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAl à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, CSorf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715. Enfin, selon le troisième aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOCS 1092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650.
5 Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction de l'un ou l'autre de ces fragments comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du fragment polynucléotidique. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le fragment polynucléotidique mise en évidence 10 par une technique de détection de ligands.
La « deuxième utilisation selon l'invention » est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à un des gènés de l'invention. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents::.
Les différentes fonctions que peuvent xevêtir un fragments polyuucléotidique ont 15 déj à été explicitées dans la présente demande. En particulier, ces fonctions dëpendent de la nature du fragment polynucléotidique, selon s'il s'agit d'ADN ou d'ARN par exemple.
Une modulation de la fonction peut correspondre a une diminution de la capacité à être . transcrit, ou traduit, ou bien à un changement dans la capacité à interagir avec d'autres facteurs. En fonction des propriétés dudit fragment utilisé, l'homme de l'art est capable de 20 déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à monitorer.
Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées.
La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé
25 précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des fonctions des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, le produit d'expression dont on 30 cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ôu partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain.
Selon le deuxième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à
tout ou partie d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain. Selon Ie troisième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des I8 gènes du chromosome 11 humain. De préférence, le fragment d'ADN comprend au moins 18 nucléotides.
Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que dêcrit comprend une étape de mise en présence de Ia molécule à tester et du produit d'expression. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit produit d'expression, par I O exemple Ia détection d'une éventuelle f xation de cette moléculé sur le produit d'expression mise en~~évidence par une technique de détection de ligands. ..
Commè mentionné précédemment dans la demande, ~ on entend par produit d'expression d'un fragment d'ADN aussi bien les .molécules ,°,d'ARN
issues de Ia transcription du .fragment; ~ :à tout stade de maturation, que les polypeptides issus de la traduction, aussi à tout stade de maturation. Pour une molécule d'ARN, différents stades de maturation sont représentés par la présence ou l'absence de coiffe, de queue polyadénylée, par exemple. Par différents stades de maturation d'un polypepüde, on inclut entre autres les polypeptides avant et après le repliement, avant et après clivage des différents signaux d'adressage, avec et sans glycosylation, avec et sans ponts disulfure.
Quant aux fonctions remplies par les produits d'expression des fragments d'ADN, elles sont très nombreuses et elles dépendent de la nature du produit d'expression en question. Des exemples ont déjà été donnés plus haut dans la présente demande.
La « troisième utilisation selon l'invention >a est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents. Pour ce qui doit être compris par la locution «
moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN », des exemples ont déjà
été
donnés pour définir la troisiëme utilisation selon l'invention.
En fonction des propriétés dudit produit d'expression utilisé, l'homme de l'art est capable de déterminer quel est Ie paramètre dont la variation est facile à
suivre.
Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées.

La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par Ie procédé
précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des fonctions des produits d'expression des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention permet aussi de mettre en évidence les gènes impliqués dans Ia pigmentation de la peau, des cheveux et des phanères, au sein des trois zones chromosomiques de l'invention. Une utilisation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser des marqueurs SNPs au sein de chacune des régions chromosomiques d'intérêt dans le but de localiser plus finement les gènes impliqués dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
La présente invention repose sur l'identification par les inventeurs de gènes, sur les chromosomes 3;°z5 et 11 humains, impliquées dans le phénomène de pigmentation ou de dépigmentation. Cette bàse génétique leur a permis d'envisager lés -utilisations en thérapie et en cosmétique décrites:: précédemment, ainsi que les procédés' de,diagnostic.. illustrés précédemment.
Mais comme déJà mentionné, les inventeurs soupçonnent que de nombreux gènes sont impliqués dans les phénomènes de pigmentation, et dans ceux liés à la régulation et Ia cessation de cette pigmentation.
De ce fait, les utilisations particulièrement préférées sont celles qui tirent partie de la combinaison des résultats obtenus pour les trois zones chromosomiques de l'invention.
En particulier, une premiére utilisation de combinaison dans le domaine de la cosmétique et de la thérapie, fait de préférence usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques dont la séquence de chacun correspond, au moins en partie, à celle d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien à celle d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien à celle d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
De plus, dans une autre demande de brevet, déposée 1e même jour par le même demandeur, les inventeurs ont aussi mis en évidence par une méthode similaire, d'autres gènes impliqués aussi dans Ie phënomène de pigmentation ou dépigmentation, sur les chromosomes 6 (entre les marqueurs D6S1629 et D6S257) et 9 (entre le marqueur et la région télomérique),. Cette base génétique leur a permis d'envisager des utilisations en thërapie et en cosmétique similaires à celles décrites précëdernment, ainsi que des procédés de diagnostic similaires à ceux illustrés précédemment.

De préférence, il est donc fait usage de deux fragments ou plus, la séquence d'au moins un correspondant, au moins en partie, à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, la séquence de l'autre ou des autres correspondant, au moins en partie, ou bien à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 1 l, ou bien à celle d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT 007592.445, NT 007592.446, NT 007592.506, NT 007592.507, NT 007592.508, HSPA1B, G8, NEUl, NG22, BATB, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT'007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT 007592.459 et NT 007592.457, ou bien à celle d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT 030046.18, NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, a GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les DDX31 et GTF3:C4.
De préférence, parmi les différents fragments polynucléotidiques dont il est fait usage, au moins deux ont des séquences correspondant à deux chromosomes distincts, ou à
deux gènes distincts: IL.-est aussi .envisageable que pour un même .gène, les rdifférents fragments dont il est fait usage aient des natures chimïques différentes, par exemple de l'ADN pour le premier fragment et de l'ARN pour le second. Il est aussi envisageable que différents fragments aient une séquence correspondant au même gène, mais avec les faibles variations permises par la définition de « séquences correspondances », c' est-à-dire au plus un nucléotide différent sur 10, de préférence 1 sur 100.
Les fragments contiennent au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant Ia séquence qui doit correspondre au moins parüellement à l'un des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à I'un des gènes de l'invention.
Toutes les utilisations préférées, la nature chimique des fragments, leur environnement, ont déjà été explicités en détails dans la parue décrivant la première utilisation selon l'invention.
Lorsqu'il est fait usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques, ces deux fragments sont de préférence portés par des molécules distinctes. Il est aussi envisageable que ces deux fragments fassent partie par exemple d'un même vecteur. Selon un cas préféré, les différents fragments sont de même nature chimique, par exemple de l'ADN
pour tous les fragments.
Pour les utilisations en thérapeutique, les fragments polynucléotidiques entrent dans la fabrication d'un médicament.

Une deuxième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de Ia thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction d'un fragment d'ADN
choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des S
gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
Une utilisation préférée üre partie des résultats obtenus sur Ies chromosomes

6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux agents ou plus, l'un au moins modulant 1a fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi . les fragments appartènant etlou correspondant à toût ou partie des gènes précédemment mentionnés sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les ~autres.agents modulant chacun la fonction d'uw.îragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ow partie d'un gène de l'invention ou d'un'gène..choisi parmi les gènes HLAG~ NT 007592.445;.NT
0075.92.446, NT 007592.506, NT 007592.507, NT 007592.508, HSPA1B, G8, NEUl, NG22, BATB, HLA-DMB, HLA-DMABRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT 007592.459, NT 007592.457, FREQ, NT 030046.18, NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les différents agents .dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts, ou deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique, les différents agents dont il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même fragment d'ADN.
Les fragments d'ADN dont Ia fonction est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins parüellement à l'un des gènes de l'invention.
Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la deuxième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament.

Une troisième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou S partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou d'un des gènes de l'invention du chromosome S humain, ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
Une utilisation préférée tire parue des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux agents ou plus, l'un au moins modulant la fonction du produit d'exprèssion d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des gènes ~.de l'invention sur les chromosomes 3, 5~ :et 11, le ou les auires agents modulant chacun, la fonction du produit d'expression d'~un:~.~fragïnent d'ADN choisi parmi: les fragments appartenant etlou correspondant à~toùt ou-.,partie des gènes précédemment mentionnés;,.ou bien.~à tout ou 1S partie d'un gène 'choisi parmi les gènes HLAG, NT 007592.445: NT
007592.446, NT 007S92.S06, NT 007S92.S07, NT 007S92.S08, HSPA1B, G8~ NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT 007592.459, NT 007592.457, FREQ, NT 030046.18, NT 030046.17, GTF3CS, CEL, CELL, FS, ABO, BARLHI, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction du produit d'expression de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts, ou deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique de l'invention, les différents agents dont il est fait usage 2S modulent des fonctions différentes d'un même produit d'expression d'un fragment d'ADN, ou bien modulent différents produits d'expression d'un fragment d'ADN, par exemple les ARN à différents stades de maturation, ou bien les ARN issus de différents épissages.
Les fragments d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins I8 nucléotides successifs, ces nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à
l'une des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.

