EP1320603A1 - Utilisations du gene gjb6 dans le traitement de certaines alopecies dont le syndrome de clouston, et pour le criblage de composes susceptibles d' tre efficaces dans le traitement d'alopecies avec predisposition genetique - Google Patents

Utilisations du gene gjb6 dans le traitement de certaines alopecies dont le syndrome de clouston, et pour le criblage de composes susceptibles d' tre efficaces dans le traitement d'alopecies avec predisposition genetique

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EP1320603A1
EP1320603A1 EP01972222A EP01972222A EP1320603A1 EP 1320603 A1 EP1320603 A1 EP 1320603A1 EP 01972222 A EP01972222 A EP 01972222A EP 01972222 A EP01972222 A EP 01972222A EP 1320603 A1 EP1320603 A1 EP 1320603A1
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EP
European Patent Office
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gene
gjb6
connexin
mutation
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01972222A
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German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Waksman
Jérôme LAMARTINE
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Genethon
Universite D'Evry Val D'Essonne
Original Assignee
Genethon III
Universite D'Evry Val D'Essonne
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Filing date
Publication date
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention results from the identification of mutations in the gene
  • GJB6 responsible for Clouston syndrome.
  • the symptomatology of this syndrome suggests that GJB6, coding for connexin 30 (Cx-30), is very probably also involved in other alopecias with genetic predisposition, notably non-pathological.
  • the invention therefore relates to the use of constructs comprising the GJB6 gene, both for the preparation of pharmaceutical compositions intended for the treatment of Clouston syndrome and / or certain alopecia, as for the screening of molecules capable of having a beneficial effect in the treatment of alopecia. Also provided are methods of diagnosing Clouston syndrome.
  • Clouston Syndrome or Hydrotic Ectodermal Dysplasia (HED, OMIM 129500)
  • HED Hydrotic Ectodermal Dysplasia
  • People with this syndrome mainly have hypotrichosis and pathological alopecia, associated with nail dystrophy and hyperkeratosis of the palms and soles of the feet.
  • patients may have other clinical signs such as deafness, mental retardation, hyperpigmentation of the skin as well as eye and skeletal abnormalities.
  • This pathology affects the epidemic, which is a stratified epithelium of ectodermal origin.
  • This epithelium consists of the basal layer, which rests on the dermo-epidermal junction of the grainy and thorny layers and the most superficial horny layer.
  • This tissue which is renewed in two weeks, owes this property to keratinocytes, which are the main cellular constituent of the epidermis.
  • the keratinocytes of the basal layer have the capacity to renew themselves, to differentiate and to start their migration in the higher layers of the epidermis to reach the spiny layer and finally lose their nucleus at the level of the stratum corneum.
  • the renewal capacity of keratinocytes is due to the presence of stem cells which, in addition to their capacity for self-renewal, give rise to daughter cells with high division potential and cells which enter into differentiation.
  • keratinocytes are located at the base of the epidermis.
  • stem cells are also localized in the hair follicle (Rochat, Kobayashi et al. 1994). These pluripotent stem cells would give rise to various cells such as the cells of the external sheath, the cells of the internal sheath, of the bulb or even the sebaceous gland of the hair follicle, and finally the inter-follicular keratinocytes.
  • the locus responsible for Clouston syndrome identified in 1996, is located on chromosome 13, at 13q11 (Kibar, Der Kaloustian et al. 1996).
  • the identification of recombination events in people suffering from this syndrome has made it possible to delimit the chromosomal region of interest by the micro-satellite markers D13S1830 and telomeric D13S1380 (Kibar, Dube et al. 2000; Lamartine, Laoudj et al . 2000).
  • a contig of BACs covering the chromosomal region of interest was obtained and a set of genes and ESTs was located in this contig (Lamartine, Pitaval et al. 2000).
  • GJB2 and GJB6 genes which code for two proteins (connexin 26 and connexin 30, respectively).
  • the Connexin family includes around fifteen members. These proteins combine at the plasma membrane to form homomeric or heteromeric hexamers, called Connexons.
  • Two Connexons form a channel connecting two cells, called a gap junction.
  • Several communicating junctions form junctional plates and are involved in the transport of small molecules such as iP 3 , sugars, amino acids or even ions such as calcium. This ensures an adaptive and coordinated response of a set of cells during development or to changes in the environment.
  • connexins are responsible for various hereditary pathologies, such as dermatological pathologies and deafness, Charcot Marie Tooth neuropathy and cataracts.
  • hereditary pathologies such as dermatological pathologies and deafness, Charcot Marie Tooth neuropathy and cataracts.
  • connexins are responsible for various hereditary pathologies, such as dermatological pathologies and deafness, Charcot Marie Tooth neuropathy and cataracts.
  • mutations in the GJB2 gene, encoding Cx-26 connexin have been shown to be responsible for a genetic form of deafness such as DNFB1 deafness, the autosomal recessive mode of which is not state of knowledge associated with no clinical dermatological sign.
  • other mutations in the gene encoding Cx-26 connexin are responsible for palmoplantar keratoderma associated with deafness.
  • Mutations in the GJB3 gene, encoding Cx-31 connexin, are also responsible for a genetic form of deafness. It is non-syndromic sensorineural deafness with autosomal recessive transmission. In addition, mutations in this gene are responsible for hereditary dermatosis: variable erythrokeratoderma.
  • GJB6 gene encoding Connexin Cx-30 is responsible for a form of deafness of genetic origin. It is autosomal dominant non-syndromic sensorineural deafness. (NSRD3). A mutation of threonine in position 5 to methionine is responsible for this pathology. Mutations in the same gene are also responsible for hydrotic ectodermal dysplasia, or Clouston syndrome.
  • the authors of the present invention have identified the gene and mutations that cause Clouston syndrome.
  • GJB2 was a very good candidate gene since it has been shown that mutations in this gene are responsible for non-syndromic deafness of genetic origin and that deafness can be a symptom associated with Clouston Syndrome. However, no mutation in this gene has been found in individuals with HED families.
  • GJB6 connexin 30 encoded by the GJB6 gene has been located in the region 13q11, close to GJB2 (Kelley, Abe et al. 1999).
  • GJB6 is an intron-free gene of 786 base pairs which is expressed in particular in the murine epidermis (Dahl, Manthey et al. 1996). Mutations in human Connexin are responsible for autosomal dominant deafness (Grifa, Wagner et al. 1999). Therefore, GJB6 was also a very good candidate for Clouston Syndrome.
  • the sequencing of this gene has made it possible to identify mutations in the coding part of the GJB6 gene associated with Clouston syndrome.
  • Two types of mutations have been identified in patients who are of diverse geographic origins.
  • the mutation 31 (G> A) causes the glycine at position 11 to change by an arginine. .
  • Another mutation, 263 (C> T), causes the alanine at position 88 to be replaced by a valine. These mutations were not found in normal subjects of the families studied and in the general population (118 individuals were studied).
  • a first aspect of the invention is therefore the sequence of the human gene GJB6, and the mutated forms of this sequence involved in Clouston syndrome.
  • the invention relates in particular to DNA constructs carrying the sequence of the human gene GJB6, mutated or not, vectors carrying these constructs, cells transformed by these vectors, as well as transgenic animals expressing human, wild or mutated Connexin.
  • the invention also relates to antisense oligonucleotides directed against mutated alleles 31 (G> A) and 263 (C> T) and to gene transfer vectors for treatment by gene therapy of Clouston syndrome, as well as to a diagnostic method for this syndrome, PCR primers for the detection of mutations 31 (G> A) and 263 (C> T), and diagnostic kits for Clouston syndrome.
