JP3099896B2 - 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 - Google Patents
先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定Info
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- JP3099896B2 JP3099896B2 JP08528624A JP52862496A JP3099896B2 JP 3099896 B2 JP3099896 B2 JP 3099896B2 JP 08528624 A JP08528624 A JP 08528624A JP 52862496 A JP52862496 A JP 52862496A JP 3099896 B2 JP3099896 B2 JP 3099896B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、特許出願第08/410540号（これは援用され
て本明細書に含まれる）の一部継続出願である。
て本明細書に含まれる）の一部継続出願である。
謝辞 本発明は、NIHグラントHD06274、HD07688、HD17481、
RR000847、DK37922およびDK42154によって部分的に支援
された。合衆国政府は本発明に関して権利を有する。
RR000847、DK37922およびDK42154によって部分的に支援
された。合衆国政府は本発明に関して権利を有する。
序 技術分野 本発明は、先天性類脂質副腎過形成（類脂質CAH）を
引き起こす変異座位として認定された遺伝子配列、およ
び本疾患の診断、さらに該疾患の遺伝的伝達可能性の指
標として該変異遺伝子存在を検出する方法に関する。
引き起こす変異座位として認定された遺伝子配列、およ
び本疾患の診断、さらに該疾患の遺伝的伝達可能性の指
標として該変異遺伝子存在を検出する方法に関する。
背景 ステロイドホルモン合成は、トロピックホルモン刺激
に反応して大きく増加する。もっともステロイド生成酵
素をコードする遺伝子の転写増加は長期のホルモン反応
に重要であるが、急性反応における速度制限工程は、ミ
トコンドリアへのコレステロールの輸送である（J.F.Cr
ivelloら、J.Biol.Chem.255:8144（1980）;C.R.Jefcoat
eら、J.Steroid Biochem.27:721（1987））。この輸送
に関与する幾つかの分子が提唱されたが、それらの役割
は未だ明確にはなっていない。
に反応して大きく増加する。もっともステロイド生成酵
素をコードする遺伝子の転写増加は長期のホルモン反応
に重要であるが、急性反応における速度制限工程は、ミ
トコンドリアへのコレステロールの輸送である（J.F.Cr
ivelloら、J.Biol.Chem.255:8144（1980）;C.R.Jefcoat
eら、J.Steroid Biochem.27:721（1987））。この輸送
に関与する幾つかの分子が提唱されたが、それらの役割
は未だ明確にはなっていない。
初期の実験によって、先天性類脂質副腎過形成（類脂
質CAH）は、副腎および性腺ステロイドホルモンの重篤
な欠乏という特徴をもつ（H.J.Degenhartら、Acta Endo
chrinol.71:215（1972）;S.Koizumiら、Clin.Chem.Acta
77:301（1977）;B.P.Hauffaら、Clin.Endocrinol.23:4
81（1985））常染色体の劣性障害であることが示された
（Praderら、Helv.Paed Acta 17:285−289（1962））。
罹患幼児は、ステロイドホルモンの修復処置がなければ
塩欠失、高カリウム血症性アシドーシス、脱水のために
死亡する。最初に報告された32名の患者の調査で、遺伝
的に男女は等しい頻度で罹患することが示唆されたが、
ただし性別は、しばしば性腺の外観および組織学的状況
または口腔塗抹標本から推量された（Hauffaら、198
5）。XY遺伝型の男性患者は、精巣のテストステロン合
成の欠如のために女性外性器をもつ。障害された副腎お
よび性腺のミトコンドリアは、コレステロールからプレ
グネノロンへの変換ができないので、この疾患は、以前
にはコレステロール側鎖切断酵素（P450scc）における
欠陥のためであると考えられた。しかしながら、P450sc
cの関与は罹患者の分子遺伝学的分析によって除外され