Toutes les utilisations préfërées de tels agents ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la troisième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament.
Une quatrième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux produits d'expression de fragments d'ADN choisis parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien d'uri des 18 gènes de l'invention du chromosome I I humain.
- Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux produits d'expression ou plus, l'un au moins est le produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou côrrespondant à tout ou partie d'un des gènes de l'invention, 'le ou les autres étant chacun le produit . d'expression d'un fragment d'ADN . choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène de l'invention ou d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT 007592.445, NT 007592.446, NT 007592.506, NT 007592.507, NT 007592.508, HSPA1B, G8, NEUl, NG22, BATS, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT 007592.588, GltM4, RNF23, FLJ22638, NT 007592.459, NT_007592.457, F1ZEQ, NT 030046.18, NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLHl, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les différents produits d'expression dont il est fait usage, au moins deux sont issus de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts, ou à deux gènes distincts Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique de l'invention, les différents produits d'expression dont il est fait usage soient issus d'un même fragment d'ADN, il peut s'agir par exemple des ARN à
différents stades de maturation, ou bien des ARN issus de différents épissages. Les mêmes possibilités sont offertes pour les polypeptides issus de la traduction des ARN.
Les fragments d'ADN dont les produits d'expression sont utilisés selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à
l'un des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.
Toutes les utilisations préférées de tels produits d'expression ont déjà été
explicitées en détails dans Ia partie décrivant la quatrième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les produits d'expression entrent dans la fabrication d'un médicament.
Pour les quatre types d'utilisations de combinaison décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation.
Parmi les rioinbreuses combinaisons envisagées par la présente invention, une combinaison très intéressante comprend au moins un. fragment polynucléotidique ou un produit d'expression d'une séquence correspondant à tout, ou partie du gène DDX31 ou GTF3C4 du chromosome 9~humain. , .ï~,.
Afin de ürér ~profit~ de la combinaison de ces zones chromosomiques, la présente invention concerne aussi des procédés de combinaison. Ces procédés sont mis en oeuvre pour Ia détermination d'une éventuelle prédisposition à la canitie précoce:
Un procédé de combinaison selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'au moins deux marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Les marqueurs sélectionnés sont choisis parmi les marqueurs appartenant à la région du chromosome 3 humain comprenant les gènes KIAA1042, CCK, CACNAlD, ARHGEF3 et AL133097, les marqueurs appartenant à Ia région du chromosome 5 humain comprenant les gènes KLHL3, IiNRPAO, CDC25C, EGRl, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715 et les marqueurs appartenant à la région du chromosome 11 humain comprenant les gènes GUCYlA2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC02953b, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. Des marqueurs préférés appartiennent à l'un de ces gènes.
Selon une variante du procédé, l'un au moins des marqueurs sélectionnés est choisi parmi les marqueurs appartenant à l'une des régions précédera canent mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres marqueurs sélectionnés appartenant aux régions chromosomiques précédemment mentionnées, ou bien à celle du chromosome humain comprise entre les marqueurs D6S 1629 et D6S257, ou bien à celle du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et la région télomérique (télomère du bras Iong). Sur les chromosomes 6 et 9, les marqueurs sont de préférence au sein d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT 007592.445, NT 007592.446, NT 007592.506, NT 007592.507, NT 007592.508, HSPA1B, G8, NEUl, NG22, BATB, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAI, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT 007592.459, NT 007592.457, FREQ, NT 030046.18, NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les marqueurs sélecïionnés, deux aû moins n'appartiennent pas à la même région chromosomique de l'invention, au même gène de l'invention.
L'étape-suivante..de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents :dans - un échantillon de matériel génétique Tissu ~de: l'individu qui subit le test diagnostique: Deux.
allèles différents, portés par les deux .versions du chromosome, peuvent être identifiés:
Les modalités de mise en oeuvre de ces procédés ont déjà été.explicitées dans la partie consacrée aux procédés de diagnostic.
Pour les quatre types d'utilisation de combinaison décrits précédemment, les combinaisons de (invention pourront être incorporëes dans une composition cosmétique ou pharmaceutique telle que décrite plus haut.
Les procédés de combinaison de l'invention ne sont pas limités à l'utilisation de deux marqueurs, ils ne sont pas limités non plus aux deux étapes décrites et peuvent contenir d'auires étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de combinaison de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique des marqueurs sélectionnés à la forme allélique de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afm d'établir Ie diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
Comme pour les procédés de diagnostic déj à mentionnés dans Ia présente demande, une situation particulièrement intéressante consiste à comparer les allèles des marqueurs sélectionnés aux allèles de ces mêmes marqueurs chez d' autres individus de la même famille que l'individu à diagnostiquer.
La présente invention permet enfin de mettre en évidence les gènes impliqués dans la pigmentaüon de la peau, des cheveux et des phanères, au sein des cinq zones chromosomiques mentionnées. Une utilisation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser une combinaison des marqueurs SNPs au sein de chacune des régions chromosomiques d'intérêt dans le but de localiser plus finement les gènes impliqués dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
Enfin, la présente invention concerne un kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments ptilynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au .
moins 1.8 nucléotides .consécutifs dont la séquence correspond à tact ou partie d'un des 5 gènes -de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien d'un des .. gènes rvde .
l'invention du chromosome 5 humain, . ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du :
chromosome 11 humain.
Selon une variante du kit, celui-ci comprend deux fragments ou plus, la séquence d'au moins un correspondant, au moins en partie, à celles précëdemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, la séquence de l'autre ou de chacun des autres correspondant, au moins en parue, ou à celles précédemment mentionnées, ou bien à celle d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT 007592.445, NT 007592.446, NT 007592.506, NT 007592.507, NT 007592.508, HSPAIB, G8, NEUI, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA,, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT 007592.459, NT 007592.457, FREQ, NT 030046.18, NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLHl, DDX31, GTF3C4 et ~96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
Légende des figures Figure 1 : Composition des familles analysées pour liaison avec la région-candidate Figure 2 : Région candidate pour la CP sur le chromosome 3 : Localisation chromosomique et distribution des marqueurs Figure 3 : Représentation graphique des scores NPL obtenus pour (analyse de liaison non-paramétrique multipoints génome global sur les familles CP pour les chromosomes retenus.
Abscisse = position sur la carte génétique (0 = pter) 5 Ordonnée = score NPL
Figure 3A : Chromosomes 3 et 5 ; IFigure 3B : Chromosomes 6 et 9 Figure 3C : Chromosomel l Figure 4 : Représentation schématique des loci CP identifiés sur les chromosomes 11, 5 et 3 par l'étude génome global.
10 La distance entre marqueurs est indiquée en cM.
Figure 4A : Chromosome 11, locus l 1q14-q22 Figdre 4B : Chr~m~some 5, locûs Sq31-q32 Figure 4C.: Chromosome 3, locus 3p14.1-p12.3 > .~:~, Figûre 4D : Chromosome 6, locus6p21-p12 ~ ...
15 Figure 4E : Chromosome 9, locus 9q34 Figure S : Lod scores simulés pour les 29 familles sélectionnées.
Dans l'ordre, les colonnes affichent le Lod score moyen, la déviation standard, le Lod score minimum, le Lod score maximum et le groupe (A-E) dans lequel la famille se place selon son score.
20 Figure 6 : Lod scores potentiels par famille en fonction du taux d'hétérogénéité
génétique de la CP.
Figure 7 : Lod scores dëtaillé par famille en fonction du taux d'hétérogénéité
génétique de la CP : nouvelle simulation aprés collection des nouvelles familles.
Figure 8 : Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche des régions 25 chromosomiques candidates. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 9 : Probabilité (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité.
30 Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 10 : Comparaison de la composition des familles entre l'analyse régions-candidates et l'analyse Génome-global.
Figure 11 : Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénëité de Ia CP.

Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 12 : Probabilitë (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 13 : Composition des 4 pools. Les pools AI et AII sont composés d'individus atteints de canitie précoce. Les deux pools contrôles BI et BII sont composés d'individus « croisés » pour origine et âge avec les individus atteints de canitie précoce.
lo EXEMPLES
EXEMPLE 1 ' . .
Résumé des travaai.~c effectués . ' Afm de localiser le ou les gènes de la canitie précoce (CP); il a été réalisé
un programme d'analyse dë ségrégations (liaison génétique) chez des familles où
ce trait se transmet à travers les générations. Au terme d'une série de présëlections sur la base de la puissance statistique de l'échantillon et de la confirmation des phénotypes, douze familles sont retenues pour participer à une étude de liaison et l'ADN fut préparé à
partir d'un échantillon de sang périphërique de chacun des individus informatifs (présentant et ne présentant pas le trait). L'étude a été réalisée selon deux approches principales, analyse ciblée sur une région-candidate et êtude génome-global sur les vingt-deux chromosomes autosomiques et le chromosome X.
De l'ensemble des analyses réalisées en fixant ou ne fixant pas des paramètres pour la transmission du trait de CP, 3 loci potentiels se dégagent sur les chromosomes 11, 5 et 3 en plus de ceux identifiés sur les chromosomes 6 et 9. Les trois loci (chromosomes l 1q14-q22, Sq31-q32, 3p14.1-p12.3) montrent des signes suggestifs de liaison à la CP.
Cette étude, et en particulier Ia discordance entre les scores obtenus pour les analyses paramétrique/non-paramétrique, suggère que la canitie précoce ne serait pas provoquée par un petit nombre de gènes à effet majeur, mais serait plutôt gouvernée par un système multifactoriel incluant l'action de plusieurs gènes de prédisposition.

INTRODUCTION
Le caractère héréditaire de Ia canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie, est une hypothèse proposée depuis bien longtemps, du fait du caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains.
Pour explorer Ia canitie de par son aspect génétique, il a été réalisé une étude de ségrégation de l'ADN chez des familles dont Ia canitie apparaît très tôt dans la vie. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette chasse aux gènes, la composition de l'échantillon pour l'étude s'est déroulée selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype CP fut attribué
°aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitië de la chevelure était grise à
30 ans. Les familles furent retenues pour l'étude sur la base' de leurs performances statistiques dans l'analyse de sêgrégation.
La partie de l'étu.de réalisée est décrite selon quatre époqûes principales:
A- Époque 1: Détermination du potentiel de l' étude. Un première sélection des familles les plus informatives est réalisée par une simulation d'analyse de liaison.
B- Époque 2: Confirmation médicale des phénotypes et collection des échantillons sanguins chez les familles présélectionnées. Cette campagne de vérification aboutit à une nouvelle liste de familles candidates pour l'étude. Une nouvelle simulation de liaison permet d'estimer le potentiel de l'échantillon corrigé.
C- Époque 3: Analyse de liaison génétique avec la région chromosomique candidate pour la CP. Première phase d'analyse des ADNs pour la région chromosomique qui pourrait contenir les gènes de la CP.
D- Époque 4: Analyse de liaison génétique globale de Ia CP sur tout le génome humain.
Analyse de ségrégations familiales sur I'ADN des 22 chromosomes autosomiques et le chromosome X afin de détecter les régions qui se lient au trait CP.
Les rësultats obtenus à chaque époque sont présentés sous forme de tableaux et de figures de manière synthétique dans les tableaux récapitulatifs ou de manière profonde dans Ies tableaux détaillés.

