FR2853532A1 - Genes des chromosomes 6 et 9 impliques dans la canitie precoce - Google Patents

Genes des chromosomes 6 et 9 impliques dans la canitie precoce Download PDF

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Abstract

Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT_007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459 et NT_007592.457, ou dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à l'un de ces gènes, utilisation des produits d'expression de l'un de ces gènes et utilisation d'agents capables de modifier la fonction de ces produits d'expression, à des fins cosmétiques, thérapeutiques ou diagnostiques.

Description

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GÈNES DES CHROMOSOMES 6 ET 9 IMPLIQUÉS DANS LA
CANITIE PRÉCOCE
Annuler ou atténuer autant que faire se peut les effets du vieillissement est une préoccupation qui ne cesse de croître. Dans ce contexte, faire disparaître des cheveux blancs jugés disgracieux grâce à des shampoings traitants colorants est désormais une activité très répandue. Il est clair cependant que, même si cette technique permet effectivement d'annuler les effets du phénomène, elle n'en affecte nullement les causes. De ce fait, cette solution est temporaire et doit être fréquemment renouvelée.
Dans ce contexte, les inventeurs ont choisi d'explorer l'apparition des cheveux blancs, ou canitie, sous un angle totalement nouveau, celui de la génétique.
En effet, explorer la canitie de par son aspect génétique permet de mettre en évidence les mécanismes profonds de la dépigmentation. Cela permet aussi d'identifier les gènes qui sont impliqués dans la canitie. Cette identification ouvre la porte à de très nombreuses applications, dans le domaine du soin des cheveux, tant cosmétiques que thérapeutiques ou diagnostiques.
Il est hautement novateur de chercher à connaître les régions génomiques de la canitie par analyse de liaison génétique alors que d'autres études visent plutôt à décrypter la biochimie de la canitie.
Les inventeurs ont choisi de tirer partie de l'hypothèse proposée depuis bien longtemps du caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie. Le caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains est en effet aisément observable.
Le deuxième obstacle de la mise en #uvre des méthodes de génétique inverse concerne la définition exacte du phénotype. Une parfaite définition du phénotype étudié est en effet nécessaire. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette identification de gènes, le choix et la composition de l'échantillon utilisé dans la présente invention se sont déroulés selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype canitie précoce fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans.
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De plus, il est vraisemblable que d'une part la canitie précoce ait une origine multigénique et non monogénique, et que d'autre part, des facteurs environnementaux aient une influence sur le phénotype. Il s'agit de fait de définir un ensemble de causes prédisposant à la canitie précoce plutôt qu'une mutation unique responsable du phénotype.
Dans ce contexte, la génétique inverse n'est pas, habituellement, une technique recommandée par les généticiens. Il est donc original de la part des inventeurs d'avoir utilisé cette méthode.
Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs de définir des zones chromosiques et/ou génomiques comprenant des gènes impliqués avec une forte probabilité dans la canitie. Dans la présente demande, les régions des chromosomes ou les sous-parties de ces régions, identifiées par les inventeurs comme comprenant des gènes statistiquement impliqués dans la canitie, seront dénommées indifféremment "régions chromosomiques de l'invention" ou "régions génomiques de l'invention" ou "zones chromosomiques de l'invention" ou "zones génomiques de l'invention". Quant aux gènes identifiés dans le cadre de la présente invention au sein desdites régions, ils seront dénommés gènes de l'invention .
L'objet de la présente invention concerne d'une part les gènes des régions chromosomiques identifiés et d'autre part l'utilisation de produits dérivés, tels que des produits de transcription ou de traduction, dans les domaines de la cosmétique, de la thérapeutique et du diagnostic.
Pour les domaines de la thérapie et de la cosmétique, la présente invention concerne successivement l'utilisation de polynucléotides dérivant d'un gène compris dans une région chromosomique de l'invention, l'utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à ce gène, l'utilisation des produits d'expression du gène et l'utilisation d'agents capables de modifier la fonction de ces produits d'expression. L'utilisation conjointe ou combinée d'au moins deux des produits précédents peut s'avérer judicieuse, en particulier dans le domaine thérapeutique.
La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic d'une canitie précoce basé sur les variations alléliques au sein des gènes compris dans les régions chromosomiques de l'invention. En matière de diagnostic, il peut être, de plus, particulièrement pertinent de combiner les renseignements provenant de différents gènes des zones chromosomiques de l'invention.
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GLOSSAIRE
Dans le cadre de la présente invention, les termes énoncés revêtent la signification suivante :
Par fragment polynucléotidique, on entend toute molécule résultant de l'enchaînement linéaire d'au moins deux nucléotides, cette molécule pouvant être monocaténaire, bicaténaire ou tricaténaire. Il peut donc s'agir d'une molécule d'ADN double-brin, d'un ADN simple brin, d'un ARN, d'un duplex ADN simple brin-ARN, d'un triplex ADN-ARN ou de toute autre combinaison. Le fragment polynucléotidique peut être naturel isolé, recombinant ou bien synthétique. Lorsque le fragment polynucléotidique comporte des brins complémentaires, la complémentarité n'est pas nécessairement parfaite, mais l'affinité entre les différents brins est suffisante pour permettre l'établissement de liaison stable de type Watson Crick entre les deux brins.
Bien que l'appariement des bases soient de préférence de type Watson-Crick, d'autres types ne sont pas exclus, tels qu'un appariement de type Hoogsteen ou Hoogsteen inverse.
On considère que la séquence S d'une molécule correspond à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire l'enchaînement des bases de S de celui de la molécule d'ADN donnée par l'un des processus suivants
1. par identité, ou bien
2. par identité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile, ou bien
3. par complémentarité, ou bien
4. par complémentarité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile.
De plus, on considère que deux séquences restent correspondantes s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans l'un des processus précédents (complémentarité ou bien identité, avec ou sans échange T, U), de préférence moins d'une erreur sur 100. Par conséquent, les deux molécules ont aussi nécessairement des longueurs voisines, la variation maximale de longueur étant de 10% d'après le taux d'erreur accepté, elles ont de préférence une différence de longueur inférieure à 1%.
Cette définition ne suppose pas que les deux molécules soient de même nature, en particulier pour ce qui est de leur squelette, il s'agit d'une correspondance entre leur séquence uniquement.
Par exemple, deux séquences d'ADN identiques correspondent l'une à l'autre.
De même, si ces deux séquences sont substantiellement identiques, c'est-à-dire identiques
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à plus de 90%, elles correspondent l'une à l'autre. Une séquence d'ARN, issue de la traduction d'une molécule d'ADN quelconque, correspond à la séquence de cette molécule d'ADN. De même, une séquence synthétique, par exemple hybride ADN-ARN, peut correspondre à une séquence d'ADN. Il en va de même entre une séquence d'ADN et l'ARN anti-sens ayant pour cible cette séquence.
Sur le même schéma, on considère que la séquence S d'une molécule d'ADN correspond à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire la séquence S de celle de la molécule d'ADN donnée par le processus 1 ou 3 uniquement. La même latitude est autorisée concernant la possibilité d'introduction d'erreurs dans ces processus, c'est-à-dire que l'on considère que deux séquences d'ADN restent correspondantes s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans les processus de complémentarité ou bien d'identité, de préférence moins d'une erreur sur 100.
Les produits d'expression d'un fragment d'ADN englobent toutes les molécules traduisant l'information génétique portée par ce fragment. Les ARN correspondant à la transcription du fragment d'ADN, à tous les stades de maturation, sont donc des produits d'expression ; il en est de même pour les polypeptides, à tous les stades de maturation, résultant de la traduction des ARN. Si des clivages interviennent au sein du polypeptide, comme par exemple le clivage de signaux d'adressage, tous les polypeptides résultants sont aussi considérés comme des produits d'expression du fragment d'ADN initial.
Dans le contexte de l'invention, la fonction primaire d'un fragment d'ADN est de préférence d'être transcrite puis traduite en protéine. La fonction secondaire de l'ADN peut être assimilée à la fonction de la protéine résultant de la traduction de cet ADN. La fonction d'un fragment d'ADN revêt aussi d'autres significations dans la présente invention. En particulier, un fragment d'ADN peut appartenir à une région régulatrice d'un gène, sa fonction est alors, ou bien d'être le site de fixation d'enhancers ou d'inhibiteurs, ou bien d'être le site de fixation de l'ARN polymérase, ou bien d'être un site de reconnaissance pour le positionnement de l'ARN polymérase, ou bien toute autre fonction généralement assimilée à une séquence régulatrice.
D'autres fonctions sont envisageables pour les fragments d'ADN. En particulier, leur simple présence au sein d'un gène peut faciliter les recombinaisons. De même, une fonction selon l'invention peut être celle des télomères et avoir trait à la dégénérescence.
D'autres fonctions particulières attribuées à des fragments d'ADN sont bien connues par les biologistes.
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Un marqueur génétique est une séquence d'ADN détectable. En génétique humaine, les marqueurs sont des séquences particulières de l'ADN pouvant prendre différentes formes selon les individus. Ce polymorphisme des marqueurs permet de suivre leur transmission dans le cadre des arbres généalogiques.
Parmi les marqueurs classiques, on peut identifier deux grandes catégories de marqueurs qui sont les marqueurs microsatellites et les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism).
Un microsatellite est une séquence d'ADN répétée, constituée d'un motif relativement simple : un di, un tri ou un tétra nucléotide le plus souvent. Le nombre de répétitions change pour un même motif selon les individus et peut varier de quelques unités (une douzaine au minimum pour un dinucléotide), jusqu'à plus d'une centaine. Ces séquences sont dispersées un peu partout dans le génome, de façon presque aléatoire, mais à des endroits identiques d'un individu à un autre. Elles sont très abondantes (environ une tous les 10000 nucléotides = 10 kb) et elles sont très polymorphes. C'est la variation de longueur de la répétition en tandem qui constitue le marqueur. Ces séquences microsatellites sont donc très utilisées comme marqueurs génétiques.
Normalement, il n'y a pas de lien explicite entre un marqueur microsatellite et un gène, sinon une co-localisation. La longueur d'une répétition en tandem n'a pas, selon les connaissances actuelles, et en dehors de quelques rares cas de marqueurs intragéniques associés à certaines pathologies, de lien avec le rôle d'un gène. Dans le cadre de la présente invention, les marqueurs microsatellites sont des outils pour localiser les gènes impliqués dans la canitie précoce. Comme il existe beaucoup moins de polymorphisme dans les gènes que dans les marqueurs, un allèle génique sera représenté par plusieurs allèles d'un même marqueur microsatellite.
Il existe différentes méthodes pour définir la localisation de séquences particulières d'ADN le long des chromosomes. L'unité de mesure physique est le nombre de paires de bases. Toutefois, le centimorgan est souvent utilisé, c'est une unité de recombinaison donc une unité de mesure génétique et non physique. Deux séquences particulières d'un même chromosome sont distantes d'un centimorgan si elles recombinent une fois sur cent lors de la méiose. Un centimorgan équivaut approximativement à 106 paires de bases.
Une autre méthode pour localiser des séquences particulières d'ADN le long des chromosomes consiste à définir leur position relativement à des marqueurs jalonnant les
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chromosomes et dont la position est parfaitement déterminée et connue. Des marqueurs très utilisés sont les marqueurs microsatellites dont il existe des cartographies très complètes. En particulier le GDB Genome Database est une banque de données, connue mondialement pour répertorier entre autres les STSs (Sequence tagged sites), bornes spécifiques et uniques de l'ADN dont font partie les microsatellites. Les codes DxSxxxx (par exemple D6S257), servant à identifier ces marqueurs, sont leur numéro d'accession dans GDB. Ces codes sont un moyen d'identification non ambigu et universel car seul GDB attribue ce type de code. Comme on peut trouver de tels marqueurs microsatellites environ tous les 10 kb, il est donc possible de définir la position de toute séquence à lOkb près, en indiquant les marqueurs micro satellites l'encadrant.
Un SNP (Single Nucleotide Pholymorphism) est un polymorphisme qui touche une unique base de l'ADN. C'est la forme de polymorphisme la plus répandue dans le génome humain, et elle se caractérise également par une grande stabilité lors de la transmission. La plupart de ces polymorphismes n'ont pas d'implications fonctionnelles.
On compte environ 1 SNP sur 100 paires de bases. La connaissance de ces SNPs permet d'établir une cartographie du génome humain et les SNPs servent alors de véritables marqueurs du génome, d'autant plus qu'ils mutent lentement et ont peu de chance de réapparaître de façon récurrente.
Par région chromosomique entre deux marqueurs, on entend toute la séquence comprise entre ces deux marqueurs, les bornes étant comprises, donc la séquence des marqueurs y compris.
En génétique inverse, les indices permettant de localiser un gène proviennent de la comparaison de la transmission d'un phénotype, supposé induit par un gène muté ou par un allèle donné, avec la transmission de marqueurs connus, au sein d'une même famille.
Ces données de co-ségrégation d'un phénotype et d'un marqueur permettent d'établir une analyse de liaison génétique.
La co-transmission d'un phénotype et d'un marqueur suggère que le gène responsable du phénotype et le marqueur sont physiquement proches l'un de l'autre sur le chromosome. La liaison est déterminée par l'analyse du schéma de transmission d'un gène et d'un marqueur dans des familles qui s'y prêtent.
L'analyse de liaison repose sur la co-transmission de certaines formes de marqueurs avec la forme défectueuse, ou modifiée d'un gène. Mais c'est une analyse indirecte dans le sens où d'une part, lors d'une première étape, un phénotype est associé à
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la forme défectueuse ou modifiée du gène. Une erreur dans l'assignation de certains phénotypes fausse l'étude. D'autre part, cette étude est basée sur des statistiques, ces statistiques reposant sur l'analyse d'un échantillon de la population, il s'agit donc d'un sondage. Enfin, il faut noter que lorsqu'il est possible d'associer un allèle particulier du marqueur avec un allèle du gène (en fait un phénotype), cette association n'est a priori valable que pour les échantillons inter-familiaux.
Le résultat des analyses de liaison dépend évidemment du degré de liaison entre le marqueur et le locus de la maladie. Cinq centimorgans (5 cM) est considéré comme un minimum de liaison pour un diagnostic. Une liaison à 5 cM signifie que l'on a 95% de chances d'arriver à une conclusion correcte et seulement 1 chance sur 20 qu'une recombinaison soit survenue entre le marqueur et le locus de la maladie.
Par le terme gène, dans le cadre de la présente invention, on entend non seulement la partie strictement codante, mais également les parties non codantes telles que les introns, et les parties régulatrices, en 5' et 3', les UTR (UnTranslated Region), notamment le ou les promoteurs, enhancers etc... associés.
Les inventeurs ont identifié deux régions chromosomiques distinctes, appartenant aux chromosomes 6 et 9 et qui sont impliquées dans la canitie précoce. Ces deux régions sont chacune des régions ou zones chromosomiques de l'invention. Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence l'implication de certains gènes appartenant à ces régions chromosomiques, appelés gènes de l'invention.
Selon un premier aspect, l'invention concerne les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1 (neuraminidase precursor), NG22, BAT8 (ankyrin repeat-containing protein), HLADMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4 (glutamate receptor, metabotropic 4), RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457 du chromosome 6 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de ces gènes, tels que des produits de transcription ou d'expression. Ces gènes appartiennent à la première zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 6 par les marqueurs microsatellites D6S1629 et D6S257. Cette zone sera plus particulièrement dénommée première zone chromosomique de l'invention .
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Des gènes préférés parmi les gènes précédemment cités au sein de la première zone chromosomique de l'invention sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588. Des gènes tout particulièrement préférés sont les gènes NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508.
Selon un second aspect, l'invention concerne les gènes FREQ (frequenin homolog), NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5 (general transcription factor IIIC, polypeptide 5), CEL (carboxyl ester lipase bile salt-stimulated), CELL (carboxyl ester lipase-like bile salt-stimulated), FS (Forssman synthetase), ABO blood group (transferase A, alpha), BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6 du chromosome 9 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de ces gènes, tels que des produits de transcription ou d'expression. Ces gènes appartiennent à la seconde zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 9 par le marqueur microsatellite D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long). Cette zone sera plus particulièrement dénommée deuxième ou seconde zone chromosomique de l'invention .
Des gènes préférés parmi les gènes précédemment cités au sein de la deuxième zone chromosomique de l'invention sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes tout particulièrement préférés sont les gènes DDX31 et BARHL1.
Pour les 2 zones chromosomiques identifiées ci-dessus, la présente invention couvre des fragments polynucléotidiques ayant une longueur minimale de 18 nucléotides, dont la séquence correspond au moins partiellement à l'un des gènes du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, ou à l'un des gènes du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Ces fragments polynucléotidiques se caractérisent de plus fonctionnellement par leur implication dans la canitie, ou bien dans la canitie précoce, et éventuellement dans les deux phénomènes. En effet, les gènes impliqués dans la canitie précoce sont très vraisemblablement également impliqués dans la canitie due au vieillissement.
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Selon une possibilité envisagée par la présente invention, un fragment impliqué dans la canitie ou la canitie précoce et possédant une séquence répondant aux exigences mentionnées plus haut peut être utilisé en thérapie.
Plus particulièrement, le premier aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 6 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Ces gènes sont compris dans la première zone chromosomique de l'invention délimitée sur le chromosome 6 par les marqueurs microsatellites D6S1629 et D6S257.
De préférence, un fragment selon l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588. De manière encore préférée, le gène est choisi parmi les gènes NT~007592.506, NT 007592.507 et NT 007592.508.
Le second aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 9 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce. Selon cet aspect de l'invention, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Ces gènes sont compris dans la seconde zone chromosomique de l'invention délimitée sur le chromosome 9 par le marqueur microsatellite D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long).
De préférence, un fragment selon l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène choisi parmi les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. De manière encore préférée, le gène est choisi parmi les gènes DDX31et BARHL1.
Le fragment polynucléotidique dont il est fait référence dans le cadre de l'invention correspond à un fragment d'un chromosome. Ce fragment a une longueur minimale de 18 nucléotides, et une longueur maximale qui peut aller jusqu'à la longueur
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totale du gène en question, ou de plusieurs gènes de l'invention qui sont contigus au sein de la région chromosomique. De préférence, le fragment a un nombre de nucléotides supérieur à 18. Une longueur particulièrement préférée est comprise entre 18 et 10000 nucléotides, de préférence entre 30 et 8000 nucléotides.
Selon des variantes préférées de l'invention, il est fait référence à des fragments dont la longueur est comprise entre 30 et 5000 nucléotides, de préférence entre 50 et 3000 nucléotides, par exemple entre 100 et 2000 nucléotides, ou entre 200 et 1000 nucléotides.
L'invention concerne également l'utilisation en cosmétique ou en thérapie d'un fragment polynucléotidique ou du produit d'expression d'un fragment ou d'un agent modulant la fonction d'un fragment, ou bien d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment, où le fragment en question correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, ou à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, de l'une des deux zones chromosomiques de l'invention. Selon un cas préféré, le fragment correspond plus particulièrement à une partie d'un exon de l'un de ces gènes.
Dans ce qui suit, seront désignés produits de l'invention , le fragment, le produit d'expression d'un fragment, l'agent modulant la fonction d'un fragment, et l'agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique correspondant à tout ou partie de l'un des 22 gènes du chromosome 6 ou l'un des 12 gènes du chromosome 9 identifiés par les inventeurs.
Pour ces gènes identifiés par les inventeurs, la présente invention concerne tout d'abord des utilisations dans le domaine de la cosmétique. On entend par cosmétique toute application qui ne tend à modifier que l'esthétique et n'a aucune visée thérapeutique.
Pour toutes les utilisations selon l'invention dans le domaine de la cosmétique, le produit de l'invention peut être conditionné sous différentes formes appropriées, seul ou en combinaison avec d'autres agents. En particulier, des formes préférées sont destinées à des applications locales et elles concernent les crèmes, les lotions, les gels, les émulsions, les pommades et les shampoings. D'autres formes sont aussi envisageables pour des
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utilisations selon l'invention, en particulier sous forme de pilules pour une administration orale.
Parmi les différentes visées cosmétiques dans le cadre de la présente invention, un domaine particulièrement préféré est celui de la pigmentation. La pigmentation peut être celle de la peau ou bien des phanères. Il peut s'agir de la couleur de la pigmentation comme de l'absence de pigmentation ; les problèmes touchant à la qualité et à l'intensité de la pigmentation sont aussi concernés par la présente invention.