た（D.Linら、J.Clin.Invest.88:1955（1991）;Y.Sakai
ら、J.Clin.Endocrinol.Metab.79:1198（1994））。本
出願人らは、この欠陥はコレステロールのミトコンドリ
アへの輸送に深くかかわっているであろうと推論した
（D.Linら、J.Clin.Invest.88:1955（1991）;D.Linら、
Genomics 18:643（1993））。しかしながら、類脂質CAH
に関する分子的欠陥のこの最新の解釈より以前には、こ
の疾患に付随する特定の欠陥は全く知られていなかっ
た。
質CAH）は、副腎および性腺ステロイドホルモンの重篤
な欠乏という特徴をもつ（H.J.Degenhartら、Acta Endo
chrinol.71:215（1972）;S.Koizumiら、Clin.Chem.Acta
77:301（1977）;B.P.Hauffaら、Clin.Endocrinol.23:4
81（1985））常染色体の劣性障害であることが示された
（Praderら、Helv.Paed Acta 17:285−289（1962））。
罹患幼児は、ステロイドホルモンの修復処置がなければ
塩欠失、高カリウム血症性アシドーシス、脱水のために
死亡する。最初に報告された32名の患者の調査で、遺伝
的に男女は等しい頻度で罹患することが示唆されたが、
ただし性別は、しばしば性腺の外観および組織学的状況
または口腔塗抹標本から推量された（Hauffaら、198
5）。XY遺伝型の男性患者は、精巣のテストステロン合
成の欠如のために女性外性器をもつ。障害された副腎お
よび性腺のミトコンドリアは、コレステロールからプレ
グネノロンへの変換ができないので、この疾患は、以前
にはコレステロール側鎖切断酵素（P450scc）における
欠陥のためであると考えられた。しかしながら、P450sc
cの関与は罹患者の分子遺伝学的分析によって除外され
た（D.Linら、J.Clin.Invest.88:1955（1991）;Y.Sakai
ら、J.Clin.Endocrinol.Metab.79:1198（1994））。本
出願人らは、この欠陥はコレステロールのミトコンドリ
アへの輸送に深くかかわっているであろうと推論した
（D.Linら、J.Clin.Invest.88:1955（1991）;D.Linら、
Genomics 18:643（1993））。しかしながら、類脂質CAH
に関する分子的欠陥のこの最新の解釈より以前には、こ
の疾患に付随する特定の欠陥は全く知られていなかっ
た。
発明の要旨 したがって、本発明の目的は、ヒトの先天性類脂質過
形成の遺伝学的診断方法を提供することである。
形成の遺伝学的診断方法を提供することである。
本発明の別の目的は、遺伝学的カウンセリングで使用
するためにヒトの先天性類脂質副腎過形成の原因となる
遺伝子の変異の有無を検出することである。
するためにヒトの先天性類脂質副腎過形成の原因となる
遺伝子の変異の有無を検出することである。
本発明のまた別の目的は、該疾患をもつ患者で不完全
蛋白と交換する蛋白を提供することによって、ヒトの先
天性類脂質副腎下過形成を治療する方法を提供すること
である。
蛋白と交換する蛋白を提供することによって、ヒトの先
天性類脂質副腎下過形成を治療する方法を提供すること
である。
本発明のまた別の目的は、ミトコンドリアの異常なコ
レステロール代謝が本発明の蛋白に反応する酵素によっ
て支配されているということを条件として、該疾患をも
つ患者で不完全蛋白と交換する蛋白を提供することによ
って、当該代謝により引き起こされる高コレステロール
血症または他の疾患を治療または予防する方法を提供す
ることである。
レステロール代謝が本発明の蛋白に反応する酵素によっ
て支配されているということを条件として、該疾患をも
つ患者で不完全蛋白と交換する蛋白を提供することによ
って、当該代謝により引き起こされる高コレステロール
血症または他の疾患を治療または予防する方法を提供す
ることである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の蛋白（本発明の
突然変異蛋白）の発現のためのプロモーター、または哺
乳類細胞もしくは遺伝子移入哺乳類での異種遺伝子発現
のためのプロモーター、または遺伝子治療用異種遺伝子
の発現のためのプロモーターを提供することである。
突然変異蛋白）の発現のためのプロモーター、または哺
乳類細胞もしくは遺伝子移入哺乳類での異種遺伝子発現