  • connexin 30 is the only Connexin identified to date as responsible for a dermatological pathology for which patients have alopecia. It is therefore probable that connexin 30 is also one of the factors implicated in at least certain other forms of alopecia with genetic predisposition.
  • a first type of mutation can affect the regulatory sequences for the expression of the GJB6 gene and could be the cause of alopecia, especially in the male subject.
  • the presence in the regulatory regions of the GJB6 gene of nucleotide sequences fixing the factors responding to androgens could be responsible for androgenetic alopecia.
  • other types of sequences in the regulatory regions should not be excluded. that could be involved in the expression of this gene.
  • Molecules or protein factors involved in the regulation of GJB6 expression could act as pharmacological agents, or even as drugs or cosmetic products involved in hair growth.
  • Such protein molecules or factors are included in a group comprising:
  • the action at the level of the GJB6 gene can be direct, that is to say on the transcription or inhibition factors thereof, or indirect, that is to say at the level of the synthesis of substances or metabolites that may interact with these factors.
  • a second type of mutation in the GJB6 gene capable of promoting alopecia with genetic predisposition concerns mutations in the coding region of the gene, which would cause functional loss in the Cx-30 protein.
  • mutations 31 (G> A) and 263 (C> T) make the product of the GJB6 gene inactive by preventing, for example, its transport to the membrane plasma (as described for Connexin 32 mutants (VanSlyke, Deschenes et al. 2000)), or its ability to form Connexons.
  • the disease could be due to a phenomenon of haplo-insufficiency.
  • the present invention relates in particular to nucleic acid constructs comprising the GJB6 gene, where appropriate carrying one or more mutations observed in patients with congenital alopecia or manifestly involving genetic factors.
  • Transformed cells and transgenic animals carrying one of these constructs are also part of the invention.
  • Such transgenic cells or animals can be used to screen for molecules capable of having a beneficial effect on alopecia. Indeed, it is possible to screen molecules by putting them in contact with cells carrying a construction such as those described above, and then to analyze the effect of said molecules on the expression of connexin 30 and / or on its functionality.
  • Connexin 30 can be determined for example by means of a DNA chip, and its functionality can be tested for example by measuring the electrophysiological activity of Connexons, in a system such as Xenopus egg. Such screening methods are also part of the invention.
  • Clouston syndrome suggests that the presence of an allele of the GJB6 gene carrying the mutation 31 (G> A) or the mutation
  • the invention therefore also relates to the use of a nucleic acid allowing the expression of a non-functional mutated form of connexin 30, for the preparation of pharmaceutical and / or cosmetic compositions intended to reduce the hairiness of the regions treated.
  • the authors of the present invention have therefore identified and sequenced the gene responsible for Clouston syndrome, which is the GJB6 gene, coding for connexin 30. They have shown that an individual carrying one of the mutations 31 (G> A) or 263 (C> T) in this gene is affected by Clouston syndrome.
  • the invention therefore relates, firstly, to the coding sequence of the human gene for connexin 30 (Seq ID No. 1), as well as to a recombinant nucleic acid molecule carrying this sequence, if necessary mutated so that the mutation results in a non-conservative substitution of the amino acid located in position 11 and / or the amino acid located in position 88.
  • sequence designates on the one hand, l information on a succession of nucleotides, and on the other hand, the support of this information, that is to say a nucleic acid molecule (DNA or RNA) carrying said succession of nucleotides.
  • the coding sequence of the human connexin 30 gene is placed under the control of a promoter allowing its expression in eukaryotic cells, in particular those of the epidermis; preferably, this promoter is the natural promoter of the human GJB6 gene, optionally mutated.
  • Nucleic acid molecules comprising a version of the human connexin 30 gene carrying at least one mutation frequently observed in subjects with alopecia with genetic predisposition are also part of the invention, that the mutation (s) in question are located in the coding sequence of the GJB6 gene or in the regulatory sequences for the expression of this gene.
  • a particular embodiment of the invention relates to an antisense oligonucleotide of a region of the coding sequence of connexin 30 comprising one of the mutations 31 (G> A) or
  • the invention also relates to gene transfer vectors comprising a nucleic acid such as those described above.
  • vectors can be viral vectors, for example derived from a virus selected from the group consisting of adenoviruses, retroviruses, lentiviruses, viruses associated with adenovirus (AAV), herpes viruses (HSV), virus of vaccinia, alphaviruses, baculoviruses, SV40 virus, and Ebstein-Barr virus. it can also be chimeras comprising elements of several viruses, or non-viral vectors, possibly synthetic.
  • AAV adenovirus
  • HSV herpes viruses
  • virus of vaccinia alphaviruses
  • baculoviruses SV40 virus
  • Ebstein-Barr virus Ebstein-Barr virus
  • One aspect of the present invention is the use of a nucleic acid or a vector such as those described above, for the preparation of a composition intended for the treatment of Clouston syndrome or
  • Another aspect of the invention relates to pairs of primers for detecting mutations 31 (G> A) or 263 (C> T), and methods of detecting these mutations.
  • the mutation 31 does not affect a restriction site.
  • one can carry out a mutagenic amplification for example by PCR using oligonucleotides which will modify, during PCR, a nucleotide close to nucleotide 31.
  • This technology makes it possible to create a restriction site which comprises said nucleotide 31.
  • Example 2 describes a mutagenic PCR making it possible to create the restriction site Bcl ⁇ from the allele carrying the mutation 31 (G > A), but not creating a restriction site from the allele not mutated in position 31.
  • the two alleles can then be identified by migration on agarose gel after cutting with Bcl ⁇ .
  • the invention therefore relates to pairs of primers allowing the mutagenic amplification of a fragment of the GJB6 gene comprising the nucleotide in position 31, such as the products of the mutagenic amplification produced from a GJB6 allele carrying or not mutation 31 (G> A) are discernible by digestion with a chosen restriction enzyme.
  • the restriction enzyme is Bcl ⁇
  • the primers contain the following sequences: 5'-ATGGATTGGGGGACGCTGCAC-3 'and
  • the invention also relates to a method for searching for mutation 31 (G> A) for the diagnosis of Clouston syndrome, comprising the following steps:
  • the mutation 263 removes an existing Haell restriction site on the wild allele.
  • the mutation can therefore be demonstrated by amplification of the region containing the mutation, followed by cleavage of the amplification product by the restriction enzyme Haell.
  • the two alleles can then be separated by migration on agarose gel.
  • the invention therefore relates to pairs of primers allowing the amplification of a fragment of the GJB6 gene comprising the nucleotide at position 263, chosen so that Haell digestion of the amplified fragment makes it possible to distinguish the presence or not of the site. of Haell restriction between nucleotides 260 and 270.
  • the invention relates to a pair of primers of 20 to 50 nucleotides comprising the following sequences:
  • pairs of primers described above can be included in a diagnostic kit for Clouston syndrome, which is also part of the invention.
  • a diagnostic kit for Clouston syndrome which is also part of the invention.
  • Such a kit can contain one or more pairs of primers. He can. in addition to containing the restriction enzymes Bcl ⁇ and Haell and buffers adapted to the activity of these enzymes.
  • nucleic acid or a vector such as those described above and carrying a mutated version of the GJB6 gene, leading for example to a non-conservative mutation of residue 11 or of residue 88 can also be used, according to the present invention, for the preparation of a composition intended to limit the growth of hairs and / or to promote their fall.