RÉSULTATS
A- Époque 1: Choix des familles avec l'aide de la simulation d'analyse de liaison Au terme d'une tentative de sélection des familles avec une canitie précoce selon des critères d'informativité pour une localisation génique, 29 familles ont été soumises à
une simulation d'analyse de liaison génétique. Sur la base de la disponibilité
de tous les individus, il s'avérait que ce projet possédait un potentiel de succès.très encourageant car dix-neuf pedigrees (soit 255 individus) furent alors retenus. Cette conclusion n'étant valable que si les phénotypes sont confirnlés et si Ia majorité des sujets acceptent de participer à l'étude. Parmi cette sélection se trouvent sept familles très inîormatives qui individuellemént pôurraiènt atteindre ou dépasser un Lod sèore Z=4.00 (soit plus que la limite inférieure de significativité du Lod score qui est de Z=3.00). Afin de rassembler un maximum de cliaa~ic~ dè succès; iI était très important .que .le diagnostic de CP soit attr-ibué
avec rigueur.
Le résultat de cette étude permet, selon la robustesse de l'évaluation clinique, de qualifier les familles qui sont ensuite collectées pour l'étude génétique.
1. Critëres pour l'attrihutioyz du phénotype CI' Vingt-neuf familles parmi les 65, ont été retenues, sur des critères de structure (nombre d'individus total, atteints, disponibles), pour être analysées en simulation.
Lors du processus de simulation:
a) un logiciel génère une série de réplicats du fichier code en assignant des génotypes simulés. Le fichier obtenu pour chaque famille explore plusieurs combinaisons alléliques (génotypes) chez chacun des individus.
b) un logiciel vient ensuite analyser chacun des réplicats pour estimer les Lod scores (Z) possibles de analyse de liaison génétique chez chaque famille. Les résultats, sous forme de Lod scores minimum, moyen et maximum permettent ainsi d'évaluer le potentiel de chaque famille dans ce type d'étude.
Évidemment, ces estimations ne restent valables que dans le cas oû chaque individu s'est vu attribuer un phénotype correct. En cas d'incertitude, le phénotype doit être indiqué comme inconnu; il n'est alors pas pris en compte dans l'étude et donc ne nécessite pas d'être prélevé. Le Lod score diminue (dans des proportions variables) chaque fois qu'un individu est enlevé pour phénotype incertain.

Les arbres généalogiques ont été redessinés à l'aide d'un logiciel de gestion de pedigrees, qui construit également Ies fichiers codés (fichiers preplink) pour l'analyse de liaison génétique. En plus des codes indiquant pour chaque individu, les liens de parenté, le sexe, le phénotype ainsi que le génotype qui sera inerémenté par le logiciel de simulation SLINK, un code de disponibilité (cd) (tableau 1) est attribué. Il pondère ainsi, par un code de 0 à 3, le caractère informatif de chaque individu dans l'étude.
Le phénotype de chaque individu fut assigné d'après les informations figurant dans les pedigrees et les tableaux de description du rapport Genormax.
Toutefois, pour certains individus, le phénotype a été modifié d'après les critères indiqués dans le tableau 2. Les individus, non-présents sur les pedigrees initiauX (identifiés par un numéro seulement) ont été portés phénotypiquement inconnu, et sont été considërés indisponibles (cd--3). ~ , .
a. C~des de disponibilité
Lors de Ia simulation, n'ont été pris en compte que les individus pour lesquels (tableau 1):
- il sera possible, d'après l'étude Genormax, de prélever du sang en vue de préparer l'ADN pour les étude de génétique (âge, domicile en France métropolitaineloutre-mer/étranger, consentement à priori);
- le phénotype de canitie précoce aura été clairement défini (tableau 2).
Tableau 1: Définition des codes de disponibilité
code de disponibilit ADN phnotype (cd) 0 indisponible connu 1 disponible inconnu 2 disponible connu 3 indisponible inconnu Tableau 2: Définition des phénotypes < 25ans 25 ans >25ans pas de cheveux blancs 0 0 1 quelques cheveux blancs (qb) (- 2 0 0 de 50%) b. Assi~atio~e du phéuotype selon l'âge Afin d'écarter les risques d'erreurs, Ies critères suivants ont été définis pour l'assignation du phénotype en fonction de l'âge chez les individus de moins de 30 ans.
Toutefois, lors de L'examen clinique final, il est souhaitable que la défmüion du phénotype 5 soit plus quantitative.
c. Autres paramétres Après examen de la variation du Lod score maximum chez Ia famille Can65 (test 100, 200, 300, 500 réplications), le nombre de réplications (générations des combinaisons alléliques)~ a finalerrientvété fixë à 200.
10 La fréquence du trait a été fixée â 1%. Le nombre d:'allèles possibles pour le génotype est fixé à 6 avec une fréquence équivalgnte~pour chacun;
2. Résultats a- Classifcatio~ des~'amilles selon leurs scores Le tableau 3 donne unë indication du potentiel des familles GENORMAX en fonction du 15 Lod score maximum (Zmax) atteint (groupe A-E). La figure 5 rapporte le Lod score simulé pour chaque famille.
Tableau 3: Statistiques familles/Lod scores maximum. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure S.
Lod Score Maximum (LMxjnombre de famillesgrupe Zmax > ou = 4 7 A

3<Zmax<4 2<Zmax<3 6 C
_-1<Zmax<2 7 D
-Zmax<i Le Lod score maximum ne peut être atteint que lorsqu'un marqueur de fADN est 20 informatif à 100% dans une famille. Le plus souvent, même avec le type de marqueurs utilisés (les marqueurs les plus informatifs dans les régions chromosomiques à
visiter), le Lod score n'atteindra pas sa valeur maximum.
En analyse de liaison génétique, pour êire significatif, le Lod score doit atteindre ou excéder la valeur de 3 (résultat à 1000!1).

b- Effet d'un diagnostic incorrect suY les t~ésultats d'analyse de liaison L'effet de l'attribution d'un diagnostic incorrect a été testé sur les résultats d'analyse (en cas de liaison à un locus) par une simulation sur la famille Can46 en variant Ie phénotype de 1,2 ou 3 individus (tableau 4). .
Tableau 4: Lod score obtenus pour une série de distances du marqueur au locus du trait (Lod score maximum en gras).
1- selon le~ dia gnosticactuel(lodscoxemaximum) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0..3 0.4 Lod score ;'.,2.282.24 2.08 1.88 ~ 0.95 0.43 1.44 a 2- 3 individus incorrectement nostiqus diag (A2,~.R10, R19) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score -3.89 -1.75 -0.90 -0.50-0.14 -0;01 0.01 ~a 3- 2 individus incorrectement nostiqus(A2, R19) diag 1$ distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score -2.85 -0.75 -0.05 0.22 0.36 0.30 0.17 a 4- 1 individu incorrectement (R19) diagnostiqu distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score 1.24 1.24 1.23 1.16 0.94 0.63 0.27 a 3. Discussion, conclusion et décisions Cette étude de simulation permet de placer les 29 familles présélectionnées en 5 groupes selon le Lod score maximum potentiel. Bien qu'une liaison soit significative dès que la valeur de Lod score de Z=3.00 est atteinte, les inventeurs ont préféré
distinguer 2 groupes lorsque ce critère est vérifié car Ie Lod score simulé maximum est très rarement atteint. Ainsi la probabilité que le Lod score réel pour des familles se plaçant dans le groupe B (3<Zmax<4) est assez faible.
Les familles du groupe A seront informatives dans une analyse de liaison génétique pour la localisation dindes gènes de la canitie précoce. Pour cela, aucune incertitude ne doit subsister quant au phénotype. Dans le doute, il est conseillé d'exclure des individus, voire des familles de l' étude.