のためのプロモーター、または遺伝子治療用異種遺伝子
の発現のためのプロモーターを提供することである。
上記のような目的および以下で一層容易に明らかにな
るその他の目的は、単離されたDNAまたはRNA分子を提供
することによって達成されるが、この場合、当該分子
は：（１）図１、表６または表７で説明するヒトステロ
イド生成急性調節蛋白（hStAR）cDNA、hStARゲノムDN
A、hSTARプロモーターまたはhStAR偽遺伝子から成る第
一の配列、（２）少なくとも長さが10ヌクレオチドの、
第一の配列のサブ配列である第二の配列、（３）第一ま
たは第二の配列の少なくとも１個のヌクレオチドが異な
るヌクレオチドで置換されている第三の配列、（４）当
該第一または第二の配列で少なくとも１個のヌクレオチ
ドが欠失しているか、または挿入されている第四の配
列、または（５）第一、第二または第三のいずれかに相
補的な第五の配列を含み、この場合、（１）該分子がRN
A分子の場合、この分子の配列でＴはＵと置換され、
（２）第三の配列は第一または第二の配列に対して少な
くとも95％同一で、さらに（３）第二の配列はマウスSt
ARcDNAに存在しないことを条件とする。本発明はまた、
ヒトの変異StAR遺伝子（例えば先天性類脂質副腎過形成
に付随するような変異）を検出する方法を提供する。
るその他の目的は、単離されたDNAまたはRNA分子を提供
することによって達成されるが、この場合、当該分子
は：（１）図１、表６または表７で説明するヒトステロ
イド生成急性調節蛋白（hStAR）cDNA、hStARゲノムDN
A、hSTARプロモーターまたはhStAR偽遺伝子から成る第
一の配列、（２）少なくとも長さが10ヌクレオチドの、
第一の配列のサブ配列である第二の配列、（３）第一ま
たは第二の配列の少なくとも１個のヌクレオチドが異な
るヌクレオチドで置換されている第三の配列、（４）当
該第一または第二の配列で少なくとも１個のヌクレオチ
ドが欠失しているか、または挿入されている第四の配
列、または（５）第一、第二または第三のいずれかに相
補的な第五の配列を含み、この場合、（１）該分子がRN
A分子の場合、この分子の配列でＴはＵと置換され、
（２）第三の配列は第一または第二の配列に対して少な
くとも95％同一で、さらに（３）第二の配列はマウスSt
ARcDNAに存在しないことを条件とする。本発明はまた、
ヒトの変異StAR遺伝子（例えば先天性類脂質副腎過形成
に付随するような変異）を検出する方法を提供する。
図面の簡単な説明 本発明をこれから概説するが、本発明は、本明細書の
部分を構成する図面および下記の具体例についての詳細
な説明を参考になお一層理解が容易となるであろう。
部分を構成する図面および下記の具体例についての詳細
な説明を参考になお一層理解が容易となるであろう。
図１は、ヒトStARcDNA（hStARDNA）のヌクレオチド配
列および推定アミノ酸配列である。蛋白キナーゼＡおよ
び蛋白キナーゼＣ仲介燐酸化の可能な部位にはそれぞれ
一本下線および二本下線が付されている。
列および推定アミノ酸配列である。蛋白キナーゼＡおよ
び蛋白キナーゼＣ仲介燐酸化の可能な部位にはそれぞれ
一本下線および二本下線が付されている。
図２は、患者のStARcDNAのナンセンス変異の検出であ
る。上：正常（NL）ヒト胎児副腎および精巣RNA、患者
１および２の精巣RNA並びに無RNAコントロールから得た
StARのRT−PCR生成物を１％臭化エチジウム染色アガロ
ースゲル上に表示。分子サイズマーカーはHind III切断
バクテリオファージλである。下:StARcDNAのマップ。R
193→Stopは、Arg193（CGA）に代わりに終止暗号（TG
A）への置換、さらにQ258→Stopは、Gln258に代わり終
止暗号（TGA）への置換である。中が白い四角はStARcDN
Aのコード領域を表す。マップ下の短い棒線はPCRプライ
マーを示す。センスプライマーS1の配列は５′−GCAGCA
GCAGCGGCAGCA−３′（cDNA内の位置は66−84）で、アン
チセンスプライマーAS1は５′−ATGAGCGTGTGTACCAGTGCA
G−３′（1016−1037）であった。PCRプログラムは、94
℃、45秒;64℃、30秒;72℃、60秒で30サイクルであっ
た。
る。上：正常（NL）ヒト胎児副腎および精巣RNA、患者
１および２の精巣RNA並びに無RNAコントロールから得た
StARのRT−PCR生成物を１％臭化エチジウム染色アガロ