  • Other mutations leading to a loss of functionality of connexin 30 can also be envisaged in this aspect of the invention.
  • the present invention therefore therefore also includes any pharmaceutical and / or cosmetic composition comprising a nucleic acid molecule and / or a vector such as those described above. Depending on the case, this composition is intended for the treatment of Clouston syndrome, for the treatment of other alopecia with genetic predisposition, or for the reduction of the hairiness of certain regions of the body.
  • the present invention also relates to the recombinant proteins encoded by the nucleic acids and the vectors described above, as well as to any pharmaceutical and / or cosmetic composition comprising one or more of these recombinant proteins. If necessary, these proteins can be truncated.
  • a composition of the invention may also contain only fragments of the recombinant proteins described above.
  • compositions of the invention can be administered in external and local application. It may for example be a cream, a gel or a spray.
  • Another aspect of the invention relates to eukaryotic cells comprising a recombinant DNA construct such as those described above.
  • the recombinant DNA construct allowing expression of the human gene for connexin 30 can be present in extrachromosomal form or can be integrated into the genome of said cells.
  • the cells comprising a recombinant DNA construct allowing expression of the human gene for connexin 30 are HeLa or Xenopus egg cells.
  • expression of human Connexin can be stable or transient, constitutive or inducible.
  • the invention also relates to a transgenic animal comprising cells expressing the human connexin 30 gene, in its wild form or in a mutated form, such as the cells described above.
  • Expression of the human connexin 30 gene in an animal of the invention may be tissue-specific or not, and constitutive, inducible or repressible.
  • transgenic cells and animals of the invention can in particular be used to screen molecules effective in the treatment of certain alopecia. Therefore also forms part of the invention, a method of screening for molecules effective in the treatment of certain alopecia, comprising the following steps:
  • the step of determining the effect of the candidate molecule on the level of expression of the GJB6 gene can be carried out through the use of a DNA chip.
  • the cell carrying an allele of the human gene for connexin 30 is a xenopus egg
  • the step of determining the effect of the candidate molecule on the activity Connexin 30 is produced by measuring the electrophysiological activity of Connexons.
  • Figure 1 Family tree of French families (HED1 and HED2) and the Welsh family analyzed in this study. The gray numbers represent individuals whose DNA has been analyzed.
  • FIG. 2 Sequence of the GJB6 gene with the positioning of the different primers used.
  • the coding part is represented in capital letters.
  • Figure 3 Genotyping of sick and healthy individuals from two families carrying the mutation 31 (G> A). The amplification product by
  • Mutagenic PCR of the mutant allele is cut by Bcl ⁇ and gives two fragments (80 bp and 39 bp, which is not visible in the photo).
  • the mutagenic PCR amplification product of the wild-type allele is not cut (119 bp).
  • Figure 4 Genotyping of individuals from families carrying the mutation
  • the PCR amplification product of the mutant allele has a length of 854 bp.
  • the PCR amplification product of the wild-type allele is cut with Haell and gives two fragments (304 bp and 550 bp).
  • Example 1 The search for mutations in GJB6
  • the initial search for mutations in the GJB6 gene was done by sequencing three PCR fragments which cover the entire gene without an intron (pairs F1 / OPL2, S2 / S6 and S3 / R1; see Figure 2 and Table 2).
  • the DNAs of a healthy individual and a sick individual from each of the two families studied, as well as those of the individuals Rou12866 and Rou12862 (see Table 1) were sequenced. This work was carried out in collaboration with the sequencing service of Généthon.
  • the genotyping of a large number of individuals must be carried out using a simple technique allowing the detection of already known mutations.
  • the method used here consists in demonstrating the creation or the disappearance of a restriction site in the mutated sequence. Two techniques were used:
  • Mutation 263 (C> T): the mutation removes an existing Haell restriction site on the wild allele.
  • the demonstration of the mutation is carried out by PCR amplification of the region containing the mutation then by cleavage of the amplification product by the appropriate restriction enzyme. The two alleles can then be separated by migration on agarose gel
  • Mutation 31 (G> A): the mutation does not affect a restriction site. On the other hand, it is possible to create one if one also modifies a base close to the mutated site. Mutagenic oligonucleotides were used here to modify, during PCR, a nucleotide close to the mutation, so as to create the Bcl ⁇ restriction site. The two alleles can then be identified by migration on agarose gel after cutting with the appropriate enzyme.
  • the mutations in the other individuals were sought using a mutagenic PCR (Cx30-Bcll / Cx30-30mer-R; see Table 3), which creates a restriction site Sc / I in the mutated allele.
  • the PCR product is then digested with the enzyme Bcl ⁇ . Migration on gel (2% agarose + 2% Nusieve ® ) makes it possible to distinguish the mutated allele from the wild allele thanks to a size difference of 39 base pairs.
  • the mutation 263 (C> T) was sought in the other individuals according to the technique described above.
  • the mutation removes an existing Haell restriction site on the wild-type allele.
  • the distinction between the two alleles is made after PCR (Cx30-F1 / Cx30-R1; see
  • the DNA of a large number of healthy independent individuals was studied by the two strategies described above.
  • the 93 individuals tested are the grandparents of 24 CEPH families.
  • the individuals tested show neither of the two mutations. Since the mutation 263 (C> T) was identified in a family of Indian origin, 21 healthy independent Indians were tested. These individuals do not have either of the two mutations.
  • the various alleles of the GJB6 gene were cloned into the vector pUC19, flanked by the BglW or H / ⁇ dlll restriction sites.
  • the gene was amplified by PCR using primers containing BglW or H / ndllI restriction sites close to the 5 'ends (Cx30-F1Bglll / Cx30-R1 Bglll or Cx30-F1Hindlll / Cx30-R1 Hindlll, see Table 3).
  • the ends of the amplification product were made blunt by the action of the Klenow fragment of DNA Polymerase I.
  • the PCR product was cloned into the vector pUC19 (linearized by an enzyme giving blunt ends). After ligation and transformation in the E.coli strain JM109, the recombinants were identified by PCR using the primers M13-21 and

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Abstract

La présente invention résulte de l'identification de mutations dans le gène GJB6, responsables du syndrome de Clouston. La symptomatologie de ce syndrome suggère que GJB6, codant pour la connexine 30 (Cx-30), est très probablement impliqué aussi dans d'autres alopécies avec prédisposition génétique, notamment non pathologiques. L'invention porte donc sur la séquence du gène GJB6 portant au moins une des mutations 31(G>A) et 263(C>T), responsables du syndrome de Clouston, ainsi que sur l'utilisation de constructions comportant le gène GJB6, tant pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement du syndrome de Clouston et/ou de certains désordres du système pileux, que pour le criblage de molécules susceptibles d'avoir un effet bénéfique dans le traitement des alopécies. L'invention porte aussi sur des méthodes de diagnostic du syndrome de Clouston.

Description

UTILISATIONS DU GENE GJB6 DANS LE TRAITEMENT DE CERTAINES ALOPECIES DONT LE SYNDROME DE CLOUSTON, ET POUR LE CRIBLAGE DE COMPOSES SUSCEPTIBLES D'ETRE EFFICACES DANS LE TRAITEMENT D'ALOPECIES AVEC PREDISPOSITION GENETIQUE.
