JP3759346B2 - 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、先天性類脂質副腎過形成（類脂質ＣＡＨ）を引き起こす変異座位として認定された遺伝子配列、および本疾患の診断、さらに該疾患の遺伝的伝達可能性の指標として該変異遺伝子存在を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロイドホルモン合成は、トロピックホルモン刺激に反応して大きく増加する。もっともステロイド生成酵素をコードする遺伝子の転写増加は長期のホルモン反応に重要であるが、急性反応における速度制限工程は、ミトコンドリアへのコレステロールの輸送である(J.F.Crivelloら、J. Biol. Chem. 255:8144(1980); C.R. Jefcoateら、J. Steroid Biochem. 27:721(1987)）。この輸送に関与する幾つかの分子が提唱されたが、それらの役割は未だ明確にはなっていない。
【０００３】
初期の実験によって、先天性類脂質副腎過形成（類脂質ＣＡＨ）は、副腎および性腺ステロイドホルモンの重篤な欠乏という特徴をもつ（H.J. Degenhartら、Acta Endochrinol. 71:215(1972); S. Koizumiら、Clin. Chem. Acta 77:301(1977); B.P. Hauffaら、Clin. Endocrinol. 23:481(1985)）常染色体の劣性障害であることが示された（Praderら、Helv. Paed Acta 17:285-289(1962)）。罹患幼児は、ステロイドホルモンの修復処置がなければ塩欠失、高カリウム血症性アシドーシス、脱水のために死亡する。最初に報告された３２名の患者の調査で、遺伝的に男女は等しい頻度で罹患することが示唆されたが、ただし性別は、しばしば性腺の外観および組織学的状況または口腔塗抹標本から推量された（Hauffaら、1985）。ＸＹ遺伝型の男性患者は、精巣のテストステロン合成の欠如のために女性外性器をもつ。障害された副腎および性腺のミトコンドリアは、コレステロールからプレグネノロンへの変換ができないので、この疾患は、以前にはコレステロール側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）における欠陥のためであると考えられた。しかしながら、Ｐ４５０ｓｃｃの関与は罹患者の分子遺伝学的分析によって除外された（D. Linら、J. Clin. Invest. 88:1955(1991); Y. Sakaiら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 79:1198(1994))。本出願人らは、この欠陥はコレステロールのミトコンドリアへの輸送に深くかかわっているであろうと推論した（D. Linら、J. Clin. Invest. 88:1955(1991); D. Linら、Genomics 18:643(1993))。しかしながら、類脂質ＣＡＨに関する分子的欠陥のこの最新の解釈より以前には、この疾患に付随する特定の欠陥は全く知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ヒトの先天性類脂質過形成の遺伝学的診断方法を提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、遺伝学的カウンセリングで使用するためにヒトの先天性類脂質副腎過形成の原因となる遺伝子の変異の有無を検出することである。
【０００６】
本発明のまた別の目的は、該疾患をもつ患者で不完全蛋白と交換する蛋白を提供することによって、ヒトの先天性類脂質副腎下過形成を治療する方法を提供することである。
【０００７】
本発明のまた別の目的は、ミトコンドリアの異常なコレステロール代謝が本発明の蛋白に反応する酵素によって支配されているということを条件として、該疾患をもつ患者で不完全蛋白と交換する蛋白を提供することによって、当該代謝により引き起こされる高コレステロール血症または他の疾患を治療または予防する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、本発明の蛋白（本発明の突然変異蛋白）の発現のためのプロモーター、または哺乳類細胞もしくは遺伝子移入哺乳類での異種遺伝子発現のためのプロモーター、または遺伝子治療用異種遺伝子の発現のためのプロモーターを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記のような目的および以下で一層容易に明らかになるその他の目的は、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を提供することによって達成されるが、この場合、当該分子は：（１）図１、表６−１乃至６−３または表７−１乃至７−３で説明するヒトステロイド生成急性調節蛋白（ｈＳｔＡＲ）ｃＤＮＡ、ｈＳｔＡＲゲノムＤＮＡ、ｈＳＴＡＲプロモーターまたはｈＳｔＡＲ偽遺伝子から成る第一の配列、（２）少なくとも長さが１０ヌクレオチドの、第一の配列のサブ配列である第二の配列、（３）第一または第二の配列の少なくとも１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換されている第三の配列、（４）当該第一または第二の配列で少なくとも１個のヌクレオチドが欠失しているか、または挿入されている第四の配列、または（５）第一、第二または第三のいずれかに相補的な第五の配列を含み、この場合、（１）該分子がＲＮＡ分子の場合、この分子の配列でＴはＵと置換され、（２）第三の配列は第一または第二の配列に対して少なくとも９５％同一で、さらに（３）第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡに存在しないことを条件とする。本発明はまた、ヒトの変異ＳｔＡＲ遺伝子（例えば先天性類脂質副腎過形成に付随するような変異）を検出する方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
特定の具体例に沿って説明する。
【００１１】
胎盤のプロジェステロン合成は妊娠維持に必要であるという以前に得られた示唆（J.F. Straussら、Endocrinology(内分泌学）、L.J. DeGroot編、３巻、2171-2206ページ(W.B. Saunders, フィラデルフィア、1995))を基にした研究から本発明は得られた。類脂質ＣＡＨ胎児をもつ妊娠は出産予定日まで正常に進行し、さらに当該胎盤はプロジェステロンも産生することができる（P. Saengerら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:200-205(1995)）ので、本発明者らは、探索中の因子は副腎および性腺のステロイド生成に必要であるが、胎盤のステロイド合成には必要でないと推論した。最近報告された３０ｋＤａ燐酸化蛋白は、トロピック刺激に対する急激でシクロヘキシミド感受性のステロイド生成反応を仲介すると考えられる（D.M. Stocco & T.C. Sodeman, J. Biol. Chem.266,19739(1991); L.F. Epstein & N.R. Orme-Johnson, J. Biol. Chem. 266, 19739(1991); D.M.Stocco & M. Ascoli, Endocrinology, 132, 959(1993)）。この蛋白、すなわちステロイド生成急性調節蛋白（ＳｔＡＲ）がＭＡ−１０マウスリーディッヒ（Leydig）腫瘍細胞から精製された。マウスのＳｔＡＲｃＤＮＡのクローニングは科学文献に以前に報告された（B.J. Clark, J. Wells, S.R. King, D.M. Stocco, J. Biol. Chem. 269:28314(1994)）。我々の仮説、すなわちこの蛋白の遺伝的欠陥が類脂質ＣＡＨの原因であるということが正しいか否かを決定するために、ヒトのＳｔＡＲｃＤＮＡをクローニングした。ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は図１に示す。変異は図１においてヌクレオチドの番号付けシステムで示されている。さらに影響を受けるアミノ酸が番号付けシステムで表されているが、この場合、ヌクレオチド１２７〜１２９でコードされるメチオニンがＳｔＡＲ蛋白の最初のアミノ酸である。
【００１２】
ＭＡ−１０細胞およびＣＯＳ−１細胞でのマウスＳｔＡＲｃＤＮＡの一過性の発現はステロイド生成の強化をもたらす（B.J. Clark, J. Wells, S.R. King, D.M. Stocco, J. Biol. Chem. 269:28314(1994) ）。我々は、ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡについて同様な特性を発見し、さらにＳｔＡＲｍＲＮＡは副腎および性腺組織で豊富であるが、胎盤では豊富ではないことを見出した。したがって、ＳｔＡＲは、類脂質ＣＡＨに関与する因子として有力な候補であるように思える。これがきっかけとなって、我々は無関係の１９人の患者のＳｔＡＲ遺伝子を調べた。患者１（白人）はこれまで当技術分野の他の者によって報告されていない。患者２（朝鮮人）および患者３（日本人）は以前に報告されたがＳｔＡＲ遺伝子については報告されていない（患者３:B.P. Hauffaら、Clin. Endocrinol. 23:481(1985); 患者２および３：D. Linら、J. Clin. Invest. 88:1955(1991)；患者２：D.Linら、Genomics 18:643(1993))。
【００１３】
我々は、精巣ｍＲＮＡを鋳型として用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって患者１および２からＳｔＡＲｃＤＮＡを作製した。５’および３’非翻訳領域由来のＰＣＲプライマーを用いたとき、主要な生成物はＳｔＡＲｃＤＮＡであったが、多数の配列の相違を含む関連種が存在した。これは、下記実施例で報告するＳｔＡＲ偽遺伝子の発見をもたらした。その偽遺伝子と真正のＳｔＡＲとを区別させる５’非翻訳領域のＳ１と称する配列を用いて、我々は、正常コントロールおよび２人の患者の９７４ｂｐＳｔＡＲｃＤＮＡを増幅させた。これらのＲＴ−ＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩベクターを用いてサブクローニングした。それぞれ別個のＲＴ−ＰＣＲ反応から得た全患者クローンは、患者１のコドン１９３（Ａｒｇ）のＣからＴへの変化および患者２のコドン２５８（Ｇｌｎ）のＣからＴへの変化を除き、野性型配列と同一であった。これらは未成熟な終止コドンを生じ、それぞれＣ末端から９３または２８アミノ酸を欠く変異蛋白を生じる。
【００１４】
これら変異の同一性を確認するために、我々の患者のゲノムＤＮＡのＳｔＡＲ遺伝子を調べた。ＳｔＡＲ遺伝子の構造が不明であるので、この変異が収容されているエクソンを含むゲノムクローンを得るために先ずＰＣＲを用いた。これは、ｃＤＮＡ配列由来のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの種々の組み合わせを用い、正常なゲノムＤＮＡを増幅させることによって実施した。図４に示すように、プライマー対Ｓ２／ＡＳ２によって、４３７ｂｐと２９０ｂｐの２つの特異的な生成物が得られた。４３７ｂｐフラグメントの配列は、ｃＤＮＡとその両末端で完璧に適合し、中央に１４１ｂｐのイントロンを含み、したがってＳｔＡＲ遺伝子に由来するものである。２９０ｂｐフラグメントはＳｔＡＲ偽遺伝子に由来し、イントロンを欠いていた。続いて、Ｓ３と称されるイントロンプライマーをプライマーＡＳ１とともにＰＣＲに用い、２．１ｋｂの生成物が得られた（図４）。このフラグメントのマッピングおよびＤＮＡ配列決定（Sequencing）によって、このエクソンの配列はｃＤＮＡに完全に適合し、全てのイントロン／エクソン境界はＧＴ／ＡＧ法則に厳密に従うことが明らかとなった。したがってこの２．１ｋｂフラグメントはＳｔＡＲ遺伝子の３’半分に相当する。２．１ｋｂクローンから得られた配列情報によって、このエクソンのＰＣＲ増幅のためにイントロンプライマーを作製することが可能になった（図４）。
【００１５】
コドン１９３および２５８におけるナンセンス変異の存在は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ生成物を直接に配列決定することによって確認された。図５に示すように、患者１はコドン１９３にＣからＴへの変化を有し、一方、この患者の父親または母親はコドン１９３にＣおよびＴを有する（両親の２つの染色体の各々に１つ）。したがって、我々は、患者１はＡｒｇ１９３→Ｓｔｏｐ変異についてホモ接合型であり、その両親はともに、この変異のキャリアーであると結論した。同様に、患者２はＧｌｎ２５８→Ｓｔｏｐ変異についてホモ接合型である（図６）。期待したように患者２の母親はこの変異についてヘテロ接合型で、一方、正常な兄弟には変異はない。患者４もまた類脂質ＣＡＨを罹患している兄弟で、したがって患者２と同じ対立遺伝子についてホモ接合型である。さらに、患者３は患者２と同じ変異についてホモ接合型で（図６）、その母親もまたキャリアーである。患者２は人種として朝鮮系で患者３は日系であるので、この発見は、これら二人種群における本変異についての共通の起源を示唆する。
【００１６】
これらＳｔＡＲにおける成熟前終止コドンが機能的変化をもたらすということを証明するために、発現された野性型蛋白と変異蛋白のステロイド生成強化能力について調べた。リポフェクタミンを用いて、ステロイド非生成ＣＯＳ−Ｉサル腎細胞にｐＳＰＯＲＴ（ベクター）または正常ヒトＳｔＡＲ発現もしくは患者１および２（または３）由来変異ＳｔＡＲ発現ｐＳＰＯＲＴをトランスフェクト（核酸導入）した。この細胞に、ウシＰ４５０ｓｃｃとウシアドレノドキシン（ともにウォーターマン博士（Dr. Michael Waterman, Vanderbilt University)提供）を発現しているベクター、またはＦ２と呼ぶ融合蛋白（ヒトコレステロール側鎖切断系から成る：Ｈ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−アドレノドキシン還元酵素−アドレノドキシン−ＣＯＯＨ（J.A. Harikrishnaら、DNA Cell Biol. 12:371(1993))を発現しているｐＥＣＥベクターの何れかを同時にトランスフェクトした。基質は、細胞性および血清コレステロール（ｃｈｏｌ）または５μｇ／ｍｌの添加２０α−ヒドロキシコレステロール（２０α）のいずれかであった。４８時間インキュベートした後、培養液を採集し、免疫アッセーでプレグネノロンについて調べた。結果は表１に示す。コレステロール側鎖切断系とＳｔＡＲとの同時発現によって、コレステロールが基質として用いられたとき約８倍のプレグネノロン生成の強化がもたらされた。変異ＳｔＡＲ蛋白は両方とも活性を示さず、このことは、この２つのナンセンス変異の各々は類脂質ＣＡＨをもたらすことを示唆している。コレステロールと異なり、２０α−ヒドロキシコレステロールは容易にミトコンドリア内に拡散することができ、したがって、ミトコンドリアコレステロール輸送系を迂回する（M.E. Toaffら、Endocrinology, III 1785(1982))。基質として２０α−ヒドロキシコレステロールを用いたとき、正常ＳｔＡＲと変異ＳｔＡＲとの間でプレグネノロン生成には顕著な違いは存在しない。コレステロールと２０α−ヒドロキシコレステロールの利用におけるＳｔＡＲの影響の相違は、ＳｔＡＲはミトコンドリアへのコレステロールの輸送を仲介するということを強く示唆する。
【００１７】
【表１】