En particulier, l'objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un produit de l'invention pour prévenir et/ou limiter et/ou arrêter le développement de la canitie.
L'objet de l'invention se rapporte aussi à l'utilisation d'au moins un produit de l'invention pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique de la canitie caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une composition comprenant au moins un produit de l'invention.
L'invention se rapporte aussi à un procédé de traitement cosmétique destiné à favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une composition comprenant au moins un produit de l'invention.
Les zones à traiter peuvent être, par exemple et sans aucune limitation, le cuir chevelu, les sourcils, la moustache et/ou la barbe.
Plus particulièrement, les procédés de traitement de la canitie et de pigmentation naturelle des cheveux et/ou poils gris ou blancs consistent à appliquer une composition comprenant au moins un produit de l'invention.
Les procédés de traitement pour lutter contre la canitie et/ou pour stimuler la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs peut par exemple consister à appliquer la composition sur les cheveux et le cuir chevelu, le soir, garder la composition toute la nuit au contact et éventuellement effectuer un shampooing le matin ou laver les cheveux à l'aide de cette composition et à laisser à nouveau en contact quelques minutes avant de rincer. La composition conforme à l'invention s'est révélée particulièrement intéressante lorsqu'elle est appliquée sous forme de lotion capillaire, éventuellement rincée ou même sous forme d'un shampooing.
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Pour ces gènes identifiés par les inventeurs, la présente invention concerne ensuite des utilisations thérapeutiques dans le domaine de la pigmentation.
Les affections touchant le système de pigmentation, que ce soit celui de la peau ou celui des phanères, peuvent avoir de graves conséquences sur la santé des personnes atteintes. En effet, la pigmentation de la peau joue le rôle de barrière protectrice face aux agressions lumineuses en particulier, les personnes souffrant d'albinisme sont dépourvues de protection faces aux rayons du soleil qui constituent pour eux un danger important. D'autres affections mettant en jeu la pigmentation sont aussi concernées par la présente invention.
Dans le cadre des utilisations thérapeutiques et cosmétiques tendant à modifier une caractéristique de la pigmentation, il s'agit de préférence de la pigmentation de la peau. Selon d'autres cas envisagés par la présente invention, le type de pigmentation qui doit être modifiée concerne la pigmentation des phanères, en particulier les ongles ou les poils.
Selon un cas particulier préféré de la présente invention, la pigmentation dont on cherche à modifier les caractéristiques est celle du système pileux en général et de la chevelure, moustache et sourcils en particulier. La présente invention permet de modifier le phénomène d'arrêt de la pigmentation des cheveux, c'est-à-dire la canitie, en particulier lorsque celle-ci survient de manière prématurée chez une personne et que l'on parle de canitie précoce.
Pour toutes les utilisations en thérapeutique, les produits actifs entrant dans la composition d'un médicament sont de préférence associés à des excipients pharmaceutiquement acceptables. Toutes les voies d'administration considérées comme acceptables peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention, en particulier voie intradermique, intraveineuse, musculaire, orale, otique, nasale, optique. La formulation est de préférence adaptée à la voie d'administration choisie.
Les utilisations pour la fabrication d'un médicament selon l'invention peuvent faire entrer dans leur formulation d'autres principes actifs. De même, l'administration d'un médicament comme défini dans l'invention peut être combinée avec l'administration d'un autre médicament, que cette administration soit simultanée, séquentielle ou séparée.
De même, les différents produits dont il est fait usage dans le cadre des utilisations en thérapie, peuvent être combinés et entrer dans la composition d'un unique médicament ou bien peuvent servir à la fabrication de différents médicaments. En
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particulier, s'ils entrent dans la composition de médicaments distincts, ils peuvent être administrés à des fréquences différentes.
Les caractéristiques et les variantes préférées des produits dont il est fait usage dans les utilisations selon l'invention peuvent être identiques dans le cadre des utilisations en cosmétologie et pour des utilisations du même produit dans la fabrication d'un médicament.
Dans les deux cas, l'utilisation de produits selon l'invention peut nécessiter que le produit soit introduit dans un fluide corporel, ou bien dans des tissus, ou dans des cellules.
Pour l'introduction dans des cellules, l'utilisation peut prévoir que le produit soit actif dans le cytoplasme des cellules, ou bien dans le noyau cellulaire.
La première utilisation, cosmétique ou thérapeutique, envisagée dans le cadre de l'invention est l'utilisation d'un fragment polynucléotidique dont la séquence correspond, au moins en partie, à l'un des gènes du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, ou à l'un des gènes du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Pour les utilisations en thérapeutique, le fragment polynucléotidique entre dans la fabrication d'un médicament.
Dans le cadre de cette première utilisation selon l'invention, les gènes préférés du chromosome 9 sont BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31 et BARHL1. Les gènes préférés du chromosome 6 sont HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT 007592.507 et NT 007592.508.
Concernant la nature chimique de ce fragment polynucléotidique, il peut s'agir d'une molécule d'ADN, simple ou double brin, circulaire ou linéaire, d'une molécule d'ARN ou de toute autre molécule envisagée dans la définition de fragment polynucléotidique donnée plus haut.
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Concernant son environnement, ce fragment peut être ou faire partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Il peut, dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour comporter ce fragment dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant ce fragment, il est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si le fragment est inséré dans un vecteur, le dit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement la traduction du fragment. Ce fragment peut aussi être entouré par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique, conduisant éventuellement à l'insertion du fragment de l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
Le fragment polynucléotidique tel que décrit peut se trouver sous forme naturelle ou bien être de nature synthétique, ou bien être en partie l'un et en partie l'autre, en particulier s'il s'agit d'une molécule duplex constitué de deux brins aux origines différentes. Selon différents cas envisagés par la présente invention, le fragment polynucléotidique peut être isolé, il peut avoir subi une étape de purification. Il peut s'agir aussi d'un fragment recombinant, par exemple synthétisé dans un autre organisme. Selon un exemple préféré, il s'agit d'un fragment d'ADN ayant été amplifié par PCR (Polymérisation Chain Reaction) puis purifié.
Selon d'autres constructions envisagées par la présente invention, la première utilisation fait usage d'une fragment polynucléotidique associé à une sonde. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation du fragment, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. La sonde peut aussi permettre de suivre la dégradation du fragment. La nature de la sonde est de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. L'homme du métier saura quelle sonde est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Le fragment polynucléotidique, dont il est fait usage dans le cadre de cette première utilisation selon l'invention, peut être utilisé dans un test d'hybridation, un séquençage, un microséquençage ou bien un test de détection de mésappariement.
Ce fragment selon l'invention contient au moins 18 nucléotides successifs, ces 18nucléotides constituant une séquence qui correspond à tout ou partie d'un gène du
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chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457 ou à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. En particulier, un fragment selon l'invention peut ne contenir que 18 bases complémentaires de 18 bases successives de l'un des gènes précédemment décrits.
Selon un autre cas particulier, le fragment décrit peut être l'ADNc ou l'ARN de l'une des gènes précédemment décrits. Il peut correspondre à un ou plusieurs exons de l'un des gènes, il peut correspondre à une séquence de régulation de l'un des gènes identifiés sur les chromosomes 6 et 9.
Dans le cadre de cette première utilisation, le nombre de fragments polynucléotidiques tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul.
En particulier, il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. De préférence, les séquences des différents fragments correspondent à des gènes distincts ou à des exons distincts.
Alternativement, il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. De préférence, les séquences des différents fragments correspondent à des gènes distincts ou à des exons distincts.
Cette première utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
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Selon un cas particulier envisagé, la première utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un fragment nucléotidique tel que décrit ou non.
Dans le cas où un gène responsable de la pigmentation est défectueux car muté, cette première utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un fragment polynucléotidique qui représente une nouvelle copie sauvage du gène endogène défectueux.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette première utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN antisense qui va bloquer la traduction dudit gène.
Une deuxième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes identifiés dans le cadre de la présente l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'un des gènes identifiés par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction d'une séquence endogène comprise dans l'un de ces gènes identifiés par l'invention. De préférence, un agent servant pour cette deuxième utilisation selon l'invention module non seulement la fonction d'un fragment d'ADN exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN endogène correspondant.
Le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à l'un des gènes du chromosome 6 choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457.
Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à l'un des gènes du chromosome 9 choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. En particulier, il peut s'agir d'un plasmide ayant uniquement une courte séquence correspondante à l'une des régions chromosomiques mentionnées. De
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préférence, la correspondance des séquences est établie sur au moins 18 nucléotides successifs.
Dans le cadre de cette deuxième utilisation selon l'invention, les gènes préférés du chromosome 9 sont BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31 et BARHL1. Les gènes préférés du chromosome 6 sont HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT 007592.507 et NT 007592.508.
Toutes les remarques qui précèdent, dans la partie définition, sur ce qu'il faut entendre par fonction d'un fragment d'ADN sont valables pour envisager toutes les utilisations correspondant à un deuxième utilisation selon l'invention.
Etant donné la pluralité de fonctions des fragments d'ADN, la modulation de ces fonctions comprend des aspects très différents. Dans le cas particulier où la fonction dudit fragment est d'être transcrite, moduler une telle fonction consiste à favoriser ou inhiber la capacité dudit fragment à être transcrit. Cela peut aussi consister à modifier le site d'initiation et de terminaison de la transcription, ou bien à modifier le taux d'initiation de la transcription. Selon un autre cas, moduler la fonction peut aussi consister à modifier l'épissage de l'ARN, par exemple en modifiant des signaux de reconnaissance de l'ADN responsables la répartition entre introns et exons.
Quand le fragment d'ADN appartient à une séquence régulatrice, modifier sa fonction peut consister à inhiber la fixation des enhancers ou des inhibiteurs. Elle peut consister au contraire à favoriser leur fixation, ou bien à favoriser la fixation d'autres facteurs de transcription. Il en est de même lorsqu'il s'agit de séquences utilisées par l'ARN polymérase.
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, comme dans le cadre de toutes les autres utilisations selon l'invention, le nombre de produits, en l'occurrence d'agents modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes identifiés dans le cadre de la présente invention, n'est pas limité et peut être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette deuxième utilisation, les différents agents dont il est fait usage peuvent avoir en commun de tous moduler la fonction de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un même gène de
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l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, ce gène est l'un des gènes du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Selon le deuxième aspect de la présente invention, le gène en question est l'un des gènes du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Des agents selon l'invention sont par exemple des molécules d'ADN simple brin capable de se fixer à des sous-régions définies de l'un des gènes de l'invention, pour former des triples hélices. Dans ces conditions, des agents selon l'invention abolissent la fonction de la sous-région à laquelle ils s'hybrident.
D'autres agents selon l'invention sont de préférence des polypeptides capables d'interagir avec des sous-régions définies de l'un des gènes de l'invention. De préférence, des agents selon l'invention sont des enhancers ou des inhibiteurs se fixant sur des régions régulatrices de l'un des gènes du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 etNT~007592.457.
Alternativement, des agents selon l'invention sont des enhancers ou des inhibiteurs se fixant sur des régions régulatrices de l'un des gènes du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Une autre catégorie d'agents selon l'invention concerne des molécules capables d'interagir avec des régions précises de l'ADN pour en changer sa conformation. Une autre catégorie concerne des molécules interagissant avec des inhibiteurs ou des enhancers pour en modifier leur fonction, les inhibiteurs ou enhancers ayant la fonction initiale de modifier l'expression de fragments d'ADN appartenant à l'un des gènes identifiés dans le cadre de la présente l'invention.
Un agent dont il est fait usage selon cette deuxième utilisation de l'invention peut en particulier moduler la fonction d'un fragment d'ADN correspondant à 18 bases successives de l'un des gènes précédemment décrits.
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Cette deuxième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la seconde utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, par exemple, à sa région promotrice.
Dans le cas où l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va activer la transcription dudit gène, par exemple en se fixant à sa région promotrice, ou bien en se fixant à un éventuel inhibiteur qui cessera de ce fait d'inactiver ledit gène.
Une troisième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
En particulier, un tel agent selon l'invention module la fonction d'un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes du chromosome 6 choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Selon un autre cas, un agent selon l'invention module la fonction d'un polypeptide issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés. Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée, peut correspondre au moins en partie à l'un des gènes du chromosome 9 choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
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Dans le cadre de cette troisième utilisation selon l'invention, les gènes préférés du chromosome 9 sont BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31 et BARHL1. Les gènes préférés du chromosome 6 sont HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT 007592.507 et NT 007592.508.
Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'un des gènes de l'invention identifiées par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'une séquence endogène comprise dans l'un des gènes de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette troisième utilisation selon l'invention module non seulement la fonction d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN endogène correspondant.
Moduler la fonction d'un polypeptide peut être réalisé de différentes manières. En particulier, il est possible de croître ou décroître son activité, son rendement, sa spécificité, son avidité pour un anticorps, il est possible de modifier son substrat pour une enzyme, son taux de conversion.
Des agents selon l'invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes identifiés par les inventeurs sur le chromosome 6, ou bien à l'un des gènes identifiés par les inventeur sur le chromosome 9.
D'autres agents remplissant les mêmes rôles peuvent être des molécules d'ADN simple brin, ou bien des molécules hybrides ADN-ARN. Le rôle de ces agents selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit.
D'autres agents préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables de se fixer sur ledit transcrit et ainsi d'en moduler sa traduction. De tels agents de la classe des polypeptides peuvent être d'origine naturelle ou synthétique (synthétisés chimiquement ou par voie biotechnologique). Notamment il peut s'agir d'anticorps. Comme mentionné plus haut, cette modulation peut se traduire par l'action de favoriser, empêcher, retarder,
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accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit. En particulier, l'interaction entre le polypeptide et ledit transcrit peut constituer un obstacle à la fixation normale des ribosomes.
Des agents tels que définis dans la présente invention peuvent moduler la fonction de la protéine codée par un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes du chromosome 6 choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Ces agents sont ou non de nature protéique. Un agent selon l'invention peut intervenir à un stade précoce en empêchant le repliement correct de la protéine. Un agent selon l'invention peut aussi modifier la fonction de ladite protéine en modifiant sa structure tridimentionnelle après le repliement. Il est aussi envisageable que cet agent soit un inhibiteur de la protéine, en particulier un inhibiteur compétitif.
Selon l'autre aspect de l'invention, des agents tels que définis dans la présente demande peuvent moduler la fonction de la protéine codée par un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes du chromosome 9 choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Les agents qui peuvent convenir dans le cadre de la présente invention ne sont pas limités à ceux cités précédemment.
Dans le cadre de cette troisième utilisation, le nombre d'agents modifiant la fonction d'un produit d'expression tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul.
Cependant, dans le cadre de cette troisième utilisation, les différents agents dont il est fait usage peuvent avoir en commun de tous moduler la fonction de produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un même gène de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, ce gène est choisi sur le chromosome 6 humain parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 etNT~007592.457. Selon le deuxième aspect de la présente invention, le gène en question est choisi sur le
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chromosome 9 parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Cette troisième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la troisième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette troisième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN antisens qui va bloquer la traduction dudit gène en empêchant le passage ARN-protéine. Une autre situation préférée consiste à choisir pour agent un anticorps capable de se fixer sur la protéine résultant de la traduction dudit gène.
Une quatrième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes identifiés dans le cadre de la présente invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
En particulier, un tel produit d'expression est le transcrit ARN, quelque soit le stade de maturation dudit transcrit, issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes du chromosome 6 choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, ou bien à l'un des gènes du chromosome 9 choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. En cas d'épissage, le transcrit peut donc être de taille inférieure au fragment d'ADN dont il est issu. De préférence, si le produit d'expression est une molécule d'ARN, elle comporte au moins 18 nucléotides.
Dans le cadre de cette quatrième utilisation selon l'invention, les gènes préférés du chromosome 9 sont BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement
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les gènes DDX31 et BARHL1. Les gènes préférés du chromosome 6 sont HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT 007592.507 et NT 007592.508.
Selon un autre cas préféré, un produit d'expression selon l'invention est issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés. Un tel produit d'expression peut donc comporter moins de 6 acides aminés si le transcrit dont il est issu a subi des étapes d'épissage. De préférence, un produit d'expression peptidique contient au moins 6 acides aminés.
Le produit d'expression selon l'invention ne provient pas nécessairement des étapes de transcription ou de traduction d'ADN génomique. En particulier, un produit d'expression utilisé selon l'invention peut être un produit d'expression issu d'ADN exogène dont une partie de la séquence au moins correspond à une partie de l'un des gènes de l'invention.
Est aussi envisagée par la présente invention l'utilisation d'un agent parfaitement synthétique mais semblable au produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène ou endogène correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention.
Des produits d'expression tels qu'utilisés par la présente invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes identifiés sur le chromosome 6 ou bien à l'un des gènes identifiés sur le chromosome 9. En particulier, pour former des ARN anti-sens ayant pour cible un ARN spécifique, il est envisageable d'utiliser des ARN issus de la transcription de la même séquence d'ADN que la cible mais non pas du brin leader, mais de sa séquence complémentaire portée par l'autre brin. On obtient ainsi des fragments d'ARN complémentaires des fragments cibles normalement synthétisés par la cellule. Le rôle attendu de ces produits d'expression selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction des transcrits normalement synthétisés par la cellule.
D'autres produits d'expression préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables d'introduire un changement dans le fonctionnement de la cellule dans laquelle elles agissent.
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Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, le nombre de produits d'expression d'un fragment d'ADN dont la séquence appartient ou correspond au moins en partie à l'un des gènes de l'invention, n'est pas limité et peut être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette quatrième utilisation, les différents produits dont il est fait usage peuvent avoir en commun d'être tous des produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un même gène de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, ce gène est l'un des gènes du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 etNT~007592.457. Selon le deuxième aspect de la présente invention, le gène en question est l'un des gènes du chromosome 9 choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Cette quatrième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la quatrième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN anti-sens qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, au transcrit synthétisé par la cellule.
Dans le cas où l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant dans la cellule ou bien une molécule d'ARN permettant la synthèse de la protéine codée par le gène ou bien la protéine codée par le gène.
Pour les quatre types d'utilisations décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation.
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Pour les quatre types d'utilisation décrits précédemment, le produit de l'invention pourra être incorporé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique.
Une telle composition comprend, dans un milieu pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable, une quantité de produits de l'invention comprise entre 0,001 et 10 % en poids par volume.
La composition peut être administrée par voie orale ou appliquée sur la peau (sur toute zone cutanée du corps) et/ou le cuir chevelu ou les cheveux.
Par voie orale, la composition peut contenir le ou les produits de l'invention en solution dans un liquide alimentaire tel qu'une solution aqueuse ou hydroalcoolique, éventuellement aromatisée. Ils peuvent également être incorporés dans un excipient solide ingérable et se présenter par exemple sous forme de granulés, de pilules, de comprimés ou de dragées. Ils peuvent également être placés en solution dans un liquide alimentaire luimême éventuellement conditionné dans des capsules ingérables.
Selon le mode d'administration, la composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées, particulièrement en cosmétologie.
Une composition préférée de l'invention est une composition cosmétique adaptée à une application topique sur le cuir chevelu et/ou la peau.
Pour une application topique, la composition utilisable peut être notamment sous la forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle du type crème ou gel aqueux ou anhydres, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elle peut ainsi se présenter sous forme d'onguent, de teinture, de crème, de pommade, de poudre, de timbre, de tampon imbibé, de solution, d'émulsion ou de dispersion vésiculaire, de lotion, de gel, de spray, de suspension, de shampooing, d'aérosol ou de mousse. Elles peuvent être anhydres ou aqueuses. Elle peut également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition peut en particulier être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation)
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éventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les cheveux, de masque.
Lorsque l'invention consiste en une utilisation à des fins cosmétiques, la composition sera préférentiellement une crème, une lotion capillaire, un shampoing ou un après-shampoing.
Les quantités des différents constituants des compositions utilisables sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés.
Lorsque la composition est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5% à 80% en poids, et de préférence de 5% à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les émulsionnants et les co-émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. L'émulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% à 30% en poids, et de préférence de 0,5 à 20% en poids par rapport au poids total de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques.
Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus de 90% du poids total de la composition.
Dans une variante, la composition sera telle que le ou les produits de l'invention sont encapsulés dans un enrobage tel que des microsphères, des nanosphères, des oléosomes ou des nanocapsules, l'enrobage sera choisi selon la nature chimique du produit de l'invention.
A titre d'exemple, les microsphères pourront être préparées selon la méthode décrites dans la demande de brevet EP 0 375 520.
Les nanosphères pourront se présenter sous forme de suspension aqueuse et être préparées selon les méthodes décrites dans les demandes de brevet FR 0015686 et FR 0101438.
Les oléosomes consistent en une émulsion huile dans eau formée par des globules huileux pourvus d'un enrobage cristal liquide lamellaire dispersé dans une phase aqueuse (voir les demandes de brevet EP 0 641 557 et EP 0 705 593).
Les produits de l'invention pourront aussi être encapsulés dans des nanocapsules consistant en un enrobage lamellaire obtenu à partir d'un tensio-actif siliconé (voir la demande de brevet EP 0 780 115), les nanocapsules pourront également être préparées à base de polyesters sulfonique hydrodispersibles (voir la demande de brevet FR 0113337).
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Les produits de l'invention pourront également être complexés à la surface de globules huileux cationiques, quelque soit leur taille (voir les demandes de brevet EP 1 010 413, EP 1 010 414, EP 1 010 415, EP 1 010 416, EP 1 013 338, EP 1 016 453, EP 1 018 363, EP 1 020 219, EP 1 025 898, EP 1 120 101, EP 1 120 102, EP 1 129 684, EP 1 160 005 et EP 1 172 077).
Les produits de l'invention peuvent enfin être complexés à la surface de nanocapsules ou nanoparticules pourvues d'un enrobage lamellaire (Voir EP 0 447 318 et EP 0 557 489) et contenant un tensio-actif cationique à la surface (voir les références citées précédemment pour les tensio-actifs cationiques).
En particulier, on préférera une composition telle que l'enrobage du ou des produits de l'invention a un diamètre inférieur ou égal à 10 m.
De façon connue, la composition peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique, et par exemple de 0,01% à 10% du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques.
Comme huiles ou cires utilisables, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffme. On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique).
Comme émulsionnants utilisables, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de Tefose 63 par la société Gattefosse.
Comme solvants utilisables, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol, le propylène glycol.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que
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l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et la silice hydrophobe, éthylcellulose, polyéthylène.
Les compositions peuvent associer au moins un produit de l'invention à d'autres agents actifs. Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple : - les agents modulant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation des cellules de la peau tels que le rétinol et ses esters, la vitamine D et ses dérivés, les oestrogènes tels que l'oestradiol, les modulateurs de l'AMPc tels que les dérivés de POMC, l'adénosine, ou la forskoline et ses dérivés, les prostaglandines et leurs dérivés, la triiodotrionine et ses dérivés ; - des extraits de végétaux tels que ceux d'Iridacées ou de soja, extraits pouvant alors contenir ou non des isoflavones ; - des extraits de micro-organismes ; - les agents anti-radicaux libres tels que l'a-tocophérol ou ses esters, les superoxyde dismutases ou ses mimétiques, certains chélatants de métaux ou l'acide ascorbique et ses esters ; - les anti-séborrhéiques tels que certains acides aminés soufrés, l'acide 13-cis rétinoïque, l'acétate de cyprotérone ; - les autres agents de lutte contre les états desquamatifs du cuir chevelu comme le zinc pyrithione, le disulfure de sélénium, le climbazole, l'acide undécylénique, le Kétoconazole, la piroctone olamine (octopirox) ou la ciclopiroctone (ciclopirox) ; en particulier, il pourra s'agir d'actifs stimulant la repousse et/ou favorisant le ralentissement de la chute des cheveux, on peut plus particulièrement citer à titre non limitatif : - les esters d'acide nicotinique, dont notamment le nicotinate de tocophérol, le nicotinate de benzyle et les nicotinates d'alkyles en C1-C6 comme les nicotinates de méthyle ou d'hexyle ; - les dérivés de pyrimidine, comme le 2,4-diamino 6-piperidinopyrimidine 3oxyde ou "Minoxidil" décrit dans les brevets US 4,139,619 et US 4,596,812 ; - les agents inhibiteurs de lipoxygenase ou inducteur de cyclo-oxydase favorisant la repousse des cheveux comme ceux décrits par la Demanderesse dans la demande de brevet européen EP 0 648 488 ;
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- les agents antibactériens tels que les macrolides, les pyranosides et les tétracyclines, et notamment l'Erythromycine ; - les agents antagonistes de calcium, comme la Cinnarizine, la Nimodipine et la Nifedipine ; - des hormones, telles que l'estriol ou des analogues, ou la thyroxine et ses sels ; - des agents antiandrogènes, tels que l'oxendolone, la spironolactone et la flutamide ; - des inhibiteurs stéroïdiens ou non stéroïdiens des 5-a-réductases tels que ceux décrits par la Demanderesse dans les demandes de brevet européen EP 0 964 852 et EP 1 068858 ou encore le finastéride ; - des agonistes des canaux potassiques dépendant de l'ATP tels que la cromakalim et le nicorandil.
Dans une autre possibilité de mise en #uvre, la présente invention concerne des procédés pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu.
En effet, la canitie précoce est un phénotype qui a été défini par les inventeurs comme étant, entre autres, caractérisé par l'apparition des premiers cheveux blancs tôt dans la vie, et de préférence vers l'âge de 18 ans. Comme ce phénotype est transmis à la génération suivante, il peut s'avérer important, pour les individus dont un parent ou un proche est atteint, de déterminer, avant l'apparition des symptômes, s'ils seront ou non sujets à cette atteinte. Le procédé de diagnostic selon l'invention est parfaitement adapté aux individus âgés de moins de 18ans.
Comme il est très probable que des facteurs environnementaux jouent un rôle dans le phénotype canitie comme dans celui canitie précoce , il s'agit, grâce aux procédés de l'invention, d'évaluer les risques de développer un tel phénotype, c'est-à-dire une prédisposition à la canitie précoce.
Un procédé selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'un ou de plusieurs marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Par marqueur, on entend une séquence d'ADN dont les différentes variations alléliques sont porteuses d'informations. Un tel marqueur peut être une courte séquence d'un gène dont la mutation est source du phénotype. Il peut s'agir aussi d'un marqueur situé physiquement sur le chromosome dans une région très proche d'un gène impliqué dans la canitie précoce. De préférence, le marqueur est un SNP (Single nucleotide polymorphism).
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Selon un premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 6 humain comprenant les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de l'un de ces gènes. Des gènes préférés sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Selon un deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 9 humain comprenant les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de l'un de ces gènes. Des gènes préférés sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6 et tout particulièrement les gènes DDX31 et BARHL1.
L'étape suivante de la mise en #uvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour le ou les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents dans un échantillon de matériel génétique issu de l'individu qui subit le test diagnostique. Deux allèles différents, portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
L'échantillon contenant le matériel génétique peut être le sang, une unique goutte étant suffisante pour la mise en #uvre d'un procédé selon l'invention. D'autres échantillons de fluides corporels peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Il est aussi envisageable d'utiliser quelques cellules issues de l'individu. L'homme de l'art saura déterminer quel échantillon pourra être utilisé dans le cadre de ce test, tout en minimisant le désagrément pour l'individu le subissant. Ce test diagnostic pourra éventuellement être couplé avec d'autres tests génétiques.
Les techniques courantes, bien connues du biologiste moléculaire, peuvent être utilisées pour effectuer la détermination des allèles du ou des marqueurs choisis ; des tests d'hybridation sont en particulier très courants dans ce genre d'étapes.
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Divers marqueurs sont potentiellement préférés dans le cadre de la mise en #uvre du procédé de l'invention. En particulier, des marqueurs bi-alléliques peuvent s'avérer particulièrement adéquats si une forme allélique traduit une prédisposition à la canitie précoce alors que l'autre forme allélique reflète au contraire l'absence d'une telle prédisposition. D'autres marqueurs plus courants sont polymorphiques et peuvent être trouvés sous au moins deux formes alléliques et généralement plus de deux.
Parmi les marqueurs qui peuvent être sélectionnés à la première étape du procédé de l'invention, des marqueurs particulièrement bien connus sont les SNPs. Lors de la sélection du marqueur, il est très important de se baser sur la valeur informative du polymorphisme du marqueur. Une situation particulièrement privilégiée consiste à sélectionner un marqueur dont certains variants alléliques traduisent une prédisposition à la canitie précoce alors que tous les autres variants reflètent au contraire l'absence d'une telle prédisposition. Dans de nombreuses situations, le marqueur ne remplit pas entièrement une telle condition, c'est-à-dire que par exemple certains allèles sont présents préférentiellement mais non exclusivement chez les individus prédisposés à la canitie.
Dans ces situations, il peut être très judicieux de sélectionner plusieurs marqueurs, afin d'établir un test diagnostic aussi fiable que possible.
Lorsque les marqueurs sélectionnés sont des SNP, les différents variants alléliques correspondent à la modification d'une base. Une situation particulièrement avantageuse à rechercher lors de la sélection du marqueur, correspond à la situation où certains allèles (modification d'une base) sont caractéristiques d'une prédisposition à la canitie précoce.
Selon le premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les marqueurs SNP suivants : 2734988,2734967, 1419664,2517502, rs733539, rs494620,154973, 206779,60071, rs763028.
Selon le deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les marqueurs SNP suivants : 418620, rs302919,913705, 932886,429269 et rs2526008.
Les procédés de l'invention ne sont pas limités aux deux étapes décrites et peuvent contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique du ou des marqueurs sélectionnés à la forme allélique de ce ou de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison
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supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'établir le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
Etant donné que la canitie précoce est une atteinte vraisemblablement multigénique, les causes de prédisposition sont nombreuses et peuvent difficilement être toutes envisagées de manière exhaustive. Par contre, au sein d'une même famille dont certains membres ont été précocement atteints de canitie, il est très probable que la cause de la susceptibilité est unique. De ce fait, lors de l'étape de comparaison, mentionnée comme éventuelle troisième étape des procédés de l'invention, une comparaison particulièrement riche en information est la comparaison des allèles du marqueur de l'individu subissant le test aux allèles du même marqueur pour les personnes de sa famille dont le phénotype est connu. Si plusieurs marqueurs ont été sélectionnés, il faut de préférence répéter cette opération pour tous les marqueurs.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules ayant un effet particulier. En particulier, l'invention concerne un procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique.
Selon le premier aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457. Des gènes préférés sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Selon le deuxième aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1,
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DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31et BARHL1.
Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction de l'un ou l'autre de ces fragments comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du fragment polynucléotidique. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le fragment polynucléotidique mise en évidence par une technique de détection de ligands.
La deuxième utilisation selon l'invention est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à un des gènes de l'invention. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents.
Les différentes fonctions que peuvent revêtir un fragment polynucléotidique ont déjà été explicitées dans la présente demande. En particulier, ces fonctions dépendent de la nature du fragment polynucléotidique, selon s'il s'agit d'ADN ou d'ARN par exemple.
Une modulation de la fonction peut correspondre à une diminution de la capacité à être transcrit, ou traduit, ou bien à un changement dans la capacité à interagir avec d'autres facteurs. En fonction des propriétés dudit fragment utilisé, l'homme de l'art est capable de déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à monitorer.
Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées.
La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des fonctions des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique de l' invention.
Selon le premier aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457.
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Des gènes préférés sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT~007592.508.
Selon le deuxième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31et BARHL1.
De préférence, le fragment d'ADN comprend au moins 18 nucléotides.
Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du produit d'expression. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit produit d'expression, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le produit d'expression mise en évidence par une technique de détection de ligands.
Comme mentionné précédemment dans la demande, on entend par produit d'expression d'un fragment d'ADN aussi bien les molécules d'ARN issues de la transcription du fragment, à tout stade de maturation, que les polypeptides issus de la traduction, aussi à tout stade de maturation. Pour une molécule d'ARN, différents stades de maturation sont représentés par la présence ou l'absence de coiffe, de queue polyadénylée, par exemple. Par différents stades de maturation d'un polypeptide, on inclut entre autres les polypeptides avant et après le repliement, avant et après clivage des différents signaux d'adressage, avec et sans glycosylation, avec et sans ponts disulfure.
Quant aux fonctions remplies par les produits d'expression des fragment d'ADN, elles sont très nombreuses et elles dépendent de la nature du produit d'expression en question. Des exemples ont déjà été donnés plus haut dans la présente demande.
La troisième utilisation selon l'invention est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents. Pour ce qui doit être compris par la locution moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN , des exemples ont déjà été donnés pour définir la troisième utilisation selon l'invention.
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En fonction des propriétés dudit produit d'expression utilisé, l'homme de l'art est capable de déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à monitorer.
Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées.
La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des fonctions des produits d'expression des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention permet aussi de mettre en évidence les mutations des gènes impliqués dans la pigmentation de la peau, des cheveux et des phanères, pour les gènes de l'invention. Une utilisation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser les marqueurs SNPs décrits précédemment au sein de chacune des régions comprenant les gènes d'intérêt dans le but de localiser plus finement les mutations de ces gènes impliquées dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
Dans le cadre de ces utilisations, selon le premier aspect de l'invention, les marqueurs dont il est fait usage pour la détermination des gènes d'intérêt sont choisis parmi les marqueurs SNP : 2734988,2734967, 1419664,2517502, rs733539, rs494620, 154973, 206779, 60071, rs763028.
Selon le deuxième aspect de l'invention, les marqueurs dont il est fait usage pour la détermination des gènes d'intérêt sont choisis parmi les marqueurs SNP 418620, rs302919,913705, 932886, 429269 et rs2526008.
La présente invention repose sur l'identification par les inventeurs de gènes, sur les chromosomes 6 et 9 humains, impliqués dans le phénomène de pigmentation ou de dépigmentation. Cette base génétique leur a permis d'envisager les utilisations en thérapie et en cosmétique décrites précédemment, ainsi que les procédés de diagnostic illustrés précédemment.
Mais comme déjà mentionné, les inventeurs soupçonnent que de nombreux gènes sont impliqués dans les phénomènes de pigmentation, et dans ceux liés à la régulation et la cessation de cette pigmentation. Notamment, il est envisagé que les gènes de l'invention sur le chromosome 9 sont principalement responsables de la canitie, alors que les gènes de l'invention sur le chromosome 6 sont concernés par la précocité de la canitie. De ce fait, un
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part importante de la présente invention consiste à combiner les résultats obtenus pour les gènes de l'invention, pour en tirer le plus d'informations complémentaires.
En particulier, une première utilisation de combinaison dans le domaine de la cosmétique et de la thérapie, fait de préférence usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques dont la séquence de chacun correspond, au moins en partie, à celle d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457 ou bien à celle d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Des gènes préférés sur le chromosome 6 sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Des gènes préférés sur le chromosome 9 sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31et BARHL1.
De préférence, parmi les différents fragments polynucléotidiques dont il est fait usage, au moins deux ont des séquences correspondant à deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour un même gène de l'invention, les différents fragments dont il est fait usage aient des natures chimiques différentes, par exemple de l'ADN pour le premier fragment et de l'ARN pour le second. Il est aussi envisageable que différents fragments aient une séquence correspondant au même gène, mais avec les faibles variations permises par la définition de séquences correspondances , c'est-à-dire au plus un nucléotide différent sur 10, de préférence 1 sur 100.
Les fragments selon l'invention contiennent au moins 18 nucléotides successifs, ces 18nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.
Toutes les utilisations préférées, la nature chimique des fragments, leur environnement, ont déjà été explicités en détails dans la partie décrivant la première utilisation selon l'invention.
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Lorsqu'il est fait usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques, ces deux fragments sont de préférence portés par des molécules distinctes. Il est aussi envisageable que ces deux fragments fassent partie par exemple d'un même vecteur. Selon un cas préféré, les différents fragments sont de même nature chimique, par exemple de l'ADN pour tous les fragments.
Pour les utilisations en thérapeutique, les fragments polynucléotidiques entrent dans la fabrication d'un médicament.
Une deuxième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, et ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Des gènes préférés sur le chromosome 6 sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Des gènes préférés sur le chromosome 9 sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31et BARHL1.
De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction de fragments d'ADN correspondant à deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour un même gène de l'invention, les différents agents dont il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même fragment d'ADN.
Les fragments d'ADN dont la fonction est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes identifiés dans le cadre de la présente invention.
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Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la deuxième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament.
Une troisième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLADQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, et ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
* Des gènes préférés sur le chromosome 6 sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Des gènes préférés sur le chromosome 9 sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31et BARHL1.
De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction du produit d'expression de fragments d'ADN correspondant à deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour un même gène de l'invention, les différents agents dont il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même produit d'expression d'un fragment d'ADN ou bien modulent différents produits d'expression d'un fragment d'ADN, par exemple les ARN à différents stades de maturation, ou bien les ARN issus de différents épissages.
Les fragments d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.
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Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la troisième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament.
Une quatrième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux produits d'expression de fragments d'ADN choisis parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, et ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Des gènes préférés sur le chromosome 6 sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Des gènes préférés sur le chromosome 9 sont les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement le gène Q96MA6.
De préférence, parmi les différents produits d'expression dont il est fait usage, au moins deux sont issus de fragments d'ADN correspondant à deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour un même gène de l'invention, les différents produits d'expression dont il est fait usage soient issus d'un même fragment d'ADN, il peut s'agir par exemple des ARN à différents stages de maturation, ou bien des ARN issus de différents épissages. Les mêmes possibilités sont offertes pour les polypeptides issus de la traduction des ARN
Les fragments d'ADN dont les produits d'expression sont utilisés selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.
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Toutes les utilisations préférées de tels produits d'expression ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la quatrième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les produits d'expression entrent dans la fabrication d'un médicament.
Pour les quatre types d'utilisations de combinaison décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation.
Parmi les nombreuses combinaisons envisagées par la présente invention, une combinaison très intéressante comprend au moins un fragment polynucléotidique correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457 pour la première utilisation de combinaison.
Pour la deuxième utilisation de combinaison, parmi les agents dont il est fait usage, de préférence un au moins de ces agents module la fonction d'un fragment d'ADN correspondant ou bien appartenant à un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT 007592.457.
Pour la troisième utilisation de combinaison, parmi les agents dont il est fait usage, de préférence un au moins de ces agents module la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant ou bien appartenant à un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 etNT~007592.457.
Pour la quatrième utilisation de combinaison, parmi les produits d'expression dont il est fait usage, de préférence, un au moins de ces produits d'expression est issu d'un fragment d'ADN correspondant ou bien appartenant à un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB,
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HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457.
Dans toutes les utilisations de combinaison précédemment décrites, en cosmétique ou en thérapie, il est fait usage de plusieurs fragments ou de plusieurs produits d'expression de fragment ou de plusieurs agents modulant la fonction de fragments, ou bien de plusieurs agents modulant la fonction du produit d'expression de fragments, où le fragment en question correspond à tout ou partie de l'un des gènes de l'invention. De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question correspond à un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 etNT~007592.457.
De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question dans les utilisations de combinaison correspond à un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Pour les quatre types d'utilisation de combinaison décrits précédemment, les combinaisons de l'invention pourront être incorporées dans une composition cosmétique ou pharmaceutique telle que décrite plus haut.
Afin de tirer profit de la combinaison de ces gènes sur les deux régions chromosomiques, la présente invention concerne aussi des procédés de combinaison. Ces procédés sont mis en #uvre pour la détermination d'une éventuelle prédisposition à la canitie précoce.
Un procédé de combinaison selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'au moins deux marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Les marqueurs sélectionnés sont choisis parmi les marqueurs appartenant à la région du chromosome 6 humain comprenant les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, les marqueurs appartenant à la région du chromosome 9 humain comprenant les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. De
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préférence, les marqueurs sélectionnés appartiennent à la séquence de l'un des gènes mentionnés sur les chromosomes 6 et 9.
Des gènes préférés sur le chromosome 6 sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Des gènes préférés sur le chromosome 9 sont les gènes BARLH1, DDX31, GTF3 C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31et BARHL1.