ースゲル上に表示。分子サイズマーカーはHind III切断
バクテリオファージλである。下:StARcDNAのマップ。R
193→Stopは、Arg193（CGA）に代わりに終止暗号（TG
A）への置換、さらにQ258→Stopは、Gln258に代わり終
止暗号（TGA）への置換である。中が白い四角はStARcDN
Aのコード領域を表す。マップ下の短い棒線はPCRプライ
マーを示す。センスプライマーS1の配列は５′−GCAGCA
GCAGCGGCAGCA−３′（cDNA内の位置は66−84）で、アン
チセンスプライマーAS1は５′−ATGAGCGTGTGTACCAGTGCA
G−３′（1016−1037）であった。PCRプログラムは、94
℃、45秒;64℃、30秒;72℃、60秒で30サイクルであっ
た。
図３は、StAR遺伝子のPCRマッピングである。上：左
のパネルは、２％臭化エチジウム染色アガロースゲル上
に表示したプライマーS2/AS2で増幅したゲノムPCR生成
物。分子サイズマーカーはHae III切断バクテリオファ
ージΦx174である。右パネルは、１％アガロースゲル上
に表示したプライマーS3/AS1で増幅したゲノムPCR生成
物。分子サイズマーカーはHind III切断バクテリオファ
ージλである。両方のゲルで、PCRの鋳型としてゲノムD
NAを加えた場合がレーン１で、添加しなかったのがレー
ン２である。下:StAR遺伝子の３′半分のマップを示
す。中が白い四角はエクソンを示し、各エクソンの最後
に記した数字はcDNA配列の対応するヌクレオチドの位置
を示す（B.J.Clark,J.Wells,S.R.King,D.M.Stocco,J.Bi
ol.Chem.269:28314（1994））。種々のPCRプライマーお
よび生成物の位置はマップの下に示す。センスプライマ
ーS2は、５′GACAAAGTGATGAGTAAAGTG−３′（442−46
2）で、アンチセンスプライマーAS2は、５′−TGTGGCCA
TGCCAGCCAGCA−３′（717−738）であった。S2/AS2を用
いるPCRプログラムは、94℃、45秒;58℃、30秒;72℃、6
0秒で35サイクルであった。センスプライマーS3は５′G
TGAGCAAAGTCCAGGTGCG−３′であった。S3/ASIを用いるP
CRプログラムは、94℃、50秒;64℃、30秒;72℃、90秒で
35サイクルであった。
のパネルは、２％臭化エチジウム染色アガロースゲル上
に表示したプライマーS2/AS2で増幅したゲノムPCR生成
物。分子サイズマーカーはHae III切断バクテリオファ
ージΦx174である。右パネルは、１％アガロースゲル上
に表示したプライマーS3/AS1で増幅したゲノムPCR生成
物。分子サイズマーカーはHind III切断バクテリオファ
ージλである。両方のゲルで、PCRの鋳型としてゲノムD
NAを加えた場合がレーン１で、添加しなかったのがレー
ン２である。下:StAR遺伝子の３′半分のマップを示
す。中が白い四角はエクソンを示し、各エクソンの最後
に記した数字はcDNA配列の対応するヌクレオチドの位置
を示す（B.J.Clark,J.Wells,S.R.King,D.M.Stocco,J.Bi
ol.Chem.269:28314（1994））。種々のPCRプライマーお
よび生成物の位置はマップの下に示す。センスプライマ
ーS2は、５′GACAAAGTGATGAGTAAAGTG−３′（442−46
2）で、アンチセンスプライマーAS2は、５′−TGTGGCCA
TGCCAGCCAGCA−３′（717−738）であった。S2/AS2を用
いるPCRプログラムは、94℃、45秒;58℃、30秒;72℃、6
0秒で35サイクルであった。センスプライマーS3は５′G
TGAGCAAAGTCCAGGTGCG−３′であった。S3/ASIを用いるP
CRプログラムは、94℃、50秒;64℃、30秒;72℃、90秒で
35サイクルであった。
図４はPCR生成物の直接的な配列決定（seaquencing）
を示す。（Ａ）（上）は、正常コントロール、患者１お
よび患者の両親の直接PCR配列決定（ダイナル社の方法
（Dynal,Inc.,Lake Success,ニューヨーク））である。
矢印はナンセンス変異に含まれるヌクレオチドを示す：
コントロールではＣ、患者１ではＴ、両親ではＣおよび
Ｔ。（下）DNAとアミノ酸配列。（Ｂ）正常コントロー
ル、患者２および患者３の直接PCR配列決定である。矢