【００１８】
ＳｔＡＲは、２５残基のミトコンドリア指向配列（これはミトコンドリアへの輸送後Ｎ−末端から切断される）をもつ２８５アミノ酸蛋白として合成される。前駆体および成熟ＳｔＡＲは、それぞれ分および時間の範囲の半減期をもつ。免疫ブロットをデジタルビデオスキャンによって調べたところ(Clarkら、1994）、野性型プラスミドをトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞では約７０％のＳｔＡＲが成熟型であることが分かった。しかしながら、患者１由来の変異蛋白については成熟型は全く認められず、患者２については約１０％が処理を受けていた（データは示さず）が、このことは活性の欠如についての可能なメカニズムを示唆している。
【００１９】
我々はまたＳｔＡＲ遺伝子の異常なイントロン変異を確認したが、これはｍＲＮＡスプライシングでエラーを生じ、したがって類脂質ＣＡＨを引き起こす（M.K. Teeら、Hum. Mol. Genet. 4:2299-2305(1995c))。患者５の精巣組織から調製したＳｔＡＲｃＤＮＡの初期分析によって、これは正常組織から得られる９７４ｂｐより小さいことが示されたが、このことは患者のＳｔＡＲｍＲＮＡにおける重要な構造的変化を示唆する。クローン化ｃＤＮＡの配列決定によって、この患者のｃＤＮＡからエクソン５の全てが欠如していることが示唆された（図７〜９）。これは、エクソン５に対応する１８５ｂｐを欠くわずか７８９ｂｐのより短いｃＤＮＡを生じる。エクソン５の欠失は、おそらくエクソン５から直ぐ上流のイントロン４におけるｍＲＮＡスプライシングエラーが存在することを示唆した。したがって、プライマーＳ３（これはイントロン４に存在する）およびＡＳ２（これはエクソン５に存在する）を患者のゲノムＤＮＡＰＣＲ増幅のために用いた。このＤＮＡをサブクローニングし、プライマーＳ３（これはイントロン４に存在する）を用いて配列決定を行った。イントロン４とエクソン５との接合部から１１ｂｐのイントロン４内にただ１つのヌクレオチド変化（Ｔ→Ａ変異）が認められた（図７〜９）。
【００２０】
このＴ→Ａ変異(transversion)はＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ→ＣＣＡＡＧＧ）を破壊し、この塩基変化のメンデルの分離を確認することができた。増幅ゲノムＤＮＡのＮｃｏＩ制限消化の分析によって、患者５はＴ→Ａ変異についてホモ接合型であることが確認された（図１）。Ｔ→Ａ変異をもつトランスフェクト細胞から得られたＲＮＡおよび患者５の精巣ＲＮＡで実施したＲＮアーゼ保護アッセーによって、Ｔ→Ａ変異は異常なｍＲＮＡスプライシングの幾つかの型をもたらすことが確認された（実施例９）。
【００２１】
このコードされた短縮（truncated)蛋白が活性であるか否かを決定するために、短縮ＳｔＡＲｃＤＮＡを発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１でクローニングし、これをステロイド非生成ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトするために用いた。このＣＯＳ−１細胞をヒトＰ４５０ｓｃｃ系の融合蛋白（Ｆ２と呼ぶ）を発現するベクターで同時トランスフェクトした。コードされるＦ２蛋白は、Ｈ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−アドレノドキシン還元酵素−アドレノドキシン−ＣＯＯＨで、３つの成分の分子比における変動に起因するＰ４５０ｓｃｃ活性の変動の可能性を排除する完全に活性な酵素である(Harikrishnaら）。Ｆ２および正常ＳｔＡＲをトランスフェクトした細胞は、コレステロールからプレグネノロンへの効率的な変換を支援したが、短縮ＳｔＡＲを発現するベクターとＦ２との同時トランスフェクションは、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクターだけをトランスフェクトしたコントロール細胞で認められた以上のコレステロールからプレグネノロンへの変換を生じなかった（表２）。トランスフェクト化細胞のＲＮＡのノザンブロットによって、正常ＳｔＡＲおよび変異ＳｔＡＲを発現しているベクターは、予想したサイズのＳｔＡＲｍＲＮＡを同等量発現することが示されたが、このことはこのｍＲＮＡは安定であることを示唆している。しかしながら、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１により発現される正常ＳｔＡＲ蛋白を検出するマウスＳｔＡＲに対する抗血清（ストッコ博士（Dr. D. Stocco, Texas Tech U.）ご提供）によるウェスタンブロットでは、変異体によってコードされた何れの短縮ＳｔＡＲも検出されなかった。したがって、短縮ｍＲＮＡは安定で機能的な蛋白をコードしない。
【００２２】
【表２】

【００２３】
４人の罹患患者（患者１、２、３および４）で２つのナンセンス変異および５番目の患者(Teeら）でスプライシングエラーを見出し、さらにＳｔＡＲ変異は類脂質ＣＡＨを引き起こす可能性があることを明らかにしたので、様々な人種群から新たに１４人の患者のＳｔＡＲ遺伝子を調べ、類脂質ＣＡＨ表現型をもつ全ての患者がＳｔＡＲ変異をもつか否かを決定した。
【００２４】
類脂質ＣＡＨをもつ１４人の患者からゲノムＤＮＡを得た（表３）。エクソン１−４をそれぞれ個々にＰＣＲ増幅させ、自動配列決定に付した結果、患者７の１つの対立遺伝子上にただ１つの変異（ヌクレオチドの挿入とフレームシフト）が明らかになった。エクソン５−７をただ１つの２．１ｋｂフラグメントとして増幅させ、これをクローニングしてその全体（イントロンを含む）を全患者について手動で配列決定した。認定した変異は、罹患患者並びに可能な限り両親および兄弟の個々のＰＣＲ増幅エクソンの直接配列決定によって確認された。これら変異の多くはまた、ＰＣＲ増幅ＤＮＡのＲＦＬＰ分析によって確認することができた（表４）。これら１４人の患者および先に報告した５人の患者に関する発見を表３に要約した。患者１１および１２並びに患者２および４は兄弟であり、患者９は既知の血縁結婚に基づき、したがってこれら１９人の患者は３３個の別個の対立遺伝子を表す。
【００２５】
【表３】

【００２６】
【表４】

【００２７】
Ｑ２５８Ｘは日本では殆どの類脂質ＣＡＨの原因である。Ｑ２５８Ｘ変異は患者２、３および４でホモ接合体（すなわち４つの独自の対立遺伝子のうち４つ）で、日本人の６つの対立遺伝子（患者６−８）のうち４つに存在し、日本人／朝鮮人の１０個の障害対立遺伝子の８つの全てについてである。日本人の患者で見出されたその他の変異は他の患者では認められず、新規な変異を表しているかもしれない。一方、Ｑ２５８Ｘ変異は創始者効果（founder effect）を示しているように思える。したがって、この変異は、日本でのこの障害対立遺伝子が優勢であることの説明となり、この場合類脂質ＣＡＨは共通である（Hauffaら; Fukamiら、Clin. Pediatr. Endocrinol. 4:39-46(1995); Matsuoら、Horm. Res. 41(付録):106(1994))。Ｑ２５８変異は、プライマーＳ４およびＡＳ４によるゲノムＤＮＡの増幅(Linら、Science 267:1828-1831(1995))と、それに続くＥｃｏＲＩＩによる消化によって容易に識別できる。なぜなら原因となるＣ→Ｔ変異（下線部）はＥｃｏＲＩＩ部位（ＣＣＡＧＧ）を破壊するからである（表４）。
【００２８】
Ｒ１８２Ｌはパレスチナ系アラブ人で一般的な変異である。類脂質ＣＡＨは、２集団（日本人およびドイツ系スイス人（Hauffaら))でより普遍的に不均衡に発生するとして以前に記載されたが、この疾患はアラブ人では報告がなかった。しかしながら、われわれの患者のうち６人がパレスチナ系アラブ人起源であった。患者１０および１１は兄弟で、患者９は既知の血縁結婚の結果であった。その結果、これら６人の患者は、９つの独自の対立遺伝子を示した。これら９つの対立遺伝子の７つ（７８％）は、変異Ｒ１８２Ｌを含んでいた。これらの患者の出身地はヨルダン、イスラエル、クェートおよびデンマークであり、したがって関連はないようである。イントロン多形現象とＳｔＡＲ遺伝子内の他の変異との識別により、７つの障害対立遺伝子が完全には同一ではないことが明らかになった。兄弟の患者１０および１１、または患者１２では他の変異は認められなかった。Ｒ１８２Ｌについてヘテロ接合体である患者１３はまた、ΔＣ６５０のフレームシフト変異についてもホモ接合体であった。患者１４は、フレームシフト変異ΔＴ５９３およびＲ１８２Ｌについて二重にホモ接合体であった。したがって、Ｒ１８２Ｌ変異は種々の配列で見出され、アラブパレスチナ人集団と密接に関係していた。Ｒ１８２Ｌ変異は、プライマーＥｘ５ＳおよびＥｘ５ＡＳによるゲノムＤＮＡの増幅とそれに続くＴｓｐ４５Ｉによる消化によって容易に認識される（表３）。
【００２９】
ＳｔＡＲ変異はエクソン５−７に集中する。我々は、日本人でもアラブ人でもない別の５人の患者を調べた。患者１５（土着のアメリカ人であるメキシコ人）は、Ｒ２７２を欠く３ｂｐ欠失についてホモ接合体であるが、その他の点ではＳｔＡＲ蛋白は無傷であった。患者１６（ギリシャ人）はフレームシフト変異についてホモ接合体であった。患者１７（イギリス出身の白人）はエクソン５で始まる外来ＤＮＡセグメントの挿入についてホモ接合体であった。これら３事例でＳｔＡＲ遺伝子はそれぞれの変異についてホモ接合体であったが、これら家族から家系について情報を得ることはできなかった。患者１８（カナダ出身の白人）は、Ｌ２７５ＰおよびＡ２１８Ｖについて合成ヘテロ接合体であった。表２で調査した３３の対立遺伝子において合計１４の変異を見出したが、それらのうち１つを除く全てがエクソン５、６または７に障害を与えていた。
【００３０】
これら認定した変異が患者の類脂質ＣＡＨを引き起こしていることを証明するために、実施例３で述べるように種々のＳｔＡＲ変異をトランスフェクトしたステロイド非生成ＣＯＳ−１細胞の条件付け培養液によるコレステロールのプレグネノロン変換を分析した。
【００３１】
ＳｔＡＲ機能はＳｔＡＲプロセッシングとは関係がない。ＳｔＡＲ蛋白の活性型はミトコンドリア内の切断型よりむしろ前駆体分子であり、ＳｔＡＲ前駆体は、それがミトコンドリアに入るときに外膜と内膜との間に接触部位を形成することによってステロイド生成を刺激するように機能すると提唱された(Clarkら、J. Biol. Chem. 269:28314-28322(1994); Stoccoら、^Cellular and Molecular R ulation of Testicular Cells”（精巣細胞の細胞調節と分子調節）、C. Desjardins編、Springer-Verlag,ニューヨーク(1996)）。しかしながら、日本人の共通の変異Ｑ２５８Ｘで認められるようなＳｔＡＲのカルボキシ末端の僅か２８アミノ酸の欠失が全ての活性を欠失させ(Linら、1995）、さらに表４の結果は、Ｒ２７２の欠失または、１６９位、１８２位、２１８位および２７５位のアミノ酸の置換は全ての活性を除去することを示す。患者７のエクソン２のフレームシフトの例外を除き、我々が発見した変異の全てはエクソン５−７に存在する。したがってエクソン１−４のいずれも偶発的変異の傾向が少なく、またこの領域のミスセンス変異は非表現型である。我々は後者の説明を好む。
【００３２】
ヒトＳｔＡＲ遺伝子の転写領域の変異は、ＳｔＡＲ蛋白の変化またはその産生制御の変化をもたらす場合は類脂質ＣＡＨを引き起こすであろう。類脂質ＣＡＨの分子的基礎が確立されるまで、この疾患は症候群、場合によってただ１つの共通の表現型をもつ異なる遺伝的疾患群と考えられねばならなかった。種々の人種的および遺伝的背景から得た類脂質ＣＡＨの患者のＳｔＡＲ蛋白に対する遺伝子の変異が明らかになったことによって、この遺伝子の変異は、類脂質ＣＡＨの患者の全てではないとしても圧倒的多数にとって原因となることが初めて明らかになった。１人のＣＡＨ患者（患者１９）でＳｔＡＲ変異の検出ができなかったということは、突然変異、プロモーター変異、未調査上流スプライシング変異、反復配列決定エラーの検出における技術的な問題のためかもしれない。また、患者１９は、区別できない表現型を生じるまた別の遺伝子の変異を有するかもしれない。障害された胎児の胎盤はＣＡＨにおいて正常にステロイドを産生するという実験(Saengerら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:200-205(1995)）、および妊娠期間中胎児はプロジェステロンを要求するということによって、類脂質ＣＡＨについて以前に考慮された因子の何れも（Ｐ４５０ｓｃｃ、Ａｄｘ、ＡｄＲｅｄ、ＳＡＰエンドゼピン、ＰＢＲ）、患者１９の疾患の原因とは考えがたい。
【００３３】
類脂質ＣＡＨの遺伝型性別は最も普遍的なものは男性で、これは、遺伝的性別は等しい頻度で影響を受けるとした初期の研究（しかしながら、この時は遺伝的性別は生殖腺の外観および組織学の記述から、または口腔塗抹標本からしばしば推論された（Hauffaら）とは一致しない。表２は、我々の系では１９人の患者のわずか３人（１５．８％）が４６，ＸＸで、さらに日本の初期の報告（Matsuoら、1994))では６３人の確定された核型をもつ類脂質ＡＣＨ患者のうち僅か１６人（２５．４％）が４６，ＸＸであることが分かった。このことは、障害された４６，ＸＸの胎児の大半が妊娠初期に失われるか、または障害された２３Ｘの精子が卵子を受精させる可能性が少ないか、または障害された２３Ｙ精子よりも低い頻度で障害２３Ｘ精子が産生されるかのいずれかであることを示唆している。幾つかの予備的実験によれば、ステロイド生成は精原細胞で生じることが示唆され受精前に性別の偏りは生じるという仮説を支持できる。しかしながら、未知の性状に関する把握の偏りも現時点では除外できない。
【００３４】
類脂質ＣＡＨは、不完全なステロイド生成酵素によって惹起されないステロイドホルモン合成に関する唯一の先天性疾患である。類脂質ＣＡＨの変異ＳｔＡＲの確認によって、この激烈な疾患の出生前分子診断が初めて可能になった。非機能的ＳｔＡＲによる類脂質ＡＣＨはＳｔＡＲ遺伝子ノックアウト効果に匹敵し、ＳｔＡＲは副腎および性腺ステロイド生成に必須であることを示している。したがって、ＳｔＡＲは、Ｐ４５０ｓｃｃへのコレステロールのアクセスのために不可欠の役割を果たす確認された最初の蛋白である。正常な胎盤のステロイド生成の存在並びに、胎盤（われわれが発見したように）および他のステロイド生成組織（例えば脳（P. Robel & E.E. Baulieu, Trends Endocrinol. Metabo. 5:1(1994); S.H. Mellon, J. Clin. Endocrinol. Metab. 78:1003(1994))におけるＳｔＡＲ発現が存在しないことの結果として類脂質ＡＣＨをもつ胎児が無事であることは、これらの組織においてはミトコンドリアへのコレステロール輸送を促進する異なるメカニズムが存在することを示唆する。類脂質ＡＣＨにおけるＳｔＡＲのこの重要な役割をこのように明瞭にすることによって、ＳｔＡＲは、ステロイドホルモン合成の急性トロピック調節を仲介する長い間捜し求めてきた分子であるという仮説の最初の遺伝的証拠が提供される（D.M. Stocco & T.C. Sodeman, J. Biol. Chem. 266:19739(1991); L.F. Epstein & N.R. Orme-Johnson, J. Biol. Chem. 266:19739(1991); D.M. Stocco & M. Ascoli, Endocrinolgy 132:959(1993))。
【００３５】
しかし、ＳｔＡＲの作用はステロイド生成に特異的ではなく、さらにＳｔＡＲはミトコンドリアの２７−ヒドロキシラーゼ活性を刺激することができる。ミトコンドリアコレステロール２７−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４５０ｃ２７）は２７−ヒドロキシコレステロールおよびＣ２７酸、３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸の形成を触媒する（Andersonら、J. Biol. Chem. 264:8222-8229(1989); Suら、DNA Cell Bio. 9:657-665(1990))。Ｐ４５０ｃ２７およびアドレノドキシンを同時にトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞でのＳｔＡＲの発現は、実施例１０に示すように３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸(3βhydroxy-5-cholestenoicacid）の生成を６倍以上増加させた（３群対４群の比較についてｐ＜０.００５)。Ｐ４５０ｃ２７によるコレステロール代謝のこのＳｔＡＲ仲介増加は、コレステロール側鎖切断のＳｔＡＲ刺激について我々が観察したものと同じ次数規模であった（Sugawaraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4778-4782(1995))。これらの観察は、ＳｔＡＲは、ステロイド生成チトクロームＰ４５０ｓｃｃ以外の酵素によってミトコンドリアコレステロール代謝を強化することができることを明示している。
【００３６】
Ｐ４５０ｃ２７は、ＳｔＡＲを発現する卵巣を含む多数の組織で認められる（Andersonら；Suら）。したがって、ＳｔＡＲはステロイド生成細胞でコレステロールの２７−ヒドロキシコレステロールおよびＣ２７酸への代謝に寄与できるであろう。そのようにして形成されたヒドロキシステロールは細胞性コレステロールの恒常性を管理する役割を持つことができるであろう(Rennertら、Endocrinology 127:738-746(1990))。Ｐ４５０ｃ２７は肝臓で強く発現されるが、それは肝で胆汁酸合成における役割を果たす。ＳｔＡＲ遺伝子は肝では発現されない（Sugawaraら、PNAS(1995)）ので、他の因子または過程が肝性２７−ヒドロキシラーゼへのコレステロールアクセスを管理する必要がある。ＳｔＡＲ遺伝子は肝に導入され、２７−ヒドロキシラーゼ経路を介して胆汁酸生成を強化し、したがってコレステロールの廃棄を促進できる。
【００３７】
コード領域の外で生じる変異もまた、例えば患者５で観察されたように類脂質ＣＡＨを惹起することができるので、我々はさらにゲノムＤＮＡおよびＳｔＡＲ遺伝子のプロモーター領域について調べた。患者１９では、類脂質ＣＡＨは転写に干渉するプロモーター内の変異によって生じる可能性がある。５’および３’非翻訳領域内に生じる変異は、同様に、例えばｍＲＮＡの安定性を変えることによって、または翻訳開始に影響を及ぼすことによって転写または翻訳に干渉することがあるかもしれない。
【００３８】
ＳｔＡＲ遺伝子配列は７つのエクソンと、全てＧＴ／ＡＧ法則に従う（Mount, 1982)エクソン−イントロン接合部を含む。
【００３９】
【表５】