De préférence, parmi les marqueurs sélectionnés, deux au moins n'appartiennent pas au même gène de l'invention. Selon un cas particulier de la présente invention, les marqueurs, au nombre de deux au minimum, sont choisis parmi la liste suivante de marqueurs SNP : 2734988,2734967, 1419664,2517502, rs733539, rs494620,154973, 206779, 60071, rs763028, 418620, rs302919, 913705,932886, 429269 et rs2526008.
L'étape suivante de la mise en #uvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents dans un échantillon de matériel génétique issu de l'individu qui subit le test diagnostique. Deux allèles différents, portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
Les modalités de mise en oeuvre de ces procédés ont déjà été explicitées dans la partie consacrée aux procédés de diagnostic.
Les procédés de combinaison de l'invention ne sont pas limités à l'utilisation de deux marqueurs, ils ne sont pas limités non plus aux deux étapes décrites et peuvent contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de combinaison de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique des marqueurs sélectionnés à la forme allélique de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'établir le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
Comme pour les procédés de diagnostic déjà mentionnés dans la présente demande, une situation particulièrement intéressante consiste à comparer les allèles des
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marqueurs sélectionnés aux allèles de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus de la même famille que l'individu à diagnostiquer.
Enfin, la présente invention concerne un kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Des gènes préférés sur le chromosome 6 sont les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQAl, HLA-DQA2 et NT~007592.588, et tout particulièrement les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT 007592.508.
Des gènes préférés sur le chromosome 9 sont les gènes BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et tout particulièrement les gènes DDX31 et BARHL1.
Les fragments ont de préférence une longueur comprise entre 15 et 5000 nucléotides, de préférence entre 30 et 5000, de préférence entre 40 et 3000 nucléotides.
Légende des figures Figure 1 : des familles analysées pour liaison avec la région-candidate Figure 2 : Région candidate pour la CP sur le chromosome 6 : Localisation chromosomique et distribution des marqueurs Figure 3 : Représentation graphique des scores NPL obtenus pour l'analyse de liaison non-paramétrique multipoints génome global sur les familles CP pour les chromosomes 6 et 9.
Abscisse = position sur la carte génétique (0 = pter)
Ordonnée = score NPL Figure 4 : Représentation schématique des loci CP identifiés sur les chromosomes 6 et
9 par l'étude génome global.
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La distance entre marqueurs est indiquée en cM.
Figure 4A : 6, locus6p21-p 12 Figure 4B : 9, locus 9q34 Figure 5 : Lod scores simulés pour les 29 familles sélectionnées.
Dans l'ordre, les colonnes affichent le Lod score moyen, la déviation standard, le Lod score minimum, le Lod score maximum et le groupe (A-E) dans lequel la famille se place selon son score.
Figure 6 : Lod scores potentiels par famille en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP.
Figure 7 : scores détaillé par famille en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP : simulation après collection des nouvelles familles.
Figure 8 : simulation sur les familles finalisées pour la recherche des régions chromosomiques candidates. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 9 : (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 10 : de la composition des familles entre l'analyse région- candidate et l' analyse Génome-global.
Figure 11 : Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité de la CP.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 12 : (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 13 : récapitulatif des différentes étapes de l'analyse des régions A et B à l'aide de la technologie basée sur les SNPs.
Figure 14 : Composition des 4 pools. Les pools AI et AII sont composés d'individus atteints de canitie précoce. Les deux pools contrôles BI et BII sont composés d'individus croisés pour origine et âge avec les individus atteints de canitie précoce.
Figure 15 : Graphe indiquant la significativité des 288 SNPs testés sur les pools pour la régions A. L'abscisse représente les SNPs, numérotés de 1 à 288 le long de
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la région A (du télomère p vers le télomère q), chaque SNP étant séparé de ses voisins par une région de 30kb en moyenne. L'ordonnée représente 1/p, p étant la significativité statistique. Cependant, les valeurs 1/p supérieure à
500 (c'est-à-dire p<0,02) ont été maximalisées à 500.
Figure 16 : Graphe indiquant la significativité des 171 SNPs testés sur les pools pour la régions B. L'abscisse représente les SNPs, numérotés de 1 à 171 le long de la région B (du télomère p vers le télomère q), chaque SNP étant séparé de ses voisins par une région de 30kb en moyenne. L'ordonnée représente 1/p, p étant la significativité statistique. Cependant, les valeurs 1/p supérieure à
500 (c'est-à-dire p<0,02) ont été maximalisées à 500.
Figure 17 : Tableau répertoriant les 43 SNP retenus pour le génotypage individuel. La première colonne indique leur numéro (numéro attribué à l'étape précédente de 1 à 288 le long de la région A, du télomère p vers le télomère q). La seconde colonne indique le nom du SNP. Les colonnes suivantes indiquent les valeurs des différentes comparaisons A-B (AI-BI ; AII-BII ; AI-BII) avec la valeur p associée. La mention M signifie que la valeur de la significativité p est inférieure à 0,05. La dernière colonne précise le gène éventuellement chevauché par ledit SNP.
Figure 18 : répertoriant les 33 SNP retenus pour le génotypage individuel. Les colonnes contiennent le même type d'informations que pour la figure 17.
Figure 19 : répertoriant les 43 SNP retenus pour le génotypage individuel. La première colonne indique la position sur le chromosome, la seconde leur identifiant, la colonne suivante leur numéro (numéro attribué à l'étape précédente de 1 à 288 le long de la région A, du télomère p vers le télomère q). Les colonnes suivantes indiquent s'il s'agit de SNPs présents au sein d'un cluster ou de doubles spots.
Figure 20 : Tableau répertoriant les 33 SNP retenus pour le génotypage individuel. Les colonnes contiennent le même type d'informations que pour la figure 19.
Figure 21 : Représentation schématique des résultats de déséquilibre de liaison sur la région A. La significativité des associations entre SNPs pris deux à deux est représentée par un code de couleur.
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Figure 22 : Représentation schématique des résultats de déséquilibre de liaison sur la région B. La significativité des associations entre SNPs pris deux à deux est représentée par un code de couleur.
Figure 23 : représentant la comparaison des fréquences alléliques/ génotypiques pour chaque SNP de la région A dans les groupes 'canitie précoce' et contrôle, mettant en lumière les associations SNPs/phénotypes.
Les gènes concernés sont indiqués en abscisse avec les SNPs.
Figure 24 : représentant la comparaison des fréquences alléliques/ génotypiques pour chaque SNP de la région B dans les groupes 'canitie précoce' et contrôle, mettant en lumière les associations SNPs/phénotypes.
Les gènes concernés sont indiqués en abscisse avec les SNPs.
EXEMPLES EXEMPLE 1 Résumé des travaux effectués
Afin de localiser le ou les gènes de la canitie précoce (CP), il a été réalisé un programme d'analyse de ségrégations (liaison génétique) chez des familles où ce trait se transmet à travers les générations. Au terme d'une série de présélections sur la base de la puissance statistique de l'échantillon et de la confirmation des phénotypes, douze familles sont retenues pour participer à une étude de liaison et l'ADN fut préparé à partir d'un échantillon de sang périphérique de chacun des individus informatifs (présentant et ne présentant pas le trait). L'étude a été réalisée selon deux approches principales, analyse ciblée sur une région-candidate et étude génome-global sur les vingt-deux chromosomes autosomiques et le chromosome X.
De l'ensemble des analyses réalisées en fixant ou ne fixant pas des paramètres pour la transmission du trait de CP, deux loci potentiels se dégagent sur les chromosomes 6 et 9. Le locus sur le chromosome 6p21-p12 entre les marqueurs D6S1629 et D6S1280, dans la région des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC, HLA) présente de robustes évidences pour contenir un gène de prédisposition et un autre locus (chromosome 9q31-q32) montre également des signes suggestifs de liaison à la CP.
Cette étude, et en particulier la discordance entre les scores obtenus pour les analyses paramétrique/non-paramétrique, suggère que la canitie précoce ne serait pas
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provoquée par un petit nombre de gènes à effet majeur, mais serait plutôt gouvernée par un système multifactoriel incluant l'action de plusieurs gènes de prédisposition.
INTRODUCTION
Le caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie, est une hypothèse proposée depuis bien longtemps, du fait du caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains.
Pour explorer la canitie de par son aspect génétique, il a été réalisé une étude de ségrégation de l'ADN chez des familles dont la canitie apparaît très tôt dans la vie. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette chasse aux gènes, la composition de l'échantillon pour l'étude s'est déroulée selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype CP fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans. Les familles furent retenues pour l'étude sur la base de leurs performances statistiques dans l'analyse de ségrégation.
La partie de l'étude réalisée est décrite selon quatre époques principales: A- Epoque 1 : du potentiel de l'étude. Un première sélection des familles les plus informatives est réalisée par une simulation d'analyse de liaison.
B- Epoque 2 : médicale des phénotypes et collection des échantillons sanguins chez les familles présélectionnées. Cette campagne de vérification aboutit à une nouvelle liste de familles candidates pour l'étude. Une nouvelle simulation de liaison permet d'estimer le potentiel de l'échantillon corrigé.
C- Epoque 3: Analyse de liaison génétique avec la région chromosomique candidate pour la CP. Première phase d'analyse des ADNs pour la région chromosomique qui pourrait contenir les gènes de la CP.
D- Epoque 4 : de liaison génétique globale de la CP sur tout le génome humain.
Analyse de ségrégations familiales sur l'ADN des 22 chromosomes autosomiques et le chromosome X afin de détecter les régions qui se lient au trait CP.
Les résultats obtenus à chaque époque sont présentés sous forme de tableaux et de figures de manière synthétique dans les tableaux récapitulatifs ou de manière profonde dans les tableaux détaillés.
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RESULTATS A- Epoque 1: Choix des familles avec l'aide de la simulation d'analyse de liaison
Au terme d'une tentative de sélection des familles avec une canitie précoce selon des critères d'informativité pour une localisation génique, 29 familles ont été soumises à une simulation d'analyse de liaison génétique. Sur la base de la disponibilité de tous les individus, il s'avérait que ce projet possédait un potentiel de succès très encourageant car dix-neuf pedigrees (soit 255 individus) furent alors retenus. Cette conclusion n'étant valable que si les phénotypes sont confirmés et si la majorité des sujets acceptent de participer à l'étude. Parmi cette sélection se trouvent sept familles très informatives qui individuellement pourraient atteindre ou dépasser un Lod score Z=4. 00 (soit plus que la limite inférieure de significativité du Lod score qui est de Z=3.00). Afin de rassembler un maximum de chance de succès, il était très important que le diagnostic de CP soit attribué avec rigueur.
Le résultat de cette étude permet, selon la robustesse de l'évaluation clinique, de qualifier les familles qui sont ensuite collectées pour l'étude génétique.
1. Critèrespour l'attribution du phénotype CP
Vingt-neuf familles parmi les 65, ont été retenues, sur des critères de structure (nombre d'individus total, atteints, disponibles), pour être analysées en simulation.
Lors du processus de simulation: a) un logiciel génère une série de réplicats du fichier code en assignant des génotypes simulés. Le fichier obtenu pour chaque famille explore plusieurs combinaisons alléliques (génotypes) chez chacun des individus. b) un logiciel vient ensuite analyser chacun des réplicats pour estimer les Lod scores (Z) possibles de analyse de liaison génétique chez chaque famille. Les résultats, sous forme de Lod scores minimum, moyen et maximum permettent ainsi d'évaluer le potentiel de chaque famille dans ce type d'étude.
Evidemment, ces estimations ne restent valables que dans le cas où chaque individu s'est vu attribuer un phénotype correct. En cas d'incertitude, le phénotype doit être indiqué comme inconnu; il n'est alors pas pris en compte dans l'étude et donc ne nécessite pas d'être prélevé. Le Lod score diminue (dans des proportions variables) chaque fois qu'un individu est enlevé pour phénotype incertain.
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Les arbres généalogiques ont été redessinés à l'aide d'un logiciel de gestion de pedigrees, qui construit également les fichiers codés (fichiers preplink) pour l'analyse de liaison génétique. En plus des codes indiquant pour chaque individu, les liens de parenté, le sexe, le phénotype ainsi que le génotype qui sera incrémenté par le logiciel de simulation SLINK, un code de disponibilité (cd) (tableau 1) est attribué. Il pondère ainsi, par un code de 0 à 3, le caractère informatif de chaque individu dans l'étude.
Le phénotype de chaque individu fut assigné d'après les informations figurant dans les pedigrees et les tableaux de description du rapport Genormax. Toutefois, pour certains individus, le phénotype a été modifié d'après les critères indiqués dans le tableau 2. Les individus, non-présents sur les pedigrees initiaux (identifiés par un numéro seulement) ont été portés phénotypiquement inconnu, et sont été considérés indisponibles (cd=3). a. Codes de disponibilité
Lors de la simulation, n'ont été pris en compte que les individus pour lesquels (tableau 1): - il sera possible, d'après l'étude Genormax, de prélever du sang en vue de préparer l'ADN pour les étude de génétique (âge, domicile en France métropolitaine/outremer/étranger, consentement à priori); - le phénotype de canitie précoce aura été clairement défini (tableau 2).
Figure img00490001
<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1 <SEP> : <SEP> Définition <SEP> des <SEP> codes <SEP> de <SEP> disponibilité
<tb> code <SEP> de <SEP> disponibilité <SEP> (cd) <SEP> ADN <SEP> phénotype
<tb> 0 <SEP> indisponible <SEP> connu
<tb> 1 <SEP> disponible <SEP> inconnu
<tb> 2 <SEP> disponible <SEP> connu
<tb> 3 <SEP> indisponible <SEP> inconnu
<tb> Tableau <SEP> 2 <SEP> : <SEP> Définition <SEP> des <SEP> phénotypes
<tb> <25ans <SEP> 25 <SEP> ans <SEP> >25ans
<tb> pas <SEP> de <SEP> cheveux <SEP> blancs <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> quelques <SEP> cheveux <SEP> blancs <SEP> (qb) <SEP> (- <SEP> de <SEP> 50%) <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
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b. Assignation du phénotype selon l'âge
Afin d'écarter les risques d'erreurs, les critères suivants ont été définis pour l'assignation du phénotype en fonction de l'âge chez les individus de moins de 30 ans.
Toutefois, lors de l'examen clinique final, il est souhaitable que la définition du phénotype soit plus quantitative. c. Autres paramètres
Après examen de la variation du Lod score maximum chez la famille Can65 (test 100,200, 300,500 réplications), le nombre de réplications (générations des combinaisons alléliques) a finalement été fixé à 200.
La fréquence du trait a été fixée à 1%. Le nombre d'allèles possibles pour le génotype est fixé à 6 avec une fréquence équivalente pour chacun.
2. Résultats a- Classification desfamilles selon leurs scores Le tableau 3 donne une indication du potentiel des familles GENORMAX en fonction du Lod score maximum (Zmax) atteint (groupe A-E). La figure 5 rapporte le Lod score simulé pour chaque famille.
Tableau 3 : familles/Lod scores maximum. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 5.
Figure img00500001
<tb>
<tb>
Lod <SEP> Score <SEP> Maximum <SEP> (LMx) <SEP> nombre <SEP> de <SEP> familles <SEP> groupe
<tb> Zmax <SEP> > <SEP> ou <SEP> = <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> A
<tb> 3<Zmax<4 <SEP> 6 <SEP> B
<tb> 2<Zmax<3 <SEP> 6 <SEP> C
<tb> 1#Zmax<2 <SEP> 7 <SEP> D
<tb> Zmax<l <SEP> E
<tb>
Le Lod score maximum ne peut être atteint que lorsqu'un marqueur de l'ADN est informatif à 100% dans une famille. Le plus souvent, même avec le type de marqueurs utilisés (les marqueurs les plus informatifs dans les régions chromosomiques à visiter), le Lod score n'atteindra pas sa valeur maximum.
En analyse de liaison génétique, pour être significatif, le Lod score doit atteindre ou excéder la valeur de 3 (résultat à 1000/1).
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b- Effet d'un diagnostic incorrect sur les résultats d'analyse de liaison
L'effet de l'attribution d'un diagnostic incorrect a été testé sur les résultats d'analyse (en cas de liaison à un locus) par une simulation sur la famille Can46 en variant le phénotype de 1,2 ou 3 individus (tableau 4).
Tableau 4: Lod score obtenus pour une série de distances du marqueur au locus du trait (Lod score maximum en gras).
Figure img00510001
<tb>
<tb>
1- <SEP> selon <SEP> le <SEP> diagnostic <SEP> actuel(lod <SEP> score <SEP> maximum)
<tb> distance <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 01 <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0. <SEP> 4
<tb> Lod <SEP> score <SEP> 2.28 <SEP> 2. <SEP> 24 <SEP> 2. <SEP> 08 <SEP> 1. <SEP> 88 <SEP> 1. <SEP> 44 <SEP> 0. <SEP> 95 <SEP> 0. <SEP> 43 <SEP> a
<tb> 2- <SEP> 3 <SEP> individus <SEP> incorrectement <SEP> diagnostiqués <SEP> (A2, <SEP> R10, <SEP> R19)
<tb> distance <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 01 <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0.4
<tb> Lod <SEP> score-3.89 <SEP> -1. <SEP> 75 <SEP> -0. <SEP> 90 <SEP> -0. <SEP> 50 <SEP> -0. <SEP> 14 <SEP> -0. <SEP> 01 <SEP> 0. <SEP> 01 <SEP> a
<tb> 3- <SEP> 2 <SEP> individus <SEP> incorrectement <SEP> diagnostiqués(A2, <SEP> R19)
<tb> distance <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 01 <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0.4
<tb> Lod <SEP> score-2.85 <SEP> -0. <SEP> 75 <SEP> -0. <SEP> 05 <SEP> 0. <SEP> 22 <SEP> 0. <SEP> 36 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> a
<tb> 4- <SEP> 1 <SEP> individu <SEP> incorrectement <SEP> diagnostiqué <SEP> (R19) <SEP>
<tb> distance <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 01 <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0.4
<tb> Lod <SEP> score <SEP> 1. <SEP> 24 <SEP> 1. <SEP> 24 <SEP> 1. <SEP> 23 <SEP> 1. <SEP> 16 <SEP> 0. <SEP> 94 <SEP> 0. <SEP> 63 <SEP> 0. <SEP> 27 <SEP> a
<tb>
3. Discussion, conclusion et décisions
Cette étude de simulation permet de placer les 29 familles présélectionnées en 5 groupes selon le Lod score maximum potentiel. Bien qu'une liaison soit significative dès que la valeur de Lod score de Z=3.00 est atteinte, les inventeurs ont préféré distinguer 2 groupes lorsque ce critère est vérifié car le Lod score simulé maximum est très rarement atteint. Ainsi la probabilité que le Lod score réel pour des familles se plaçant dans le groupe B (3<Zmax<4) est assez faible.
Les familles du groupe A seront informatives dans une analyse de liaison génétique pour la localisation du/des gènes de la canitie précoce. Pour cela, aucune incertitude ne doit subsister quant au phénotype. Dans le doute, il est conseillé d'exclure des individus, voire des familles de l'étude.
Toutefois, chez certaines de ces familles, la proportion élevée d'individus atteints/non-atteints (parfois tous les enfants atteints) doit inciter à une extrême méfiance sur le caractère génétique à 100% du trait. Bien entendu, il n'est pas exclu que dans
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certaines familles, le gène CP ait été transmis simultanément par les branches paternelle et maternelle de la première génération. Dans ce cas, les petits enfants seraient tous atteints (Can28,43, 53...). Afin de pouvoir considérer positivement ces quelques familles, il est hautement souhaitable de vérifier cette hypothèse.
Les familles du groupe B sont elles-mêmes très intéressantes car elles permettent d'étoffer l'échantillon, même si individuellement elles ne pourront accéder à un Lod score significatif dans la plupart des cas. En groupe, elles peuvent cependant permettre de consolider le Lod score, spécialement s'il s'avère que le trait était génétiquement hétérogène (légèrement).
Les familles du groupe C, peuvent être également utilisées dans des études de réplications des résultats de liaison génétique.
Les familles des groupes D et E (Zmax<2) sont peu informatives pour une analyse de liaison génétique.