印はコントロールのＣ並びの患者２および患者２の両者
のＴを示す。（Ａ）では、センスPCRプライマー（S3）
は図２で述べたが、ビオチン化アンチセンスプライマー
（AS3）は５′GGATGCAGTCCACATGCTTGG−３′であった。
PCRプログラムは、94℃、45秒;64℃、30秒;72℃、45秒
で35サイクルであった。センスプライマー、５′GATACA
TTCATTACTCAC−３′（613−630）を配列決定に用いた。
（Ｂ）では、センスビオチン化プライマー（S4）は５′
−CCTGGCAGCCTGTTTGTGATAG−３′（1201−1223）であっ
た。PCRプログラムは、94℃、45秒;63℃、30秒;72℃、4
5秒で35サイクルであった。アンチセンスプライマーAS1
を直接配列決定に用いた。
を示す。（Ａ）（上）は、正常コントロール、患者１お
よび患者の両親の直接PCR配列決定（ダイナル社の方法
（Dynal,Inc.,Lake Success,ニューヨーク））である。
矢印はナンセンス変異に含まれるヌクレオチドを示す：
コントロールではＣ、患者１ではＴ、両親ではＣおよび
Ｔ。（下）DNAとアミノ酸配列。（Ｂ）正常コントロー
ル、患者２および患者３の直接PCR配列決定である。矢
印はコントロールのＣ並びの患者２および患者２の両者
のＴを示す。（Ａ）では、センスPCRプライマー（S3）
は図２で述べたが、ビオチン化アンチセンスプライマー
（AS3）は５′GGATGCAGTCCACATGCTTGG−３′であった。
PCRプログラムは、94℃、45秒;64℃、30秒;72℃、45秒
で35サイクルであった。センスプライマー、５′GATACA
TTCATTACTCAC−３′（613−630）を配列決定に用いた。
（Ｂ）では、センスビオチン化プライマー（S4）は５′
−CCTGGCAGCCTGTTTGTGATAG−３′（1201−1223）であっ
た。PCRプログラムは、94℃、45秒;63℃、30秒;72℃、4
5秒で35サイクルであった。アンチセンスプライマーAS1
を直接配列決定に用いた。
図５は類脂質CAHを引き起こす変異を示す。A:DNA配列
決定。下に示した正常配列は、エクソン５および６の接
合部を示すが、一方、患者の配列はエクソン６に連結さ
れたエクソン４を示している。B:イントロン変異。矢印
は、イントロン４とエクソン５との接合部から11bpのＴ
→Ａ変化を示す。C:患者の遺伝子とコードされるmRNAの
概略図。イントロン４のＴ→Ａ変化（Ｘとして示す）は
前駆体mRNAのスプライシングを破壊し、エクソン５の欠
失をもたらす。
決定。下に示した正常配列は、エクソン５および６の接
合部を示すが、一方、患者の配列はエクソン６に連結さ
れたエクソン４を示している。B:イントロン変異。矢印
は、イントロン４とエクソン５との接合部から11bpのＴ
→Ａ変化を示す。C:患者の遺伝子とコードされるmRNAの
概略図。イントロン４のＴ→Ａ変化（Ｘとして示す）は
前駆体mRNAのスプライシングを破壊し、エクソン５の欠
失をもたらす。
図６は家族調査である。正常コントロール（N1）、患
者（Pt）、父親（Fa）および母親（Mo）のゲノムDNAを
プライマーS2およびAS5で増幅し、432bpの生成物を得
た。DNAを未切断またはNco I（＋）で消化後電気泳動
し、100bpラダーマーカーと比較し、臭化エチジウムで
染色した。DNAのマップは下に示す。５′末端から74bp
のNco I部位は、該DNAのNcoによる完全消化の内部コン
トロールとして役立つことに留意されたい。
者（Pt）、父親（Fa）および母親（Mo）のゲノムDNAを
プライマーS2およびAS5で増幅し、432bpの生成物を得
た。DNAを未切断またはNco I（＋）で消化後電気泳動
し、100bpラダーマーカーと比較し、臭化エチジウムで
染色した。DNAのマップは下に示す。５′末端から74bp
のNco I部位は、該DNAのNcoによる完全消化の内部コン
トロールとして役立つことに留意されたい。
図７はStAR遺伝子プロモーターのDNA配列である。主
要な転写開始部位から転写された配列は肉太活字で示さ
れる。翻訳された配列には下線を施し、アミノ酸は一文
字コードで示されている。TATA様成分は枠で囲んだ。反
復配列には下線を施した。
要な転写開始部位から転写された配列は肉太活字で示さ
れる。翻訳された配列には下線を施し、アミノ酸は一文
字コードで示されている。TATA様成分は枠で囲んだ。反
復配列には下線を施した。