Toutefois, chez certaines de ces familles, la proportion élevée d'individus atteints/non-atteints (parfois tous les enfants atteints) doit inciter à une extrême méfiance sur le caractère génétique à 100% du trait. Bien entendu, il n'est pas exclu que dans certaines familles, le gène CP ait été transmis simultanément par les branches~paternelle et S maternelle de la première génération. Dans ce cas, les petits enfants seraient tous atteints (Can28, 43, 53...). Afin de pouvoir considérer positivement ces quelques familles, il est hautement souhaitable de vérifier cette hypothèse.
Les familles du groupe B sont elles-mêmes très intéressantes car elles permettent d'étoffer l'échantillon, même si individuellement elles ne pourront accéder à
un Lod score significatif dans la plupart des cas. En groupe, elles peuvent cependant permettre de consolider le Lod score, spécialement s'il s'avère que Ie trait .. était génétiquement hétërQgène (l~gèrernent): - ~ .
Les familles du groupe C, peuvent être également. utilisées. dans des études de réplications des résultats de liaison génétique.
1 S Les familles des groupes D et E (Zrnax<2) sont peu informatives pour une analyse de liaison génétique.
Il semble, sous réserve d'une caractérisation clinique robuste, que les familles des groupes A,B et C sont appropriées pour une étude d'analyse de liaison génétique et qu'elles doivent être collectées (individus avec cd=2). En effet, les analyses de liaison génétique réalisées sur des échantillons insuffisamment caractérisés sont vouées à l'échec ou à un "pèle" résultat (locus imprécis). Étant donné, que dans de telles analyses, certains paramètres ne peuvent être sous total contrôle (en particulier l'informativité
des génotypes), et que l'hétérogénéité génétique toujours possible rend la tâche plus délicate (car elle réduit la puissance de l'analyse sur l'ensemble des familles), il semble donc 2S indispensable de rassembler dès le départ tous les atouts qui peuvent être gérés. Dans cette première étape, les inventeurs ont donc fortement recommandé que le phénotype de chaque individu avec un code de disponibilité approprié (ed=2) soit soigneusement vérifié avant collection (phénotype confirmé, ou exclusion de I'échantillon/de la famille).
B- Époque 2: Collection des éclzasztillohs, cotzfirttzatiofz des plzétzotypes et nouvelles estitnatiofzs du potefitiel de l'étude Sur la base des résultats de l'époque 1, les 19 familles (groupes A, B, et C) retenues pour former une banque dans laquelle seront prélevés les pedigrees pour les analyses de liaison génétique, furent contactées pour confirmation du diagnostic CP et collection d'une série d'individus atteints et non atteints.
Cette campagne de vérification médicale des phénotypes a permis de confirmer un grand nombre des diagnostiques CP, mais pas tous comme prévu. Le refus de quelques individus clés (atteints de CP) de participer au projet, le décès de certains ainsi que réajustement d'une partie des phënotypes a conduit à ne pas retenir un certain nombre de familles et réduit le potentiel d'informativité de plusieurs autres familles.
1- Re'-estimatioh du potefZtiel de l'étude après cohfi~matioh des phénotypes Afin de..ré-estimer le potentiel de l'étude après la vérification des phénotypes, les inventeurs ont simulé une analyse de liaison sur les 8 familles: qui pouvaient encore étre informatives, Le tableau 5 présente les .résultats obtenus pour l'ensemble des 8 familles dans 3 situations d'hétérogénéité gênéüque (0%, soit toutes les familles liées au même locus, 50% ou seulement la moitië des familles liées au locus; ,70% ou seulement environ un tiers des familles liées).
Tableau 5: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité~génétique de Ia CP
Les résultats détaillés par familles figurent dans le tableau de la figure 6.
Taux d' Hétérogénéité Moyen StdDev Minimun Maximum Max époduel 0% 5.094620 1.679698 1.221207 8.835722 38.823 50% 1.619190 1.553049 0.000000 7.409957 -70% 0.835383 1.022004 0.000000 5.517145 -2- Cohclusioh Dans un effort continuel pour l'optimisation de l'échantillon pour les analyses de liaison, 4 familles supplémentaires ont été identifiées (tableau 6; 2 familles -can65B et can46B- sont des branches collatërales des familles can65 et can46) et les phénotypes de nouveau vérifiés.

Tableau 6: Liste finale des familles 1 c103974

7 CAN46B

8 an53,.

CAN62 .

11 CAN65 , Aprs une nouvelle simulation (tableau 7), il s'avre que le Lod score maximum gnral de aison est peine suprieur (Z=8.91) si les 12 familles li retenues (phnotypes strictement finis) sont lies au mme locus. L'augmentation attendue d du Lod score par l'apport de nouvelles familles est cependant rduite par la correction et le durcissement des phnotypes.

Tableau 7: Nouvelle simulaïion après collection des nouvelles familles.
Les Lod scores potentiels sont exprimés en fonction du taux d'hétérogénéité
génétique.
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 7.
Taux d' Htrognit Moyen StdDev Minimun Maximum 0~ 4.752321 1.748924 0.356854 8.914062 50~ 1.535356 1.418022 0.000000 6.078132 70% 0.719737 0.978920 0.000000 5.282466 La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z=1.0, Z=2.0, Z=3.0 respectivement et qui donne une approximation de la chance de trouver une liaison significative (tableau 8).

Tableau 8: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité
Taux d' htrognit 0~ 50% 70~

5 Lod score 1.000 99.500 57.000 27.000 2.000 95.500 31.000 8.500 3.000 84.500 14.000 3.500 C Époque 3: ~lualyse de liaison géhëtique de ta CP avec la région candidate 1- Hypothèse 10 La région 3p14.1-p12.3 est dite « région-candidate » (RC) car elle est associée à Ia canitie précoce..par le biais de la maladie de Klein Waardenburg .(type TIA) à
laquelle le trait' est associé.
2- Composition filiale des familles Dans un souci d'optimisation technique, un échantillon de.92 individus atteints et 15 non-atteints parmi les 12 familles est retenu (voir figure 1). Cette sélection est formée en fonction de l'informativité potentielle de chaque individu et confnrnée par une nouvelle simulation de liaison. L'ajout de quelques individus conduit à une légère augmentation du Lod score potentiel (de x.91 â 9.04, selon homogénéité complète, tableau 9) et donc de la puissance de l'échantillon (tableau 10).
20 Tableau 9: Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche sur la région chromosomique candidate. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéitë
génëtique. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 8.
Taux d' htrognit Moyen StdDev Minimun Maximum 25 0% 4.367608 1.649267 0.564761 9.042465 50% 1.354325 1.359845 0.000000 6.610168 70~ 0.666549 0.891330 0.000000 4.988076 90~ 0.222622 0.378039 0.000000 2.528617 Tableau 10: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 9.
Taux d' hétérogênêité 0% 50~ 70~ 90~
S Lod score 1.000 98.000 48.500 21.500 4.000 2.000 94.500 23.500 9.500 0.500 3.000 79.000 12.000 3.000 0.000 3- Mat~queurs ~nicrosatellites utilisés ~ . ~ . .-La distribution des marqueurs sur la région candidate ~;du chromosome 3 est p~é5entée dâns la figure 2.
4- Analyses de liaison Plusieurs types d'analyses de liaison ont été réalisés afin d'augmenter la probabilité d'observer une liaison existante entre cette région chromosomique et la CP.
Pour cette analyse, les deux approches suivantes ont été réalisées:
- 2-points (analyse itérative entre le trait et les marqueurs pris un-à-un);
- multipoints (analyse pour chaque chromosome selon une carte de marqueurs placés en fonction de leurs distances respectives).
1. Analyses avec paraxnëtres dëfznis, paramétriques (PL): Mode de transmission (dominant), fréquence du trait (1%), équifréquence des allëles de marqueurs testés et pénétrante (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants). Méthode 2 points et multipoints.
2. Analyse indépendante du mode de transmission du trait, non-paramétrique (NPL):
Analyse de déviation de la proportion d'allèles partagés pour chaque paire d'individus atteints (dans chaque famille par identité par descendance) par rapport à une transmission au hasard. Dans l'analyse multipoints, toutes les paires d'atteints (all-pairs, score Z-all=loglo de p-values, et p-values) ont été considérées. Dans la méthode 2-points, ce sont les paires de germains qui ont été étudiées (affected sib-pair, p-values).
S- Résultats Les résultats sont exposës dans le tableau 11.

Tableau 11 : Résultat de l'analyse de liaison sur la région-candidate Quand seule une position est indiquée, et non pas un nom de marqueur, cela signifie que la position est intermédiaire entre 2 marqueurs.
Global 2-points multipoint Chromo- Marqueurl L Marqueur/ NPL Marqueurl d Rgion Lod position o position position cM cM cM

some 3 3p14.1-p12.31.03 1,55 2,58 @ 0.2 82 D3S2409/70 ~~_?ry.;~1 ~--~ià'.' ~d .. tî 4ef ., ~e 'z~'~~.wrt~ ~~~~~:t~,~~yït k ,.
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Chrom Région ,~~~~'u~ i ~~.~~;rs~~ ~tta~~~~~ .~~~ , nome ~~;~'x~~~~~,~.,'~'~"y ~3,~. '.t~~â~~u' <"'~°.'='~"~ ~-,, "a ~
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3 3p14.1-p12.3 ~~~~~Y.,,~'~~:~~~,ds ~~ iF73S18~ r~.~~~,~ ~~,_F ~ :~ 1 ~ ' .-~~-~, 6-Discussion et cotzclusio~a Cette étude distingue un locus fortement suggéré de prédisposition à la canitie précoce sur le chromosome 3p14-p12 (vers les marqueurs D3S2409 et D3S1766;
multipoints NPL= 2.58 à la position 12 et HLod:=1.55 à la position 24).
Ce résultat documente positivement les présomptions d'association qui portent sur la région chromosomique 3p 14-P 12 vis-à-vis de la canitie précoce.
Il est à noter qu'une famille (CAN53) montre une liaison relativement élevée pour cette région chromosomique.
D- Époque 4: A~aalyse de liaisoh génétique globale de la CP avec le gétzo~ze.
L'analyse globale du génome permet de faire une visite de tous les chromosomes (un sondage global) afin de trouver des régions impliquées et éventuellement un locus majeur qui gouvernerait la canitie précoce. Cette grande analyse permet également d'estimer le taux d'hétérogénéité génétique de la CP.
1- Cotztehu des fa~zilles Ce sont les mêmes familles que celles qui ont été étudiées dans la phase régions-candidates (époque 3), mais avec cependant un ajustement de certaines dans leur contenu (voir tableau 12). Certains membres peu informatifs ont été remplacés par d'autres, plus récemment recrutés, ou dont le diagnostic a été précisé plus tardivement.
Afin de confirmer le bénéfice de l' évolution de l' échantillon, une nouvelle simulation d'analyse de liaison a été réalisée pour différentes situations d'hétérogénéité
génétique (tableau 13 et tableaux des îigures 11A, 11B, 11C et 11D). Les Lods scores exprimés montrent une évolution favorable. Ainsi, considérant le Lod score moyen possible, il serait possible d'obtenir un résultat significatif (Z>_3.0) pour une hétérogénéité
atteignant 20% (soit 1/5 des familles non liées au locus). En fait, ce résultat est très conservateur et il serait possible d'atteindre la significativité avec un échanfiillon nettement plus hétérogéne (sdit 50-70% avec l'utilisation de marqueurs microsatellites montrant une hétérozygosité moyéï~ne dé 0.7).
Tableau 12 : Comparaison du nombre d'individus étudiés dans chaqûe familles entre l'analyse régions-candidates et l'analyse génome-global. (détail composition des familles, tableau de la figure 10) Total individus 92 96 Tableau 13: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité
génëtique de la CP
Les résultats détaillés figurent dans les tableaux de la figure 11.
Taux d' htrognit Moyen StdDev Minimun Maximum S 0% 4.751841 1.749689 0.334792 9.338889 20~ 3.115806 1.866821 0.024841 8.780452 50% 1.378378 1.467072 0.000000 7.508479 70% 0.672997 0.904472 0.000000 5.226281 90~ 0.242418 0.402384 0.000000 2.722478 La pûissance de .l'échantillon peut être également observée.: sous . l'angle du nombre de réplications (de. génotypes) qui atteignent ou dépassent les ~Lod scôres Z=1.0, Z 2.0, Z=3.0 respectifs. La probabilité de trouver une liaison significative (tableau 14 et figure 12) avec 4/5 des familles liées au même Locus est de 50%.~ Ce résultat est basé sur un Iod score moyen qui est conservateur.
Tableau 14: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de l, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 12.
Taux d' htrognit 0% 20% 50% 70% 90~

1.000 99.000 87.500 47.000 23.000 5.500 2.000 93.500 69.500 25.500 11.500 0.500 3.000 84.000 48.500 15.000 3.500 0.000 Les analyses peuvent donc indiquer des liaisons significatives si l'hétérogénéité
de l'échantillon ne dépasse pas 20 % (soit seulement 1/5 des familles ne se liant pas à un locus majeur unique), mais il est encore possible d'identifier une liaison dans le cas oü Ia moitié des familles ne sont pas liées à ce locus.