【００４０】
本出願がその一部継続出願となっている米国特許出願第０８／４１０５４０号に開示した最初のゲノムクローンについて我々は詳細な配列分析を実施した。親出願で開示したとおりコード領域およびイントロン４の配列は正確であったが、さらに本発明のＤＮＡ分子の性状を調べたところ、配列決定の誤りが認められ、コード領域の配列５’を訂正した。
【００４１】
【表６】

【表７】

【表８】

【００４２】
ＳｔＡＲ遺伝子の主要な転写開始部位（ＲＮアーゼ保護分析によって決定し、さらにプライマー伸長分析（primer extension analysis)によって確認した）は、
翻訳開始部位の前方１５４ｂｐに位置する（図１１）。主要転写開始部位から上流のＤＮＡ配列は、ＴＡＴＡ様成分（ＴＴＴＡＡ）を−２４から−２０ｂｐに含む。幾つかの推定Ｓｐ１接合部位がまたプロモーター内に配列ＡＴＴＴおよび（Ｔ)ｎＣＴの繰り返しと同様に存在する。一続きのトリヌクレオチドの繰り返しは転写された５’非翻訳領域に認められた。我々は反対鎖（ＴＧＡＣＣＴＴＧＡ）上に１つのコンセンサス配列の位置を決定した。みなしご核因子、ステロイド生成因子−１（ＳＦ−１、ＡｄＢＰ４とも称される）がこの配列を認識することができるが、これはまた多数のステロイド生成酵素遺伝子の発現に必須のようである(Hondaら、J. Biochem. (Tokyo)112:573-575(1990); Riceら、Mol. Endocrinol. 5: 1552-1561(1991) ）。
【００４３】
この転写開始部位から上流１．３ｋｂのＤＮＡは、マウスＹ−１副腎皮質腫瘍細胞にトランスフェクトされたときルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導した（実施例１１）が、反対の向きで挿入された同じフラグメントはプロモーターのないコントロールプラスミドと同じ程度のルシフェラーゼ発現を誘導しただけであった。
【００４４】
ＳｔＡＲｃＤＮＡの配列と認定した偽遺伝子の配列を比較するために、この偽遺伝子の性状をさらに調べた。その配列を表７−１乃至７−３に示す。親出願に開示したこの偽遺伝子配列は少数の配列決定の誤りを含んでいたが、表７−１乃至７−３に示す配列では訂正されている。
【００４５】
【表９】

【表１０】

【表１１】

【００４６】
したがって、本発明は、以下の（１）−（５）を含む単離ＤＮＡ分子を提供する：（１）図１、表６−１乃至６−３または表７−１乃至７−３で説明したｈＳｔＡＲｃＤＮＡ、ｈＳｔＡＲゲノムＤＮＡ、ｈＳｔＡＲプロモーターまたはｈＳｔＡＲ偽遺伝子から成る第一の配列；（２）第一の配列のサブ配列である少なくとも長さが１０ヌクレオチドの第二の配列；（３）第一または第二の配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換されている第三の配列；（４）当該第一または第二の配列で少なくとも１つのヌクレオチドが欠失もしくは挿入されている第四の配列；または（５）第一、第二または第三の配列のいずれかに対して相補的な配列であって、（１）当該分子は、当該配列（１）−（５）のいずれかにおいてＴがＵに置き換えられているＲＮＡ分子であってもよく、（２）該第三の配列は第一または第二の配列と少なくとも９５％同一であり、（３）該第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡに存在せず、さらに（４）当該第四の配列が２０個より多い挿入ヌクレオチドおよび２００個より多い欠失ヌクレオチドを含まないということを条件とする。これらの配列の何れもヒトのＳｔＡＲ遺伝子の変異の有無の認定に用いることができ、したがって個々人（例えば先天性類脂質副腎過形成の家族歴をもつ人々）の遺伝カウンセリングに用いることができる（ただし一般集団のスクリーニングも同様に可能である）。特に、本発明は既に確認された特定の変異の認定の使用に限定されないことは注記されるべきであろう。本明細書で識別される正常遺伝子配列から外れたＳｔＡＲ遺伝子のいずれの変異も、潜在的に致死的な遺伝的欠陥を示唆するものである。たとえ、変異位置に異なるアミノ酸をコードしないいわゆる “非発現性（サイレント）”変異も潜在的な疾患変異である。なぜならば、そのような変異は、当該遺伝子に、または当該遺伝子からその翻訳または転写に干渉する翻訳されない遺伝信号を導入または除去する能力を有するからである。本明細書で明らかにされた遺伝子配列を基にした効用の１つは、類脂質ＣＡＨ歴をもつ家族の遺伝カウンセリングにあるので、ＳｔＡＲ遺伝子に何らかの変異が存在する場合は類脂質ＣＡＨの伝搬の可能性に関して患者に助言を与えることができる。問題の変異をもつ子孫が類脂質ＣＡＨの徴候を示してもまたは示さなくとも、当該疾患の潜在的な存在に対して患者の適切なケアとモニタリングを選択できる。正常な遺伝子との違いがなければ、そのような新たなケアおよび／またはモニタリングも（同時に発生する費用とともに）除外できるであろう。新たな情報（もし何らかの情報が有る場合には）が入手できるので（例えばある非発現性変異または保存的置換変異が類脂質ＣＡＨを生じるか、または生じないかという情報）、特定の変異について与えられる助言は変化しうるであろう。しかしながら、提供される助言における変化が、類脂質ＣＡＨの十分な原因であることを本発明が初めて示したＳｔＡＲ遺伝子における変異の有無についての最初の決定を変えることはない。
【００４７】
完全な長さのＳｔＡＲｃＤＮＡ配列を含む分子は、サブ配列の素として（下記で考察）またはＳｔＡＲ分子自体の調製の出発材料として有用である。 “サブ配列”は、表示した完全な長さの配列の１つから得られる連続ヌクレオチド群である。そのようなサブ配列は、出発ヌクレオチドから化学合成によって（例えば自動遺伝子合成装置で）、または完全な長さの配列の生化学的操作によって調製することができる。後者の生化学的操作では、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いフラグメントを調製し、場合によって（１）エキソヌクレアーゼによる末端ヌクレオチド切断、および／または（２）所望の配列を選別するためにサイズ仕分けおよび／または親和性補足が続く。用いられる条件下で固有であるために十分な長さのＳｔＡＲｃＤＮＡ配列の何れのサブ配列も、あるＳｔＡＲ遺伝子変異（例えば本明細書に記載されたような変異）の有無を確認する方法の一部分として、ゲノムのＳｔＡＲ遺伝子の全部または一部分のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅で用いられる２つのプライマーのうちの１つとして有用である。第二のプライマーは、増幅されるべき変異または他の配列がこの２つのプライマーの間に配置されるように反対鎖の配列から簡単に選択することができる。別の好ましいサブ配列は本明細書で述べる正常な配列からの変異を含む配列で、そのような配列は、特定の変異体の存在を検出するために対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション技術で用いることができる。好ましいサブ配列はまた、正常なＳｔＡＲ遺伝子と偽遺伝子とを識別することができるもの（すなわち表６−１乃至６−３の正常ＳｔＡＲ遺伝子ＤＮＡまたは表７−１乃至７−３のＳｔＡＲ偽遺伝子ＤＮＡの両方には見出されないもの、または図７〜９に示したまた別のスプライス領域に広がるもの）を含む。
【００４８】
所望の標的配列との固有のハイブリダイゼーションに必要なサブ配列の長さは、用いられる特定の方法によって変動するが、遺伝的材料について日常的確認を実施している通常の技術を有する者の範囲内にある。典型的なプライマーは、長さが少なくとも１０、好ましくは少なくとも１４より好ましくは少なくとも１７、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドで、典型的には長さが２００未満、好ましくは１００未満、より好ましくは７０未満、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満である。最も好ましいサブ配列は、表６−１乃至６−３および表７−１乃至７−３に述べるヒトＳｔＡＲ配列の少なくとも１つに見出されるが、マウスＳｔＡＲＤＮＡには認められない。
【００４９】
ＳｔＡＲ遺伝子の配列およびサブ配列と同一のものを含むそのような分子に加え、変異配列を含む分子もまた、変異について特定のプローブとして用いることができるので有用である。例えば、アミノ酸をコードするコドンの終止コドン（すなわちナンセンス変異）へのいくつかの変異は以下の実施例および本明細書の他の場所で明らかにされるが、例えば、Ａｒｇ１９３→ＳｔｏｐおよびＧｌｎ２５８→Ｓｔｏｐ変異である。（本明細書では “コドン”は、文脈から明示されない限り遺伝子のリーディングフレーム（読み枠）における核酸の３つ組みを指す。）したがって、好ましい種類の変異配列分子は、コード配列の３’末端以外の場所でコドンを終止コドンに変化させ、その結果、短縮された非機能的ＳｔＡＲポリペプチド分子がコードされるヌクレオチド置換（１つ以上の置換）を含むものである。変異コドンは、正常なコード配列の３’末端から好ましくは少なくとも５、より好ましくは１０、さらに好ましくは２０、さらに好ましくは３０コドン離れていて、その結果標的内に十分な欠失が生じ、機能のない生成物が得られる。別の好ましい種類の変異配列分子は、少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド、より好ましくは１００ヌクレオチドを越え、最も好ましくは１８５ヌクレオチドまでの欠失を含むが、しかし２００ヌクレオチドを越えない欠失を含む。別の好ましい種類の変異配列分子は、２０ヌクレオチド未満、より好ましくは５ヌクレオチド未満、最も好ましくは１ヌクレオチドの挿入を含む。他の好ましい種類の変異配列分子は、非機能的ＳｔＡＲ分子を生じることが分かっているもの、例えば非保存アミノ酸置換を生じるもの、および該遺伝子に存在する翻訳もしくは転写信号配列を変更するもの、または不適切な翻訳もしくは転写信号配列を導入するものである。
【００５０】
直ぐ上の考察は、ゲノムＤＮＡのセンス鎖の配列またはサブ配列についてであることは理解されよう。そのような配列は、それらの相補的性質の結果としてゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖の存在を検出するために用いることができる。しかしながら、上記で考察した配列の何れかと相補的な配列を用いることもまた可能である。なぜならば、それらはセンス鎖と相補的で、それらを検出することができるからである。
【００５１】
本発明の分子は、マウスのゲノムＳｔＡＲ遺伝子配列と異なる配列を（ＳｔＡＲ遺伝子産物のための開始コドンから終止コドンまでの領域内に）含み、さらにヒトＳｔＡＲｃＤＮＡまたはゲノム配列と少なくとも９５％同一である。９５％同一とは、問題の配列が、ヌクレオチドの各挿入、欠失または置換をただ１つの違いとして数えたとき、比較しようとしている配列と５％未満の異なるヌクレオチドを含むことを意味する。長さが２０ヌクレオチド未満の配列は、それが９５％より高い同一の場合には標準配列と同一でなければならないことは明白であろう。
【００５２】
同一性および相対的同一性は、以下の例を参照することによって容易に理解できよう。例えば、仮想配列、
abcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcd
（これは長さが４０ “ヌクレオチド”）がそれに対して測定を実施しようとしている基準であると考えると、以下の仮想ヌクレオチド配列の各々は該基準配列に対して９５％同一である（すなわち各々は、標準４０ヌクレオチド配列と単一ヌクレオチド２個の違いを有する）。
【００５３】
abcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdab
〔３’末端に２つの欠失〕
abcabcdabcdabcdabcabcdabcdabcdabcdabcd
〔２つのランダム位の欠失〕
ababcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcd
〔５’末端に２つの挿入〕
abcdabcdabcdabdabcdabcdabcdabcdaabcdabcd
〔１つのランダム挿入および１つのランダム欠失〕
abcdabcdbbcdabcdabcdabcdabcdabcdbbcdabcd
〔２つの “a”ヌクレオチドの “b”ヌクレオチドによる置換]
abcdabcbabcdabcdabcdabcdabcadabcdabcdabcd
〔１つの置換および１つの挿入〕
特に本発明の分子に関して同様な多くの例（それらはしばしばこの例よりサイズが大きい）が提供できることは明白であろう。しかしながら、これらの例は当業者に本明細書で用いる “％相違”の意味を教示するためには十分であろう。また、相違を計算する前に比較されるべき配列は最大の同一性を与えるために並べられることは容易に理解されよう。コンピュータープログラム（例えば文献に記載されたＦＡＳＴＡプログラム（W.R. Pearson & D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448(1988)を用いることができるが、一方、必要とされる高い相同性は目で見た配列比較によって最大限の相同性を得る並べ方を容易に見出すことができることを示している。好ましい具体例では、並べ方決定プログラムでは、２００塩基対までのギャップの幅が許される。
【００５４】
ＳｔＡＲ遺伝子に由来するかまたは関連すると上記で示唆された特定の配列は、ポリヌクレオチドの配列全体であってもよく、またより大きな配列の一部分でもよい。例えば、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセーがよく知られているが、これは、異なる分子（例えば標的ゲノム配列または固形支持体に対して固定装置として作用する第二のポリヌクレオチドに存在する配列）とともにハイブリダイズするサブ配列を含む長いポリヌクレオチド配列を利用する。例えば、米国特許第５２８８６０９号および５１２４２４６号を参照されたい。
【００５５】
本明細書で説明する配列によって性状を明らかにされるポリヌクレオチドを指すために用いられる場合、 “単離（された）”という言葉は、通常はＳｔＡＲ遺伝子に付随しているゲノムＤＮＡの少なくとも一部分から分離されたことを意味し、好ましくはポリヌクレオチド以外の全てのヒト細胞性物質から分離されたことを意味する。ＳｔＡＲ遺伝子を包含するゲノムＤＮＡの未確認セグメントを含有するベクターを含んでいた可能性がある遺伝子ライブラリーは、ＳｔＡＲ遺伝子が存在することが分かっていないので、さらに／または他のヒトＤＮＡを含むベクターから分離されていないので “単離”されていない。殆どの場合、本発明の単離分子は、５０ｋｂ未満、好ましくは３０ｋｂ未満、より好ましくは２０ｋｂ未満の長さを有するであろう。最低限の長さは上記で考察した。
【００５６】
一般には、本発明の組成物は、人間に先天性類脂質副腎過形成を惹起し、もしくは惹起する可能性がある、または人間の子孫に先天性類脂質副腎過形成を伝達し、もしくは伝達する可能性がある遺伝的欠陥の存在を検出する方法で使用されるが、この場合、当該組成物はヒトのＳｔＡＲ遺伝子の変異を識別するために用いられる。先ず初めに、遺伝カウンセラーらは、今や正常であることが確認され、さらに疾患と関連がないと分かったＳｔＡＲ遺伝子との違いを簡単に調べるであろう。なぜならば、この正常な配列からの逸脱であるものはいずれも疾患を惹起する潜在性を有するからである。異なる（しかし未だ確認はされていない）遺伝子が先天性類脂質副腎過形成の家族歴をもつ者に見出された場合は特に、ＳｔＡＲ遺伝子は遺伝カウンセリングのために必要にして十分な基準である。特定の遺伝子（またはそれが存在しないこと）が、先天性類脂質副腎過形成について正の関係を持つことが確認されたので、いくつかの事例において遺伝カウンセラーは、ＳｔＡＲ遺伝子の蛋白産物の配列を変化させる、または転写もしくは翻訳されないＳｔＡＲ遺伝子を生じるＳｔＡＲ遺伝子の１つまたは２つ以上の特定の変異を確認することに焦点を合わせるであろう。しかしながら、患者のＳｔＡＲ遺伝子の何らかの変異の有無を単純に確認することは遺伝分析およびカウンセリングの重要な部分であり続けるであろう。
【００５７】
Ｑ２５８ＸおよびＲ１８２Ｌは、日本人およびパレスチナ人の障害対立遺伝子のそれぞれ７０−８０％の原因であり、有効な遺伝的スクリーニングの機会を提供する。したがって、我々はこれらの変異および他の変異の診断を促進させるためにＰＣＲに準じた方法を考案した（図12〜13）。各々の場合において、ＤＮＡを疑わしい変異を包含する一対のプライマーで増幅し、続いて変異によってその認識配列が作出されるかまたは破壊される制限酵素でこのＰＣＲ生成物を切断する。表４は、Ｑ２５８ＸおよびＲ１８２Ｌ変異の他、同様に診断が可能な他の６つの変異について、そのオリゴヌクレオチド対、制限エンドヌクレアーゼおよび切断パターンを示す。全てのオリゴヌクレオチドの配列は表８に示す。
【００５８】
【表１２】