La présente invention résulte de l'identification de mutations dans le gène
GJB6, responsables du syndrome de Clouston. La symptomatologie de ce syndrome suggère que GJB6, codant pour la connexine 30 (Cx-30), est très probablement impliqué aussi dans d'autres alopécies avec prédisposition génétique, notamment non pathologiques. L'invention porte donc sur l'utilisation de constructions comportant le gène GJB6, tant pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement du syndrome de Clouston et/ou de certaines alopécies, que pour le criblage de molécules susceptibles d'avoir un effet bénéfique dans le traitement des alopécies. L'invention porte aussi sur des méthodes de diagnostic du syndrome de Clouston.
Le Syndrome de Clouston, ou Dysplasie Ectodermale Hydrotique (HED, OMIM 129500), est une maladie génétique monogénique rare à transmission autosomique dominante. Les personnes atteintes de ce syndrome présentent principalement une hypotrichose et une alopécie pathologique, associée à une dystrophie des ongles ainsi qu'une hyperkératose de la paume des mains et de la plante des pieds. Dans certains cas, les patients peuvent présenter d'autres signes cliniques tels que surdité, retard mental, hyperpigmentation de la peau ainsi que des anomalies oculaires et du squelette. Cette pathologie atteint l'épidémie, qui est un epithélium stratifié d'origine ectodermique. Cet epithélium est constitué de la couche basale, qui repose sur la jonction dermo-épidermique des couches granuleuse et épineuse et de la couche cornée la plus superficielle. Ce tissu, qui se renouvelle en deux semaines, doit cette propriété aux kératinocytes, qui sont le constituant cellulaire principal de l'épiderme. Les kératinocytes de la couche basale ont la capacité de se renouveler, de se différencier et de commencer leur migration dans les couches plus supérieures de l'épiderme pour atteindre la couche épineuse et enfin perdre leur noyau au niveau de la couche cornée. La capacité de renouvellement des kératinocytes est due à la présence de cellules souches qui, outre leur capacité d'auto-renouvellement, donnent naissance à des cellules filles à fort potentiel de division et des cellules entrant en différenciation. Ces trois populations de kératinocytes sont situées à la base de l'épiderme. De plus, il a été montré que des cellules souches sont aussi localisées dans le follicule pileux (Rochat, Kobayashi et al. 1994). Ces cellules souches pluri- potentes donneraient naissance à diverses cellules telles que les cellules de la gaine externe, les cellules de gaine interne, du bulbe ou encore la glande sébacée du follicule pileux, et enfin les kératinocytes inter-folliculaires.
Le locus responsable du syndrome de Clouston, identifié en 1996, est situé sur le chromosome 13, en 13q11 (Kibar, Der Kaloustian et al. 1996). L'identification d'événements de recombinaison chez des personnes atteintes de ce syndrome a permis de délimiter la région chromosomique d'intérêt par les marqueurs micro-satellites centromérique D13S1830 et télomérique D13S1380 (Kibar, Dube et al. 2000; Lamartine, Laoudj et al. 2000). Par la suite, un contig de BACs couvrant la région chromosomique d'intérêt a été obtenu et un ensemble de gènes et d'ESTs a été localisé dans ce contig (Lamartine, Pitaval et al. 2000). Parmi les gènes connus présents dans la région HED se trouvent les gènes GJB2 et GJB6, qui codent pour deux protéines (connexine 26 et connexine 30, respectivement). La famille des connexines comprend une quinzaine de membres. Ces protéines s'associent au niveau de la membrane plasmique pour former des hexamères homomériques ou hétéromériques, appelés connexons.
Deux connexons forment un canal reliant deux cellules, appelé jonction communicante ("gap junction" en anglais). Plusieurs jonctions communicantes forment des plaques jonctionnelles et sont impliquées dans le transport de petites molécules telles que iP3, les sucres, les acides aminés ou encore les ions tels que le calcium. Ainsi est assurée une réponse adaptative et coordonnée d'un ensemble de cellules au cours du développement ou aux changements de l'environnement.
Des mutations dans les gènes des connexines sont responsables de différentes pathologies héréditaires, telles que des pathologies dermatologiques et de surdité, la neuropathie de Charcot Marie Tooth et des cataractes. Plusieurs exemples illustrent en particulier l'implication des connexines dans des pathologies dermatologiques et de surdité héréditaires.
Par exemple, il a été démontré que des mutations dans le gène GJB2, codant la connexine Cx-26, sont responsables d'une forme génétique de surdité telles que la surdité DNFB1, dont le mode de transmission autosomique récessif n'est en l'état des connaissances associé à aucun signe clinique dermatologique. Par ailleurs, d'autres mutations dans le gène codant la connexine Cx-26 sont responsables d'une kératodermie palmo-plantaire associée à une surdité.
Des mutations du gène GJB3, codant la connexine Cx-31, sont aussi responsables d'une forme génétique de surdité. Il s'agit de la surdité neurosensorielle non syndromique à transmission autosomique récessive. En outre, des mutations de ce gène sont responsables d'une dermatose héréditaire : l'érythrokératodermie variable.
Enfin, il est connu qu'une mutation du gène GJB6 codant la connexine Cx-30 est responsable d'une forme de surdité d'origine génétique. Il s'agit de surdité sensorineurale autosomale dominante non syndromique . (NSRD3). Une mutation de la thréonine en position 5 en méthionine est responsable de cette pathologie. Des mutations du même gène sont par ailleurs responsables de la dysplasie ectodermale hydrotique, ou syndrome de Clouston.
Les auteurs de la présente invention ont identifié le gène et les mutations à l'origine du syndrome de Clouston.
Initialement, GJB2 était un très bon gène candidat puisqu'il a été montré que des mutations dans ce gène sont responsables de surdités non-syndromiques d'origine génétique et que la surdité peut être un symptôme associé au Syndrome de Clouston. Pourtant, aucune mutation dans ce gène n'a été trouvée chez les individus atteints des familles HED.
Plus récemment, une autre connexine (connexine 30) codée par le gène GJB6 a été localisée dans la région 13q11 , proche de GJB2 (Kelley, Abe et al. 1999). GJB6 est un gène sans intron de 786 paires de base qui est exprimé en particulier dans l'épiderme murin (Dahl, Manthey et al. 1996). Des mutations dans la connexine 30 humaine sont responsables d'une surdité autosomique dominante (Grifa, Wagner et al. 1999). Par conséquent, GJB6 était aussi un très bon candidat pour le Syndrome de Clouston.
Le séquençage de ce gène, qui ne possède qu'un seul exon, a permis d'identifier des mutations dans la partie codante du gène GJB6 associées au syndrome de Clouston. Deux types de mutations ont été identifiées chez des malades qui sont d'origines géographiques diverses. La mutation 31(G>A) entraîne le changement de la glycine en position 11 par une arginine.. Une autre mutation, 263(C>T), provoque le remplacement de l'alanine en position 88 par une valine. Ces mutations ne sont pas retrouvées chez des sujets normaux des familles étudiées et dans la population générale (118 individus ont été étudiés).
Un premier aspect de l'invention est donc la séquence du gène humain GJB6, et les formes mutées de cette séquence impliquées dans le syndrome de Clouston. L'invention porte notamment sur des constructions d'ADN portant la séquence du gène humain GJB6 muté ou non, des vecteurs portant ces constructions, des cellules transformées par ces vecteurs, ainsi que des animaux transgéniques exprimant la connexine 30 humaine, sauvage ou mutée.
L'invention porte également sur des oligonucléotides antisens dirigés contre les allèles mutés 31(G>A) et 263(C>T) et sur des vecteurs de transfert de gène destinés au traitement par thérapie génique du syndrome de Clouston, ainsi que sur une méthode de diagnostic de ce syndrome, des amorces PCR permettant la détection des mutations 31(G>A) et 263(C>T), et des kits de diagnostic du syndrome de Clouston.