SS
2- Marqueurs de l'ADN
L'ADN de 96 individus appartenant aux 12 familles sélectionnées a été génotypé
pour 400 marqueurs polymorphes distribués sur les 22 autosomes et le chromosome X
(tableau 15) selon un intervalle inter-marqueurs moyen de 9.2 cM (densité). Ce sont des S microsatellites de l'ADN, qui sont composés de répétitions en tandem de type dinucléotidique (CA)n de la collecüon du Généthon (Evry, France).
Tableau 15: Nombre de marqueurs analysés pour chaque chromosome durant le genome vide scan ChromosomeNb de marqueurs . 4 22

9 20

10 20

11 18

12 19

13 14

14 14

15 14

16 13

17 15

18 14

19 12

20 13

21 5

22 7 total 400 Le taux d'hétérozygosité moyen observé est de 0.70, et la taille moyenne de l'intervalle inter-marqueurs se situe â 9.2 cM.
3-Analyses de liaison Pour cette approche globale, les inventeurs ont réalisé plusieurs types d'analyses afin d'optimiser leurs performances pour trouver une liaison entre une région du génome et la CP. L'analyse paramétrique, plus performante sur le plan de la puissance, tient compte du mode de transmission du trait et est la plus adaptée dans le cas des traits monogéniques.
L'analyse non-paramétrique qui permet d'identifier une liaison même si Ie mode de transmission supposé est erroné, est aussi plus robuste dans 1e cas des traits multigéniques.
Pour chacune de ces analyses, les inventeurs ont utilisé les méthodes déjà
évoquées, la méthode 2-points (analyse itérative entre le trait et chaque marqueur) et la méthode multipoints (analyse globale sur chaque chromosome selon une carie de marqueurs).
a- Analyses avec paramètYes définis, pa~~amétriques (PL) IO ~ Mode de transmission (dominant), ~ . Fréquence du trait (1%), ~ Equi-fréquences alléliques de tous les marqueurs, ~ Pénétrances définies (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants), I S ~ Méthodes 2-points et multipoints.
~ Les Scores de probabilité de liaison sont exprimés en:
- Lod score Z (échantillon homogène);
- Lod score ZH (échantillon hétérogène) et taux d'hétérogénéité a (proportion de familles qui ne sont pas liées à ce locus).
b- Analyse indépendante du mode de transmission du trait, non paramétrique (NPL), Il s'agit d'une analyse de la déviation de la proportion d'allèles partagés par paires d'individus atteints par rapport à une transmission des allèles au hasard (identité par descendance). Les inventeurs ont considéré toutes les paires d'individus atteints pour l'analyse multipoints, et les paires de germains pour l'analyse 2 points.
Les scores de probabilité de liaison sont exprimés en - NPL ou Z-all (LoglO de valeur p) pour la méthode rnultipoints sur toutes les paires d'individus atteints;
- valeur "p" pour la méthode 2-points sur les paires de germains atteints.

4- Résultats La fïgure 3 rapporte les scores NPL obtenus pour l'analyse de liaison non-paramétrique sur les chromosomes 3, 5, 11, 6 et 9.
a- ~~ésultats détaillés Les tableaux 16 (meilleurs résultats analyses 2-points) et 17 (meilleurs résultats analyses multipoints) rapportent les meilleurs résultats obtenus pour les chromosomes retenus.
Tableau 16: Meilléurs résultats analyses 2-points pour les chromosome retenus L NPL

romo Locus*Mar ueurLocalisation q c Vit) ThetaZ(a;t)ThetaAlphaSibpair nome (distance-pter) omogene~te eterogene~

3 4 D3S1285 91,2 0,688 0,2 0,819 '0,120,59 D3S1601 214,4 0,006153 5 6 D5S422 164,2 2, 0,14 2, .0,141

23 D5S647 74,07 0,021524 11 19 D11S908 108,6 0,777 0,2 0,846 0,06 0,6 4 21,5 0,203028 Tableau 17 : Meilleurs résultats de l'analyse mufti-points pour les chromosomes retenus Chromo LocalisationZ (a, ZH) Z_all p informatio nome cM value (distance-pter) omogene~t eterogenei e 3 72 -9,34 (0.1411, 2,62 0,00700,78 0.4780 5 146 -7,84 (0.0959, 1,70 0,05030,75 0.0787 168 -3,97 (0.4022, 0,71 0,23340,62 1.1118 11 106 -6,31 (0.3441, 2,61 0,00720,72 1.5288 Sô
b- résultats Yetercus Le tableau 18 rapporte les meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) discutés ci-dessous:
Tableau 18 : Meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) Chromosome Positionlpter Score Pomt or Multipoinf (MP) Non-paramétrique npl >3.0 ~-all _ s~~~~~~~*~. MP
a ~
~~_~
' N;f R"
. ~ , ~i ~
' s .

9 151 ~' MP

~

. ~ ~;
a .~~ :

npl >~:5 ~ all ~'9. ~ F. .
. .F ;agi, , g.:,.
~
~~t ~
73.a #~", ~ ~.#
e ~

~.m ~~
~

~
.
~

11 106 ~~ MP
~~

~

~y~~
~

npl >2.0 Z-all r~.N S''T, 72 w, ~ 'x~~,~,a~~a;MP
~
~ ~w~

~~
~~ ~~
' 101 :. _ MP
G,~~~r -~~
~:

~s,~~~~

Chromosome Positionlpter Score Po~n or Multipoint (MP) Paraméfirique Lod >2.0 LOd i'.r 'r ~. ~ 'i i '~?
,_-,.,...._z":~~.._...__ ..,,i Lod >1.5 LOd "

' > z~'a .t' ~s Lod >1.o Lod 168 1,~31'ttl ~ MP
6 ' ~ '' " '~
61 't r~4~94 M P
6 89,7 ~ '1,45 ;,..2P

i En terme de PL:
a- Un Lod score (2P) ZH=2.007 a été relevé sur le bras long du chromosome 5 (position 164.2 cM à partir du télomère supérieur) soit en position 374 sur la bande Sq31-q32.
b- Lod scores intermédiaires (1.5<ZH<2.0) - chromosome l 1q14-q22, position 106 (MP-ZH=1.53) c- Lod score~intéressants (1.0<ZH<1.5) - chromosome Sq31-q32, position 168 (MP-ZH=1.11) - chromosome 6p21-p12, position 61 (MP-ZH=1.43) ~ - chromosome 6q13-q14, position 90 (2P-ZH=1.46).. .
r.
ü En terme de NPL:
Il a été distingué ici les scores loglo pour l'étudë de déviâtion..du partage allélique, identité par descèndance, (IBD), pour toutes les paires d'atteints~(scorès étude multipoints Z-all) ainsi que les valeurs p pour lès paires de germains atteints (àffected sib-pairs, scores étude 2-points, p-values).
Les meilleurs scores sont abordés. selon leur rang par rapport à la limite de significativité:
- Z-all>3, 2.5<Z-all<3, 2.0<Z-all<2.5 - p<10-5 et 10-5<p<10-4 a- Scores Z all>3.0 Sur le chromosome 6p21-p12, le score atteint en utilisant les marqueurs génome-global maximise à un Z-all=3.52 à la position 71 (entre les marqueurs D6S1610 et D6S257). Toutefois, la précision du locus est probablement affectée par la grande distance entre ces 2 maxqueurs de la batterie génome-global qui est plus nettement plus importante que l'intervalle moyen observé (26.11 cM).
Le second meilleur score est atteint sur le chromosome 9q31-q32, position 151 (Z-all=3.37) b- Scores 2.5<Z all<3.0 - chromosome 3p14-p13, position 72 (Z-all=2.62) - chromosome 11q21-q22, position 106 (Z-all=2.61) e- Scores 2.0<Z all<a.5 - chromosome 9q31-q32, position 131 (Z-all=2.13) - chromosome 3q21, position 101 (Z-all=2.15 ) ainsi que les p-values <10-5 et 10~

d. p<1x10-4 - chromosome 6q31.3-q33, position 154 (p=0.000012) iii Les loci qui sont identifiés simultanément par PL et NPL:
PL NPL

6p21-p12, position 1.42 3.59 11q14-q22, position 1.52 2:6 10 5'-Discussion et cohclusiofi ' , .
Les 2 scores significatifs ou à la bordure de la significativité selon que l'on considère le trait comme étant monogénique ou multifactoriel .(Landes et Kruglyak 1995) ont été observés pour les chromosomes 6p21-p12 (NPL MP Z-all=3.59) et 9q31-q32 (NPL
MP Z-all=3.37).
15 Parmi ces 2 loci, le plus robuste est celui du 6p21-p12 qui est renforcé
par un MP-PL Lod score, qui bien que moyen, maximise à ZH=1.42 Un autre locus apparaît également assez intéressant, il est situé sur le chromosome l 1q14-q22 car les scores PL et NPL maximisent à la même position 106 (Z-all 2.61, PL
1.52). Le score NPL est d'ailleurs dans la fourchette de suggestivité dans un cas de 20 monogénisme ou dans un cas de multigénisme (suggestivité: monogénisme 2<Z-all<3;
multigénisme 2.2<Z-all<3.6).
Enfm le locus Sq31-q32 avec le meilleur PL lod score (2P) (ZH=2.00) se situe également dans des valeurs de suggestivité (en monogénisme).
Il faut ajouter une série de valeur p pour les analyses de germains atteints qui sont 25 également dans la fourchette de suggestivité (chromosomes 6q31.3-q33). Ce sont des loci à
considérer aussi.
D-Discussiofa et conclusion géhërales Au terme des différentes époques d'analyses, plusieurs régions chromosomiques sont identifiées ou suggérées.