Il semble, sous réserve d'une caractérisation clinique robuste, que les familles des groupes A, B et C sont appropriées pour une étude d'analyse de liaison génétique et qu'elles doivent être collectées (individus avec cd=2). En effet, les analyses de liaison génétique réalisées sur des échantillons insuffisamment caractérisés sont vouées à l'échec ou à un "pâle" résultat (locus imprécis). Etant donné, que dans de telles analyses, certains paramètres ne peuvent être sous total contrôle (en particulier l'informativité des génotypes), et que l'hétérogénéité génétique toujours possible rend la tâche plus délicate (car elle réduit la puissance de l'analyse sur l'ensemble des familles), il semble donc indispensable de rassembler dès le départ tous les atouts qui peuvent être gérés. Dans cette première étape, les inventeurs ont donc fortement recommandé que le phénotype de chaque individu avec un code de disponibilité approprié (cd=2) soit soigneusement vérifié avant collection (phénotype confirmé, ou exclusion de l'échantillon/de la famille).
B- Epoque 2: Collection des échantillons, confirmation des phénotypes et nouvelles estimations dupotentiel de l'étude
Sur la base des résultats de l'époque 1, les 19 familles (groupes A, B, et C) retenues pour former une banque dans laquelle seront prélevés les pedigrees pour les analyses de liaison génétique, furent contactées pour confirmation du diagnostic CP et collection d'une série d'individus atteints et non atteints.
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Cette campagne de vérification médicale des phénotypes a permis de confirmer un grand nombre des diagnostiques CP, mais pas tous comme prévu. Le refus de quelques individus clés (atteints de CP) de participer au projet, le décès de certains ainsi que réajustement d'une partie des phénotypes a conduit à ne pas retenir un certain nombre de familles et réduit le potentiel d'informativité de plusieurs autres familles.
1- Ré-estimation du potentiel de l'étude après confirmation desphénotypes
Afin de ré-estimer le potentiel de l'étude après la vérification des phénotypes, les inventeurs ont simulé une analyse de liaison sur les 8 familles qui pouvaient encore être informatives. Le tableau 5 présente les résultats obtenus pour l'ensemble des 8 familles dans 3 situations d'hétérogénéité génétique (0%, soit toutes les familles liées au même locus, 50% ou seulement la moitié des familles liées au locus, 70% ou seulement environ un tiers des familles liées).
Tableau 5 : Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP Les résultats détaillés par familles figurent dans le tableau de la figure 6.
Taux d'
Hétérogénéité Moyen StdDev Minimun Maximum Max époquel
0% 5. 094620 1. 679698 1. 221207 8. 835722 38. 823
50% 1. 619190 1. 553049 0. 000000 7. 409957 -
70% 0. 835383 1. 022004 0. 000000 5. 517145 2- Conclusion
Dans un effort continuel pour l'optimisation de l'échantillon pour les analyses de liaison, 4 familles supplémentaires ont été identifiées (tableau 6 ; 2 familles-can65B et can46B- sont des branches collatérales des familles can65 et can46) et les phénotypes de nouveau vérifiés.
Après une nouvelle simulation (tableau 7), il s'avère que le Lod score maximum général de liaison est à peine supérieur (Z=8. 91) si les 12 familles retenues (phénotypes strictement définis) sont liées au même locus. L'augmentation attendue du Lod score par l'apport de nouvelles familles est cependant réduite par la correction et le durcissement des phénotypes.
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Tableau 6: Liste finale des familles
1 c103974
2 F104512
3 CAN33
4 CAN35
5 CAN43
6 CAN46
7 CAN46B
8 Can53
9 CAN55
10 CAN62
11 CAN65
12 CAN65B Tableau 7 : Nouvelle simulation après collection des nouvelles familles.
Les Lod scores potentiels sont exprimés en fonction du taux d'hétérogénéité génétique Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 7.
Figure img00540001
<tb>
<tb>
Taux <SEP> d' <SEP>
<tb> Hétérogénéité <SEP> Moyen <SEP> StdDev <SEP> Minimun <SEP> Maximum
<tb> 0% <SEP> 4. <SEP> 752321 <SEP> 1. <SEP> 748924 <SEP> 0. <SEP> 356854 <SEP> 8. <SEP> 914062
<tb> 50% <SEP> 1. <SEP> 535356 <SEP> 1. <SEP> 418022 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 6. <SEP> 078132
<tb> 70% <SEP> 0. <SEP> 719737 <SEP> 0. <SEP> 978920 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 5. <SEP> 282466
<tb>
La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z=1.0, Z=2. 0, Z=3. 0 respectivement et qui donne une approximation de la chance de trouver une liaison significative (tableau 8).
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Tableau 8 : (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1,2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité
Figure img00550001
<tb>
<tb> Taux <SEP> d'
<tb> hétérogénéité <SEP> 0% <SEP> 50% <SEP> 70%
<tb> Lod <SEP> score <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 99. <SEP> 500 <SEP> 57. <SEP> 000 <SEP> 27.000
<tb> 2. <SEP> 000 <SEP> 95. <SEP> 500 <SEP> 31. <SEP> 000 <SEP> 8. <SEP> 500
<tb> 3. <SEP> 000 <SEP> 84. <SEP> 500 <SEP> 14. <SEP> 000 <SEP> 3. <SEP> 500
<tb>
C- Epoque 3: Analyse de liaison génétique de la CP avec la région candidate 1- Hypothèse
La région 6p21 est dite région-candidate (RC) car elle est associée à la canitie précoce par le biais d'affections auto-immunes (maladie de Biermer, maladie de Basedow, Thyroïdites, Myasthénie) auxquelles le trait est associé.
2- Composition finale des familles
Dans un souci d'optimisation technique, un échantillon de 92 individus atteints et non-atteints parmi les 12 familles est retenu (voir figure 1). Cette sélection est formée en fonction de l'informativité potentielle de chaque individu et confirmée par une nouvelle simulation de liaison. L'ajout de quelques individus conduit à une légère augmentation du Lod score potentiel (de 8. 91 à 9. 04, selon homogénéité complète, tableau 9) et donc de la puissance de l'échantillon (tableau 10).
Tableau 9 Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche sur la région chromosomique candidate. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique.
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 8.
Figure img00550002
<tb>
<tb>
Taux <SEP> d'
<tb> hétérogénéité <SEP> Moyen <SEP> StdDev <SEP> Minimun <SEP> Maximum
<tb> 0% <SEP> 4. <SEP> 367608 <SEP> 1. <SEP> 649267 <SEP> 0. <SEP> 564761 <SEP> 9. <SEP> 042465
<tb> 50% <SEP> 1. <SEP> 354325 <SEP> 1. <SEP> 359845 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 6. <SEP> 610168
<tb> 70% <SEP> 0. <SEP> 666549 <SEP> 0. <SEP> 891330 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 4. <SEP> 988076
<tb> 90% <SEP> 0. <SEP> 222622 <SEP> 0. <SEP> 378039 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 2. <SEP> 528617
<tb>
<Desc/Clms Page number 56>
Tableau 10 : (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité.
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 9.
Figure img00560001
<tb>
<tb>
Taux <SEP> d'
<tb> hétérogénéité <SEP> 0% <SEP> 50% <SEP> 70% <SEP> 90%
<tb> Lod <SEP> score
<tb> 1. <SEP> 000 <SEP> 98. <SEP> 000 <SEP> 48. <SEP> 500 <SEP> 21. <SEP> 500 <SEP> 4. <SEP> 000
<tb> 2. <SEP> 000 <SEP> 94. <SEP> 500 <SEP> 23. <SEP> 500 <SEP> 9. <SEP> 500 <SEP> 0. <SEP> 500
<tb> 3. <SEP> 000 <SEP> 79. <SEP> 000 <SEP> 12. <SEP> 000 <SEP> 3. <SEP> 000 <SEP> 0. <SEP> 000
<tb>
3- Marqueurs microsatellites utilisés
La distribution des marqueurs sur la région candidate du chromosome 6 est présentée dans la figure 2.
4- Analyses de liaison
Plusieurs types d'analyses de liaison ont été réalisés afin d'augmenter la probabilité d'observer une liaison existante entre cette région chromosomique et la CP.
Pour cette analyse, les deux approches suivantes ont été réalisées: - 2-points (analyse itérative entre le trait et les marqueurs pris un-à-un); - multipoints (analyse pour chaque chromosome selon une carte de marqueurs placés en fonction de leurs distances respectives).
1. Analyses avec paramètres définis, paramétriques (PL) : Mode de transmission (dominant), fréquence du trait (1%), équifréquence des allèles de marqueurs testés et pénétrance (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants). Méthode 2- points et multipoints.
2. Analyse indépendante du mode de transmission du trait, non-paramétrique (NPL):
Analyse de déviation de la proportion d'allèles partagés pour chaque paire d'individus atteints (dans chaque famille par identité par descendance) par rapport à une transmission au hasard. Dans l'analyse multipoints, toutes les paires d'atteints (all-pairs, score Z-all=logio de p-values, et p-values) ont été considérées. Dans la méthode 2- points, ce sont les paires de germains qui ont été étudiées (affected sib-pair, p-values).
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5- Résultats
Les résultats sont exposés dans le tableau 11.
Tableau 11: Résultat de l'analyse de liaison sur la région-candidate Quand seule une position est indiquée, et non pas un nom de marqueur, cela signifie que la position est intermédiaire entre 2 marqueurs.
Figure img00570001
<tb>
<tb>
Global
<tb> 2-points <SEP> multipoint
<tb> Chromo- <SEP> @ <SEP> Marqueur/ <SEP> Marqueur/ <SEP> @ <SEP> Marqueur/
<tb>
Figure img00570002

some Région Lod position cM Lod position cM NPL position some "eglon position cM position cM position cM
Figure img00570003
<tb>
<tb> 6 <SEP> 6p21 <SEP> 1.12@0.1 <SEP> D6S1017/54 <SEP> 1,28 <SEP> 58 <SEP> 3,56 <SEP> D6S1017/54
<tb>
Figure img00570004

.............. Il .........
ChromoSOME region
Figure img00570005
<tb>
<tb> 6 <SEP> 6p21 <SEP> 35 <SEP> 1,67 <SEP> D6S1629 <SEP> 0,93 <SEP> 40@D6S1629
<tb>
6- Discussion et conclusion
Cette étude distingue un locus prédominant de prédisposition à la canitie précoce sur le chromosome 6p21-p12 dans la région des gènes HLA (autour de D6S1017; scores maximum NPL= 3.52, p=0.000514, HLod :=2.01). La région de liaison (avec un degré de confiance de 99%, NPL>2.50) se situe entre les position 41 et 67 sur la carte des marqueurs sélectionnés. L'analyse non-paramétrique fournit une série de valeurs significatives entre les positions 47 cM et 58 cM (entre D6S1019 et D6S1280). Le Lod score bien que de rang suggestif supporte également la localisation d'un gène important sur le chromosome 6p.
Ces résultats documentent positivement les présomptions d'association qui portent sur la région du chromosome 6p21 vis-à-vis de la canitie précoce.
Il est à noter qu'une famille (CAN35) montre une liaison relativement élevée.
Le résultat de la liaison sur le chromosome 6p21 dans la région du HLA est très encourageant si l'on se souvient que la littérature fournit peu d'exemples d'analyses non-
<Desc/Clms Page number 58>
paramétriques aussi informatives. Il fournit un point de départ prometteur vers l'identification des gènes de susceptibilité à la Canitie Précoce, à l'aide des stratégies d'associations de polymorphismes.
D- Epoque 4: Analyse de liaison génétique globale de la CP avec le génome.
L'analyse globale du génome permet de faire une visite de tous les chromosomes (un sondage global) afin de trouver des régions impliquées et éventuellement un locus majeur qui gouvernerait la canitie précoce. Cette grande analyse permet également d'estimer le taux d'hétérogénéité génétique de la CP.
1- Contenu des familles
Ce sont les mêmes familles que celles qui ont été étudiées dans la phase régionscandidates (époque 3), mais avec cependant un ajustement de certaines dans leur contenu (voir tableau 12). Certains membres peu informatifs ont été remplacés par d'autres, plus récemment recrutés, ou dont le diagnostic a été précisé plus tardivement.
Tableau 12 : Comparaison du nombre d'individus étudiés dans chaque familles entre l'analyse régions-candidates et l'analyse génome-global. (détail composition des familles, tableau de la figure 10)
Figure img00580001
<tb>
<tb> familles <SEP> Région <SEP> Candidate <SEP> Génome <SEP> Global
<tb> A35 <SEP> 11 <SEP> 11
<tb> A46 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> A65 <SEP> 5 <SEP> 9
<tb> A53 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> B43 <SEP> 7 <SEP> 7
<tb> B55 <SEP> 7 <SEP> 7
<tb> C33 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> C62 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> A46B <SEP> 6 <SEP> 7
<tb> A65B <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 103974 <SEP> 12 <SEP> 10
<tb> 104512 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> Total <SEP> individus <SEP> 92 <SEP> 96
<tb>
<Desc/Clms Page number 59>
Afin de confirmer le bénéfice de l'évolution de l'échantillon, une nouvelle simulation d'analyse de liaison a été réalisée pour différentes situations d'hétérogénéité génétique (tableau 13 et tableaux des figures 11A, 11B, 11C et 11D). Les Lods scores exprimés montrent une évolution favorable. Ainsi, considérant le Lod score moyen possible, il serait possible d'obtenir un résultat significatif (Z#3.0) pour une hétérogénéité atteignant 20% (soit 1/5 des familles non liées au locus). En fait, ce résultat est très conservateur et il serait possible d'atteindre la significativité avec un échantillon nettement plus hétérogène (soit 50-70% avec l'utilisation de marqueurs microsatellites montrant une hétérozygosité moyenne de 0.7).
Tableau 13 : scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP Les résultats détaillés figurent dans les tableaux de la figure 11.
Figure img00590001
<tb>
<tb>
Taux <SEP> d'
<tb> hétérogénéité <SEP> Moyen <SEP> StdDev <SEP> Minimun <SEP> Maximum
<tb> 0% <SEP> 4. <SEP> 751841 <SEP> 1. <SEP> 749689 <SEP> 0. <SEP> 334792 <SEP> 9. <SEP> 338889
<tb> 20% <SEP> 3. <SEP> 115806 <SEP> 1. <SEP> 866821 <SEP> 0. <SEP> 024841 <SEP> 8. <SEP> 780452
<tb> 50% <SEP> 1. <SEP> 378378 <SEP> 1. <SEP> 467071 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 7. <SEP> 508479
<tb> 70% <SEP> 0. <SEP> 672997 <SEP> 0. <SEP> 904472 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 5. <SEP> 226281
<tb> 90% <SEP> 0. <SEP> 242418 <SEP> 0. <SEP> 402384 <SEP> 0. <SEP> 000000 <SEP> 2. <SEP> 722478
<tb>
La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications (de génotypes) qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z=1.0, Z=2.0, Z=3.0 respectifs. La probabilité de trouver une liaison significative (tableau 14 et figure 12) avec 4/5 des familles liées au même locus est de 50%. Ce résultat est basé sur un lod score moyen qui est conservateur.
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Tableau 14 : (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1,2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité Les résultats détaillés figurent dans les tableaux de la figure 12.
Figure img00600001
<tb>
<tb>
Taux <SEP> d'
<tb> hétérogénéité <SEP> 0% <SEP> 20% <SEP> 50% <SEP> 70% <SEP> 90%
<tb> 1. <SEP> 000 <SEP> 99. <SEP> 000 <SEP> 87. <SEP> 500 <SEP> 47. <SEP> 000 <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> 5. <SEP> 500
<tb> 2. <SEP> 000 <SEP> 93. <SEP> 500 <SEP> 69. <SEP> 500 <SEP> 25. <SEP> 500 <SEP> 11. <SEP> 500 <SEP> 0. <SEP> 500
<tb> 3. <SEP> 000 <SEP> 84. <SEP> 000 <SEP> 48. <SEP> 500 <SEP> 15. <SEP> 000 <SEP> 3. <SEP> 500 <SEP> 0. <SEP> 000
<tb>
Les analyses peuvent donc indiquer des liaisons significatives si l'hétérogénéité de l'échantillon ne dépasse pas 20 % (soit seulement 1/5 des familles ne se liant pas à un locus majeur unique), mais il est encore possible d'identifier une liaison dans le cas où la moitié des familles ne sont pas liées à ce locus.
2- Marqueurs de l'ADN
L'ADN de 96 individus appartenant aux 12 familles sélectionnées a été génotype pour 400 marqueurs polymorphes distribués sur les 22 autosomes et le chromosome X (tableau 15) selon un intervalle inter-marqueurs moyen de 9. 2 cM (densité). Ce sont des microsatellites de l'ADN, qui sont composés de répétitions en tandem de type dinucléotidique (CA)n de la collection du Généthon (Evry, France).
<Desc/Clms Page number 61>
Tableau 15 : de marqueurs analysés pour chaque chromosome durant le genome wide-scan.
Figure img00610001
<tb>
<tb> Chromosome <SEP> Nb <SEP> de <SEP> marqueurs
<tb> 1 <SEP> 31 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 30
<tb> 3 <SEP> 23
<tb> 4 <SEP> 22
<tb> 5 <SEP> 22
<tb> 6 <SEP> 20
<tb> 7 <SEP> 22
<tb> 8 <SEP> 14
<tb> 9 <SEP> 20
<tb> 10 <SEP> 20
<tb> 11 <SEP> 18
<tb> 12 <SEP> 19
<tb> 13 <SEP> 14
<tb> 14 <SEP> 14
<tb> 15 <SEP> 14
<tb> 16 <SEP> 13
<tb> 17 <SEP> 15
<tb> 18 <SEP> 14
<tb> 19 <SEP> 12
<tb> 20 <SEP> 13
<tb> 21 <SEP> 5
<tb> 22 <SEP> 7
<tb> X <SEP> 18
<tb> total <SEP> 400
<tb>
Le taux d'hétérozygosité moyen observé est de 0. 70, et la taille moyenne de l'intervalle inter-marqueurs se situe à 9. 2 cM.
3- Analyses de liaison
Pour cette approche globale, les inventeurs ont réalisé plusieurs types d'analyses afin d'optimiser leurs performances pour trouver une liaison entre une région du génome et la CP. L'analyse paramétrique, plus performante sur le plan de la puissance, tient compte du mode de transmission du trait et est la plus adaptée dans le cas des traits monogéniques.
L'analyse non-paramétrique qui permet d'identifier une liaison même si le mode de transmission supposé est erroné, est aussi plus robuste dans le cas des traits multigéniques.
Pour chacune de ces analyses, les inventeurs ont utilisé les méthodes déjà évoquées, la méthode 2-points (analyse itérative entre le trait et chaque marqueur) et la
<Desc/Clms Page number 62>
méthode multipoints (analyse globale sur chaque chromosome selon une carte de marqueurs). a- Analyses avecparamètres définis, paramétriques (PL) # Mode de transmission (dominant), # Fréquence du trait (1%), # Equi-fréquences alléliques de tous les marqueurs, # Pénétrances définies (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants), # Méthodes 2-points et multipoints.
# Les Scores de probabilité de liaison sont exprimés en: - Lod score Z (échantillon homogène); - Lod score ZH (échantillon hétérogène) et taux d'hétérogénéité a (proportion de familles qui ne sont pas liées à ce locus). b- Analyse indépendante du mode de transmission du trait, non-paramétrique (NPL),
Il s'agit d'une analyse de la déviation de la proportion d'allèles partagés par paires d'individus atteints par rapport à une transmission des allèles au hasard (identité par descendance). Les inventeurs ont considéré toutes les paires d'individus atteints pour l'analyse multipoints, et les paires de germains pour l'analyse 2-points.
Les scores de probabilité de liaison sont exprimés en - NPL ou Z-all (LoglO de valeur p) pour la méthode multipoints sur toutes les paires d'individus atteints; - valeur "p" pour la méthode 2-points sur les paires de germains atteints.
4- Résultats a- résultats détaillés
Pour le chromosome 6 en particulier, les 20 marqueurs appartenant à la batterie du génome global (GG) ont d'abord été analysés, puis l'analyse a été répétée en additionnant les 13 marqueurs utilisés pour l'analyse région-candidate (RC) aux 20 marqueurs du génome global.
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La figure 3 rapporte les scores NPL obtenus pour l'analyse de liaison nonparamétrique sur les chromosomes 6 et 9.
Le tableau 16 rapporte les meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) discutés ci-dessous: Tableau 16 : Meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) sur les marqueurs utilisés pour l'analyse GG sauf * (* 33 marqueurs RC+GG).