図８は類脂質CAHのPCR診断である。A:プライマーHB55
とHB34を用いた患者４の家族のゲノムDNAのPCR増幅とそ
れに続くAlu I消化。患者のサンプルから265bpバンドが
得られ、その両親は265と162＋103bpバンドについてヘ
テロ接合型で、正常コントロールは162および103bpバン
ドのみを有する。B:患者５と６の家族、HB55とHB34で増
幅しTsp45 Iで切断した。患者は切断されない295bpフラ
グメントを有し、コントロールは173bpおよび122bpフラ
グメントを有し、両親はヘテロ接合型である。C:患者７
および９のR182Lをもつ対立遺伝子の遺伝的変動を示
す。PCRはパネルＢの通りであった。すなわち、いずれ
の患者のDNAもTsp45 Iでは切断されず、患者９はまたΔ
T593フレームシフト変異についてホモ接合型で、この変
異はAva II/Sau96 I部位を破壊する（これはまた一定し
ない消化をもたらすStu I部位を生じる）。D:プライマ
ーB2およびAS1を用いた患者10のDNAのPCR増幅とそれに
続くEsp I消化。患者の203bpフラグメントは消化され
ず、一方、コントロールは107および96bp生成物に切断
される。
とHB34を用いた患者４の家族のゲノムDNAのPCR増幅とそ
れに続くAlu I消化。患者のサンプルから265bpバンドが
得られ、その両親は265と162＋103bpバンドについてヘ
テロ接合型で、正常コントロールは162および103bpバン
ドのみを有する。B:患者５と６の家族、HB55とHB34で増
幅しTsp45 Iで切断した。患者は切断されない295bpフラ
グメントを有し、コントロールは173bpおよび122bpフラ
グメントを有し、両親はヘテロ接合型である。C:患者７
および９のR182Lをもつ対立遺伝子の遺伝的変動を示
す。PCRはパネルＢの通りであった。すなわち、いずれ
の患者のDNAもTsp45 Iでは切断されず、患者９はまたΔ
T593フレームシフト変異についてホモ接合型で、この変
異はAva II/Sau96 I部位を破壊する（これはまた一定し
ない消化をもたらすStu I部位を生じる）。D:プライマ
ーB2およびAS1を用いた患者10のDNAのPCR増幅とそれに
続くEsp I消化。患者の203bpフラグメントは消化され
ず、一方、コントロールは107および96bp生成物に切断
される。
図９は、種々のヒト組織のStARmRNAの発現を示す。表
示の組織から単離したポリ（Ａ）＋RNA2μｇを含むノザ
ンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Clontech L
aboratories）から購入し、StARおよびβ−アクチンcDN
Aプローブで連続的に調べた。左のパネルＡのStARにつ
いてのオートラジオグラムは24時間露光され、右のパネ
ルＡのStARについてのオートラジオグラムは４時間露光
された。アクチン（Ｂ）についてはブロットは両方とも
２時間露光した。
示の組織から単離したポリ（Ａ）＋RNA2μｇを含むノザ
ンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Clontech L
aboratories）から購入し、StARおよびβ−アクチンcDN
Aプローブで連続的に調べた。左のパネルＡのStARにつ
いてのオートラジオグラムは24時間露光され、右のパネ
ルＡのStARについてのオートラジオグラムは４時間露光
された。アクチン（Ｂ）についてはブロットは両方とも
２時間露光した。
図10は、cAMPによるヒト顆粒層細胞におけるStARmRNA
発現の調節である。ヒト顆粒層細胞の初代培養を４日間
行ない、さらに８−ブロモ−cAMP（1.5mM）を24時間い
くつかのプレート（＋）に添加した。ヒト栄養膜細胞の
初代培養もまた、1.5mM、24時間の８−ブロモ−cAMPの
存在下（＋）または非存在下（−）で樹立した。全RNA
を抽出し、ノザンブロットを実施し（５μgRNA/レー
ン）、さらにブロットをStARおよび28SrRNAcDNAプロー
ブで連続的に調べた。オートラジオグラムを画像分析シ
ステム（Resource Technology,ナッシュビル、テネシ
ー）で調べ、28SrRNAと比較してヒト顆粒層細胞におけ
るStARmRNAの増加を決定した。この増加はある実験では
３倍、別の実験では７倍であった。
発現の調節である。ヒト顆粒層細胞の初代培養を４日間
行ない、さらに８−ブロモ−cAMP（1.5mM）を24時間い