Les inventeurs ont donc démontré l'implication directe de la connexine 30 dans le syndrome de Clouston. Une des manifestations cliniques majeures du syndrome de Clouston, ou HED, est une hypotrichose. Cette hypotrichose atteint notamment le cuir chevelu et les cheveux peuvent être rares et très fins, voire absents. Il faut de plus noter que, par la consultation de la base de données OMIM (Online Medelian Inheritance in Man), le terme alopécie donne accès à 117 rubriques dont HED qui, par une des manifestations cliniques de la maladies, fait partie des alopécies. Il est remarquable que la connexine 30 soit la seule connexine identifiée à ce jour comme responsable d'une pathologie dermatologique pour laquelle les patients sont atteints d'alopécie. Il est donc probable que la connexine 30 soit aussi un des facteurs impliqués dans au moins certaines autres formes d'alopécies à prédisposition génétique.
Il est possible de concevoir deux types de mutations du gène GJB6 responsables au moins partiellement d'alopécies indépendantes du syndrome de Clouston.
Un premier type de mutation peut affecter les séquences régulatrices de l'expression du gène GJB6 et pourrait être à l'origine d'alopécie, notamment chez le sujet masculin. La présence dans les régions régulatrices du gène GJB6 de séquences nucléotidiques fixant les facteurs répondant aux androgènes pourrait être responsable d'alopécie androgénétique. Il ne faut toutefois pas exclure d'autres types de séquences dans les régions régulatrices, . qui pourraient être impliquées dans l'expression de ce gène.
Des molécules ou des facteurs protéiques intervenant dans la régulation de l'expression de GJB6 pourraient agir comme agents pharmacologiques, voire comme médicaments ou produits cosmétiques intervenant dans la croissance des poils. De telles molécules ou facteurs protéiques sont compris dans un groupe comprenant :
• des molécules inhibant ou neutralisant des facteurs de transcription inhibiteurs de la transcription du gène GJB6,
• des molécules activatrices de facteurs de transcription activant l'expression du gène GJB6, • les facteurs de transcription impliqués dans la répression ou Pactivation de l'expression du gène GJB6.
L'action au niveau du gène GJB6 peut être directe, c'est-à-dire sur les facteurs de transcription ou d'inhibition de ceux-ci, ou indirecte, c'est-à-dire au niveau de la synthèse de substances ou de métabolites susceptibles d'interagir au niveau de ces facteurs.
Un deuxième type de mutations du gène GJB6 susceptibles de favoriser une alopécie avec prédisposition génétique concerne des mutations dans la région codante du gène, qui entraîneraient une perte fonctionnelle au niveau de la protéine Cx-30. En effet, une des hypothèses pour expliquer le caractère dominant du syndrome de Clouston est que les mutations 31(G>A) et 263(C>T) rendent le produit du gène GJB6 inactif en empêchant, par exemple, son transport à la membrane plasmique (comme décrit pour des mutants de la Connexine 32 (VanSlyke, Deschenes et al. 2000)), ou sa capacité à former des connexons. Dans ce cas, la maladie pourrait être due à un phénomène d'haplo- insuffisance. On peut émettre aussi l'hypothèse que ces mutants sont dominants négatifs et que la présence d'une ou plusieurs sous-unités non fonctionnelles dans un connexon soit suffisante pour altérer ou empêcher son fonctionnement. On peut donc imaginer que d'autres mutations dans le gène GJB6 puissent altérer partiellement la fonctionnalité des connexons, de manière moins drastique que les mutations impliquées dans le syndrome de Clouston, et que cette altération partielle soit seulement un facteur inhibant la croissance des cheveux et/ou favorisant leur chute. Il convient de noter que les alopécies avec prédispositions génétiques autres que le syndrome de Clouston sont peut-être d'origine multifactorielle, et en particulier polygénique. Toutefois, il est probable que certaines mutations du gène GJB6, situées dans la séquence codante ou dans les séquences régulatrices de l'expression de ce gène, soient associées à des alopécies à prédisposition génétique. Les considérations ci-dessus quant à l'implication du gène GJB6 dans les alopécies en général ont donc permis aux inventeurs de déterminer plusieurs applications liées à ce gène.
La présente invention porte notamment sur des constructions d'acide nucléique comprenant le gène GJB6, le cas échéant portant une ou plusieurs mutations observées chez des patients ayant une alopécie congénitale ou impliquant manifestement des facteurs génétiques. Des cellules transformées et des animaux transgéniques portant l'une de ces constructions font également partie de l'invention. De tels cellules ou animaux transgéniques peuvent être utilisés pour cribler des molécules susceptibles d'avoir une effet bénéfique sur l'alopécie. En effet, il est possible de cribler des molécules en les mettant au contact de cellules portant une construction telle que celles décrites ci-dessus, et d'analyser ensuite l'effet desdites molécules sur l'expression de la connexine 30 et/ou sur sa fonctionnalité. L'expression de la connexine 30 peut être déterminée par exemple grâce à une puce à ADN, et sa fonctionnalité peut être testée par exemple par mesure de l'activité électrophysiologique des connexons, dans un système tel que l'œuf de Xénope. De telles méthodes de criblage font également partie de l'invention.
Par ailleurs, le caractère dominant du syndrome de Clouston suggère que la présence d'un allèle du gène GJB6 portant la mutation 31(G>A) ou la mutation
263(C>T) exprimé dans les cellules des follicules pileux est suffisante pour altérer les cycles anagène, catagène ou télogène du follicule pileux. Cette constatation permet d'imaginer des nouvelles stratégies destinées. à corriger certaines anomalies liées à une hyper-pilosité (hirsutisme), ou plus généralement, à limiter la pilosité de certaines régions du corps, en transférant localement, dans les cellules épidermiques de la région dont on souhaite réduire la pilosité, un allèle muté du gène GJB6. En particulier, le transfert d'une molécule d'acide nucléique codant pour une forme de la connexine 30 portant une mutation non conservative au niveau du résidu 11 et/ou du résidu 88, entraînera une alopécie au niveau de la région traitée. Il est probable que d'autres mutations de la connexine 30 entraînent le même résultat. L'invention porte donc aussi sur l'utilisation d'un acide nucléique permettant l'expression d'une forme mutée non fonctionnelle de la connexine 30, pour la préparation de compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques destinées à réduire la pilosité des régions traitées.
Les auteurs de la présente invention ont donc identifié et séquence le gène responsable du syndrome de Clouston, qui est le gène GJB6, codant pour la connexine 30. Ils ont montré qu'un individu portant l'une des mutations 31(G>A) ou 263(C>T) dans ce gène est affecté du syndrome de Clouston. L'invention porte donc, en premier lieu, sur la séquence codante du gène humain de la connexine 30 (Seq ID n°1), ainsi que sur une molécule d'acide nucléique recombinant portant cette séquence, le cas échéant mutée de telle sorte que la mutation entraîne une substitution non conservative de l'acide aminé situé en position 11 et/ou de l'acide aminé situé en position 88. Dans l'ensemble de ce texte, le terme « séquence » désigne d'une part, l'information sur une succession de nucléotides, et d'autre part, le support de cette information, c'est- à-dire une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) portant ladite succession de nucléotides. Dans une réalisation préférée des molécules d'acide nucléique de l'invention, la séquence codante du gène humain de la connexine 30 est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans des cellules eucaryotes, notamment celles de l'épiderme ; de manière préférée, ce promoteur est le promoteur naturel du gène humain GJB6, le cas échéant muté.