Figure img00630001
<tb>
<tb>
2-point <SEP> (2P) <SEP> or
<tb> Chromosome <SEP> Position/pter <SEP> Score <SEP> Multipoint <SEP> (MP) <SEP>
<tb> Non-paramétrique
<tb> npl <SEP> >3.0 <SEP> Z-all
<tb>
<tb> 9 <SEP> 151 <SEP> 3,37 <SEP> MP
<tb> npl <SEP> >2.0 <SEP> Z-all
<tb> 131. <SEP> 00 <SEP> 2,13
<tb> 154,1 <SEP> 2P
<tb> Paramétrique
<tb> Lod>1.0 <SEP> Lod
<tb>
Figure img00630002

%4eh 89,7 !4e 2P
Figure img00630003
<tb>
<tb> * <SEP> 33 <SEP> marqueurs <SEP> (RC+GG)
<tb>
i En terme de PL:
Lod score intéressants (1.0<ZH<1.5) - chromosome 6p21-p12, position 61 (MP-ZH=1.43) - chromosome 6ql3-ql4, position 90 (2P-ZH=1.46) ii En terme de NPL:
Il a été distingué ici les scores logio pour l'étude de déviation du partage allélique, identité par descendance (IBD), pour toutes les paires d'atteints (scores étude multipoints
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Z-all) ainsi que les valeurs p pour les paires de germains atteints (affected sib-pairs, scores étude 2-points, p-values).
Sur le chromosome 6p21-pl2, le score atteint en utilisant les marqueurs génomeglobal maximise à un Z-all=3. 52 à la position 71 (entre les marqueurs D6S1610 et D6S257). Toutefois, la précision du locus est probablement affectée par la grande distance entre ces 2 marqueurs de la batterie génome-global qui est plus nettement plus importante que l'intervalle moyen observé (26.11cM).
Compte-tenu de la taille de cet intervalle, une analyse complémentaire a été réalisée sur l'ensemble des 33 marqueurs utilisés lors des analyses GG et RC. Cette analyse permet de retrouver un score plus élevé (Z-all=3,59) pour la position 57cM (voir tableau 16).
Le second meilleur score est atteint sur le chromosome 9q31-q32, position 151 (Z-all=3.37) iii Le locus qui est identifié simultanément par PL et NPL:
Figure img00640001
<tb>
<tb> PL <SEP> NPL
<tb> 6p21-p12, <SEP> position <SEP> 57-61 <SEP> 1.42 <SEP> 3.59
<tb>
5- Discussion et conclusion
Les 2 scores significatifs ou à la bordure de la significativité selon que l'on considère le trait comme étant monogénique ou multifactoriel (Lander et Kruglyak 1995) ont été observés pour les chromosomes 6p21-pl2 (NPL MP Z-all=3. 59) et 9q31-q32 (NPL MP Z-all=3.37).
Parmi ces 2 loci, le plus robuste est celui du 6p21-p12 qui est renforcé par un MPPL Lod score, qui bien que moyen, maximise à ZH=1.42.
D- Discussion et conclusion générales
Au terme des différentes époques d'analyses, plusieurs régions chromosomiques sont identifiées ou suggérées.
C'est la région 6p21-p12 (voir Figure 4A) qui a recueilli le meilleur consensus pour une liaison génétique au trait CP. La discordance entre analyses paramétriques et non-
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paramétriques génère quelques incertitudes quant à l'importance du rôle du ou de ces gènes dans la pathophysiologie de la canitie.
Le second locus est sur le chromosome 9q31-q32 avec un score NPL presque significatif (Z-all=3.37). a Chromosome 6p21-p12:
Les limites de la région désignée par l'analyse de liaison, se situent sur la position 41 (limite supérieure, Z-all=2. 02) et la position 95 (limite inférieure, Z-all=2. 09) soit 54 cM. Il est possible de réduire cette région à une longueur de 15cM en considérant des bornes 65 cM et 80 cM (entre D6S1610 et D6S257 respectivement ; analyse 20 marqueurs) ou 50 cM et 73 cM (entre D6S1629 et D6S1280 respectivement ; analyse 33 marqueurs).
La région identifiée contient les gènes du complexe majeur histocompatibilité (MHC, HLA). Il ne faut cependant pas exclure qu'un gène indépendant du HLA puisse être impliqué dans la gouverne, ou la susceptibilité au trait CP. b Chromosome 9q34
Les inventeurs placent la limite proximale de cette région à partir de la position qui recueille un score Z-all=2.5 sur le marqueur D9S290; la limite distale se plaçant sur le télomère du bras long du chromosome 9 (vers le marqueur D9S158). Cette région s'étend sur une longueur de 10 cM (figure 4B).
EXEMPLE 2 : Analyse des régions d'intérêt avec des SNP 'Single Nucleotide Polymorphism'
A la suite des travaux présentés dans l'exemple 1, les inventeurs ont poursuivi l'analyse des régions des chromosomes 6 et 9 à l'aide la technologie basée sur les SNP, afin de mettre en évidence les gènes impliqués dans la canitie précoce.
Les SNP (single nucleotide polymorphism) représentent une forme de polymorphisme particulièrement répandue dans le génome humain et très stable. On évalue le nombre de SNP à environ 1 SNP tous les 100 nucléotides, ce qui permet d'établir une véritable cartographie du génome humain à l'aide des SNP. Les SNP sont souvent classés en différentes catégories, notamment selon qu'ils sont dans une région codante ou non,
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dans une région régulatrice ou dans une autre région non codante du génome, que le polymorphisme modifie l'acide aminé codé ou non, etc...
A l'issue du programme Human Genome Project , les SNP sont désormais mieux connus et référencés, ainsi que leur position dans le génome (GDB).
Différentes méthodes ont été mises au point pour mettre en évidence ces polymorphismes entre différents individus, souvent basées sur les méthodes utilisées pour détecter des mutations ponctuelles (RFLP-PCR, hybridation avec des oligomères spécifiques des allèles, mini-séquençage, séquençage direct...).
Dans le cadre de la présente demande, les inventeurs ont utilisé la technologie MALDITOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) pour détecter les différents allèles des SNPs candidats. De plus amples détails sur cette technologie sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans diverses publications (Stoerker J, et al, Nat Biotechnol 2000 Nov; 18(11): 1213-6 et Tang K et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1999 Aug, 96,10016-20).
Dans un premier temps, les inventeurs ont défini très précisément les régions des chromosomes 6 et 9 à analyser avec les SNPs. Dans une seconde étape, 1500 SNPs appartenant aux régions précédentes ont été pré-sélectionnés sur certains critères (SNPs candidats in silico) et 697 ont été retenus suite à une étape de validation expérimentale.
Dans une étape suivante, les inventeurs ont assemblé les ADN des différents individus atteints de canitie précoce et des individus 'contrôles' en différents groupes, puis effectué le génotypage de ces différents groupes grâce à 450 SNPs choisis parmi les 697. A l'issue de ce génotypage, les résultats ont permis de définir 76 SNPs pour effectuer ensuite un génotypage individuel (et non plus sur des groupes).
Les différentes étapes sont décrites plus amplement dans les sections suivantes et représentées schématiquement dans la figure 13.
1- Définition des régions à analyser par les SNP Dans un premier temps, les inventeurs ont défini plus précisément les régions d'intérêt sur les chromosomes 6 et 9, à partir des résultats obtenus grâce à l'analyse avec les marqueurs microsatellites (voir les travaux décrits dans l'exemple 1) sur les 12 familles sélectionnées (voir tableau 6).
La région sur le chromosome 6, dénommée région A, est définie par sa position chromosomique ainsi que par trois autres types de coordonnées pour une précision et une
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sécurité optimale dans la définition de cette région pour les étapes ultérieures. Il en est de même pour la région du chromosome 9, dénommée région B.
Région A : position chromosomique : 6p22-6pl2.3
Entre le gène HLA-F et le marqueur microsatellite D6S1651
Entre le SNP rs2075682 et le SNP rsl973934
Entre les positions 39'625'529 bp* et 50'602'544 bp* Région B : position chromosomique 9q34.13-9q34.3 (qter)
Entre le marqueur D9S290 et le télomère 9q
Entre le SNP rs2096071 et le SNP rsl378955
Entre les positions 123'405'258 bp* et 133'021'490 bp*.
* La position de la séquence (en terme de paires de bases bp) est exprimée en fonction de la version de la banque de données sur le génome humain mise à jour en décembre 2001 (soit NCBI Build28).
2- Recherche des SNP candidats (in silico) et validation (expérimental).
A partir des régions A et B telles que définies plus haut, une seconde étape a consisté à déterminer une collection de SNPs appartenant à ces régions, de façon à obtenir une carte de marqueurs des deux régions. Ces marqueurs ont également été définis de telle façon qu'ils couvrent les 21Mbp (longueur totale des deux régions) d'une façon homogène et équidistante. La distance entre les différents SNPs a été fixée en moyenne à 30 kb. Cette opération a été réalisée par la sélection de 1500 SNPs répondant à ces critères (SNPs candidats in silico).
Parmi les 1500 ainsi présélectionnés lors de la première étape, 1379 SNPs se sont avérés opérationnels. Par opérationnel, on entend amplifiables à l'aide des réactifs définis de manière usuelle. Les 1379 SNPs sélectionnés ont été analysés sur 92 individus contrôles (individus du Centre d'Etude du Polymorphisme Humain) afin de valider la présence d'au moins deux allèles pour chacun des SNP (validation du polymorphisme).
A l'issue de cette sélection expérimentale, seuls les SNPs présentant une fréquence allélique de l'allèle le plus rare d'au moins 10%, ont été retenus. Par cette méthode, 697 SNPs ont été validés, 465 sur la région A et 232 sur la région B.
3- Assemblage des ADN (Pooling) Afin d'augmenter la capacité de génotypage, une stratégie de pooling a été effectuée sur les différents ADN. La puissance de cette méthode est rapportée dans différentes
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publications (notamment Werner et al, Hum Mutat 2002 Jul;20(l): 57-64, Bansal et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2002 Dec 24;99(26):16871-4).
Pour effectuer ce pooling, les ADN des différents individus avec le trait 'canitie précoce' (CP) et celui des individus contrôles ont été assemblés suivant 4 groupes. Cet assemblage a été réalisé de façon à ce que chacun des ADN soit représenté de manière équimolaire dans chacun des groupes, afin de garantir qu'aucun individu n'ait d'influence prépondérante sur le résultat par rapport à un autre. A cette fin, la concentration exacte de chacun des ADN a été mesurée par la méthode Picogreen dans les différents échantillons des individus.
Les groupes ont été ainsi constitués en tenant compte d'un score phénotypique (score canitique) qui a été attribué pour chaque individu. Les scores canitiques ont été établis de la façon suivante. Dans un premier temps, deux sortes de critères ont été définis, les critères primaires, dont le score est de 2 et les critères secondaires, dont le score est de 1.
Il y a 2 critères primaires (score=2) qui sont : 1) premiers cheveux blancs avant 18 ans ; 2) chevelure poivre et sel claire à 30 ans (index 4) : Il y a 3 critères secondaires (score=l) qui sont : 1) premiers cheveux blancs avant 25 ans ; 2) Chevelure poivre et el foncée à 30 ans (index 3) ; 3) notion familiale de canitie précoce.
Pour chaque individu, la présence d'un critère primaire incrémente le score de 2 et la présence d'un critère secondaire incrémente le score canitique de 1.
Il a ainsi été possible de définir 5 groupes différents selon le score phénotypique. Parmi les individus atteints, 72 individus dont le score est supérieur ou égal à 4 ou 5 et 132 individus dont le score canitique est strictement supérieur à 2.
Groupe AI : ce groupe est constitué par l'ADN des 72 individus CP dont le score phénotypique est de 4 ou 5.
Groupe AII: ce groupe est constitué par l'ADN des 132 individus CP, dont le score phénotypique est de 3,4 ou 5.
Groupes BI et BII : ces groupes sont constitués par l'ADN des individus contrôles dont l'origine ethnique ou géographique est proche de celle des individus CP. Pour ces individus contrôle, les critères de sélection ont été un âge supérieur à 40 ans avec l'absence de critère de canitie. Les critères d'appariement avec un individu du groupe AI ou AII est l'origine géographique, le sexe et la couleur des cheveux à 18 ans.
De cette manière, chaque individu CP du groupe AI est représenté par un individu contrôle dans le groupe BI dont le lieu d'origine (familial ou bien lieu de naissance) est proche ou identique. Il en va de même pour chaque individu du groupe AII.
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Par cette méthode, les pools AII et BII présentent une plus grande fiabilité du point de vue statistique car ils comprennent un nombre plus important d'individus. Les pools AI et BI sont quant à eux plus fiables quant au phénotype des individus le composant.
La constitution des différents groupes est représentée schématiquement sur la figure 14.
4- Sélection des SNPs validés pour le génotypage sur les ADN groupés.
Parmi les 697 SNPs validés à l'étape 2,450 ont été choisis lors d'une nouvelle étape de sélection. Cette nouvelle sélection est basée sur l'intervalle entre les SNPs, fixé en moyenne entre 30 et 50 kb.
Les 450 SNPs retenus se partagent ainsi : Région A : 283 SNPs Région B : 167SNPs.
Les différents SNPs utilisés pour les étapes successives sont répertoriés dans les tableaux suivants. Ces tableaux comportent également 9 SNPs additionnels, qui ont été rajoutés à une étape suivante pour compléter la liste. Ces 9SNPs additionnels sont les SNPs n 19, 38, 103,105 et 287 pour la région A et les SNPs n 86, 97, 131et 137 pour la région B.
Les 288 SNPs de la région A et les 171 SNPs de la régions B ont été numérotés par ordre de croissant le long (télomère p vers télomère q) des régions A et B qu'ils couvrent de manière quasi-équidistante et homogène.
Figure img00690001
<tb>
<tb>
Région <SEP> A <SEP> : <SEP>
<tb> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP
<tb> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant
<tb> 1 <SEP> rs1610602 <SEP> 73 <SEP> rs1061808 <SEP> 145 <SEP> rs847852 <SEP> 217 <SEP> 326799
<tb> 2 <SEP> rs1737071 <SEP> 74 <SEP> rs1044506 <SEP> 146 <SEP> rs847846 <SEP> 218 <SEP> 1384546
<tb> 3 <SEP> rs1737006 <SEP> 75 <SEP> rs367398 <SEP> 147 <SEP> rs707967 <SEP> 219 <SEP> 477011
<tb> 4 <SEP> rs1736936 <SEP> 76 <SEP> rs397379 <SEP> 148 <SEP> rs1886243 <SEP> 220 <SEP> 227813
<tb> 5 <SEP> 2734988 <SEP> 77 <SEP> rs482194 <SEP> 149 <SEP> rs942373 <SEP> 221 <SEP> 609699
<tb> 6 <SEP> 2734967 <SEP> 78 <SEP> rs505274 <SEP> 150 <SEP> rs1888822 <SEP> 222 <SEP> 1338908
<tb> 7 <SEP> 2524033 <SEP> 79 <SEP> rs1265758 <SEP> 151 <SEP> 2071920 <SEP> 223 <SEP> 1557143
<tb> 8 <SEP> ucla34k~818417 <SEP> 80 <SEP> 1555115 <SEP> 152 <SEP> 2267663 <SEP> 224 <SEP> 1293467
<tb> 9 <SEP> rs426483 <SEP> 81 <SEP> rs743862 <SEP> 153 <SEP> rs1888823 <SEP> 225 <SEP> rs542444
<tb> 10 <SEP> rs259926 <SEP> 82 <SEP> rs983561 <SEP> 154 <SEP> 2267664 <SEP> 226 <SEP> 626965
<tb> 11 <SEP> rs259919 <SEP> 83 <SEP> rs1548306 <SEP> 155 <SEP> rs2038067 <SEP> 227 <SEP> 857318
<tb> 12 <SEP> rs1264708 <SEP> 84 <SEP> 2308818 <SEP> 156 <SEP> 2894401 <SEP> 228 <SEP> 636845
<tb> 13 <SEP> 1015465 <SEP> 85 <SEP> rs1987948 <SEP> 157 <SEP> rs1016146 <SEP> 229 <SEP> 1329711
<tb>
<Desc/Clms Page number 70>
Figure img00700001
<tb>
<tb> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP
<tb> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant
<tb> 14 <SEP> rs757259 <SEP> 86 <SEP> 608766 <SEP> 158 <SEP> rs2064319 <SEP> 230 <SEP> 1329714
<tb> 15 <SEP> rs1029237 <SEP> 87 <SEP> 60071 <SEP> 159 <SEP> 2395634 <SEP> 231 <SEP> 2396380
<tb> 16 <SEP> rs971570 <SEP> 88 <SEP> rs763024 <SEP> 160 <SEP> rs1360780 <SEP> 232 <SEP> 1285007
<tb> 17 <SEP> rs962899 <SEP> 89 <SEP> rs763028 <SEP> 161 <SEP> 2766532 <SEP> 233 <SEP> 1748235
<tb> 18 <SEP> rs1045251 <SEP> 90 <SEP> 2857152 <SEP> 162 <SEP> 2766557 <SEP> 234 <SEP> 1284958