【００５９】
ＳｔＡＲ遺伝子またはＳｔＡＲ遺伝子変異体を確認するために用いられる実際の技術自体は本発明の部分ではない。遺伝子変異を識別するために用いられる多くの技術の何れも（現時点で既知であるか後に開発されるかにかかわらず）用いることができる。例えば特異的なプローブによるハイブリダイゼーションで、これは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（増幅しないか、または検出された領域の例えばＰＣＲによる増幅の後のいずれか）、制限フラグメント長多形現象（ＲＦＬＰ）分析（ristriction fragment length polymorphism analysis)、またはランダム増幅多形性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析(random amplified polymorphic DNA analysis）を含む。他の分析技術には、酵素不適合スキャンニングおよび転写／翻訳分析が含まれる。これらの技術は全て多くの特許および他の出版物に記載されている。例えば以下を参照されたい。ＲＦＬＰ:D. Botstein ら、American Journal of Human Genetics32:314-321(1980)、ＲＡＰＤ:J.G.K. Williamsら、Nucleic Acids Research 18:6531-6535(1990） 特に有利な結果を達成するために、検査する患者によって異なる識別技術を選択することができる。例えば、特定のＳｔＡＲ遺伝子変異と関係があることが分かっている特定の人種または民族群には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションが好ましい技術である。大型で混在型集団のスクリーニングのためには、一本鎖形態多形現象が好ましい。各個人については、遺伝子および／またはｃＤＮＡの全体的な配列決定および基準配列との比較（例えば本明細書に示されたようなもの）が好ましい。
【００６０】
多くの確認技術でホストのゲノムＤＮＡ（またはメッセンジャーＲＮＡ）の何らかの増幅が、より高い感度を分析に付与するために実施されるであろう。そのような場合には、ＳｔＡＲ遺伝子全体を増幅する必要はなく、単に検出される該遺伝子の一部分または該遺伝子内の特定の場所が増幅される。したがって、本発明の方法は一般に、診断医によって実施される特定の分析のために選択されたセグメントともにＳｔＡＲ遺伝子の少なくともセグメントの増幅（例えばＰＣＲによる）を含む。
【００６１】
類脂質ＣＡＨは常染色体の劣性遺伝疾患であるので、いくつかの場合には本発明の方法は、正常なＳｔＡＲ遺伝子もしくは変異ＳｔＡＲ遺伝子に対してホモ接合体として、または正常ＳｔＡＲ遺伝子もしくは変異ＳｔＡＲ遺伝子に対してヘテロ接合体として患者を分類するであろう。なぜならばこのような情報は遺伝カウンセリングのために有益な情報だからである。
【００６２】
診断が行われる患者は、遺伝カウンセリングの通常の事例のように成人または新生児であってもよいが、出生前診断も胎児で実施できる。成人または新生児の遺伝分析のためには、通常は血液サンプルが用いられる（例えば濾紙上の乾燥血のスクリーニング）が、一方、出生前診断用サンプルは通常は羊水穿刺または絨毛膜絨毛生検によって得られる。
【００６３】
ヒトの完全な長さのＳｔＡＲ遺伝子は、機能をもつＳｔＡＲ蛋白を生じるより短い遺伝子と同じように患者の先天性類脂質副腎過形成を修正するために用いることができるが、これは、遺伝子治療によるかまたはＳｔＡＲ蛋白のインビトロ生成とそれに続く該蛋白の投与により患者にヒトＳｔＡＲ遺伝子の遺伝子産物の有効量を供給することによって実施される。類脂質ＣＡＨは劣性であるので、したがってＳｔＡＲの補充的供給によって治療でき、そのような治療は容易に利用できる。同様に、高コレステロール血症の治療および予防は、遺伝子治療またはインビトロ生成ＳｔＡＲ蛋白の投与のいずれかによって、ヒトのＳｔＡＲ遺伝子の遺伝子産物の有効量を患者の肝臓に供給することによって達成できる。
【００６４】
遺伝物質または遺伝子産物を投与する種々の技術は周知であり、それ自体は本発明の部分を構成しないことは理解されるところであろう。本発明は単に、本発明の遺伝材料または蛋白を、先に投与されている遺伝材料または蛋白の代わりに供給することを含む。例えば、遺伝子産物を産生するように細胞をトランスフォームする技術は、米国特許第５２８３１８５号（題名は “細胞に核酸を送達する方法”）の他に多数の科学論文、例えばフェルガーらの論文に記載されている（Felgerら、”Lipofectin: A Highly Efficient, Lipid-Mediated DNA-Transfection Procedure”(リポフェクチン：極めて効果的な脂質仲介ＤＮＡトランスフェクション方法）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)）。インビボ蛋白産生についての技術は、例えばミューラーらの論文に記載されている(Muellerら、”Laboratory Methods − Efficient Transfection and Expression of Heterologous Genes in PC12 Cells”(実験室手技−ＰＣ１２細胞における異種遺伝子の効果的トランスフェクションと発現）、DNA & Cell Biol. 9(3):221-229(1990))。欠乏症を克服するために蛋白を投与することは周知であるので（例えば糖尿病における高血糖修正のためのインシュリン投与）、この技術のこれ以上の考察は不要であろう。現存する技術のある程度の修正は特定の応用について必要かもしれないが、このような修正は、本明細書で提供する現存の知識およびガイダンスを用いる当該技術分野の通常の医師の技術レベルの範囲内にあるであろう。
【００６５】
ＳｔＡＲプロモーターは、哺乳類細胞、遺伝子導入哺乳動物でのＳｔＡＲ遺伝子、ＳｔＡＲ変異体または異種遺伝子を発現させるために、または遺伝子治療で異種遺伝子の発現のために用いることができる。組織特異的遺伝子発現が、通常はＳｔＡＲｍＲＮＡを産生しないような細胞型（例えば胎盤、肝、絨毛上皮腫細胞）の多くで、異種遺伝子の場合は発現されないような程度まで達成され、さらに、通常ＳｔＡＲｍＲＮＡを産生する細胞（例えば副腎および性腺細胞）でも発現される。好ましいプロモーターフラグメントには、図１１のＡ−１３００ＧＣＴＴからＧＧＴＣＣ−１までの配列が含まれる。さらに小さなフラグメントも用いることができるが、好ましさは低下する。
【００６６】
本発明はこれまで一般的に説明してきたが、詳述のためで限定を目的としない以下の詳細な実施例でより一層理解されよう。
【００６７】
【実施例】
[実施例１]：ＳｔＡＲｃＤＮＡクローンの単離とＤＮＡ配列分析
１８才の男性の副腎皮質から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡで調製された、ラムダｇｔ２２Ａ中のヒト副腎皮質ｃＤＮＡライブラリーはラクロア、ベレンガーおよびトレンブレー博士(Dr. Andre Lacroix, Dr. Alain Belanger, Yves Tremblay, University of Laval, ケベック、カナダ）から提供された。部分的な長さのマウスＳｔＡＲｃＤＮＡ(Clarkら、1994）を用いてこのライブラリーをスクリーニングした。５０個以上の陽性クローンを６０００００個のプラークのスクリーニングで検出した。２つのプラーク精製ファージクローンを配列分析のために選んだ。各々は約１．６ｋｂの挿入物を含んでいた。両挿入物はｐＳＰＯＲＴ（GIBO-BRL, ベセスダ、メリーランド）でサブクローニングし、Ｔａｑジデオキシ配列決定試薬を使って自動ＤＮＡ配列決定装置（Applied Biosystems, Inc.）で配列を調べた。
【００６８】
ＤＮＡ配列分析で性状を調べたこの２つのヒトＳｔＡＲｃＤＮＡは、同一の１２６ヌクレオチド５’非翻訳領域を有していた。両クローンは２８５アミノ酸蛋白をコードする８５５ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含んでいた。１．６ｋｂのｃＤＮＡ（そのヌクレオチド配列は図１に示す）は６２３ヌクレオチドの３’非翻訳配列を有し、これは、２３ヌクレオチド上流でＡＡＴＡＡＡ配列が前に付いたポリ（Ａ）＋テールで終わっていた。
【００６９】
推定ヒトＳｔＡＲアミノ酸配列は、マウスのそれと８４％同一である(Clarkら、1994）（図１）。この配列は、塩基性および疎水性アミノ酸で構成される２５アミノ酸Ｎ−末端配列を含むが、これはミトコンドリアを標的とする配列に特徴的である。ｃＡＭＰ依存蛋白キナーゼによる燐酸化のための７つのコンセンサス部位および３つの蛋白キナーゼＣ燐酸化部位が成熟蛋白配列に存在する。遺伝子工学的に操作したＣＯＳ−１細胞でのＳｔＡＲの発現によってステロイド生成は増加する。
【００７０】
[実施例２]ＣＯＳ−１細胞でのＳｔＡＲｃＤＮＡの発現
ヒトＳｔＡＲ蛋白の機能活性を調べるために、ステロイド生成におけるステロールキャリア蛋白２の機能を調べるために以前に用いた方法を利用した（R. Yamamoto, C.B. Kallen, G.O. Babalola, H. Rennert, J.T. Billheimer, III J.F. Syraus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:463-467(1991)）。簡単に記せば、ＣＯＳ−１細胞に１０μｌ／培養皿を使用し、リポフェクタミン（GIBCO-BRL)を用いて種々の発現ベクターをトランスフェクトした。このベクターは、ｃＤＮＡ挿入物を含まないｐＳＰＯＲＴ、１．６ｋｂＳｔＡＲｃＤＮＡを含むｐＳＰＯＲＴ（ｐＳｔＡＲ）、並びにウシＰ４５０ｓｃｃおよびアドレノドキシンのための発現ベクター（ｐＣＤＡＤＸ）（ウォーターマン博士(Dr. Michael Waterman, Vanderbilt University, ナッシュビル、テネシー）提供）を含む。トランスフェクション後４８時間してから、培養液を先に記載したように（R. Yamamoto, C.B. Kallen, G.O. Babalola, H. Rennert, J.T. Billheimer, III J.F. Syraus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:463-467(1991)）プレグネノロンの放射能免疫アッセーのために採集した。１つの実験では、ヒドロキシステロール（２０α−ヒドロキシステロール）を培養液に添加した（５μｇ／ｍｌ）。このヒドロキシステロールはより可溶性のプレグネノロン前駆体で、コレステロール側鎖切断反応の中間体である。２０α−ヒドロキシコレステロールのようにヒドロキシステロールは、コレステロール移動の調節移動メカニズムを飛び越え、したがって一般に最大のコレステロール側鎖切断活性を提供する（M.E. Toaff, H. Scleyer, J.F. Straus,III, Endocrinology 1785-1790(1982)）。予備実験によって、トランスフェクト化ＣＯＳ細胞は、プロジェステロンの約１０倍のプレグネノロンを分泌し、さらにプロジェステロン測定レベルはプレグネノロンと平行して変化することが明らかになった。したがって、我々のステロイド生成の指標としてプレグネノロン分泌をモニターした。
【００７１】
ＣＯＳ−１細胞は、ｃＤＮＡ挿入物を欠くｐＳＰＯＲＴベクターまたはＳｔＡＲｃＤＮＡを含むｐＳＰＯＲＴをトランスフェクトしたときプレグネノロンを分泌しなかった（表９）。しかしながら、ウシＰ４５０ｓｃｃおよびアドレノドキシンの発現を誘導するプラスミドを細胞に同時トランスフェクションしたとき、ステロイド生成活性が細胞に付与された。Ｐ４５０ｓｃｃ、アドレノドキシンおよびＳｔＡＲ発現プラスミドによるＣＯＳ−１細胞の三重トランスフェクションによって、ステロイド分泌は、ｐ４５０ＳＣＣ、アドレノドキシンおよびコントロールｐＳＰＯＲＴプラスミドをトランスフェクトした細胞より４から２０倍増加した。ｐＰ４５０ｓｃｃ、ｐＡＤＸおよびｐＳＰＯＲＴをトランスフェクトした細胞を２０α−ヒドロキシコレステロール（比較的可溶性のコレステロール側鎖切断反応中間体）とともに培養することによって、ｐＳｔＡＲと同じ程度にプレグネノロン分泌が刺激されたが、Ｐ４５０ｓｃｃおよびアドレノドキシンプラスミドで同時トランスフェクトしたＣＯＳ細胞におけるｐＳｔＡＲ応答は増大されなかった。Ｐ４５０ｓｃｃおよびアドレノドキシン発現が無い場合、２０α−ヒドロキシコレステロールの存在下でのプレグネノロン合成は検出できなかった。これらの発見は、ｐＳＰＯＲＴプラスミド “コントロール”はステロイド生成酵素の発現に干渉しなかったことを表している。外因性ヒドロキシコレステロールはＳｔＡＲによって刺激されるステロイド産生を増大させなかったという事実はまた、ＳｔＡＲはトランスフェクト化ＣＯＳ細胞においてステロイド生成活性をほぼ最大限まで促進することを示唆する。
【００７２】
ＣＯＳ細胞系におけるＳｔＡＲの発現によって促進されるステロイド生成の４倍以上の増化は、ステロイド生成強化の手段としてステロールキャリア蛋白２発現プラスミドをＣＯＳ細胞にトランスフェクトしたとき我々が観察した２倍の増化より実質的に大である（R. Yamamoto, C.B. Kallen, G.O. Babalola, H. Rennert, J.T. Billheimer, III J.F. Syraus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:463-467(1991)）。これらの発見はＳｔＡＲはステロイド生成を促進するという考えと一致するが、一方、これらの実験はＳｔＡＲの作用の正確なメカニズムを明らかにはしない。
【００７３】
【表１３】