WO 2004/007764 61 PCT/FR2003/002153 .
Validité des loti IIql4-q22, Sq31-q32, 3p14.1 p12.3 a Chromosome 11 g14-g~2 Les inventeurs identifient une région entre les positions 100 et 115 (entre D11S898 et D115925) (figure 4A).
b Chromosome Sg31-g32 Cette région recueille le meilleur résultat PL et bipoint de ces analyses qui se situe à une distance de recombinaison (theta) 0.14 (environ 14 clvn du marqueur DSS422. En se plaçant à cette distance de DSS422 vers le haut de la carte (position 149), on arrive dans le voisinage du locus qui rassemble le meilleur score NPL multipoints du~chromosome 5 (Z-all=1.70, vers marqueur DSS436). Un certain consensus 'apparaît pour ce locus également (figure 4B).
c Chromosome 3p14.1 p1~.3 Il s'agit d'une région de presque 30 cM entre les' positions 60 ët 87 (entre D3S1277 et D3S1285 (figure 4C).
EXEMPLE Z : Analyse des régions d'intérêt avec des SNP 'Single Nucleotide Polymorphism' A la suite des travaux présentés dans l'exemple I, les inventeurs ont poursuivi l'analyse des régions des chromosomes 3, 5 et 11 à l'aide la technologie basée sur les SNP, afin de mettre en évidence les gènes impliqués dans la canitie précoce.
L'analyse de la totalité du génome des familles où ségrègent le trait canitie précoce a en effet mis en évidence 5 régions chromosomiques qui se lient avec le phénotype. Au delà des loti 6p21-pl2 (A) et 9q31-q32 (B) distingués par des Lod scores significatifs (Lod score non-paramétrique NPL=3,59 et NPL=3,36 respectivement) d'autres régions présentent un intérêt en raison des scores de liaison d'ordre suggestif dans plus d'une analyse.
La région sur le chromosome 3 (3p14.1-p12.3) présente en effet des résultats d'amplitude équivalente obtenus simultanément dans l'étude des gènes candidats et génome global (régions candidates multipoint Lod score non-paramétrique RC-MP-NPL=2.58, régions candidates analyse 2-points Lod score paramétrique RC-2P-PL=1.55, génome global rnultipoint Lod score non-paramétrique GG-MP NPL=2.62).
La région sur le chromosome 5 (5q31-q32 ) est retenue en raison du seul locus en analyse PL-2 point qui atteigne un Lod score significatif (GG-2P-PL=2.00).
La région sur le chromosome 11 (11q14-q22) est retenue en raison de son score parmi les 5 les plus élevés en NPL et en PL (GG-MP-NPL=2.61, et GG-2P-PL
1.52).
Abbréviations utilisées RC : régions candidates GG :génome global MP : multipoint 2P : arïalyse 2-points NPL : Lod score non-paramétrique PL : Lod score paramétrique Les SNP (single nucleotide polymorphism) représentent .une forme de polymorphisme particulièrement répandue dans le génome humain et très stable.
On évalue le nombre de SNP à environ 0,8 SNP tous les 1000 nucléotides (séquences.codantes et non codantes confondues), ce qui permet d'établir une véritable cartographie du génome humain à l'aide des SNP. Les SNP sont souvënt classés en différentes catégories, notamment selon qu'ils sont dans une région codante ou non, dans une région régulatrice ou dans une auire région non codante du génome, que le polymorphisme modifie l'acide aminé codé ou non, etc...
A l'issue du programme « Human Genome Project », les SNP sont désormais mieux connus et référencés, ainsi que leur position dans le génome (GDB).
Différentes méthodes ont été mises au point pour mettre en évidence ces polymorphismes entre différents individus, souvent basées sur les méthodes utilisées pour détecter des mutations ponctuelles (RFLP-PCR, hybridation avec des oligomères spécifiques des allèles, mirai-séquençage, séquençage direct...).
Dans le cadre de la présente demande, les inventeurs ont utilisé la technologie MALDI
TOF (matrix-assisted laser desorptionlionization time-of flight mass spectrometry) pour détecter les différents alléles des SNPs candidats. De plus amples détails sur cette technologie sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans diverses publications (Stoerker J, et al, Nat Biotechnol 2000 Nov;l8(11):1213-6 et Tang K et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1999 Aug, 96, 10016-20).
Dans un premier temps, les inventeurs ont défini très précisément les régions des chromosomes 3, 5 et 11 à analyser avec les SNPs. Dans une seconde étape, 3848 SNPs appartenant aux régions précédentes ont été pré-sélectionnés sur certains critères (SNPs candidats in silico) et 3227 ont été retenus suite à une étape de validation expérimentale.
Dans une étape suivante, les inventeurs ont assemblé les ADN des différents individus atteints de canitie précoce et des individus 'contrôles' en différents groupes, puis effectué
le génotypage de ces différents groupes grâce à 1264 SNPs choisis parmi les 3227.
Les différentes étapes sont décrites plus amplement dans les sections-suivantes. ' 1- Définition des régions à analyser par les SNP
Dans un premier temps, les inventeurs ont défini plus précisément les régions d'intêrêt sur les chromosomes 3, 5. et 11, à partir des résultats obtenus grâce à l'analyse avec les marqueurs microsatellites (voir les travaux décrits dans l'exemple 1) sur les 12 familles sélectionnées (voir tableau 6).
La région sur le chromosome 3, dénommée région C, est définie par sa position chromosomique ainsi que par trois autres types de coordonnées pour une précision et une sécurité optimale dans la définition de cette région pour les étapes ultérieures. Il en est de méme pour la région du chromosome 5, dénommée région D et pour la région du chromosome 11, dénommée région E.
Le tableau suivant répertorie les différentes caractéristiques cartographiques des régions C,D et E (code et taille de la région en Mb et Kb, numéro des marqueurs microsatellites qui bornent les régions, position dans la séquence du génome, numéro d'un SNP). Les deux colonnes pour les positions sur le génome diff'erent par la version différent de database (NCBI UCSC freeze avril 2002 et juin 2002).
La taille cumulée des trois régions C+D+E est de 77'351 Kb soit 77.106 bp.

Rgion (position)position Position juin-02 SNPs Marqueur avril 02* build jure 30* correspondants microsatellite C (29 Mb, 29874 Kb) D3S1277 35'157'800 33942809 bp - 33943047 rs2358597 bp D3S1285 70'849'345 63816465 bp - 6381.6700 rs3220162 bp D (27 Mb, 27900 Kb) DSS2115 142'024'245134371735 bp -134372005 rs779569 bp DSS422 ~ 164'058'941162271092 bp -162271243 rs3220441 bp E (19 Mb,19577 Kb) D11S898 99'381'686 103'25U'155bp-103'250'287bprs538343 D11S925 ~ 119'692'004122827697 bp =122827871 rs732480 bp * La position de la séquence (en terme de paires de bases bp) est exprimée en fonction du numéro de la vérsion de la banque de données sur le génome humain selon une mise à jour UCSC (http://genome.cse.ucsc.edul ) et/ou un numéro de version d'assemblage de séquence du génome humain, en avril 2002 (soit NCBI Build29) ou en juin 2002 (soit NCBI Bui1d30).
UCSC Freeze (correspondance avec Ia version NCBI Assembled Genome Sequence, build) Novembre 2002 (NCBI Build3l) Juin 2002 (NCBI Bui1d30) Avril 2002 (NCBI Build29) Décembre 2001 (NCBI Build28) 2- Recherche des SNP candidats (in silico) et validation (expérimental).
A partir des régions C, D et E telles que définies plus haut, une seconde étape a consisté à
déterminer une collection de SNPs appartenant à ces régions, de façon à
obtenir une carte de marqueurs des trois régions. Ces marqueurs ont également été définis de telle façon qu'ils couvrent les 77Mbp (longueur totale des trois régions) d'une façon homogène et équidistante. La distance entre les différents SNPs a été fixée en moyenne à
50 kb. Cette opération a été réalisée par la sélection de 3848 SNPs répondant à ces critères (SNPs candidats in silico).