Des molécules d'acide nucléique comprenant une version du gène humain de la connexine 30 portant au moins une mutation fréquemment observée chez des sujets ayant une alopécie avec prédisposition génétique font également partie de l'invention, que la ou les mutation(s) en question soient situées dans la séquence codante du gène GJB6 ou dans les séquences régulatrices de l'expression de ce gène.
L'identification de mutations à l'origine du syndrome de Clouston permet d'envisager une thérapie de cette pathologie. Ainsi, une réalisation particulière de l'invention porte sur un oligonucleotide antisens d'une région de la séquence codante de la connexine 30 comportant l'une des mutations 31(G>A) ou
263(OT).
Bien entendu, l'invention porte aussi sur des vecteurs de transfert de gène comportant un acide nucléique tel que ceux décrits ci-dessus. Ces vecteurs peuvent être des vecteurs viraux, par exemple dérivés d'un virus sélectionné dans le groupe constitué des adénovirus, des rétrovirus, des lentivirus, des virus associés à l'adénovirus (AAV), des virus herpès (HSV), du virus de la vaccine, des alphavirus, des baculovirus, du virus SV40, et du virus d'Ebstein- Barr. il peut aussi s'agir de chimères comportant des éléments de plusieurs virus, ou de vecteurs non viraux, éventuellement synthétiques. Un des aspects de la présente invention est l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un vecteur tel que ceux décrits ci-dessus, pour la préparation d'une composition destinée au traitement du syndrome de Clouston ou au traitement d'alopécies avec prédispositions génétiques.
Un autre aspect de l'invention porte sur des couples d'amorces permettant de détecter les mutations 31(G>A) ou 263(C>T), et des méthodes de détection de ces mutations.
Comme décrit dans l'exemple 2 ci-dessous, la mutation 31(G>A) ne touche pas un site de restriction. En revanche, il est possible d'en créer un si l'on modifie une base proche du nucléotide 31. Pour cela, on peut réaliser une amplification mutagene, par exemple par PCR en utilisant des oligonucléotides qui modifieront, lors de la PCR, un nucléotide proche du nucléotide 31. Cette technologie permet de créer un site de restriction qui comprend ledit nucléotide 31. L'exemple 2 décrit une PCR mutagene permettant de créer le site de restriction Bcl\ à partir de l'allèle portant la mutation 31(G>A), mais ne créant pas de site de restriction à partir de l'allèle non muté en position 31. Les deux allèles peuvent alors être identifiés par migration sur gel d'agarose après coupure par Bcl\. L'invention porte donc sur des couples d'amorces permettant l'amplification mutagene d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 31 , tel que les produits de l'amplification mutagene réalisée à partir d'un allèle GJB6 portant ou non la mutation 31(G>A) soient discernables par digestion par une enzyme de restriction choisie. Dans une réalisation particulière de cet aspect de l'invention, l'enzyme de restriction est Bcl\, les amorces contiennent les séquences suivantes : 5'-ATGGATTGGGGGACGCTGCAC-3' et
5'-GCAGCCACCACTAGGATCATGACTCGGAAA-3\
L'invention porte aussi sur une méthode de recherche de la mutation 31(G>A) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes :
• amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces tel que ceux décrits ci-dessus,
• digestion du produit de l'amplification par l'enzyme de restriction appropriée, qui est Bcl\ dans le cas particulier où l'amplification a conduit à la création d'un site de restriction Bcl\ à partir de l'allèle portant la mutation 31(G>A),
• analyse du produit de la digestion.
La mutation 263(C>T) supprime un site de restriction Haell existant sur l'allèle sauvage. La mutation peut donc être mise en évidence par amplification de la région contenant la mutation, suivie de la coupure du produit d'amplification par l'enzyme de restriction Haell. Les deux allèles peuvent alors être séparés par migration sur gel d'agarose. L'invention porte donc sur des couples d'amorces permettant l'amplification d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 263, choisis de telle façon que la digestion par Haell du fragment amplifié permette de distinguer la présence ou non du site de restriction Haell entre les nucléotides 260 et 270. En particulier, l'invention porte sur un couple d'amorces de 20 à 50 nucléotides comprenant les séquences suivantes :
5'-CTTTGCCCACTTTTGTCTGT-3' et
5'-TGACGCAGCTACATTTTACCTT-3'. Ces couples d'amorces peuvent être utilisés dans une méthode de recherche de la mutation 263(C>T) pour le diagnostic du syndrome de. Clouston, comportant les étapes suivantes :
• amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces tel que ceux décrits ci-dessus,
• digestion du produit de l'amplification par l'enzyme Haell,
• analyse du produit de la digestion, la présence de l'allèle muté conduisant à une bande non coupée par Haell.
Les couples d'amorces décrits ci-dessus peuvent être inclus dans un kit de diagnostic du syndrome de Clouston, qui fait également partie de l'invention. Un tel kit peut contenir un ou plusieurs couples d'amorces. Il peut en . outre comporter les enzymes de restriction Bcl\ et Haell et des tampons adaptés à l'activité de ces enzymes.
La connaissance de mutations impliquées dans une pathologie monogénique dominante dont un des symptômes est une alopécie peut avoir d'autres applications. Ainsi, un acide nucléique ou un vecteur tel que ceux décrits ci- dessus et portant une version mutée du gène GJB6, conduisant par exemple à une mutation non conservative du résidu 11 ou du résidu 88, peut aussi être utilisé, suivant la présente invention, pour la préparation d'une composition destinée à limiter la pousse des poils et/ou à en favoriser la chute. D'autres mutations conduisant à une perte de fonctionnalité de la connexine 30 peuvent aussi être envisagées dans cet aspect de l'invention. La présente invention comprend donc aussi toute composition pharmaceutique et/ou cosmétique comportant une molécule d'acide nucléique et/ou un vecteur tel que ceux décrits ci-dessus. Suivant les cas, cette composition est destinée au traitement du syndrome de Clouston, au traitement d'autres alopécies avec prédisposition génétique, ou à la réduction de la pilosité de certaines régions du corps.
La présente invention porte aussi sur les protéines recombinantes codées par les acides nucléiques et les vecteurs décrits ci-dessus, ainsi que sur toute composition pharmaceutique et/ou cosmétique comportant une ou plusieurs de ces protéines recombinates. Le cas échéant, ces protéines peuvent être tronquées. Une composition de l'invention peut aussi contenir seulement des fragments des protéines recombinantes décrites ci-dessus.
De façon préférée, les compositions de l'invention sont administrables en application externe et locale. Il peut s'agir par exemple d'une crème, d'un gel ou d'un spray.
*
Un autre aspect de l'invention concerne des cellules eucaryotes comportant une construction d'ADN recombinant telle que celles décrites ci-dessus. Dans ces cellules, la construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 peut être présente sous forme extra- chromosomique ou être intégrée dans le génome desdites cellules. Dans une réalisation particulière de cet aspect de l'invention, les cellules comportant une construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 sont des cellules HeLa ou d'œuf de Xénope. Dans les cellules de l'invention, l'expression de la connexine 30 humaine peut être stable ou transitoire, constitutive ou inductible. L'invention porte également sur un animal transgénique comportant des cellules exprimant le gène humain de la connexine 30, sous sa forme sauvage ou sous une forme mutée, telles que les cellules décrites ci-dessus. L'expression du gène humain de la connexine 30 dans un animal de l'invention peut être tissus- spécifique ou non, et constitutive, inductible ou répressible.