<tb> 19 <SEP> rs261943 <SEP> 91 <SEP> 241455 <SEP> 163 <SEP> rs1998894 <SEP> 235 <SEP> 2763135
<tb> 20 <SEP> rs1264585 <SEP> 92 <SEP> 2621426 <SEP> 164 <SEP> rs879668 <SEP> 236 <SEP> 2024786
<tb> 21 <SEP> 984802 <SEP> 93 <SEP> rs241405 <SEP> 165 <SEP> rs1049649 <SEP> 237 <SEP> 1321081
<tb> 22 <SEP> 1245219 <SEP> 94 <SEP> 241398 <SEP> 166 <SEP> 2395639 <SEP> 238 <SEP> rs1321076
<tb> 23 <SEP> rs1264562 <SEP> 95 <SEP> 154973 <SEP> 167 <SEP> 2250151 <SEP> 239 <SEP> 1343799
<tb> 24 <SEP> rs1264513 <SEP> 96 <SEP> 206779 <SEP> 168 <SEP> rs651158 <SEP> 240 <SEP> 1934328
<tb> 25 <SEP> rs1059510 <SEP> 97 <SEP> 2856817 <SEP> 169 <SEP> rs969659 <SEP> 241 <SEP> 1928533
<tb> 26 <SEP> rs1362119 <SEP> 98 <SEP> rs1883414 <SEP> 170 <SEP> rs743923 <SEP> 242 <SEP> 713270
<tb> 27 <SEP> rs1110465 <SEP> 99 <SEP> rs721393 <SEP> 171 <SEP> rs851016 <SEP> 243 <SEP> 1449648
<tb> 28 <SEP> rs1264432 <SEP> 100 <SEP> rs1799908 <SEP> 172 <SEP> rs851007 <SEP> 244 <SEP> 1449642
<tb> 29 <SEP> rs1264420 <SEP> 101 <SEP> rs439205 <SEP> 173 <SEP> rs743926 <SEP> 245 <SEP> 1375696
<tb> 30 <SEP> 1076829 <SEP> 102 <SEP> rs213194 <SEP> 174 <SEP> 2859129 <SEP> 246 <SEP> 756081
<tb> 31 <SEP> 1075496 <SEP> 103 <SEP> rs462618 <SEP> 175 <SEP> 2245972 <SEP> 247 <SEP> 3088356
<tb> 32 <SEP> 51457 <SEP> 104 <SEP> rs213201 <SEP> 176 <SEP> 1029312 <SEP> 248 <SEP> 2095771
<tb> 33 <SEP> 2535323 <SEP> 105 <SEP> rs462093 <SEP> 177 <SEP> rs1541316 <SEP> 249 <SEP> 1555214
<tb> 34 <SEP> rs1264377 <SEP> 106 <SEP> rs1014779 <SEP> 178 <SEP> rs933234 <SEP> 250 <SEP> 1338471
<tb> 35 <SEP> rs1264347 <SEP> 107 <SEP> rs211467 <SEP> 179 <SEP> rs763021 <SEP> 251 <SEP> 2179994
<tb> 36 <SEP> 2535326 <SEP> 108 <SEP> rs211457 <SEP> 180 <SEP> 2071794 <SEP> 252 <SEP> 1555215
<tb> 37 <SEP> rs1264326 <SEP> 109 <SEP> 381847 <SEP> 181 <SEP> rs941816 <SEP> 253 <SEP> rs1204296
<tb> 38 <SEP> rs1419693 <SEP> 110 <SEP> rs1755047 <SEP> 182 <SEP> rs664370 <SEP> 254 <SEP> 995564
<tb> 39 <SEP> rs1264300 <SEP> 111 <SEP> 769051 <SEP> 183 <SEP> rs1061632 <SEP> 255 <SEP> ucla34k~299503
<tb> 40 <SEP> 2532921 <SEP> 112 <SEP> rs396516 <SEP> 184 <SEP> rs605684 <SEP> 256 <SEP> 2799353
<tb> 41 <SEP> rs1634713 <SEP> 113 <SEP> rs210145 <SEP> 185 <SEP> rs648125 <SEP> 257 <SEP> 1442224
<tb> 42 <SEP> 1419664 <SEP> 114 <SEP> rs494835 <SEP> 186 <SEP> rs1406945 <SEP> 258 <SEP> 1899405
<tb> 43 <SEP> 2517502 <SEP> 115 <SEP> rs1570760 <SEP> 187 <SEP> rs720170 <SEP> 259 <SEP> 2396635
<tb> 44 <SEP> 2535291 <SEP> 116 <SEP> rs943470 <SEP> 188 <SEP> 2395656 <SEP> 260 <SEP> 2277121
<tb> 45 <SEP> 2284177 <SEP> 117 <SEP> rs498114 <SEP> 189 <SEP> rs236470 <SEP> 261 <SEP> 1867015
<tb> 46 <SEP> rs1265111 <SEP> 118 <SEP> rs652049 <SEP> 190 <SEP> rs236430 <SEP> 262 <SEP> 953887
<tb> 47 <SEP> rs1265181 <SEP> 119 <SEP> rs943475 <SEP> 191 <SEP> rs236402 <SEP> 263 <SEP> 1527707
<tb> 48 <SEP> rs1639108 <SEP> 120 <SEP> 942496 <SEP> 192 <SEP> rs236375 <SEP> 264 <SEP> 871728
<tb> 49 <SEP> 1793891 <SEP> 121 <SEP> 2104362 <SEP> 193 <SEP> 625474 <SEP> 265 <SEP> 1881030
<tb> 50 <SEP> rs1819788 <SEP> 122 <SEP> rs1853656 <SEP> 194 <SEP> 449840 <SEP> 266 <SEP> 1234181
<tb> 51 <SEP> rs1005248 <SEP> 123 <SEP> 747889 <SEP> 195 <SEP> rs8472 <SEP> 267 <SEP> 699945
<tb> 52 <SEP> rs1620583 <SEP> 124 <SEP> 2499740 <SEP> 196 <SEP> 707542 <SEP> 268 <SEP> 2206927
<tb> 53 <SEP> 2596429 <SEP> 125 <SEP> 2495975 <SEP> 197 <SEP> 831477 <SEP> 269 <SEP> 952884
<tb> 54 <SEP> 2507977 <SEP> 126 <SEP> 902197 <SEP> 198 <SEP> 2567280 <SEP> 270 <SEP> 2216464
<tb>
<Desc/Clms Page number 71>
Figure img00710001
<tb>
<tb> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP
<tb> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant
<tb> 55 <SEP> 2516446 <SEP> 127 <SEP> rs733457 <SEP> 199 <SEP> 2734977 <SEP> 271 <SEP> 1421372
<tb> 56 <SEP> 2523675 <SEP> 128 <SEP> rs2029461 <SEP> 200 <SEP> 445117 <SEP> 272 <SEP> 1862008
<tb> 57 <SEP> rs1065076 <SEP> 129 <SEP> 1776888 <SEP> 201 <SEP> 1565356 <SEP> 273 <SEP> 1410820
<tb> 58 <SEP> 2857605 <SEP> 130 <SEP> 1759627 <SEP> 202 <SEP> 2252937 <SEP> 274 <SEP> 1410825
<tb> 59 <SEP> 239157 <SEP> 131 <SEP> rs206942 <SEP> 203 <SEP> 2596464 <SEP> 275 <SEP> ucla34k~810022
<tb> 60 <SEP> 2736176 <SEP> 132 <SEP> rs206930 <SEP> 204 <SEP> 2442750 <SEP> 276 <SEP> 220669
<tb> 61 <SEP> rs805303 <SEP> 133 <SEP> rs206919 <SEP> 205 <SEP> 1041523 <SEP> 277 <SEP> 220711
<tb> 62 <SEP> rs805282 <SEP> 134 <SEP> 2395560 <SEP> 206 <SEP> 1041524 <SEP> 278 <SEP> 2021916
<tb> 63 <SEP> rs805293 <SEP> 135 <SEP> rs205284 <SEP> 207 <SEP> 693955 <SEP> 279 <SEP> 1932033
<tb> 64 <SEP> rs707939 <SEP> 136 <SEP> 2744971 <SEP> 208 <SEP> 483536 <SEP> 280 <SEP> 1226490
<tb> 65 <SEP> rs743399 <SEP> 137 <SEP> 2814986 <SEP> 209 <SEP> ucla34k~654528 <SEP> 281 <SEP> 2171937
<tb> 66 <SEP> rs733539 <SEP> 138 <SEP> rs2064253 <SEP> 210 <SEP> 2396240 <SEP> 282 <SEP> 819511
<tb> 67 <SEP> rs494620 <SEP> 139 <SEP> 2814951 <SEP> 211 <SEP> 2221224 <SEP> 283 <SEP> 937054
<tb> 68 <SEP> rs644045 <SEP> 140 <SEP> rs912716 <SEP> 212 <SEP> 1331293 <SEP> 284 <SEP> 926774
<tb> 69 <SEP> ucla34k~328681 <SEP> 141 <SEP> rs1555773 <SEP> 213 <SEP> 545455 <SEP> 285 <SEP> 1986278
<tb> 70 <SEP> 1265899 <SEP> 142 <SEP> 2395607 <SEP> 214 <SEP> 911983 <SEP> 286 <SEP> 2207224
<tb> 71 <SEP> rs1150755 <SEP> 143 <SEP> 2296362 <SEP> 215 <SEP> 2025230 <SEP> 287 <SEP> 2281458
<tb> 72 <SEP> 204999 <SEP> 144 <SEP> rs1051115 <SEP> 216 <SEP> 1322651 <SEP> 288 <SEP> 993612
<tb> RégionB <SEP> :
<tb> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP
<tb> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant
<tb> 1 <SEP> 2096071 <SEP> 44 <SEP> 2987903 <SEP> 87 <SEP> 787469 <SEP> 130 <SEP> 2989736
<tb> 2 <SEP> 2282394 <SEP> 45 <SEP> 2314027 <SEP> 88 <SEP> rs302919 <SEP> 131 <SEP> 2989728
<tb> 3 <SEP> 2805103 <SEP> 46 <SEP> 1544012 <SEP> 89 <SEP> 913705 <SEP> 132 <SEP> 3012797
<tb> 4 <SEP> 1331336 <SEP> 47 <SEP> 1997242 <SEP> 90 <SEP> 932886 <SEP> 133 <SEP> 1038193
<tb> 5 <SEP> 1533967 <SEP> 48 <SEP> 928677 <SEP> 91 <SEP> 429269 <SEP> 134 <SEP> 2279265
<tb> 6 <SEP> 2282179 <SEP> 49 <SEP> 928678 <SEP> 92 <SEP> 2526008 <SEP> 135 <SEP> 964138
<tb> 7 <SEP> 2011978 <SEP> 50 <SEP> 2315073 <SEP> 93 <SEP> 2072058 <SEP> 136 <SEP> 515078
<tb> 8 <SEP> 955910 <SEP> 51 <SEP> 933093 <SEP> 94 <SEP> rs739441 <SEP> 137 <SEP> 484397
<tb> 9 <SEP> 1147360 <SEP> 52 <SEP> 2315076 <SEP> 95 <SEP> 2905078 <SEP> 138 <SEP> 518630
<tb> 10 <SEP> rs940373 <SEP> 53 <SEP> 2315078 <SEP> 96 <SEP> 64967 <SEP> 139 <SEP> 752835
<tb> 11 <SEP> 2498905 <SEP> 54 <SEP> 981759 <SEP> 97 <SEP> 2905179 <SEP> 140 <SEP> 1778993
<tb> 12 <SEP> 2542248 <SEP> 55 <SEP> 2483469 <SEP> 98 <SEP> rs649168 <SEP> 141 <SEP> 1891996
<tb> 13 <SEP> 1220653 <SEP> 56 <SEP> 2478858 <SEP> 99 <SEP> 645841 <SEP> 142 <SEP> 1106256
<tb> 14 <SEP> 1867099 <SEP> 57 <SEP> 2966373 <SEP> 100 <SEP> rs644234 <SEP> 143 <SEP> 2382867
<tb> 15 <SEP> ucla34k~454177 <SEP> 58 <SEP> 540621 <SEP> 101 <SEP> 532861 <SEP> 144 <SEP> 2065385
<tb> 16 <SEP> 2241271 <SEP> 59 <SEP> 2994056 <SEP> 102 <SEP> 59071 <SEP> 145 <SEP> 872667
<tb> 17 <SEP> 1017509 <SEP> 60 <SEP> 2275500 <SEP> 103 <SEP> 1179040 <SEP> 146 <SEP> 914400
<tb> 18 <SEP> rs1182 <SEP> 61 <SEP> 10K-56700 <SEP> 104 <SEP> 1887519 <SEP> 147 <SEP> ucla34k <SEP> 923462 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 72>
Figure img00720001
<tb>
<tb> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP <SEP> SNP
<tb> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant <SEP> N <SEP> Identifiant
<tb> 19 <SEP> rs732074 <SEP> 62 <SEP> rs943851 <SEP> 105 <SEP> 1179001 <SEP> 148 <SEP> 1412512
<tb> 20 <SEP> rs1125962 <SEP> 63 <SEP> 2282006 <SEP> 106 <SEP> ucla34k~576465 <SEP> 149 <SEP> rs968569
<tb> 21 <SEP> ucla34k~598296 <SEP> 64 <SEP> 1887786 <SEP> 107 <SEP> 954052 <SEP> 150 <SEP> 210086
<tb> 22 <SEP> 1322671 <SEP> 65 <SEP> 2076 <SEP> 108 <SEP> 2492057 <SEP> 151 <SEP> 783770
<tb> 23 <SEP> 1570381 <SEP> 66 <SEP> 928013 <SEP> 109 <SEP> 2506715 <SEP> 152 <SEP> 872006
<tb> 24 <SEP> rs676492 <SEP> 67 <SEP> 869381 <SEP> 110 <SEP> 2506696 <SEP> 153 <SEP> 1537414
<tb> 25 <SEP> 2286792 <SEP> 68 <SEP> 3012757 <SEP> 111 <SEP> 1079783 <SEP> 154 <SEP> 574840
<tb> 26 <SEP> 53558 <SEP> 69 <SEP> 2987378 <SEP> 112 <SEP> rs77905 <SEP> 155 <SEP> 1001523
<tb> 27 <SEP> 1860641 <SEP> 70 <SEP> 3012717 <SEP> 113 <SEP> 129891 <SEP> 156 <SEP> 755722
<tb> 28 <SEP> 885345 <SEP> 71 <SEP> 1331631 <SEP> 114 <SEP> 2027963 <SEP> 157 <SEP> 1318383
<tb> 29 <SEP> rs1043368 <SEP> 72 <SEP> 1412075 <SEP> 115 <SEP> 628936 <SEP> 158 <SEP> 730399
<tb> 30 <SEP> 1557126 <SEP> 73 <SEP> 1331625 <SEP> 116 <SEP> rs602990 <SEP> 159 <SEP> 1009473
<tb> 31 <SEP> 947507 <SEP> 74 <SEP> 2149171 <SEP> 117 <SEP> 2428091 <SEP> 160 <SEP> 47713
<tb> 32 <SEP> 914977 <SEP> 75 <SEP> ucla34k~694625 <SEP> 118 <SEP> 2428123 <SEP> 161 <SEP> 2297690
<tb> 33 <SEP> 2210623 <SEP> 76 <SEP> 2296868 <SEP> 119 <SEP> 2519770 <SEP> 162 <SEP> 2139881 <SEP>
<tb> 34 <SEP> 1475731 <SEP> 77 <SEP> rs1185193 <SEP> 120 <SEP> 2428083 <SEP> 163 <SEP> 1335099
<tb> 35 <SEP> 928518 <SEP> 78 <SEP> 10K-52978 <SEP> 121 <SEP> 2789861 <SEP> 164 <SEP> 55096
<tb> 36 <SEP> 1864709 <SEP> 79 <SEP> 563521 <SEP> 122 <SEP> 414848 <SEP> 165 <SEP> 2501566
<tb> 37 <SEP> 944605 <SEP> 80 <SEP> 507998 <SEP> 123 <SEP> 1536474 <SEP> 166 <SEP> 2501559
<tb> 38 <SEP> 2304812 <SEP> 81 <SEP> 2362369 <SEP> 124 <SEP> 943435 <SEP> 167 <SEP> 2183138
<tb> 39 <SEP> 1866974 <SEP> 82 <SEP> 577416 <SEP> 125 <SEP> 943429 <SEP> 168 <SEP> 1054864
<tb> 40 <SEP> 2269337 <SEP> 83 <SEP> 944812 <SEP> 126 <SEP> 2182640 <SEP> 169 <SEP> 2275781
<tb> 41 <SEP> 2583839 <SEP> 84 <SEP> rs1470190 <SEP> 127 <SEP> ucla34k~177347 <SEP> 170 <SEP> 1891629
<tb> 42 <SEP> 2791743 <SEP> 85 <SEP> 2247393 <SEP> 128 <SEP> 16832 <SEP> 171 <SEP> 1099298
<tb> 43 <SEP> 2855181 <SEP> 86 <SEP> 418620 <SEP> 129 <SEP> ucla34k <SEP> 642641 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 73>
5- Génotypage sur les ADN assemblés.
Pour les 459 SNPs retenus lors de l'étape 4, l'étape suivante a été de déterminer leur allélotype, c'est-à-dire la fréquence de chacun des allèles, et ce pour les 4 groupes d'ADN assemblés (poolés) selon la sévérité et la précocité du phénotype (voir la définition des 4 groupes à l'étape 3 et figure 14).
La fréquence allélique des deux allèles a été déterminée pour chacun des SNP dans les 4 groupes. La signification statistique des écarts de fréquences alléliques entre les groupes AI et BI ou AII et BII est estimée par la valeur p représentant la significativité. Plus la valeur p est faible, plus l'écart est statistiquement significatif.
Les expériences ont été reproduites 3 fois (3 PCR), chacune des trois PCR étant ensuite testée 5 fois sur le MALDI-TOF afin d'obtenir une valeur moyenne fiable.
Les figures 15et 16 illustrent les résultats obtenus sur les régions A et B respectivement pour chaque SNP (numéroté de 1 à 288 le long de la région A et de 1 à 171 le long de la région B). L'ordonnée représente 1/p, mais les valeurs supérieures à 500 (soit p<0,002) sont maximisées à 500.
Le tableau 17 résume les résultats obtenus :
Figure img00730001
<tb>
<tb> Chromosome <SEP> 6
<tb> AI-BI<0,05 <SEP> ET <SEP> AII-BII<0,05 <SEP> AI-BI<0,05 <SEP> AII-BII<0,05
<tb> 11 <SEP> 20 <SEP> 10
<tb> Chromosome <SEP> 9
<tb> AI-BI<0,05 <SEP> ET <SEP> AII-BII<0,05 <SEP> AI-BI<0,05 <SEP> AII-BII<0,05
<tb> 2 <SEP> 9 <SEP> 22 <SEP>
<tb>
Tableau 17 : sur les pools, nombre de SNPs positifs (total 74) Ces résultats mettent en évidence l'existence de clusters, c'est-à-dire au moins trois SNPs consécutifs (donc physiquement proches les uns des autres dans le génome humain) qui ont tous une significativité p inférieure à 0,05 (appelés SNPs positifs ). Certains de ces clusters sont illustrés sur les figures 15 et 16.
Le tableau 18 récapitule les différentes particularités dans la répartition des SNPs dans les régions A et B.
<Desc/Clms Page number 74>
Figure img00740001
<tb>
<tb>
Chromosome <SEP> 6
<tb> Clusters <SEP> (3 <SEP> SNPs <SEP> consécutifs <SEP> positifs <SEP> ou <SEP> plus) <SEP> 4
<tb> Paires <SEP> (2 <SEP> SNPs <SEP> consécutifs <SEP> positifs) <SEP> 5
<tb> 'Double <SEP> spots' <SEP> (2 <SEP> SNPs <SEP> positifs <SEP> séparés <SEP> par <SEP> un <SEP> SNP <SEP> négatif) <SEP> 2
<tb> Chromosome <SEP> 9
<tb> Clusters <SEP> (3 <SEP> SNPs <SEP> consécutifs <SEP> positifs <SEP> ou <SEP> plus) <SEP> 2
<tb> Paires <SEP> (2 <SEP> SNPs <SEP> consécutifs <SEP> positifs) <SEP> 4
<tb> 'Double <SEP> spots' <SEP> (2 <SEP> SNPs <SEP> positifs <SEP> séparés <SEP> par <SEP> un <SEP> SNP <SEP> négatif) <SEP> 2
<tb>
Tableau 18 : de la répartition des SNPs positifs dans les régions A e B.
Les différents gènes des régions A et B qui sont mis en évidence par des SNPs positifs répartis en clusters, isolés ou répartis en double 'spots' constituent une première série de gènes candidats, y compris les gènes prédits. Leur liste est la suivante: Région A : RNF9, TRIM15, TRIM26, RNF23, FLJ22638, DDR1, HLA-B, HLA-DMB, HLA-DMA, COL11A2, SACM2L, RPS18, B3GALT4, HKE2 , RAB2L, TAPBF, ZNF297, DAXX, MAPK14, DOM3Z, MICA, LOC51323, TNFRSF21, MICA, HSPA1B, TNXB, CYP21A2, NOTCH4, PBX2, HLA-DRA, PHF1, ITPR3, MGC14833, BAK1, IHPK3, GRM4, TCP11, TEAD3 Région B : DDX31, GTF3C4, C90RF9, TSC1, ABL1, LOC57109, FREQ, ADAMTS13, LAMC3, SURF5, SURF6, FCN2, FCN1, OLFM1, VAV2, ABO, CELL, SARDH.
Une analyse plus fine a été réalisée qui a permis d'élaborer une nouvelle liste de gènes chevauchés par un SNP positif, grâce à ENSEMBL (ENSEMBL v.8.30a.1 17 sep 2002).
Cette liste comprend les gènes chevauchés (codants, UnTranslated Region UTR, et intronique) par un SNP positif, à l'exclusion des gènes qui sont proches d'un SNP positif situé dans une région régulatrice.
Codante : chromosome 6 : TRIM40, C60RF29, NOTCH4
<Desc/Clms Page number 75>
UTR : chromosome 6 : Q9UBA7 Intronique : Chromosome 6 : BRD2, GRM4, TEAD3, MAPK14 Chromosome 9 : Q96RU3,ABL1, LAMC3, Q96MA6, Q9NXK9, Q9GZR2, VAV2, COL5A1, KCNT1, Q8WX41 Une nouvelle analyse pour les gènes prédits, grâce à ENSEMBL, a donné les résultats suivants : Chromosome 6 :
ENST00000259854
ENST00000259855
ENST00000259941
ENST00000259940
ENST00000259930
ENST00000274855
ENST00000259847
ENST00000293587
ENST00000299124
ENST00000259945
ENST00000259862
ENST00000259876
ENST00000259875
ENST00000259895
ENST00000293682
ENST00000229412
ENST00000229725
ENST00000229729
ENST00000229825
ENST00000244501
ENST00000293728
ENST00000244371
ENST00000293739
ENST00000230240
ENST00000211372
ENST00000244475
ENST00000266008
<Desc/Clms Page number 76>
ENST00000230251
ENST00000244369
ENST00000299851
ENST00000230255
ENST00000229795
ENST00000229794
ENST00000296861
ENST00000274795
ENST00000293645
ENST00000293707
ENST00000229780
ENST00000299791
ENST00000293720
ENST00000244411
ENST00000266007
ENST00000229422 Chromosome 9 :
ENST00000298489
ENST00000266097
ENST00000263612
ENST00000245590
ENST00000298545
ENST00000298546
ENST00000298552
ENST00000298554
ENST00000298555
ENST00000277434
ENST00000277433
ENST00000298632
ENST00000291687
ENST00000298656
ENST00000298658
ENST00000298660
ENST00000277355
ENST00000298678
ENST00000298676
ENST00000298656
ENST00000298658
<Desc/Clms Page number 77>
ENST00000298660
ENST00000277355
ENST00000298678
ENST00000298676
ENST00000298682
ENST00000298683
ENST00000291744
ENST00000291741
ENST00000223427
ENST00000198253
ENST00000277527
ENST00000263 604
ENST00000266109
ENST00000298467
ENST00000266100
ENST00000277422
ENST00000263609 Les tableaux suivants répertorient les gènes prédits des régions A et B dans les clusters, les doubles spots (DS) et les SNP positifs individuels, à partir de la version NCBI Build 28 (Déc. 2001). CDS indique la séquence codante et tx le transcrit.