くつかのプレート（＋）に添加した。ヒト栄養膜細胞の
初代培養もまた、1.5mM、24時間の８−ブロモ−cAMPの
存在下（＋）または非存在下（−）で樹立した。全RNA
を抽出し、ノザンブロットを実施し（５μgRNA/レー
ン）、さらにブロットをStARおよび28SrRNAcDNAプロー
ブで連続的に調べた。オートラジオグラムを画像分析シ
ステム（Resource Technology,ナッシュビル、テネシ
ー）で調べ、28SrRNAと比較してヒト顆粒層細胞におけ
るStARmRNAの増加を決定した。この増加はある実験では
３倍、別の実験では７倍であった。
図11は、染色体８におけるStAR遺伝子の配置決定であ
る。ゲノムDNAを体細胞ハイブリッドパネルから単離
し、Hind IIIで消化し、サザンブロットを実施した。ハ
イブリッドの名称と優勢なヒト染色体を表示するが、こ
れは幾つかの事例では、該ハイブリッドに存在するただ
１つのヒト染色体である。ヒトゲノムDNAで見出される
ものと一致するハイブリダイゼーションバンドは、ヒト
染色体８を含むハイブリッドでのみ見出された。薄いバ
ンドがハイブリッドGM10478で認められたが、これは、
染色体20の他に8pフラグメントを含むことが分かってい
る。
る。ゲノムDNAを体細胞ハイブリッドパネルから単離
し、Hind IIIで消化し、サザンブロットを実施した。ハ
イブリッドの名称と優勢なヒト染色体を表示するが、こ
れは幾つかの事例では、該ハイブリッドに存在するただ
１つのヒト染色体である。ヒトゲノムDNAで見出される
ものと一致するハイブリダイゼーションバンドは、ヒト
染色体８を含むハイブリッドでのみ見出された。薄いバ
ンドがハイブリッドGM10478で認められたが、これは、
染色体20の他に8pフラグメントを含むことが分かってい
る。
図12 A:体細胞ハイブリッドマッピングによるStAR遺
伝子の8pに対する局部マッピングである。染色体８のイ
ディオグラムをフランクの文献（U.Francke,Cytogeneti
cs ＆ Cell Genetics 65:206−219（1994））にしたが
って修飾する。イディオグラムの右側は、それぞれの細
胞株に存在するヒト染色体８の部分の概略を示す。当該
染色体の細胞遺伝学地図上のこれらDNAの境界の正確な
位置はおおよそのものである。StAR、LPL、SSおよびCL1
遺伝子はPCRによって位置が決定された。遺伝子の存在
は“＋”で示し、存在しない場合は“−”で示す。陰性
コントロール細胞株、CHO−K1（これはハムスターDNAの
みを含む）もまたこの実験に含めた（結果は示さず）。
LPL、SSおよびCL1のこの位置決定は先に報告された結果
と一致する（K.L.Wion,T.G.Kirchgessner,A.J.Lusis,M.
c.,Schotz,R.M.Lawn,Science 235:1638−1641（1987）;
T.M.Fink,M.Zimmer,J.Tschopp,J.Etienne,D.E.Jeene,P.
Lichter,Genomics 16:526−528（1993）;I.Schechter,
D.G.Conrad,I.Hart,R.C.Berger,T.L.McKenzie,J.Bleska
n,D.Patterson,Genomics 20:116−118（1994））。
伝子の8pに対する局部マッピングである。染色体８のイ
ディオグラムをフランクの文献（U.Francke,Cytogeneti
cs ＆ Cell Genetics 65:206−219（1994））にしたが
って修飾する。イディオグラムの右側は、それぞれの細
胞株に存在するヒト染色体８の部分の概略を示す。当該
染色体の細胞遺伝学地図上のこれらDNAの境界の正確な
位置はおおよそのものである。StAR、LPL、SSおよびCL1
遺伝子はPCRによって位置が決定された。遺伝子の存在
は“＋”で示し、存在しない場合は“−”で示す。陰性
コントロール細胞株、CHO−K1（これはハムスターDNAの
みを含む）もまたこの実験に含めた（結果は示さず）。
LPL、SSおよびCL1のこの位置決定は先に報告された結果
と一致する（K.L.Wion,T.G.Kirchgessner,A.J.Lusis,M.
c.,Schotz,R.M.Lawn,Science 235:1638−1641（1987）;
T.M.Fink,M.Zimmer,J.Tschopp,J.Etienne,D.E.Jeene,P.