Les cellules et animaux transgéniques de l'invention peuvent notamment servir pour cribler des molécules efficaces dans le traitement de certaines alopécies. Fait donc également partie de l'invention, une méthode de criblage de molécules efficaces dans le traitement de certaines alopécies, comportant les étapes suivantes :
- mise en contact de la molécule candidate et d'une cellule ou d'un animal selon l'invention,
- détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 et/ou sur l'activité de la connexine 30.
Dans cette méthode, l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 peut être réalisée grâce à l'utilisation d'une puce à ADN.
Dans une mise en œuvre particulière de la méthode de la présente invention, la cellule portant un allèle du gène humain de la connexine 30 est un œuf de Xénope, et l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur l'activité de la connexine 30 est réalisée par mesure de l'activité électrophysiologique des connexons.
Les exemples et figures présentés ci-après, à titre non limitatif, illustrent et précisent certains aspects de la présente invention. Légende des figures :
Figure 1 : Arbre généalogique des familles françaises (HED1 et HED2) et de la famille galloise analysées dans cette étude. Les numéros en gris représentent les individus dont l'ADN a été analysé.
Figure 2 : Séquence du gène GJB6 avec le positionnement des différentes amorces utilisées. La partie codante est représentée en majuscules.
Figure 3 : Génotypage d'individus malades et sains issus de deux familles porteuses de la mutation 31(G>A). Le produit d'amplification par
PCR mutagene de l'allèle mutant est coupé par Bcl\ et donne deux fragments (80 pb et 39 pb, qui n'est pas visible sur la photo). Le produit d'amplification par PCR mutagene de l'allèle sauvage n'est pas coupé (119 pb).
Figure 4 : Génotypage d'individus issus de familles porteuses de la mutation
263(C>T). Le produit d'amplification par PCR de l'allèle mutant (non coupé) a une longueur de 854 pb. Le produit d'amplification par PCR de l'allèle sauvage est coupé par Haell et donne deux fragments (304 pb et 550 pb). Exemple 1 : La recherche de mutations dans GJB6
Matériel génétique utilisé :
Des échantillons d'ADN d'individus sains et atteints, d'origines géographiques diverses, on été utilisés (voir Tableau 1). Cette collection comporte notamment des échantillons provenant de deux familles françaises (HED1 et HED2) non- apparentées et porteuses de la maladie (voir Figure 1). Les individus non apparentés ayant servi de témoin négatif proviennent de plusieurs familles indépendantes du CEPH (Centre d'Étude du Polymorphisme Humain).
Tableau 1:
Echantillons provenant d'individus sains (S) ou atteints (A) obtenus grâce à plusieurs collaborations. Séquençage du gène GJB6 :
La recherche initiale de mutations dans le gène GJB6 a été faite par séquençage de trois fragments de PCR qui recouvrent la totalité du gène sans intron (couples F1/OPL2, S2/S6 et S3/R1 ; voir Figure 2 et Tableau 2). Les ADN d'un individu sain et d'un individu malade de chacune des deux familles étudiées ainsi que ceux des individus Rou12866 et Rou12862 (voir tableau 1) ont été séquences. Ce travail a été effectué en collaboration avec le service de séquençage de Généthon.
Tableau 2 :
Séquences des différentes amorces utilisées pour séquencer le gène GJB6. Résultats :
L'analyse des séquences des ADN provenant des individus V.1 (malade) et 111.15 (sain) de la famille HED1 (voir Figure 1) a permis de montrer que le premier est hétérozygote pour une mutation ponctuelle 31(G>A) qui touche la première base du codon 11 de la séquence et entraîne une "substitution d'un résidu glycine par un résidu arginine.
Par ailleurs, le séquençage de la totalité de la séquence codante du gène GJB6 provenant d'un individu atteint (Rou12862) et d'un individu sain (Rou12866) d'une famille ne présentant pas la mutation 31 (G>A), a permis d'identifier, dans cette famille, une nouvelle mutation, 263(C>T), dans ce même gène. Cette mutation touche la deuxième base du codon 89 de la séquence et entraîne une substitution d'un résidu alanine par un résidu valine.
Exemple 2 : La confirmation des mutations dans GJB6
Principe de génotypage d'un grand nombre d'individus pour ces mutations :
Le génotypage d'un grand nombre d'individus doit être effectué grâce à une technique simple permettant la détection de mutations déjà connues. La méthode utilisée ici consiste à mettre en évidence la création ou la disparition d'un site de restriction dans la séquence mutée. Deux techniques ont été utilisées :
• Mutation 263(C>T) : la mutation supprime un site de restriction Haell existant sur l'allèle sauvage. La mise en évidence de la mutation est effectuée par amplification par PCR de la région contenant la mutation puis par coupure du produit d'amplification par l'enzyme de restriction appropriée. Les deux allèles peuvent alors être séparés par migration sur gel d'agarose
. Mutation 31(G>A) : la mutation ne touche pas un site de restriction. En revanche, il est possible d'en créer un si l'on modifie également une base proche du site muté. On a utilisé ici des oligonucléotides mutagènes pour modifier, lors de la PCR, un nucléotide proche de la mutation, de façon à créer le site de restriction Bcl\. Les deux allèles peuvent alors être identifiés par migration sur gel d'agarose après coupure par l'enzyme appropriée.
Mutation 31 (G>A) :
Une fois la mutation 31(G>A) identifiée, les mutations chez les autres individus ont été recherchées grâce à une PCR mutagene (Cx30-Bcll / Cx30-30mer-R ; voir tableau 3), qui crée un site de restriction Sc/I dans l'allèle muté. Le produit de PCR est alors digéré par l'enzyme Bcl\. La migration sur gel (2% agarose + 2% Nusieve®) permet de distinguer l'allèle muté de l'allèle sauvage grâce à une différence de taille de 39 paires de bases.
Tableau 3 :
Séquence des différentes amorces utilisées pour amplifier le gène GJB6 ou des fragments de ce gène
Tous les échantillons disponibles des deux familles HED françaises ont été testés par cette PCR mutagene. Tous les individus atteints se sont avérés hétérozygotes alors que les individus sains sont homozygotes (voir Figure 3).
Cette même méthode a permis de détecter la mutation 31(G>A) chez d'autres malades d'origines géographiques diverses. (Voir Tableau 4). Mutation 263(OT) :
Après sa découverte chez l'individu Rou12862, la mutation 263(C>T) a été recherchée chez les autres individus selon la technique décrite ci-dessus. La mutation supprime un site de restriction Haell existant sur l'allèle sauvage. La distinction entre les deux allèles se fait après PCR (Cx30-F1 / Cx30-R1 ; voir
Tableau 3), et coupure enzymatique par Haell. Les individus hétérozygotes présentent une bande correspondant au produit de PCR non digéré en plus des bandes plus petites correspondant à l'allèle sauvage.
La simple coupure des produits de PCR Cx30-F1 / Cx30-R1 par l'enzyme Haell (voir Figure 4) a donc permis de vérifier que la totalité des individus atteints qui ne portaient pas la mutation 31 (G>A) présentent la mutation 263(C>T) et que celle-ci est absente chez les individus sains (voir Tableau 4).