【００７４】
ＣＯＳ−１細胞に表示のプラスミド（２μｇプラスミド／３５ｍｍ培養皿）をリポフェクチンを用いてトランスフェクトした。４８時間後に培養液を採集し、放射能免疫アッセーでプレグネノロンを調べた。２０α−ヒドロキシコレステロール（２０α−ＯＨ−Ｃ；５μｇ／ｍｌ）を幾つかの培養皿に添加した。４回の別々の実験結果を示す。値は±ＳＥで、各実験につき複製はＮ＝３−４。
【００７５】
[実施例３] ＳｔＡＲ変異体の同定
経験的に決定した４つのＰＣＲプログラムの１つにしたがって種々のプライマーを用いて、白血球から調製したゲノムＤＮＡを増幅した（これらは全て９５°Ｃ２分変成させることによって開始させた）。プログラム１：９４°Ｃ５０秒、６４°Ｃ３０秒、７２°Ｃ９０秒の３４サイクル。プログラム２：９４°Ｃ４５秒、５７°Ｃ４５秒、７２°Ｃ６０秒。プログラム３：９４°Ｃ５０秒、６０°Ｃ４５秒、７２°Ｃ９０秒。プログラム４：９４°Ｃ６０秒、５５°Ｃ６０秒、７２°Ｃ１２０秒の２９サイクル。全てのプログラムでパーキン・エルマー・シータスのＴａｑポリメラーゼが用いられ、７２°Ｃ１５分の最終伸長で終了させた。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーン（Gene Cklean)(BIO 101）またはキアゲン（Qiagen）樹脂（Qiagen）で精製した。エクソン１−４は表８に示すプライマー対で増幅し、記載にしたがって（Ohbaら、1994）アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）自動配列決定装置で直接配列を決定した。エクソン１は、自動配列決定のためにはＥｘ１Ｓ−Ｓ（短）およびＥｘ１ＡＳを用いて、さらに手動配列決定のためにはＥｘ１ＳＬ（長）およびＥｘ１ＡＳを用いて増幅した。エクソン５−７を含む２．１ｋｂＰＣＲフラグメントはプライマーＳ３およびＡＳ１で増幅し、ウィザードミニプレップ（Wizard miniprep)(Promega）で単離したｐＣＲＩＩ（インビトロゲン）でクローニングし、さらに３５Ｓ〔ｄＣＴＰ〕を用いてシークェナーゼ（Sequenase)２．０（USB)によるジデオキシ鎖終結によって配列決定した。自動配列決定の曖昧さは手動配列決定によって解決された（全ての手動配列決定は両方の鎖について実施した）。表３に記載したように、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化によっていくつかの変異が確認された。
【００７６】
[実施例４] ＳｔＡＲ変異体の活性
確認された変異が実際に患者の類脂質ＣＡＨの原因であるか否かを決定するために、さらにＳｔＡＲ蛋白の構造／機能要件の解明を開始するために、識別変異の各々をインビトロで調べた。種々のＳｔＡＲ変異を位置特異的変異誘発によって再現し、ｐＭＴ２またはｐＳＰＯＲＴいずれかのＳｔＡＲ発現ベクターでクローニングし、ステロイド非生成ＣＯＳ−１細胞に導入した。正常なヒトＳｔＡＲｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＭＶ４(Anderssonら）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローニングした。センスおよびアンチセンスプライマー、ＦＬ−ＳおよびＦＬ−ＡＳ（これらは完全な長さ（Full-Length)のＳｔＡＲｃＤＮＡのそれぞれ５’および３’末端に対応し、それぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む）並びに、変更されるべき配列を含む相補的プライマー対の一方を用いてオーバーラップＰＣＲによって識別された変異を再現した（表１０）。各変異の構築のために、ＰＣＲプログラム４およびＰＦＵポリメラーゼ（Stratagene）を用いて２つのＰＣＲ反応を別々に実施したが、このとき最初にＦＬ−Ｓおよびアンチセンス変異誘発性オリゴヌクレオチドを用い、二番目にＦＬ−ＡＳおよびセンス変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動、続いてジーンクリーンまたはキアゲンカラムで精製した。１００倍に希釈した後、反応の各組みの１μｌ量を合わせ、ＦＬ−ＳおよびＦＬ−ＡＳによるＰＣＲ（プログラム４）の鋳型として用いた。最終的なＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−切断ｐＣＭＶ４で切断し、さらに構築の正確さを立証するために配列決定した。ΔＲ２７２および９４７／ＩｎｓＡ／９４８変異（これは３’末端近くに存在する）は、オリゴヌクレオチドＦＬ−Ｓおよび第一のＰＣＲ反応のためにはΔＲ２７２−ＡＳまたは９４７／ＩｎｓＡ−ＡＳのいずれかを、さらにＦＬＳおよび第二の反応の各々のためには３’ブリッジオリゴヌクレオチドを用いて単独セグメント内に構築した。全てにおいてプログラム４を用いた。
【００７７】
【表１４】

【００７８】
コレステロールのプレグネノロンへの変換に対する正常ＳｔＡＲまたは変異ＳｔＡＲの作用を調べるために、コレステロール側鎖切断系の３成分を単一の単分子融合蛋白（Ｈ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−ＡｄＲｅｄ−ＡＤｘ−ＣＯＯＨ、Ｆ２と呼ぶ）として発現するベクターを細胞に同時トランスフェクトした。これによってＰ４５０ｓｃｃ活性は最適化され、Ｐ４５０ｓｃｃのその電子伝達蛋白（特にアドレノドキシン）に対する分子比の変動によるＰ４５０ｓｃｃ活性における一切の変動が排除される(Harikrishnaら;Zuberら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:699-703(1988))。可溶性コレステロール類似体（例えば２０α−ヒドロキシコレステロールまたは２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール）で細胞を培養することによって、ミトコンドリアのステロイド生成能は迂回される(Toaffら、Endocrinology 111:1785-1790(1982))。したがって、基質としてＬＤＬコレステロールを用いた場合のステロイド生成能に対する基質として２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを用いた場合のステロイド生成能の比は、ミトコンドリアのコレステロール輸送効率の指標を提供する。表１１に示すように、野性型ＳｔＡＲはステロイド生成が１０倍増加し、我々が以前に見出したものと一致し(Linら、1995）、さらに、変異体のいずれもベクターコントロールより大きな活性は示さなかった。したがって、これら認定された変異の各々は完全に不活性なＳｔＡＲ蛋白を生じた。
【００７９】
【表１５】