<Desc/Clms Page number 78>
Figure img00780001
<tb>
REGION <SEP> A
<tb> SNP# <SEP> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> 5 <SEP> à6 <SEP>
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000259854 <SEP> chr6 <SEP> 39694455 <SEP> 39909459 <SEP> 39694455 <SEP> 39909459 <SEP> + <SEP> 7
<tb> ENST00000259855 <SEP> chr6 <SEP> 39730113 <SEP> 39909459 <SEP> 39730113 <SEP> 39909459 <SEP> + <SEP> 7
<tb> 13 <SEP> à <SEP> 15
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000259941 <SEP> chr6 <SEP> 40054160 <SEP> 40061326 <SEP> 40052414 <SEP> 40061402- <SEP> 8
<tb> ENST00000259940 <SEP> chr6 <SEP> 40054447 <SEP> 40061281 <SEP> 40053956 <SEP> 40061402- <SEP> 5
<tb> ENST00000259930 <SEP> chr6 <SEP> 40064144 <SEP> 40072806 <SEP> 40063675 <SEP> 40073156 <SEP> + <SEP> 7
<tb> ENST00000274855 <SEP> chr6 <SEP> 40064144 <SEP> 40073064 <SEP> 40064144 <SEP> 40073064 <SEP> + <SEP> 2
<tb> 13 <SEP> à <SEP> 19 <SEP> (cluster <SEP> grouping)
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
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<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000298656 <SEP> chr9 <SEP> 129757553 <SEP> 129770881 <SEP> 129757553 <SEP> 129770881- <SEP> 16
<tb> ENST00000298658 <SEP> chr9 <SEP> 129757607 <SEP> 129781523 <SEP> 129757607 <SEP> 129781523- <SEP> 13
<tb> ENST00000298660 <SEP> chr9 <SEP> 129757553 <SEP> 129786638 <SEP> 129757553 <SEP> 129786638- <SEP> 26
<tb>
<Desc/Clms Page number 85>
Figure img00850001
<tb> ENST00000277355 <SEP> chr9 <SEP> 129607564 <SEP> 129789067 <SEP> 129607564 <SEP> 129789067 <SEP> + <SEP> 29
<tb> ENST00000298678 <SEP> chr9 <SEP> 129811215 <SEP> 129812613 <SEP> 129811213 <SEP> 129812613 <SEP> + <SEP> 2
<tb> ENST00000298676 <SEP> chr9 <SEP> 129814180 <SEP> 129826506 <SEP> 129607438 <SEP> 129826534 <SEP> + <SEP> 37
<tb> ENST00000298682 <SEP> chr9 <SEP> 129864608 <SEP> 129868564 <SEP> 129864598 <SEP> 129870351 <SEP> + <SEP> 5
<tb> ENST00000298683 <SEP> chr9 <SEP> 129864608 <SEP> 129869270 <SEP> 129864598 <SEP> 129871307 <SEP> + <SEP> 7
<tb> ENST00000291744 <SEP> chr9 <SEP> 129864608 <SEP> 129871199 <SEP> 129864598 <SEP> 129871307 <SEP> + <SEP> 8
<tb> ENST00000291741 <SEP> chr9 <SEP> 129864608 <SEP> 129871199 <SEP> 129864598 <SEP> 129871307 <SEP> + <SEP> 7
<tb> ENST00000223427 <SEP> chr9 <SEP> 129893584 <SEP> 129901655 <SEP> 129893369 <SEP> 129901747- <SEP> 9
<tb> ENST00000198253 <SEP> chr9 <SEP> 129896270 <SEP> 129901655 <SEP> 129893369 <SEP> 129901747- <SEP> 8
<tb> 155 <SEP> à <SEP> 156 <SEP> chr9:130714327-130728681
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000277527 <SEP> chr9 <SEP> 130609471 <SEP> 130715656 <SEP> 130609471 <SEP> 130715656- <SEP> 4
<tb> ENST00000263604 <SEP> chr9 <SEP> 130691065 <SEP> 130775279 <SEP> 130691064 <SEP> 130775281 <SEP> + <SEP> 29
<tb> SNP <SEP> + <SEP> individuels
<tb> 6
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb> 17
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb> 24
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000266109 <SEP> chr9 <SEP> 124213577 <SEP> 124360885 <SEP> 124213576 <SEP> 124360901- <SEP> 15
<tb> 27
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb>
<Desc/Clms Page number 86>
Figure img00860001
<tb> 44
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000298467 <SEP> chr9 <SEP> 125063030 <SEP> 125234391 <SEP> 125063030 <SEP> 125234391 <SEP> + <SEP> 11
<tb> ENST00000266100 <SEP> chr9 <SEP> 125184157 <SEP> 125234391 <SEP> 125183776 <SEP> 125236384 <SEP> + <SEP> 11
<tb> 57
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb> 100
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb> 104
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000277422 <SEP> chr9 <SEP> 128045772 <SEP> 128056657 <SEP> 128044878 <SEP> 128056857- <SEP> 8
<tb> 108
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb> 125
<tb> NOM <SEP> chrom <SEP> cdsDébut <SEP> cdsFin <SEP> txDébut <SEP> txFin <SEP> Brin <SEP> Nb <SEP> EXONS <SEP>
<tb> ENST00000263609 <SEP> chr9 <SEP> 129380168 <SEP> 129507477 <SEP> 129380168 <SEP> 129507477 <SEP> + <SEP> 9
<tb> 141
<tb> pas <SEP> de <SEP> gènes
<tb>
<Desc/Clms Page number 87>
6- Sélection des SNPs pour le génotypage sur les ADN individuels.
Parmi les 459 SNPs utilisés pour le génotypage sur les ADN assemblés, 76 ont été retenus pour le génotypage des ADN individuels. Les SNPs retenus montrent en effet un écart statistiquement significatif lors du génotypage sur les pools, c'est-à-dire p<0,05 pour AIBI, AII-BII ou AI-BII. Leur répartition est la suivante : Région A : 43 SNPs Région B : 33 SNPs.
La liste des SNPs ainsi choisis et la comparaison A-B sont données dans les figures 17 (région A) et 18 (région B).
Le tableau 19 résume les résultats obtenus.
Figure img00870001
<tb>
<tb>
Chromosome <SEP> 6
<tb> AI-BI<0,05 <SEP> ET <SEP> AII-BII<0,05 <SEP> AI-BI<0,05 <SEP> AII-BII<0,05 <SEP> AI-BII<0,05
<tb> 10 <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 13
<tb> Chromosome <SEP> 9
<tb> AI-BI<0,05 <SEP> ET <SEP> AII-BII<0,05 <SEP> AI-BI<0,05 <SEP> AII-BII<0,05 <SEP> AI-BII<0,05
<tb> 3 <SEP> 11 <SEP> 25 <SEP> 11
<tb>
Tableau 19 : des SNPs positifs (total 76) suite aux résultats de génotypage sur les pools.
*Le choix des 76 SNPs pour le génotypage individuel s'est concentré sur les SNPs présents dans les clusters, ceux formant des paires (2SNPs consécutifs positifs) et ceux formant des 'double spots' (2 SNPs positifs séparés par un SNP négatif). Les figures 19 et 20 illustrent la répartition des 76SNPs choisis.
En effet, il a été observé que l'estimation des fréquences alléliques sur des pools (et non sur des individus) peut conduire à des faux 'positifs' et que cette tendance est majorée lorsque les pools contiennent moins de 200 ADN. De ce fait, les SNPs positifs isolés ont été écartés ainsi que ceux ayant une discordance dans les contrôles (BI et BII).
Les 76 SNPs ont été analysés individuellement sur tous les ADN disponibles (187 individus avec le phénotype CP et 186 individus contrôles sans phénotype CP).
<Desc/Clms Page number 88>
Ce génotypage individuel permet de calculer précisément la fréquence des allèles et des génotypes observés dans les différents groupes. L'ensemble de ces données permet également de comparer la distribution des haplotypes observés au niveau des SNPs positifs organisés en 'clusters'. Par haplotype, on entend la combinaison d'allèles tendant à être transmis ensemble.
L'analyse intégrée de l'ensemble de ces données permet de déterminer les SNPs ou des groupes de SNPs qui montrent une association avec le trait CP, c'est-à-dire un allèle ou un ensemble d' allèles qui, dans une population, sont transmis plus fréquemment avec ce trait.
7- Etude du déséquilibre de liaison.
Le déséquilibre de liaison (LD, Linkage Desequilibrium) a été analysé par le programme GenePop, en l'absence de données sur la phase des haplotypes sur les chromosomes analysés.
Le déséquilibre de liaison est une situation où 2 gènes (allèles) ségrègent ensemble à une fréquence plus haute que la fréquence prédite par le produit de leurs fréquences individuelles. Cela signifie que les deux gènes ne sont pas indépendants puisqu'ils ségrègent ensemble plus fréquemment que prévu par les statistiques, il y a donc un déficit d'indépendance entre des allèles situés proche l'un de l'autre sur un même chromosome.
Cette analyse de déséquilibre de liaison a permis de définir des blocs d'ADN qui sont matérialisés par plusieurs marqueurs qui ont tendance à se transmettre plus souvent ensemble que ce qui est prévu par les lois statistiques. Cette situation est produite par une absence ou un déficit de recombinaison au sein de ce bloc. La taille des régions présentant un déséquilibre de liaison est variable selon les régions chromosomiques, elle peut varier entre lOkb et 200kb. Les résultats sont présentés dans les figures 21 et 22.
8- Comparaison des fréquences alléliques/génotypiques pour chaque SNP.
Cette comparaison des fréquences alléliques/génotypiques a été réalisée pour chaque SNP dans les groupes canitie précoce (1 à 5 et p) et dans les groupes de contrôles. Les résultats obtenus sont reproduits dans les tableaux suivants et représentés dans les figures 23 (région A) et 24 (région B).
La colonne con-con indique la comparaison entre les différents groupes d'individus contrôles. La colonne aff indique les comparaisons pour chaque groupe d' affectés, contre tous les autres groupes d'affectés ou de contrôle.
<Desc/Clms Page number 89>
Figure img00890001
<tb>
<tb>
Chromosome <SEP> 6, <SEP> région <SEP> A <SEP> Chromosome <SEP> 9, <SEP> région <SEP> B
<tb> SNP <SEP> Con-con <SEP> aff <SEP> counts <SEP> SNP <SEP> Con-con <SEP> aff <SEP> counts
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> 6 <SEP> 5 <SEP> 17 <SEP> 22 <SEP> 24 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 27 <SEP> 0 <SEP> 21 <SEP> 21
<tb> 14 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 44 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> 15 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 49 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> 19 <SEP> 3 <SEP> 11 <SEP> 14 <SEP> 57 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 5
<tb> 21 <SEP> 6 <SEP> 16 <SEP> 22 <SEP> 86 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6
<tb> 36 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 88 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 7
<tb> 42 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 90 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 43 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 91 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> 52 <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 92 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> 55 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 97 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> 66 <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 99 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 67 <SEP> 7 <SEP> 12 <SEP> 19 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> 71 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 104 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> 83 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 118 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> 87 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 120 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 89 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 125 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> 103 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 128 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> 105 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 129 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> 110 <SEP> 1 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 131 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 7
<tb> 115 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 133 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 8
<tb> 126 <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 134 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 8
<tb> 148 <SEP> 4 <SEP> 15 <SEP> 19 <SEP> 137 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> 172 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 138 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> 173 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 141 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> 178 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 155 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> 199 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 12
<tb> 201 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 16
<tb> 226 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 16
<tb> 285 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> 286 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 10
<tb> 287 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb>
9- Conclusions.
Les principales conclusions qui peuvent être tirées des résultats sont les suivantes : Tout d'abord, il y a une grande similitude entre les observations faites sur l'analyse des pools et les génotypages individuels.
Les grands clusters sont confirmés.
Le chromosome 9 révèle un intervalle, en déséquilibre de liaison (cluster majeur) qui est fortement associé au trait canitie précoce (SNP 418620 à SNP 2526008, position
<Desc/Clms Page number 90>
126'544'533 nt à position 126'745'296 nt, soit une taille de 201 kb). Ce cluster comprend les gènes DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
Les gènes ou gènes prédits identifiés dans les intervalles associés à un haplotype positif ou un cluster de SNPs positifs sont les suivants :
Région A Haplotype 5-6 HLAG Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 39733287NT 007592.445 Début (position sur chrom.): 39750711 Fin (position sur chrom.): 39778231 NT 007592.446 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 39809968Haplotypes 42-43 NT 007592.506 Début (position sur chrom.) : 40890755Fin (position sur chrom.) :
40945799NT~007592.507) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
40968983NT~007592.508) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 41013059Haplotypes 66-67 HSPA1B Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
G8 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 41738312NEU1 neuraminidase precursor
<Desc/Clms Page number 91>
Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
NG22 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 41777684BAT8 ankyrin repeat-containing protein ; Mouse Ortholog: Bat8 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 41791599Haplotypes 95-96 HLA-DMB Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
27223420HLA-DMA Début (position sur chrom.): 27231061 Fin (position sur chrom.): 27235519 BRD2 Début (position sur chrom.): 27251103 Fin (position sur chrom.) : 27263747Haplotvpes 89 (87) HLA-DQA1 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
HLA-DQA2 Début (position sur chrom.): 42582711 Fin (position sur chrom.) :
42587664NT~007592.588) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.): 42505711 Haplotypes 126
GRM4 glutamate receptor, metabotropic 4 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 43974595Haplotvpes 21 (18-21)
<Desc/Clms Page number 92>
RNF23 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : hypothetical protein FLJ22638 Début (position sur chrom.): 40245566 Fin (position sur chrom.) : or (NT~007592.459) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 40369534NT~007592.457) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 40218336Région B Haplotype 27 FREQ PubMed on Product : frequeninhomolog/ Mouse Ortholog : Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 124554366NT 030046.18 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 124489558NT~030046.17 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 124452860Haplotype 97-100 GTF3C5 PubMed on Product: general transcription factor IIIC, polypeptide 5 Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
CEL PubMed on Product : ester lipase (bile salt-stimulated) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
CELL
<Desc/Clms Page number 93>
PubMed on Product : ester lipase-like (bile salt-stimulated) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) :
FS PubMed on Product : synthetase Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : ABO blood group (transferase A, alpha) Début (position sur chrom.) : Fin (position sur chrom.) : 127924298Haplotvpe 86-92 BARHL1 DDX31 GTF3C4 Q96MA6 (Adenylate cyclase) EXEMPLE 3
Exemples de compositions - lotion capillaire fragment d'ADN issu de l'un des gènes de l'invention appartenant à la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257 0,5 g Propylène glycol 20 g Ethanol 95 30 g Eau qsp 100 g
Cette lotion est appliquée quotidiennement sur les zones à traiter et de préférence sur l'ensemble du cuir chevelu pendant au moins 10 jours et préférentiellement 1 à 2 mois.
On constate alors une diminution de l'apparition des cheveux blancs ou gris et une repigmentation des cheveux gris.
- shampooing traitant fragment d'ADN issu de l'un des gènes de l'invention appartenant à la zone chromosomique comprise entre le marqueur D9S290 et le télomère du bras long 1,5 g
<Desc/Clms Page number 94>
Polyglycéryl 3-hydroxylarylether 26 g Hydroxy propyl cellulose vendue sous la dénomination de Klucell G par la société Hercules 2 g Conservateurs qps Ethanol 95 50 g Eau qsp 100 g
Ce shampooing est utilisé à chaque lavage avec un temps de pose d'environ d'une minute. Un usage prolongé, de l'ordre de deux mois, conduit à la repigmentation progressive des cheveux gris.
Ce shampooing peut également être utilisé à titre préventif afin de retardé le blanchissement des cheveux.
- Gel traitant fragment d'ADN issu de l'un des gènes de l'invention appartenant à la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D6S 1629 et D6S257 0,75 g Huiles essentielles d'Eucalyptus 1 g Econozole 0,2 g Lauryl polyglyceryl 6 cetearyl glycoether 1,9 g Conservateurs qs Carbopol 934P vendu par la société BF Goodrich Corporation 0,3 g Agent de neutralisation qs pH 7 Eau qsp 100 g
Ce gel est appliqué sur les zones à traiter deux fois par jour (matin et soir) avec un massage terminal. Après trois mois d'application, on observe une repigmentation des poils ou cheveux de la zone traitée.
Références bibliographiques
<Desc/Clms Page number 95>
# E. Lander and L. Kruglyak. Genetic dissection of complex traits : for interpreting and reporting linkage results. Nat.Genet. 11 (3) :241-247, 1995.

Claims (30)

Revendications
1. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins
18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO,
BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
2. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins
18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ,
NT~030046.18, NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO,
BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment a une longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des phanères.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdits phanères sont les cheveux.
6. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.
8. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.
<Desc/Clms Page number 97>
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séquence correspond à tout ou partie du gène
DDX31ou du gène BARHL1.
11. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18,
NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1,
DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.
12. Procédé selon la revendication 11comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.
13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le marqueur est choisi parmi les gènes BARLH1, DDX31, GTF3C4 et
Q96MA6.
15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que le marqueur est choisi parmi les gènes DDX31 et BARHL1.
16. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les SNP 418620, rs302919,913705, 931886,429269 et 2526008 pour la détermination des gènes impliqués dans la pigmentation de la peau ou des phanères.
17. Utilisation à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques
<Desc/Clms Page number 98>
FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT 007592.588, GRM4, RNF23,
HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2,
NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508,
GTF3C4 et Q96MA6, et # une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT 007592.445,
NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARHL1, DDX31,
comprenant chacun au moins 18nucléotides successifs dont la séquence est choisie parmi : # une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT 030046.18,
18. Utilisation d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi: # un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18, NT~030046.17,
GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et
Q96MA6, et # un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445,
NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508,
HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2,
HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23,
FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
<Desc/Clms Page number 99>
19. Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
20. Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie du gène DDX31 ou du gène BARHL1.
21. Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446,
NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1,
NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT 007592.588.
22. Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 choisi parmi les gènes NT~007592.506, NT~007592.507 et NT~007592.508.
23. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) sélection d'une combinaison d'au moins deux marqueurs choisis parmi # les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18,
NT~030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO,
BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6, et . les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445,
NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507,
NT~007592.508, HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8,
HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-
DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638,
NT~007592.459 et NT~007592.457,
<Desc/Clms Page number 100>
ii) détermination des allèles des marqueurs choisis présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.
24. Procédé selon la revendication 23 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
26. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, caractérisé en ce qu'au moins un marqueur est choisi parmi les gènes BARHL1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6.
27. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, caractérisé en ce qu'au moins un marqueur est choisi parmi les gènes DDX31 et BARHL1.
28. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, caractérisé en ce qu'au moins un marqueur est choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445, NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508,
HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2,
HLA-DQA1, HLA-DQA2 et NT~007592.588.
29. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, caractérisé en ce qu'au moins un marqueur est choisi parmi les gènes NT~007592.506, NT 007592.507 et NT 007592.508.
30. Kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT~030046.18,
NT 030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31,
GTF3C4 et Q96MA6, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT~007592.445,
NT~007592.446, NT~007592.506, NT~007592.507, NT~007592.508,
HSPA1B, G8, NEU1, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2,
<Desc/Clms Page number 101>
HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT~007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT~007592.459 et NT~007592.457, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
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