Génotypage des témoins
Afin de vérifier que ces deux mutations ne correspondent pas à du polymorphisme, l'ADN d'un grand nombre d'individus sains indépendants a été étudié par les deux stratégies décrites précédemment. Les 93 individus testés sont les grands-parents de 24 familles du CEPH. Les individus testés ne présentent aucune des deux mutations. Puisque la mutation 263(C>T) a été identifiée dans une famille d'origine indienne, 21 indiens sains indépendants ont été testés. Ces individus ne présentent aucune des deux mutations.
Tableau 4 :
Génotypage des ADN obtenus grâce aux collaborations
A= atteint. S ≈sain. Exemple 3 : Clonage des allèles sauvage et mutants de la Connexine 30
Dans le but de procéder à des études fonctionnelles des connexines 30 sauvage et mutées dans divers systèmes cellulaires eucaryotes, les différents allèles du gène GJB6 ont été clones dans le vecteur pUC19, flanqués des sites de restriction BglW ou H/πdlll.
Dans une première étape, le gène a été amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant des sites de restriction BglW ou H/ndllI proches des extrémités 5' (Cx30-F1Bglll / Cx30-R1 Bglll ou Cx30-F1Hindlll / Cx30-R1 Hindlll, voir Tableau 3). Une fois le gène amplifié (à partir d'ADN génomique provenant d'individus malades, hétérozygotes, porteurs de chacune des deux mutations), les extrémités du produit d'amplification ont été rendues franches par action du fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I. Le produit de PCR a été clone dans le vecteur pUC19 (linéarisé par une enzyme donnant des extrémités franches). Après ligation et transformation dans la souche de E.coli JM109, les recombinants ont été identifés par PCR en utilisant les amorces M13 -21 et
M13 -40 du vecteur. La nature de l'insert (muté ou sauvage) a été déterminée par les techniques décrites dans l'exemple 2.
Six clones différents ont été obtenus, correspondant à la forme sauvage et aux formes mutées 31(G>A) et 263(C>T), bordées de sites BglW ou H/ndlll.
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Claims

Revendications
1. Acide nucléique recombinant codant le gène humain de la connexine 30 (Seq ID n°1 ), caractérisé en ce qu'un individu portant la mutation 31(G>A) et/ou la mutation 263(C>T) dans ce gène est affecté du syndrome de Clouston.
2. Acide nucléique recombinant selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la séquence codante de la connexine 30 est mutée de telle sorte que la mutation entraîne une substitution non conservative de l'acide aminé situé en position 11 et/ou de l'acide aminé situé en position 88.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence codante du gène humain de la connexine 30 est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans des cellules eucaryotes.
4. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur contrôlant l'expression du gène humain de la connexine 30 est le promoteur naturel du gène humain GJB6, le cas échéant muté.
5. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mutation du gène humain de la connexine 30 est située dans la séquence codante du gène GJB6.
6. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mutation du gène humain de la connexine 30 est située dans les séquences régulatrices de l'expression du gène GJB6.
7. Oligonucleotide antisens d'une région de la séquence de l'acide nucléique de la revendication 1 comportant l'une des mutations 31(G>A) ou 263(OT).
8. Vecteur de transfert de gène comportant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant.
10. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur non viral pour le transfert de gène.
11. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'une composition destinée au traitement du syndrome de Clouston.
12. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'alopécies avec prédisposition génétique.
13. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'une composition destinée à limiter la pousse des poils et/ou à en favoriser la chute.
14. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1, 3, 4 ou 7, pour la préparation d'une composition destinée au traitement du syndrome de Clouston.
15. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 , 3, 4 ou 7, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'alopécies avec prédisposition génétique.
16. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, pour la préparation d'une composition destinée à réduire la pilosité.
17. Cellule eucaryote comportant une construction d'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
18. Cellule selon la revendication 17, telle que la construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 est présente sous forme extra-chromosomique.
19. Cellule selon la revendication 17, telle que la construction d'ADN recombinant permettant l'expression du gène humain de la connexine 30 est intégrée dans le génome de ladite cellule.
20. Cellule selon les revendications 17 à 19, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule HeLa ou d'œuf de Xénope.
21. Animal transgénique comportant des cellules suivant l'une quelconque des revendications 17 à 19.
22. Méthode de criblage de molécules efficaces dans le traitement de certaines alopécies, comportant les étapes suivantes :
- mise en contact de la molécule candidate et d'une cellule selon l'une quelconque des revendications 17 à 20 ou d'un animal selon la revendication 21 ,
- détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 et/ou sur l'activité de la connexine 30.
23. Méthode selon la revendication 22, dans laquelle l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur le niveau d'expression du gène GJB6 est réalisée grâce à l'utilisation d'une puce à ADN.
24. Méthode selon la revendication 22, dans laquelle la cellule portant un allèle du gène humain de la connexine 30 est un œuf de Xénope, et l'étape de détermination de l'effet de la molécule candidate sur l'activité de la connexine 30 est réalisée par mesure de l'activité électrophysiologique des connexons.
25. Couple d'amorces permettant l'amplification mutagene d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 31, tel que les produits de l'amplification mutagene réalisée à partir d'un allèle GJB6 portant ou non la mutation 31(G>A) soient discernables par digestion par une enzyme de restriction choisie.
26. Couple d'amorces selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction est Sc/I, et par les séquences suivantes :
5'-ATGGATTGGGGGACGCTGCAC-3' et
5'-GCAGCCACCACTAGGATCATGACTCGGAAA-3'.
27. Couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment du gène GJB6 comportant le nucléotide en position 263, caractérisé en ce que la digestion par Haell du fragment amplifié permette de distinguer la présence ou non du site de restriction Haell entre les nucléotides 260 et 270.
28. Couple d'amorces selon la revendication 27, caractérisé par les séquences suivantes :
5'-CTTTGCCCACTTTTGTCTGT-3' et
5'-TGACGCAGCTACATTTTACCTT-3'.
29. Méthode de recherche de la mutation 31(G>A) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes :
• amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces selon la revendication 25,
• digestion du produit de l'amplification par l'enzyme de restriction appropriée,
analyse du produit de la digestion.
30. Méthode de recherche de la mutation 31(G>A) selon la revendication 29, dans laquelle
• l'amplification d'un fragment du gène GJB6 est réalisée avec un couple d'amorces selon la revendication 26,
• le produit de l'amplification est digéré par l'enzyme Sc/I,
• la présence de l'allèle muté conduit à une différence de 39 paires de bases.
31. Méthode de recherche de la mutation 263(C>T) pour le diagnostic du syndrome de Clouston, comportant les étapes suivantes :
• amplification d'un fragment du gène GJB6 avec un couple d'amorces
! suivant la revendication 27 ou 28 ,
• digestion du produit de l'amplification par l'enzyme Haell,
• analyse du produit de la digestion, la présence de l'allèle muté conduisant à une bande non coupée par Haell.
32. Kit de diagnostic du syndrome de Clouston, comportant un ou plusieurs couples d'amorces suivant une ou plusieurs des revendications 25 à 28.
33. Kit de diagnostic selon la revendication 32, comportant en outre les enzymes de restriction Bcl\ et Haell et des tampons adaptés à l'activité de ces enzymes.
34. Protéine recombinante codée par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10.
35. Composition pharmaceutique et/ou cosmétique pour la prévention et/ou le traitement de désordres du système pileux, comportant une protéine recombinante selon la revendication 34 ou un fragment de celle-ci.
36. Composition pharmaceutique et/ou cosmétique pour la prévention et/ou le traitement de désordres du système pileux, comportant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et/ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10.
37. Composition selon l'une quelconque des revendications 35 ou 36, caractérisée en ce qu'elle est administrable en application externe et locale.
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