【００８０】
[実施例５] ＳｔＡＲｍＲＮＡの発現
種々のヒト組織に由来するポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを含むノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Clontech Laboratorie(Palo Alto, カリフォルニア))から購入し、供給元のプロトコルにしたがって１．６ｋｂのＳｔＡＲｃＤＮＡおよびβ−アクチンｃＤＮＡをプローブとして調べた。
【００８１】
ＳｔＡＲｍＲＮＡはヒトの卵巣、精巣および腎で検出された。最も多い転写物は１．６ｋｂで、それより少ない量で４．４ｋｂおよび７．５ｋｂのｍＲＮＡが卵巣および精巣で認められた（図16）。出産可能年令の女性から得られた５つの卵巣を合わせて調製した卵巣サンプルは殆どのＳｔＡＲｍＲＮＡを含み、続いて精巣さらに腎臓がこれに続いた。同じ３２Ｐ標識ｃＤＮＡ調製物をプローブとして調べた図16に示したノザンブロットでは、卵巣および精巣を含むブロットはＳｔＡＲ発現について６時間露光し、一方、腎サンプルを含むブロットはＳｔＡＲについて２４時間露光した。両方のブロットをさらに長時間露光しても、胎盤、膵、骨格筋、肝、肺、脳、心臓、末梢血白血球、大腸、小腸、前立腺、胸腺および脾臓ではＳｔＡＲｍＲＮＡを明示することができなかった。しかしながら、β−アクチンｍＲＮＡは、同じブロットのこれら組織の全てで容易に検出できた。ヒト副腎皮質におけるＳｔＡＲの発現は、ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡを単離するために用いられたライブラリーで多数のＳｔＡＲファージクローンが検出されたという事実から推論される。
【００８２】
これらの観察は、ＳｔＡＲ発現は、ｃＡＭＰの仲介性によって作用するトロピックホルモンによる急性調節下にあるミトコンドリアのステロールヒドロキシル付加反応を起こす臓器に限られるということを示唆する。このことは副腎および性腺について正しい。これらの臓器はそれぞれの下垂体トロピックホルモン（ＡＣＴＨおよびＬＨ）に応答してコレステロール側鎖切断を強化させ、さらに腎臓についても同様で、これはＰＴＨに応答してビタミンＤの１α−ヒドロキシル付加を増加させる。別のステロイド生成臓器である胎盤はＳｔＡＲを発現しないらしいことは注目に値する。しかしながら、胎盤のプロジェステロンはｃＡＭＰによる急性調節下にあるようには思えない。胎盤栄養膜のｃＡＭＰレベルまたはｃＡＭＰ類似体を増加させる薬剤の報告された促進作用は、ステロイド生成酵素をコードする遺伝子の発現を増加させる（何時間または何日かを要する過程）ことに関係がありそうである（T.G. Golos, W.L. Miller J.F. Straus,III J. Clin. Invest. 80:896-899(1987))。脳（これもまたステロイド生成部位である（D. Patterson, C. Jones, I. Hart, J. Bleskan, R. Berger, D. Geyer, S.P. Eisenberg, M.F. Smith Jr., W.P. Arend, Genomics 15:173-176(1993))もＳｔＡＲを発現していないようであった。胎盤および脳でＳｔＡＲ発現がないことは、これら臓器のステロイドホルモン合成が他のメカニズムによって調節されていることを示唆しているが、これは以前にリーバーマンおよびその共同研究者らが提唱した（S. Lieberman, V.V.K. Prasad, Endoc. Rev. 11:469-493(1990))。
【００８３】
インビトロ受精／胎児移転を受けた女性から得たヒト顆粒層細胞培養から、または精製ヒト栄養膜細胞層細胞から全ＲＮＡを単離した。ヒト顆粒層細胞は４日間培養し、続いて１．５ｍＭの８−ブロモ−ｃＡＭＰで２４時間処理した。栄養膜細胞層細胞は１．５ｍＭの８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下または非存在下で２４時間培養した。この調製、培養並びに顆粒層細胞および栄養膜細胞層細胞の全ＲＮＡの単離についての詳細なプロトコルは以前に記載された（T.G. Golos, W.L. Miller J.F. Straus,III J. Clin. Invest. 80:896-899(1987); G.E. Ringler, L.-C. Kao, W.L. Miller, J.F. Straus, III, Mol. Cell. Endocrinol. 61:13-21(1989)）。ＳｔＡＲｃＤＮＡおよびヒト２８ＳｒＲＮＡをコードするｃＤＮＡでノザンブロットを調べた。
【００８４】
１．５ｍＭの８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下でヒト顆粒層細胞を２４時間培養することによって、ＳｔＡＲｍＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡと較べて３から７倍増加した（図１７）。対照的に、ＳｔＡＲｍＲＮＡは、サイクリックＡＭＰ類似体の存在下または非存在下で２４時間インキュベートしたヒト栄養膜細胞層細胞の初代培養では検出できなかった。ＳｔＡＲｍＲＮＡはまた、８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下（Ｐ４５０ｓｃｃおよびアドレノドキシン遺伝子のアップレギュレーションのための処置）または非存在下で２４時間培養したＪＥＧ−３絨毛上皮腫細胞から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノザンブロットでも検出されなかった（結果は示さず）（J. Picado-Leonard, R. Voutilainen, L.-C. Kao, B.-C. Chung, J.F. Strauss, III, W.L. Miller, J. Biol. Chem. 263:3240-3244(1988))。これらの観察は、トロピックホルモンは、蛋白をコードするｍＲＮＡを増加させ、したがって蛋白合成を増加させることによって部分的にＳｔＡＲレベルを制御するかもしれないということを示唆している。
【００８５】
[実施例６] ＳｔＡＲ構造遺伝子および偽遺伝子のマッピング
体細胞ハイブリッドから得たＤＮＡのサザンブロットのハイブリダイゼーションにより、さらに構造遺伝子または偽遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応分析によって、ＳｔＡＲ遺伝子およびその偽遺伝子をマッピングした。ＮＩＧＭＳヒト遺伝子変異細胞集積所(1992/1993細胞株カタログ、アメリカ予防衛生研究所）から得たヒト×ハムスターおよびヒト×マウス体細胞ハイブリッド系の高分子量ＤＮＡ、およびビオス社（BIOS Corporation, ニューヘブン、コネチカット）から購入したヒト×ハムスター体細胞ハイブリッドのＤＮＡを用いて、構造遺伝子および偽遺伝子の染色体上の配置を特定した。
【００８６】
ＳｔＡＲ構造遺伝子の局部マッピングは以下から成る染色体８の局部マッピングパネルを用いて実施された：ハイブリッド９ＨＬ１０、ＩＳＨＬ２７および２０ＸＰ０４３５−２（ワグナー博士提供（Y.J. Chang, R.T. McCabe, H. Budarf,R. Sayegh, B.S. Emanuel, P. Skolnick, J.F. Straus,III, DNA Cell Biol. 11:471-480(1992)))、８ｑ−、２１ｑ＋およびＣ１１７（M.J. Wagner, Y. Ge, M. Siciliano, D.E. Wells, Genomics 10:114-125(1991); R. Dalla-Favera, M. Bregni, J. Erikson, D. Patterson, R.C. Gallo, C.M. Croce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:464-468(1982); H.A. Drabkin, M. Diaz, C.M. Bradley, MM. Le Beau, J.D. Rowley, D. Patterson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:464-468(1985))並びにＲｅｃ８（これはＧｌｙＢＣＨＯ−Ｋ１変異体と組換え体８症候群の患者の細胞との融合によって生成されたハイブリッドである)(N. Sacchi, S. V. Cheng, R.E. Tanzi, J.F. Gusella, H.A. Drabkin, D. Patterson, J.H. Haines, T.S. Papas, Genomics 3:110-116(1988) ）。Ｒｅｃ８は組換え体８染色体を含むが、正常なヒト染色体８は含まない。
【００８７】
ハイブリッドパネルのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、サザンブロット（サザンブロットの詳細な技術は下記で説明する）に付したとき、約８ｋｂの強いハイブリダイゼーションバンドが、ヒトゲノムＤＮＡコントロールおよび ハイブリッドＧＭ１０１５６（これはヒト染色体８のみを含む）で検出された（図１８）。微かなバンドが、ＧＭ１０４７８（これはヒト染色体２０の他にヒト染色体８ｐのフラグメントもまた含む）でもまた検出された。これらの発見は、ファイルＳｔＡＲ遺伝子は染色体８に存在することを示唆した。
【００８８】
ＳｔＡＲ遺伝子が染色体８に局在することを確認するために、構造遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いるＰＣＲにより体細胞ハイブリッドを調べた。染色体８を含むハイブリッドは陽性の信号を生じ、一方、他の全てのハイブリッド（ヒト染色体２０を含むが染色体８は含まないことが分かっているハイブリッドを含む）は特異的な増幅生成物を生じなかった。
【００８９】
ヒト染色体８の局部マッピングパネルの分析によって、ＳｔＡＲ遺伝子は８ｐ上に位置決定された（図１９）。機能的ＳｔＡＲ遺伝子の局部マッピングの確認と純化は、ＳｔＡＲ機能的遺伝子を含むＹＡＣを単離し、このＹＡＣをＦＩＳＨでプローブとして用いることによって実施した（図２０）。局部マッピングは、連続的バンド形成とそれに続くＦＩＳＨによって実施した。この方法によって、ＳｔＡＲ座位は８ｐ１１．２に特定された。長さ分別測定と同様に、ＳｔＡＲＹＡＣおよび８動原体特異的プローブを用いた同時ＦＩＳＨによって、この座位の特定は確認された。
【００９０】
逆転写されたヒト精巣ＲＮＡのＰＣＲ分析およびヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって、発現ＳｔＡＲ偽遺伝子の存在が示唆された。増幅偽遺伝子生成物のＤＮＡ配列はイントロンを含まず、ヌクレオチドの挿入、欠失および置換に関して多くの場所で機能的ＳｔＡＲ遺伝子配列とは異なっていた。増幅配列は個々の幾つかの配列間で異なり、顕著な多形現象を示唆していた。偽遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて、ＳｔＡＲ偽遺伝子は染色体１３に存在することを決定した（図２１）。
【００９１】
[実施例７] サザンブロッティングとＰＣＲ分析
２４個の体細胞ハイブリッド、完全なヒト、ハムスター（ＲＪＫ８８）およびマウス（ＧＭＣｌ１−Ｄ）から得た１２μｇのゲノムＤＮＡ１０種をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースで電気泳動し、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋（Amersham, エールスベリー、イギリス）膜にブロットした。ＳｔＡＲｃＤＮＡによるハイブリダイゼーションは、先に述べた条件で実施した（Y.J. Chang, R.T. McCabe, H. Budarf, R. Sayegh, B.S. Emanuel, P. Skolnick, J.F. Straus,III, DNA Cell Biol. 11:471-480(1992)）。
【００９２】
ＳｔＡＲ構造遺伝子および偽遺伝子は、配列特異的プライマーを用いて体細胞ハイブリッドＤＮＡのＰＣＲ分析によってマッピングした。構造遺伝子のために用いられた前進方向プライマーは５’−ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧ−３’で、逆方向プライマーは５’−ＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡ−３’であった。これらの配列は小さなイントロンを含み、３００ヌクレオチドの生成物を生じる。ＰＣＲ増幅発現偽遺伝子のＤＮＡ配列に由来するプライマー（その配列は他の箇所に記載する）を偽遺伝子の配置決定に用いた。その前進方向プライマーは５’−ＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧ−３’で、逆方向プライマーは５’−ＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＧ−３’であった。これらのプライマーは８００ヌクレオチドの偽遺伝子特異的生成物生じる。ＰＣＲの条件は、９４°Ｃで５分の変成、続いて９４°Ｃ４５秒の変成、６５°Ｃ４５秒のアニーリングおよび７２°Ｃ２分の伸長が３０サイクルで、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液中の１０ｐＭのプライマーを用いた。ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した。構造的ＳｔＡＲ遺伝子の局部マッピングを確認するために、染色体８ｐの遺伝地図を作製できることが分かっている幾つかの遺伝子についての局部マッピングパネルを調べた。これらの遺伝子には、クラストリン遺伝子(clustrin gene, ＣＬ１）（A.C.M. Smith, K. Spuhler, T.M. Wiliams, T. McConnell, E. Sujansky, A. Robinson, Am. J. Human. Genetics 41:1083-1103(1987); H.V. de Silva, J.A. Harmony, W.D. Stuart, C.M. Gil, J. Ribbins, Biochemistry 29:5380-5389(1990); D.E. Jenne, J. Tschopp, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7123-7127(1989); L. Kirszbaum, J.A. Sharpe, J. Murphy, A.J. d'Apice, B. Classon, P. Hudson, I.D. Walker, EMBO J. 8:711-718(1989))、リポ蛋白リパーゼ遺伝子（ＬＰＬ）（J.M. Pineault, M. Tenniswood, J. Biol. Chem. 268: 5021-5031(1993) ）およびスクアレンシンターゼ遺伝子（ＳＳ）（K.L. Wion, T. G. Kirchgessner, A.J. Lusis, M.c. Schotz, R.M. Lawn, Science 235:1638-1641(1987)) が含まれる。ＰＣＲプライマーは文献に発表された配列から作製した。ＣＬ１特異的プライマーは５’−ＡＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＣＣ−３’および５’−ＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣ−３’で、それぞれヌクレオチド２５０４−２５２４および２８３６−２８５４を表す。ＬＰＬ特異的プライマーは、５’−ＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＴＡＣ−３’および５’−ＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧ−３’で、ヌクレオチド１６０１−１６２０および１６８７−１７０６をそれぞれ表す。ＳＳ特異的プライマーは、５’−ＡＡＡＡＧＡＡＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＩＧＧＧＡＣ−３’および５’−ＡＣＣＴＡＡＡＣＣＧＴＧＧＣＡＡＡＴ−３’で、それぞれヌクレオチド１４０５−１４２８および１５４７−１５６８を表す。
【００９３】
[実施例８] 蛍光in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）マッピング
３’非翻訳配列に対応するＳｔＡＲ特異的プライマーを用いるＰＣＲスクリーニングによって、セントルイスライブラリーからＳｔＡＲ構造的遺伝子を含む個々の酵母人工染色体（ＹＡＣ）を単離した。センスプライマーは、５’−ＣＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＡＡＧ−３’（ヌクレオチド１０４８−１０７２）であった。アンチセンスプライマーは、５’−ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＴＡＡＧＧＧ−３’（ヌクレオチド１２８７−１２６４）であった。ＹＡＣのＤＮＡ中のＳｔＡＲ配列を、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０μｌの標準的なＰＣＲ反応容積中で増幅させた。ＹＡＣＤＮＡを先ず９４°Ｃで５分変成させた。増幅は、９４°Ｃ３０秒の変成、５５°Ｃ３０秒のアニーリングおよび７２°Ｃ３０秒の伸長の３５サイクルで実施した。２％アガロースゲル（臭化エチジウムによる染色を伴う）で予想される２４０ヌクレオチドの増幅生成物の存在について、反応生成物を調べた。
【００９４】
ＹＡＣのＦＩＳＨは、以下のように変更を加えながら先の記載（G. Jiang, T.L. McKenzie, D.G. Conrad, I. Schechter, J. Biol. Chem. 268:12818-12824(1993); P. Lichter, C.-J. Tang, K. Call, G. Hermanson, A.E. Glen, D. Housman, D.C. Ward, Science 247:64-69(1990)）にしたがって実施した。ビオチン標識プローブは７５°Ｃで５分変成させ、ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡで１時間３７°Ｃ予備アニーリングを施し、さらに先に変成させ脱水したヒト染色体のスライド調製物に適用した。スライドをカバースリップで覆い、湿潤チャンバー内で３７°Ｃで一晩ハイブリダイズさせた。いくつかの実験では、染色体８の動原体特異的プローブ（Ｄ８Ｚ２：Oncor Inc., ガイザースバーグ、メリーランド）をこのハイブリダイゼーション混合物に加えた。ハイブリダイゼーション後洗浄は、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）で１５分さらに２×ＳＳＣで８分、４５°Ｃで実施した。検出は、製造元（Oncor, Inc.)の指示によって１回の増幅を用いてアビジン−ＦＩＴＣによって実施した。染色体は沃化プロピジウムで対比染色した。
【００９５】
ＦＩＳＨに先立って、１２の分裂中期分散標本をトリプシンによるＧバンド染色し写真を撮った。スライドをヘムデ（Heme-De, Fisher Scientific, フェアーローン、ニュージャージー）で洗浄し油を除去して、無水メタノールで２度１０分脱染色し、さらに７０％続いて８０％エタノールでそれぞれ２分ずつ脱水し、無水メタノール中に１０分置いて風乾させた。続いてＦＩＳＨを上記のように実施した。分裂中期分散標本を新しい場所に置き、プローブシグナルによってバンドパターンを比較してプローブの配置を特定した。断片の長さの測定によってこの配置特定を確認した（G. Jiang, T.L. McKenzie, D.G. Conrad, I. Schechter,J. Biol. Chem. 268:12818-12824(1993)）。
【００９６】
分裂中期分散標本は、エクタクローム４００スライドフィルムを用いてツァイスアキソフォト（Zeiss Axiophot）顕微鏡で撮影するか、またはコンピューターでデジタル処理しカラープリンターで印刷した。
【００９７】
[実施例９] 患者の無傷のＲＮＡとインビトロ生成ＲＮＡのＲＮアーゼ保護
Ｔ→Ａ変異のＲＮＡスプライシングに対する影響を決定するために、ヒトＳｔＡＲミニジーンのためのｐＣＭＶ４発現ベクターを構築した。このベクターは、エクソン１、２、３、４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６およびエクソン７から成る（すなわち最初の４つはｃＤＮＡ由来で、残りの構築物は天然の遺伝子由来である）一次ＲＮＡ転写物を発現する。
【００９８】
ミニジーン構築物：正常および変異ミニジーン構築物は、５’エクソン１−２−３−４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６エクソン７、３’を含み、ｐＣＭＶ４でクローニングされた。ｃＤＮＡ部分（エクソン１−２−３−４）は、５’−ＡＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧ（塩基４１−６０）および５’−ＣＣＣＣＡＴＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＣＴＣ（塩基４２１−４４２）による増幅によって生成された。ゲノム部分（エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７）は、５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＴＧ（塩基４３９−４６２）および５’−ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧ（塩基１０２１−１０４０）を用いて増幅された。ＰＣＲの後、過剰なヌクレオチドをセントリコン−１００で遠心沈澱させて除去した。ＤＮＡフラグメントを、５０μＭのｄＴＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで処理し、ＣＭＶプロモーターから下流でクローニングした。各構築物の５μｇを燐酸カルシウム沈澱によって、１０％ウシ胎児血清補充ＤＭＥＭ−Ｈ２１中で増殖させたＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。ＲＳＶ−ＬＵＣ構築物（０．５μｇ）を用いて各プレートでトランスフェクション効率をモニターした。トランスフェクション後１２時間して培養液を交換し、細胞を採集前にさらに４８時間増殖させた。ルシフェラーゼアッセー系（Promega)を１５秒用いてルシフェラーゼ活性を測定した。チオシアン酸グアニジン抽出によって全ＲＮＡを調製し、一方、細胞ＲＮＡおよび核ＲＮＡはＮＰ４０による細胞溶解によって調製した。
【００９９】
続いてこのＲＮＡのスプライシングをエクソン４および５（プローブ１）またはエクソン４、イントロン４、エクソン５およびエクソン６（プローブ２）から成るリボプローブを用いてＲＮアーゼ保護アッセーにより調べた。ＤＮＡフラグメントは、第一のプローブのための構築物のためにはセンスプライマー（Ｓ５）として５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＴＧ（塩基４４２−４６２）および、アンチセンスプライマー（ＡＳ６）５’−ＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣ（塩基７５７−７７６）を用い、さらに第二のプローブのための構築物のためにはアンチセンスプライマー（ＡＳ７）５’−ＣＴＴＧＡＧＧＴＣＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣＴＡＧＧＡＴＡ（塩基８５０−８７０）を用いて増幅させた。これらのフラグメントはｐＫＳのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングした。第三のプローブのための構築物はＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩゲノムフラグメントの第二の構築物のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントへの連結によって生成された。ＲＮアーゼ保護実験は記載のように実施した（Mol. Cell Biol. 12:2124-2134(1992)）。プローブ１は、正常なミニジーンベクターをトランスフェクトした細胞から単一の３３５ｂｐバンドを検出し、これは一切の介在イントロン配列を含まないエクソン４および５に対応する（図２２）。しかしながら、イントロン４のＴ→Ａ変異を含むベクターでトランスフェクトされた細胞では、３３５ｂｐバンドは認められず、それに代わってエクソン５（１８５ｂｐ）およびエクソン４（１５０ｂｐ）が別々のバンドとして検出され、エクソン４および５を分離させる別のＲＮＡ配列（おそらくスプライスされないイントロン４）が存在することを示唆している。エクソン４は一貫して断続的な（Stuttered)保護パターンを生じるが、この原因は不明である。
【０１００】
患者の性腺から得たＲＴ−ＰＣＲデータが示唆するように、イントロン４のＴ→Ａ変異がスプライシング機構がエクソン５に跳ぶ原因であるならば、変異ミニジーン構築物をトランスフェクトされた細胞のＲＮＡでエクソン６に融合したエクソン４が見出され、野性型ミニジーン構築物をトランスフェクトされたＲＮＡには見出されないであろうと予想される。これを調べるために、プローブ２についてＲＮアーゼ保護アッセーを実施した（図２３）。このプローブは、正常または変異体構築物をトランスフェクトした細胞から得たＲＮＡおよびコントロールｃＤＮＡで、１５０塩基フラグメント（エクソン４に対応）および２７９塩基フラグメント（エクソン５および６に対応）を検出する。トランスフェクト化細胞のＲＮＡはまた５７０ｂｐ（エクソン４、イントロン４、エクソン５および６）および４７６ｂｐ（エクソン４、イントロン４、エクソン５）のスプライスされていないフラグメントを保護する。１５０および２７９ｂｐのスプライスされた形態は正常構築物によって発現されたスプライスされていない形態よりもはるかに多いが、変異体構築物からは同等な濃度である。したがって、Ｔ→Ａ変異は正常なスプライシングに干渉する。核ＲＮＡおよび細胞質ＲＮＡが分離されると、イントロン種の殆どは核ＲＮＡであるが、幾らかのイントロン種は細胞質に存在し、さらにいくらかのスプライスされた形態が核に存在する。これは、細胞内漏出または細胞分画中の各分画の他のものによる汚染のいずれかを反映している。また、非常に高レベルのｐＣＭＶ４ベクターからの発現がスプライシング機構を飽和させる可能性も考えられる。したがって、ミニジーン発現構築物の分析は、イントロン４／エクソン５スプライス部位から１１ｂｐの単独Ｔ→Ａ変異は、ＳｔＡＲ前駆体ＲＮＡの適切なスプライシングを破壊し、類脂質ＣＡＨを惹起することを示唆する。
【０１０１】
天然ＲＮＡのＲＮアーゼ保護：患者の少量の精巣ＲＮＡがプローブ２による直接試験のために入手できた（図２４）。図５及び図６で先に観察されたように、正常なヒト胎児副腎ＲＮＡのみが２７９塩基（エクソン５および６に対応）および１５０塩基（エクソン４に対応）の予期されたフラグメントを保護した。したがって、エクソン５を欠くＰＣＲ生成物（場合によって正常ＲＮＡで認められる）は、極めてまれな事象を表す。患者のＲＮＡはいくつかの別な種を保護した。少量の５７０および４７６塩基種が存在したが、これらは、エクソン４、５および６に付随する（５７０ｂｐ）か、またはエクソン４および５にのみ付随する（４７６ｂｐ）スプライスされていないイントロン４の保持に対応する。１５０塩基種の豊富さは、正常ＲＮＡの場合よりわずかに少ないが、２７９塩基種の豊富さはるかに少なく、患者のＲＮＡの多くでエクソン５のスキップを生じるＴ→Ａ変異と一致する。患者のＲＮＡはまた、１００ｂｐのＤＮＡマーカーの近くに移動する多量の種（おそらくエクソン６（９４塩基）に対応）を生じたが、これは保護されることが予想されるが、もしＴ→Ａ変異がエクソン５のスキップを生じるとしたら他の配列に結合しないであろう。最後に患者のＲＮＡは、エクソン６に付随しない単離されたエクソン５に対応する少量の１８５ｂｐ種を含む。したがって、Ｔ→Ａ変異は不規則なＲＮＡスプライシングのいくつかの型を生じるようである。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡで認められたようにエクソン５のスキップは顕著なエラーであるが、イントロン４の保持および１８５塩基種によって反映されるまた別の下流でのスプライシングエラーもまた生じる。
【０１０２】
[実施例１０] トランスフェクション実験と３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸の分析
ＣＯＳ−１細胞にｐＣＭＶ４（Suら、1990）中のラットＰ４５０ｃ２７ｃＤＮＡおよびウシアドレノドキシン発現プラスミド（マイケル・ウォターマン博士（Dr. Michael Waterman(Vanderbilt University))ご提供）を、空のｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクター(BRL, ベセスダ、メリーランド）または先に述べたヒトＳｔＡＲｃＤＮＡを含むベクター（Sugawaraら、PNAS 1995)でトランスフェクトした。
【０１０３】
Ｐ４５０ｃ２７によるコレステロール代謝の最終産物である３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸(cholestenoic acid) の生成（Andersonら、1989）を先に記載されたように同位元素質量分析法で調べた(Reissら、J. Lipid Res. 35:1026-1030(1994)）。簡単に記せば、ジューテロ化スタンダード（５００ｎｇ）を１ｍｌ容量の媒体に加え、酸性化し酢酸エチルで抽出した後、生成物を薄層クロマトグラフィーにより単離した。Ｃ２７酸のメチル化後、溶出物をアセチル化しヒューレットパッカードＧＬＣ−ＭＳ中の融合シリカカラム（ＣＰ−ｓｉｌ１９ＣＢ、内径０．２５ｍｍ、長さ２５ｍ）上に注入した。同位元素比プログラムを用いて、ｍ／ｚ４／４〔３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸メチルエステルアセテート、分子イオン＝４７２−６０（アセテート）〕の面積をモニターし、内因性ステロール量の計算用積分によってそれぞれの面積を求めた。結果は表１２に示す。
【０１０４】
【表１６】