Parmi les 3848 ainsi envisagés lors de la première étape, 3332 SNPs ont été
pré-sélectionnés notamment en enlevant les SNPs distants de moins de l4kb. Les 3332 SNPs sélectionnés ont été analysés sur 92 individus contrôles (individus du Centre d'Étude du Polymorphisme Humain) afin de valider la présence d'au moins deux allèles pour chacun des SNP (validation du polymorphisme).
3- Assemblage des ADN (Paoling) Afin d'augmenter la capacité de génotypage, une stratégie de pooling a été
effectuée sur les différents ADN. La puissance de cette méthode est rapportée dans différentes publications (notamment Werner et al, Hum Mutat 2002 Ju1;20(1):57-64, Bansal et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2002 Dec 24;99(26):16871-4). .
Pour efféctuer ce pooling, les ADN des différents individus avec le trait 'canitie précoce' (CP) et celui des individus contrôles ont été assemblés. Cèt assemblage a été
réalisé de façon à ce que chacun des ADN soit représenté de manière équimolaire, afin de garantir qu'aucun individu n'ait d'influence prépondérante sur le résultat par rapport à un autre. A
cette fin, la concentration exacte de chacun des ADN a été mesurée par la méthode « Picogreen » dans les différents échantillons des individus.
Des groupes ont été constitués en tenant compte d'un « score phénotypique d'intensité de canitie » qui a été attribué pour chaque individu de la façon suivante.
Dans un premier temps, deux sortes de critères ont été définis, les critères primaires auxquels sont affectés des valeurs de score de 2, et les critères secondaires auxquels sont affectés des valeurs de score de 1.
Il y a 2 critères primaires (valeur de score=2 pour chacun d'eux) qui sont :
(i) premiers cheveux blancs avant 18 ans ; (ü) chevelure poivre et sel claire à 30 ans.
Il y a 3 critères secondaires (valeur de score=1 pour chacun d'eux) qui sont :
(i) premiers cheveux blancs avant 25 ans ; (ü) Chevelure poivre et sel foncée à 30 ans, (iii) notion familiale de canitie précoce.
En additionnant pour chaque individu les scores obtenus avec chacun des critères diagnostics, on peut définir pour chaque individu un score d'intensité du phénotype de canitie précoce.

Il a ainsi été possible de définir plusieurs groupes différents selon le score phénotypique.
Parmi les individus atteints, 72 individus dont le score est supérieur ou égal à 4 ou 5 et 132 individus dont le score phénotypique est supérieur ou égal à 2.
Groupe AI : ce groupe est constitué par l'ADN des 72 individus CP dont le score phénotypique est de 4 ou 5.
Groupe AII : ce groupe est constitué par l'ADN des 132 individus CP, dont le score phénotypique est de 2, 3, 4 ou 5.
Groupes BI et BII : ces groupes sont constitués par l'ADN des individus contrôles dont l'origine géographique est proche de celle des individus CP. Pour ces individus contrôles, les .critères de sélection ont été : (i) un âge supérieur à"40 ans, (ü) l'absence de signe de canitie chez l'individu contrôle, (iii) l'absence de notitin familiale de canitie. Les critères d'appariement avec un individu du groupe AI ou AII sont une origine géographique identique, un méme sexe et une couleur des cheveux identique à 18 ans.
Ainsi de cette, façon outre l'appariement atteint versus non atteint parle trait phénotypique (CP), chaque individu CP du groupe AI est représenté par un individu contrôle dans le groupe BI dont le lieu d'origine géographique est proche 'ou identique. II en va de même pour chaque individu du groupe AII.
La constitution des différents groupes est représentée schématiquement sur la figure 13.
L'utilisation de ces méthodes rigoureuses de diagnostic clinique des sujets atteints et des suj ets contrôles donnent une garantie de fiabilitë sur la qualité des données phénotypiques.
Par ailleurs, la rigueur de l'appariement selon les règles fixées par les inventeurs est la garantie de la pertinence des analyses statistiques comparant les données génomiques issues de ces individus qu'ils soient regroupés en pools ou comparés individuellement.
4- Sélection des SNPs validés pour le génotypage sur les ADN groupés.
Différents groupes de SNPs ont été constitués selon la définition suivante Définition des groupes 1, 2, 3 et 4 - groupe 1 : allèle inférieur >10%, déviation standard <0.025 - groupe 2 : allèle inférieur >10%, déviation standard >0.025 - groupe 3 : allèle inférieur <10%, déviation standard <0,025 - groupe 4 : allèle inférieur <10%, déviation standard >0.025 Une batterie de 2142 SNPs des groupes 1 et 2 furent ainsi validés pour une fréquence minimum de l'allèle le plus raie del0%. Quelques SNPs des groupes 3 et 4 (fréquence de WO 2004/007764 b~ PCT/FR2003/002153 l'allèle rare <10%) ont également été retenus afin de pouvoir compléter certaines zones oû
il n'y aurait pas assez de SNPs des groupes 1 et 2.
Par cette méthode, 3227 SNPs ont ainsi été validés.
Parmi les 3227 SNPs validés, 1264 ont été choisis lors d'une nouvelle étape de sélection.
Cette nouvelle sélection est basée sur les critères suivants - intragéniques ou proches des régions géniques - intervalles moyens inter-SNPs infra génique compris entre 30 et 50 Kb.
La très grande majorité des SNPs a été choisie dans le groupe 1 qui représente la plus grande fiabilité.
Afin de mieux couvrir les régions à analyser dont la taille globale est de 77 Mb, l'analyse a été concentrée sur les régions géniques et les régions voisines des gènes susceptibles de contenir des séquences régulatrice, en délaissant les régions sans gènes. Cela permet d'augmenter la densité de la couverture (diminuer lés intërvalles inter-SNPs) dans les régions codantes et donc d'augmenter la probabilité d'avoir'plusieurs SNPs positifs dans des zones qui seraient associées au trait CP (canitie précoce). Par régions géniques, on entend aussi bien les régions contenant des gènes connus;, que celle susceptibles d'en contenir (gènes prédits).
5- Allêlotypage sur les ADN assemblés.
Pour les 1264 SNPs retenus lors de l'étape 4, l'étape suivante a été de déterminer leur allélotype, c'est-à-dire la fréquence de chacun des allèles, ét ce pour les 4 groupes d'ADN
assemblés (poolés) selon la sévérité et la précocité du phénotype (voir la définition des 4 groupes à l'étape 3 et figure 13).
La fréquence allélique des deux allèles a été dëterminée pour chacun des SNP
dans les 4 groupes.
Toutefois, du fait que l'expérience est réalise sur des « pools » et non sur un ADN
individuel, seul l'allélotype est déterminé par cette méthode, et non le génotype.
La signification statistique des écarts de fréquences alléliques entre les groupes AI et BI ou AII et BII est estimée par la valeur « p » représentant la significativité.
Plus la valeur p est faible, plus l'écart est statistiquement significatif.
Les expériences ont été reproduites 3 fois (3 PCR), chacune des trois PCR
étant ensuite testée 5 fois sur le MALDI-TOF afin d'obtenir une valeur moyenne fiable.

WO 2004/007764 ~~ PCT/FR2003/002153 Seuls les résultats pour les groupes de 72 CP et leurs contrôles ont été
considéré, ceux-ci semblent en effet plus homogènes (les comparaisons des groupes AII-BII ne fournissant que peu de résultat positifs, faisant craindre la présence de faux-négatifs).
La fréquence des deux allèles pour chacun des SNP sont calculées dans les différents ADNs groupés. Toutefois les génotypes ne sont pas déterminés dans ce type par cette étude et par conséquent leurs fréquences parmi les différents groupes ne seront pas disponibles.
La signification statistique des écarts de fréquences alléliques entre les groupes est estimée par une valeur « p ». Seuls les SNPs dont les pvalue sont inférieures à 0.05 (5%) ont été
retenus.
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a- Tableau des comparaisons allélotynigues entres les ~rounes.
Les tableaux suivants illustrent sous forme de tableaux les résultats obtenus.
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-CHROMPOS : position sur le chromosome (NCBI build 30) -SNP ID : Nom du SNP utilisé
-AI A2 est la fréquence de l'allèle 2 (l'allèle de masse supérieur en MALDI=TOF dans le pool AI) -BI A2 est la fréquence de l'allèle 2 (l'allèle de masse supérieur en MALDI-TOF dans le pool BI) -DAI-BI est la différence de fréquence de l'allèle 2 entre pool AI et pool BI
-P-value I est la p-value calculée pour la comparaison des fréquences des pools AI et BI.
-p<0.05: valeur 0 quand la p-value est >0.05 ; valeur 1 quand la p-value est <0.05 -Code: code (ind, dbs, 2, 3), selon la nature du résultat (voir tableau des codes), indiquant s'il s'agit d'un SNP positif individuel, ou réparti en double.spot ou cluster de 2, 3 ou plus.
-LD/freq: ce critère indique si les fréquences de 2 ou 3 SNPs positifs en cluster (SNP
positifs contigus) sont compatibles avec l'existence d'un haplotype. Pour ce faire, les fréquences des 2 allèles (des SNPs positifs du cluster), allèle fréquent et allèle rare (lower and upper allele), sont analysées statistiquement pour déterminer s'il existe un déséquilibre de liaison (LD Linkage desequilibrium) se traduisant par une p-value significative.
Le déséquilibre de liaison est une situation où 2 gènes (allèles) ségrègent ensemble à une fréquence plus haute que la fréquence prédite par le produit de leurs fréquences individuelles. Cela signifie que les deux gènes ne sont pas indépendants puisqu'ils ségrègent ensemble plus fréquemment que prévu par les statistiques, il y a donc un déficit d'indépendance entre des allèles situés proche l'un de l'autre sur un même chromosome.
De plus, cela prend en considération la distance, et donc les SNPs distants de plus de 100-110 Kbs sont éliminés.
Cette analyse de déséquilibre de liaison a permis de définir des blocs d'ADN
qui sont matérialisés par plusieurs marqueurs dont la co-ségrégation des allèles dévie d'une co-ségrégation régie par le seul hasard. Cette situation est produite par une absence ou un déficit de recombinaison au sein de ce bloc. La taille des régions présentant un déséquilibre de liaison est variable. selon les régions chromosomiques, elle semble s'étendre sur 10 à
200kb. .-.
Lorsque que la zone est en noir dans cette colonne, l'assôciation est significative. En grisé, les valeurs d'association sont marginalement bônnes (acceptables).
- p-val-aval: Ce critère est basé sur la seule p-value. Si la p-value d'un SNP
ou de plusieurs groupés en clusters est inférieure à 1 %, alors le cluster est marqué comme important : case noire.
Seuls les SNPs ayant une p-value inférieure à 5% ont été indiqués dans le tableau, à
l'exception des SNPs négatifs situés entre deux SNPs positifs, ce qui détermine un double spot et ceux encadrant un cluster d'intérêt.
Code Clusters de SNPs positifs (voir les codes) LD/freqs SNPs positifs pour les tests freq et LD

SNPs positifs pour les tests freq et LD avec une p-val-avalvaleur de p (p-value) ' si ficative.

Code Dfinition 3 Cluster comprenant au moins 3 SNPs positifs 2 Cluster comprenant 2 SNPs positifs dbs double spot (2SNPs positifs encadrant un SNP ngatif) ind SNP positif individuel a~

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Le tableau ci-dessous récapitule le nombre de SNPs positifs au sein de chaque région, selon qu' il s' agit de -Spots -SNPs positifs isolés -SNPs positifs en double spots (exemple : 2 SNPs positifs séparés par 1 SNP
négatif) -Clusters -2 SNPs positifs contigus -Plus de 3 SNPs positifs contigus -Déséquilibré de liaison l fréquences Rgion Spots Clusters Psitifs Double 2 SNPs positifs~ 3 SNPs positifsLD*/Freq isols spot ou +

C ,: , 27 . 3 6. ~, 0 -. . 3 .

D ~, . 1.4 9 9 , 3 7.

14 6 8 ~ 2 ~ 5 ~' LD : Linkage desequilibrium Résultats i- région C
La région C se caractérise par un relativement grand nombre de SNPs positifs isolés. Par contre le nombre de double spots ou de clusters est relativement faible.
L'analyse de LD
(désquilibre de liaison) et des fréquences alléliques combinés ne révèle que 3 zones d'intérêt. De ces 3 zones 2 loci (positions 41527287-41677819 et 55638663-56042041) se caractérisent par une p-value <1%.
Le contenu génique de ces 3 zones (C1, C2, C3) est développé ci-dessous C1 (41527287-416778191:
-Protéine hypothétique KIAA 1042 -CCK: gastrin/cholecystokinin type b receptor (cck-b receptor) C2: (52846896-52913941) -CACNA1D: voltage-dependent 1-type calcium charnel alpha-ld subunit C3:(55638663-560420411:
-ARHGEF3 rho guanine nucleotide exchange factor 3; rhogef protein; 59.8 kda protein; exchange factor found in platelets and leukemic and neuronal tissues, xpln.

WO 2004/007764 PCT/FR2003/002153 .
-Protéine hypothétique AL133097 ü- région D
La région D se caractérise par une relative densité en clusters et l'analyse LD et freq 5 montre également plusieurs régions d'intérêt. Sept zones (D1,D2,D3,D4,D5,D6,D7) sont relevées pour leur arrangement en cluster, leur potentiel LD et l'arrangement des fréquences alléliques. Parmi ces 7 zones, 5 (en gras ; D2,D3,D5,D6,D7) semblent être plus prometteuses en raison de la significativité de la comparaison de un SNP au moins.
Le contenu génique de ces 7 zones est développé ci-dessous 10 D1(136479801-137007868):
-KLHL3 : kelch-like protein 3 -HNRPAO : heterogeneous nuclear ribonucleoprotein a0 (hnrnp, a0).
D2 (137542040-1377718051 -CDC25C:. map/microtubule affinity-regulating kinase 3 (ec 2.7.1.27) 15 -EGRl : early groWth response protein 1 (egr-1) (krox-24.pfotein) -C5orf6 : prédit -C5orf7 : prédit' -LOC51308 : prédit -ETF1 : eukaryotic peptide chaire release factor subunit 1 (erfl) 20 -HSPA9B : stress-70 protein, mitochondrial precursor D3 (139931847-1401186011 -PCDHAl à PCDHA13 :protocadherin alpha 1 precursor à protocadherin alpha 1 precursor D4~149518721-1495867741 25 -CSF1R : Macrophage Colony Stimulating Factor I Reeeptor Precursor -RPL7: 60s rïbosomal protein 17 -PDGFRB : beta platelet-derived growth factor receptor precursor (ec 2.7.1.112) D5 (149793126-149995886) -TCOF1 : Treacle Protein (Treacher Collins Syndrome Protein).
30 -AL133039 : prédit -CD74 : hla class ü histocompatibility antigen, gamma chaire -RPS 14 : 40s ribosomal protein s 14 -NDST1 : Heparan Sulfate N-Deacetylase/N-Sulfotransferase (Ec 2.8.2.8) D6 (151235618-151373121) -G3BP : ras-gtpase-activating protein binding protein 2 -GLRAl : glycine receptor alpha-1 chain precursor D7 (153463449-153854650) -CSorf3: prédit -MFAP3 : microfibril-associated glycoprotein 3 precursor -GALNT10 : putative udp-galnac:polypeptide n-acetylgalactosaminyltransferase -FLJ11715 : prédit . .
iii- région E .
La région E se caxaetérisë également par une relative densité en clusters et l'analyse LD et freq montre 6 zoriès régions d'intérêt (E1,E2,E3,E4ES,E6). Trois zones (en gras, E2, ES,E6) sont plus promettéuses en raison de la significativité de 'la comparaison entre les échantillons.
Le contenu génique'de ces 6 zones est développé ci-dessous E1 (108893187-108944206) -GUCYlA2 : guanylate cyclase soluble, alpha-2 chain (ec 4.6.1.2) E2 (110056711-1105461421 -CULS : vasopressin-activated calcium-mobilizing receptor (vacm-1) (cullin homolog 5) -ACAT1 : acetyl-coa acetyltransferase, mitochondrial precursor (ec 2.3.1.9) -NPAT :nuclear protein, ataxia-telangiectasia locus; el4 gene;
-ATM : serine-protein kinase atm (ec 2.7.1.37) (ataxia telangiectasia mutated -AF035326 : prédit -AF035327 : prédit -AF035328 : prédit -BC029536 :prédit E3 (115527211-115745012, -DRD2 : d(2) dopamine receptor -ENS303941 : prédit E4 (117397672-117752160:
IGSF4 : immunoglobulin superfamily, member 4; nectin-like protein 2 E5 (118532530-11868595'n Pas de gène connu E6 (119417270-119469358) -LOC51092 : prédit -BC010946 ; prédit -TAGLN : transgelin. (smooth muscle protein 22-alpha) (sm22-alpha) (ws3-10) (22 kda actin-binding protein).
-PCSK7 : proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 precursor (ec 3.4.21.-) -ENS300650 : prédit Exemple de Comnôsitions . , - lotion capillaire fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285 0,5 g Propylène glycol ~ 20 g Ethanol 95° 30 g Eau qsp 100 g Cette lotion est appliquée quotidiennement sur les zones à traiter et de préférence sur (ensemble du cuir chevelu pendant au moins 10 jours et préférentiellement 1 à 2 mois.
On constate alors une diminution de (apparition des cheveux blancs ou gris et une repigmentation des cheveux gris.
- shampooing traitant fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs DSS2115 et DSS422 1,5 g Polyglycéryl 3-hydroxylarylether 26 g Hydroxy propyl cellulose vendue sous la dénomination de Klucell G par la société Hercules 2 g Conservateurs qps Ethanol 95° 50 g Eau qsp 100 g Ce shampooing est utilisé à chaque lavage avec un temps de pose d'environ d'une minute. Un usage prolongé, de fondre de deux mois, conduit à la repigmentation progressive des cheveux gris.
Ce shampooing peut également être utilisé à titre préventif afin de retardé le blanchissement des cheveux.
- Gel traitant fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D11S898 et D11S925 - ~ 0,75 g Huiles essentielles d'Eucalyptus 1 g Econozole , 0,2 g' Lauryl polyglyceryl 6 cetea "ryl glycoether 1,9 g' Conservateurs ~ qs Carbopol 934P vendu par la société BF Goodrich Corporation 0,3 g Agent de neutralisation qs pH 7 Eau qsp 100 g Ce gel est appliqué sur les zones à traiter deux fois par jour (malin et soir) avec un massage terminal. Après trois mois d'application, on observe une repigmentation des poils ou cheveux de la zone traitée.
Références bibliographi~,ues ~ E. Larder and L. Kruglyak. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporiing linkage results [see commentsj. Nat. Ge~aet. 11 (3):241-247, 1995.

Claims (36)

Revendications

1. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

2. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment a une longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.

4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des cheveux.

5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.

6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.

7. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.

8. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes:
i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, AEHGEF3 et AL133097, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.

9. Procédé selon la revendication 8 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.

10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.

11. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPA0, CDC25C, EGR1, G5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715, à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

12. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPA0, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RFL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

13. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit fragment a une longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.

14. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des cheveux.

15. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.

16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.

17. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.

18. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes :
i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPA0, CDC25C, EGR1, CSorf6, CSorf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, CSorf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.

19. Procédé selon la revendication 18 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.

20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.

21. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, à
des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

22. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

23. Utilisation selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que ledit fragment a une longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.

24. Utilisation selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des cheveux.

25. Utilisation selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.

26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.

27. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.

28. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes :
i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.

29. Procédé selon la revendication 28 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.

30. Procédé selon la revendication 29 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.

31. Utilisation à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques comprenant chacun au moins 18 nucléotides successifs dont la séquence est choisie parmi .cndot. une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, et .cndot. une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPA0, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715, et .cndot. une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

32. Utilisation d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi:
.cndot. un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, et un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, FINRPA0, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5drf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1;
AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, CSorf3, MFAP3, GALNT 10 et FLJ11715, et .cndot. un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.

33. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes:
i) sélection d'une combinaison d'au moins deux marqueurs choisis parmi .cndot. les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, et .cndot. les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, H5PA9B, PCDHA1 à

PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715, et .cndot. les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, ii) détermination des allèles des marqueurs choisis présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.

34. Procédé selon la revendication 33 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allëlique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.

35. Procédé selon la revendication 34 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.

36. Kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à
tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHA1 à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNT10 et FLJ11715, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont 1a séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.