【０１０５】
[実施例１１] ＳｔＡＲプロモーターを用いた異種遺伝子の発現
ＳｔＡＲプロモーターのプロモーター活性を分析するために、ＳｔＡＲ遺伝子の１．３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ｂｐ−１２９３＋２５）を正方向および逆方向で、ホタルのルシフェラーゼをレポーター遺伝子として含むプラスミドベクターｐＧＬ２（Promega)でクローニングした。これらの実験で用いられる他のプラスミドにはｐＧＬ２基本ベクター（これはプロモーター配列を含まない)、ｐＧＬ２ コントロール（これはルシフェラーゼ遺伝子をＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーの制御下に置く）、およびｐＣＨ１１０（ｌａｃＺ遺伝子が初期ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるプラスミド）（Pharmacia)が含まれる。
【０１０６】
ネズミＹ−１副腎腫瘍細胞およびＢｅＷｏ絨毛上皮腫細胞を、１０％ウシ胎児血清およびゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを補充したダルベッコ（Dulbecco）の最小必須培養液から成る培養液で３５ｍｍのプラスチック培養皿で成育させた。トランスフェクションに用いたプラスミドマクシプレップ（Maxiprep）試薬系（Qiagen）を用いて精製した。１μｇのｐＧＬ２ プラスミド構築物および１μｇのｐＣＨ１１０プラスミドを１０μｌのリポフェクタミン（GIBCO/BRL)とともに含む血清非含有培養液１ｍｌを加える前に、４０％−６０％コンフレント状態の細胞培養を血清非含有培養液で２度洗浄した。５時間のインキュベーション後、２０％の血清を含む培養液１ｍｌと交換した。４８時間培養した後細胞を採集した。いくつかの実験では、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１ｍＭ）を培養の最後の２４時間培養液に加えた。
【０１０７】
トランスフェクション後４８時間で細胞を採集し、抽出はプロメガ（Promega)溶解緩衝液中で実施した。一定量（全抽出容積４００μｌのうち４０μｌ）をプロメガ試薬によるルシフェラーゼアッセーに用い、別の１５０μｌをプロメガ試薬によるβ−ガラクトシダーゼアッセーに用いた。トランスフェクトされていない細胞抽出物で測定した “ブランク”ルシフェラーゼ値をトランスフェクト化細胞の抽出物のルシフェラーゼの読みから差し引いた。トランスフェクション効率における変動を補正するために、ルシフェラーゼアッセーの結果はβ−ガラクトシダーゼ活性に対して基準化した。各実験で、ｐＧＬ２コントロールベクターの活性を１００％と規定した。各処置群は少なくとも３培養を含み、さらに各実験は２または３回繰り返された。結果は表１３に示す。
【０１０８】
【表１７】

【０１０９】
８−Ｂｒ−ｃＡＭＰによるＹ−１細胞処理は、ＳｔＡＲプロモーター活性を２．３倍増加させ（ｐ＜０．００２ 対ｔ検定によるログ変換データ分析）、このＤＮＡセグメントはｃＡＭＰ感応エレメントを含むことを示唆した。ＳｔＡＲプロモーター活性におけるこの増化は、ｃＡＭＰで４時間処理したヒト顆粒層細胞のＳｔＡＲｍＲＮＡの定常状態レベルの３倍の増化に一致する(Sugawaraら、1995）。これは、ｃＡＭＰに応答するＳｔＡＲｍＲＮＡの増化は少なくとも部分的には転写増化の結果であることを示唆する。
【０１１０】
Ｙ−１細胞に関する我々の発見と対照的に、ＳｔＡＲプロモーターは、ＢｅＷｏ絨毛上皮腫（これはＳｔＡＲ遺伝子を発現しない）における顕著なレポーター遺伝子の発現をもたらさなかった。これは、ＢｅＷｏ細胞を基準状態で調べようと、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰで刺激後調べようと変わらなかった。このことは、胎盤および絨毛上皮腫での検出可能なＳｔＡＲｍＲＮＡの欠如、および胎児が類脂質ＣＡＨに冒される妊娠中の胎盤のステロイド生成の持続と矛盾しない（Sugawaraら、1995）。したがって、ＳｔＡＲの組織特異的発現およびｃＡＭＰによる調節を誘導するｃｉｓ成分は、キャップ部位から上流の１．３ｋｂのＤＮＡ内に位置するように思える。
【０１１１】
本明細書で言及した全ての文献および特許出願は、個々の文献または特許出願が個々にかつ具体的に本明細書に示すのと同程度に援用して本明細書に含まれる。
【０１１２】
本発明は十分に説明されたが、当業者には、添付の請求の範囲から外れることなく多くの変更および修飾を行うことができることは明白であろう。
【０１１３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡ（ｈＳｔＡＲＤＮＡ）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。蛋白キナーゼＡおよび蛋白キナーゼＣ仲介燐酸化の可能な部位にはそれぞれ一本下線および二本下線が付されている。
【図２】ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡ（ｈＳｔＡＲＤＮＡ）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。蛋白キナーゼＡおよび蛋白キナーゼＣ仲介燐酸化の可能な部位にはそれぞれ一本下線および二本下線が付されている。
【図３】患者のＳｔＡＲｃＤＮＡのナンセンス変異の検出。上：正常（ＮＬ）ヒト胎児副腎および精巣ＲＮＡ、患者１および２の精巣ＲＮＡ並びに無ＲＮＡコントロールから得たＳｔＡＲのＲＴ−ＰＣＲ生成物を１％臭化エチジウム染色アガロースゲル上に表示。分子サイズマーカーはＨｉｎｄＩＩＩ切断バクテリオファージλである。下：ＳｔＡＲｃＤＮＡのマップ。Ｒ１９３→Ｓｔｏｐは、Ａｒｇ１９３（ＣＧＡ）に代わりに終止暗号（ＴＧＡ）への置換、さらにＱ２５８→Ｓｔｏｐは、Ｇｌｎ２５８に代わり終止暗号（ＴＧＡ）への置換である。中が白い四角はＳｔＡＲｃＤＮＡのコード領域を表す。マップ下の短い棒線はＰＣＲプライマーを示す。センスプライマーＳ１の配列は５’−ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡ−３’（ｃＤＮＡ内の位置は６６−８４）で、アンチセンスプライマーＡＳ１は５’−ＡＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＧ−３’（１０１６−１０３７）であった。ＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、４５秒；６４°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、６０秒で３０サイクルであった。
【図４】ＳｔＡＲ遺伝子のＰＣＲマッピング。上：左のパネルは、２％臭化エチジウム染色アガロースゲル上に表示したプライマーＳ２／ＡＳ２で増幅したゲノムＰＣＲ生成物。分子サイズマーカーはＨａｅＩＩＩ切断バクテリオファージΦｘ１７４である。右パネルは、１％アガロースゲル上に表示したプライマーＳ３／ＡＳ１で増幅したゲノムＰＣＲ生成物。分子サイズマーカーはＨｉｎｄＩＩＩ切断バクテリオファージλである。両方のゲルで、ＰＣＲの鋳型としてゲノムＤＮＡを加えた場合がレーン１で、添加しなかったのがレーン２である。下：ＳｔＡＲ遺伝子の３’半分のマップを示す。中が白い四角はエクソンを示し、各エクソンの最後に記した数字はｃＤＮＡ配列の対応するヌクレオチドの位置を示す（B.J. Clark, J. Wells, S.R. King, D.M. Stocco, J. Biol. Chem. 269:28314(1994)）。種々のＰＣＲプライマーおよび生成物の位置はマップの下に示す。センスプライマーＳ２は、５’ＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＴＧ−３’（４４２−４６２）で、アンチセンスプライマーＡＳ２は、５’−ＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡ−３’（７１７−７３８）であった。Ｓ２／ＡＳ２を用いるＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、４５秒；５８°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、６０秒で３５サイクルであった。センスプライマーＳ３は５’ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧ−３’であった。Ｓ３／ＡＳＩを用いるＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、５０秒；６４°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、９０秒で３５サイクルであった。
【図５】ＰＣＲ生成物の直接的な配列決定（seaquencing)を示す。（上）正常コントロール、患者１および患者の両親の直接ＰＣＲ配列決定（ダイナル社の方法(Dynal, Inc., Lake Success, ニューヨーク))である。矢印はナンセンス変異に含まれるヌクレオチドを示す：コントロールではＣ、患者１ではＴ、両親ではＣおよびＴ。（下）ＤＮＡとアミノ酸配列。
【図６】ＰＣＲ生成物の直接的な配列決定（seaquencing)を示す。正常コントロール、患者２および患者３の直接ＰＣＲ配列決定である。矢印はコントロールのＣ並びの患者２および患者２の両者のＴを示す。図５では、センスＰＣＲプライマー（Ｓ３）は図３で述べたが、ビオチン化アンチセンスプライマー（ＡＳ３）は５’ＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧ−３’であった。ＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、４５秒；６４°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、４５秒で３５サイクルであった。センスプライマー、５’ＧＡＴＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＣＡＣ−３’（６１３−６３０）を配列決定に用いた。図６では、センスビオチン化プライマー（Ｓ４）は５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴＡＧ−３’（１２０１−１２２３）であった。ＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、４５秒；６３°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、４５秒で３５サイクルであった。アンチセンスプライマーＡＳ１を直接配列決定に用いた。
【図７】類脂質ＣＡＨを引き起こす変異を示す。ＤＮＡ配列決定。下に示した正常配列は、エクソン５および６の接合部を示すが、一方、患者の配列はエクソン６に連結されたエクソン４を示している。
【図８】類脂質ＣＡＨを引き起こす変異を示す。イントロン変異。矢印は、イントロン４とエクソン５との接合部から１１ｂｐのＴ→Ａ変化を示す。
【図９】類脂質ＣＡＨを引き起こす変異を示す。患者の遺伝子とコードされるｍＲＮＡの概略図。イントロン４のＴ→Ａ変化（Ｘとして示す）は前駆体ｍＲＮＡのスプライシングを破壊し、エクソン５の欠失をもたらす。
【図１０】家族調査である。正常コントロール（Ｎ１）、患者（Ｐｔ）、父親（Ｆａ）および母親（Ｍｏ）のゲノムＤＮＡをプライマーＳ２およびＡＳ５で増幅し、４３２ｂｐの生成物を得た。ＤＮＡを未切断またはＮｃｏＩ（＋）で消化後電気泳動し、１００ｂｐラダーマーカーと比較し、臭化エチジウムで染色した。ＤＮＡのマップは下に示す。５’末端から７４ｂｐのＮｃｏＩ部位は、該ＤＮＡのＮｃｏによる完全消化の内部コントロールとして役立つことに留意されたい。
【図１１】ＳｔＡＲ遺伝子プロモーターのＤＮＡ配列である。主要な転写開始部位から転写された配列は肉太活字で示される。翻訳された配列には下線を施し、アミノ酸は一文字コードで示されている。ＴＡＴＡ様成分は枠で囲んだ。反復配列には下線を施した。
【図１２】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。プライマーＨＢ５５とＨＢ３４を用いた患者４の家族のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅とそれに続くＡｌｕＩ消化。患者のサンプルから２６５ｂｐバンドが得られ、その両親は２６５と１６２＋１０３ｂｐバンドについてヘテロ接合型で、正常コントロールは１６２および１０３ｂｐバンドのみを有する。
【図１３】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。患者５と６の家族、ＨＢ５５とＨＢ３４で増幅しＴｓｐ４５Ｉで切断した。患者は切断されない２９５ｂｐフラグメントを有し、コントロールは１７３ｂｐおよび１２２ｂｐフラグメントを有し、両親はヘテロ接合型である。
【図１４】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。患者７および９のＲ１８２Ｌをもつ対立遺伝子の遺伝的変動を示す。ＰＣＲはパネルＢの通りであった。すなわち、いずれの患者のＤＮＡもＴｓｐ４５Ｉでは切断されず、患者９はまたΔＴ５９３フレームシフト変異についてホモ接合型で、この変異はＡｖａＩＩ／Ｓａｕ９６Ｉ部位を破壊する（これはまた一定しない消化をもたらすＳｔｕＩ部位を生じる）。
【図１５】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。プライマーＢ２およびＡＳ１を用いた患者１０のＤＮＡのＰＣＲ増幅とそれに続くＥｓｐＩ消化。患者の２０３ｂｐフラグメントは消化されず、一方、コントロールは１０７および９６ｂｐ生成物に切断される。
【図１６】種々のヒト組織のＳｔＡＲｍＲＮＡの発現を示す。表示の組織から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを含むノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Clontech Laboratories)から購入し、ＳｔＡＲおよびβ−アクチンｃＤＮＡプローブで連続的に調べた。左のパネルＡのＳｔＡＲについてのオートラジオグラムは２４時間露光され、右のパネルＡのＳｔＡＲについてのオートラジオグラムは４時間露光された。アクチン（Ｂ）についてはブロットは両方とも２時間露光した。
【図１７】ｃＡＭＰによるヒト顆粒層細胞におけるＳｔＡＲｍＲＮＡ発現の調節である。ヒト顆粒層細胞の初代培養を４日間行ない、さらに８−ブロモ−ｃＡＭＰ（１．５ｍＭ）を２４時間いくつかのプレート（＋）に添加した。ヒト栄養膜細胞の初代培養もまた、１．５ｍＭ、２４時間の８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下（＋）または非存在下（−）で樹立した。全ＲＮＡを抽出し、ノザンブロットを実施し（５μｇＲＮＡ／レーン）、さらにブロットをＳｔＡＲおよび２８ＳｒＲＮＡｃＤＮＡプローブで連続的に調べた。オートラジオグラムを画像分析システム(Resource Technology, ナッシュビル、テネシー）で調べ、２８ＳｒＲＮＡと比較してヒト顆粒層細胞におけるＳｔＡＲｍＲＮＡの増加を決定した。この増加はある実験では３倍、別の実験では７倍であった。
【図１８】染色体８におけるＳｔＡＲ遺伝子の配置決定である。ゲノムＤＮＡを体細胞ハイブリッドパネルから単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、サザンブロットを実施した。ハイブリッドの名称と優勢なヒト染色体を表示するが、これは幾つかの事例では、該ハイブリッドに存在するただ１つのヒト染色体である。ヒトゲノムＤＮＡで見出されるものと一致するハイブリダイゼーションバンドは、ヒト染色体８を含むハイブリッドでのみ見出された。薄いバンドがハイブリッドＧＭ１０４７８で認められたが、これは、染色体２０の他に８ｐフラグメントを含むことが分かっている。
【図１９】体細胞ハイブリッドマッピングによるＳｔＡＲ遺伝子の８ｐに対する局部マッピングである。染色体８のイディオグラムをフランクの文献（U. Francke, Cytogenetics & Cell Genetics 65:206-219(1994))にしたがって修飾する。イディオグラムの右側は、それぞれの細胞株に存在するヒト染色体８の部分の概略を示す。当該染色体の細胞遺伝学地図上のこれらＤＮＡの境界の正確な位置はおおよそのものである。ＳｔＡＲ、ＬＰＬ、ＳＳおよびＣＬ１遺伝子はＰＣＲによって位置が決定された。遺伝子の存在は “＋”で示し、存在しない場合は“−”で示す。陰性コントロール細胞株、ＣＨＯ−Ｋ１（これはハムスターＤＮＡのみを含む）もまたこの実験に含めた（結果は示さず）。ＬＰＬ、ＳＳおよびＣＬ１のこの位置決定は先に報告された結果と一致する（K.L. Wion, T.G. Kirchgessner, A.J. Lusis, M.c., Schotz, R.M. Lawn, Science 235:1638-1641(1987); T.M. Fink, M. Zimmer, J. Tschopp, J. Etienne, D.E. Jeene, P. Lichter, Genomics 16:526-528(1993); I. Schechter, D.G. Conrad, I. Hart, R.C. Berger, T.L. McKenzie, J. Bleskan, D. Patterson, Genomics 20:116-118(1994)）。
【図２０】ＹＡＣＦＩＳＨによるＳｔＡＲの機能的遺伝子座の８ｐ１１．２への配置決定。ＹＡＣＤＮＡをｄＵＴＰおよびｄＣＴＰを用いてニックトランスレーションを行ない、本文中に記載したようにスライド当たり１μｇの酵母ＤＮＡを用いて分裂中期分散標本とハイブリダイズさせた。このプローブをアビジン−ＦＩＴＣ（黄色）で検出し、染色体には沃化プロピジウム（赤色）で対比染色を施した。パネルＡのイディオグラムの左側の矢印は、８ｐ１１．２領域へのＡ１０Ｇ５ＹＡＣのＦＩＳＨ占有場所を示す
【図２１】ＳｔＡＲ偽遺伝子のヒト染色体１３への配置決定である。体細胞ハイブリッドＤＮＡのＰＣＲ分析は、ＳｔＡＲ偽遺伝子に特異的なプライマーで実施した。パネル左側にあるレーンの数字は、図１１で調べたハイブリッドを指す。ハイブリッド “１”（ＧＭ１０８８０）はヒト染色体１とともに１３および１４を含む。ハイブリッドＧＭ０７２９９Ａはヒト染色体Ｘおよび１を含み、Ｒ３７０−２２Ａはヒト染色体１および１３を含む。 “１３”と呼ばれるハイブリッドはヒト染色体１３のみを含む。コントロールは、ｐBluescript（Stratagene, ラホイヤ、カリフォルニア）でクローニングした偽遺伝子配列を指す。８００ヌクレオチドＳｔＡＲ偽遺伝子増幅生成物は、ヒト染色体１３を含むハイブリッドでのみ認められる。
【図２２】合成ＲＮＡのＲＮアーゼからの保護を示す。これは、エクソン４（１５０ｂｐ）の３’１５０塩基、エクソン５（１８５ｂｐ）およびベクター配列の５８ｂｐから成る放射能標識プローブにハイブリダイズさせることによって調べられた。３３５ｂｐ保護生成物はエクソン４および５に一致し、１８５ｂｐ生成物はエクソン５に、さらに１５０ｂｐのバンド群はエクソン４に一致する。
【図２３】放射能標識プローブ２とのハイブリダイゼーションによって調べた合成ＲＮＡのＲＮアーゼからの保護を示す。プローブ２は、エクソン４（１５０ｂｐ）の３’１５０塩基、変異イントロン４（１４１ｂｐ）、エクソン５（１８５ｂｐ）、エクソン６（９４ｂｐ）およびベクター配列の６８ｂｐから成る。このプローブをＲＮアーゼで消化する前に下記のサンプルとハイブリダイズさせた：レーン１および１１はコントロール一本鎖ヒト胎児副腎ｃＤＮＡ；レーン２および３は変異体（患者）または正常ＳｔＡＲミニ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のＲＮＡ；レーン４はｔＲＮＡ；レーン７−１０は患者または正常ＳｔＡＲミニ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のＲＮＡを核分画と細胞質分画とに分けたもの。主要な保護フラグメントのサイズおよび組成物は表示されている。オートラジオグラムの過剰露光は、６３８、５７０、４７１および２７９塩基フラグメントが患者の核ＲＮＡに存在することを示している（レーン１０）。
【図２４】図２３に記載したようにプローブ２とのハイブリダイゼーションで調べた患者のＲＮＡのＲＮアーゼからの保護を示す。主要な保護フラグメントのサイズおよび組成は表示されている。

Claims (8)

1. 単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子であって：
   （１）配列番号２に示されるｈＳｔＡＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列；
   （２）配列番号２に示されるｈＳｔＡＲタンパク質のアミノ酸配列中、第１６９位、第１８２位、第１９３位、第２１８位、第２５８位、第２７２位、または第２７５位にアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ配列；
   （３）配列番号２に示されるｈＳｔＡＲタンパク質のアミノ酸配列中、第４１位、第１５６位、第１７５位、または第２７４位においてフレームシフト変異を生じるアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ配列；
   （４）配列番号２に示されるｈＳｔＡＲタンパク質のアミノ酸配列中、該タンパク質をコードするｃＤＮＡのエクソン５開始部である第５９２位のヌクレオチドに該当する部位へのヌクレオチド挿入変異により、該タンパク質の短縮する変異を生じるアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ配列；
   （５）配列番号２に示されるｈＳｔＡＲタンパク質のアミノ酸配列中、該タンパク質をコードするｃＤＮＡのエクソン５に由来するアミノ酸配列が欠失する変異を生じているアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ配列；
   （６）前記（１）、（２）、（３）、（４）、または（５）に対して相補的な配列；または
   （７）前記（１）、（２）、（３）、（４）、（５）または（６）においてＴがＵに置換されているＲＮＡ分子
   を含み、
   （ａ）先天性類脂質過形成の診断；
   （ｂ）先天性類脂質過形成を引き起こす遺伝子変異の検出；または
   （ｃ）先天性類脂質過形成を起こす遺伝的可能性の有無の判断
   に用い得ること
   を特徴とする、当該単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
2. 前記アミノ酸変異が、Ｇｌｕ¹⁶⁹→Ｌｙｓ変異、Ｇｌｕ¹⁶⁹→ＧＬｙ変異、Ａｒｇ¹⁸²→Ｌｅｕ変異、Ａｒｇ¹⁹³→Ｓｔｏｐ変異、Ａｌａ²¹⁸→Ｖａｌ変異、Ｇｌｎ²⁵⁸→Ｓｔｏｐ変異、Ａｒｇ²⁷²欠失変異、及びＬｅｕ²⁷⁵→Ｐｒｏ変異からなる群より選択されるアミノ酸変異であることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
3. 前記アミノ酸変異が、Ｃ⁷⁰³→Ｔ変異、Ｃ⁸⁹⁸→Ｔ変異、Ｇ²⁷⁴とＧ²⁴⁸の間へのＧ挿入変異、Ｇ⁶³¹→Ａ変異、Ａ⁶³²→Ｇ変異、Ｇ⁶⁷¹→Ｔ変異、Ｃ⁶⁵⁰欠失変異、Ｔ⁵⁹³欠失変異、Ｃ⁹⁴⁰−Ｃ⁹⁴²欠失変異、及びＧ⁹⁴⁷とＣ⁹⁴⁸の間へのＡ挿入変異からなる群より選択されるヌクレオチド変異に由来するアミノ酸変異であることを特徴とする、請求項２に記載の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
4. 前記ＤＮＡ配列（５）または該ＤＮＡ配列（５）においてＴがＵに置換されているＲＮＡ配列を含むこと、及び、イントロン４とエクソン５との接合部においてエクソン５翻訳開始部より１１塩基上流に存在するTがAに変異していることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
5. 前記変異により、直接的または間接的に、ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子の転写が抑制されることを特徴とする請求項１に記載の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
6. 前記変異により、直接的または間接的に、ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制されることを特徴とする請求項１に記載の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
7. 前記変異により、直接的または間接的に、ステロイド生成急性調節蛋白のｍＲＮＡの安定性が減少することを特徴とする請求項１に記載の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
8. （１）配列番号１に示されたｈＳｔＡＲｃＤＮＡヌクレオチド配列、または、配列番号１に示されたｈＳｔＡＲｃＤＮＡヌクレオチド配列におけるエクソン１該当部位のヌクレオチド配列、表６−１乃至６−３に説明されたｈＳｔＡＲゲノムＤＮＡのエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７またはイントロン４を含むヌクレオチド配列において、
   Ｃ⁷⁰³→Ｔ変異、Ｃ⁸⁹⁸→Ｔ変異、Ｇ²⁷⁴とＧ²⁴⁸の間へのＧ挿入変異、Ｇ⁶³¹→Ａ変異、Ａ⁶³²→Ｇ変異、Ｇ⁶⁷¹→Ｔ変異、Ｃ⁶⁵⁰欠失変異、Ｔ⁵⁹³欠失変異、Ｃ⁹⁴⁰−Ｃ⁹⁴²欠失変異、Ｇ⁹⁴⁷とＣ⁹⁴⁸の間へのＡ挿入変異，及び、イントロン４とエクソン５との接合部においてエクソン５翻訳開始部より１１塩基上流に存在するTがAに置換される変異
   からなる群より選択されるヌクレオチド変異を含むこと；または
   （２）前記配列（１）に対して相補的であること
   を特徴とする配列 を含むＤＮＡ配列、または
   前記配列（１）または（２）においてＴがＵに置換されているＲＮＡ配列
   を含むことを特徴とする、先天性類脂質過形成診断用プローブまたは先天性類脂質過形成診断用プライマー。

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