Lichter,Genomics 16:526−528（1993）;I.Schechter,
D.G.Conrad,I.Hart,R.C.Berger,T.L.McKenzie,J.Bleska
n,D.Patterson,Genomics 20:116−118（1994））。
B:YACFISHによるStARの機能的遺伝子座の8p11.2への
配置決定。YACDNAをdUTPおよびdCTPを用いてニックトラ
ンスレーションを行ない、本文中に記載したようにスラ
イド当たり１μｇの酵母DNAを用いて分裂中期分散標本
とハイブリダイズさせた。このプローブをアビジン−FI
TC（黄色）で検出し、染色体には沃化プロピジウム（赤
色）で対比染色を施した。パネルＡのイディオグラムの
左側の矢印は、8p11.2領域へのA10G5YACのFISH占有場所
を示す 図13は、StAR偽遺伝子のヒト染色体13への配置決定で
ある。体細胞ハイブリッドDNAのPCR分析は、StAR偽遺伝
子に特異的はプライマーで実施した。パネル左側にある
レーンの数字は、図７で調べたハイブリッドを指す。ハ
イブリッド“1"（GM10880）はヒト染色体１とともに13
および14を含む。ハイブリッドGM07299Aはヒト染色体Ｘ
および１を含み、R370−22Aはヒト染色体１および13を
含む。“13"と呼ばれるハイブリッドはヒト染色体13の
みを含む。コントロールは、pBluescript（Stratagene,
ラホイヤ、カリフォルニア）でクローニングした偽遺伝
子配列を指す。800ヌクレオチドStAR偽遺伝子増幅生成
物は、ヒト染色体13を含むハイブリッドでのみ認められ
る。
配置決定。YACDNAをdUTPおよびdCTPを用いてニックトラ
ンスレーションを行ない、本文中に記載したようにスラ
イド当たり１μｇの酵母DNAを用いて分裂中期分散標本
とハイブリダイズさせた。このプローブをアビジン−FI
TC（黄色）で検出し、染色体には沃化プロピジウム（赤
色）で対比染色を施した。パネルＡのイディオグラムの
左側の矢印は、8p11.2領域へのA10G5YACのFISH占有場所
を示す 図13は、StAR偽遺伝子のヒト染色体13への配置決定で
ある。体細胞ハイブリッドDNAのPCR分析は、StAR偽遺伝
子に特異的はプライマーで実施した。パネル左側にある
レーンの数字は、図７で調べたハイブリッドを指す。ハ
イブリッド“1"（GM10880）はヒト染色体１とともに13
および14を含む。ハイブリッドGM07299Aはヒト染色体Ｘ
および１を含み、R370−22Aはヒト染色体１および13を
含む。“13"と呼ばれるハイブリッドはヒト染色体13の
みを含む。コントロールは、pBluescript（Stratagene,
ラホイヤ、カリフォルニア）でクローニングした偽遺伝
子配列を指す。800ヌクレオチドStAR偽遺伝子増幅生成
物は、ヒト染色体13を含むハイブリッドでのみ認められ
る。
図14は合成RNAのRNアーゼからの保護を示す。これ
は、エクソン４（150bp）の３′150塩基、エクソン５
（185bp）およびベクター配列の58bpから成る放射能標
識プローブにハイブリダイズさせることによって調べら
れた。335bp保護生成物はエクソン４および５に一致
し、185bp生成物はエクソン５に、さらに150bpのバンド
群はエクソン４に一致する。
は、エクソン４（150bp）の３′150塩基、エクソン５
（185bp）およびベクター配列の58bpから成る放射能標
識プローブにハイブリダイズさせることによって調べら
れた。335bp保護生成物はエクソン４および５に一致
し、185bp生成物はエクソン５に、さらに150bpのバンド
群はエクソン４に一致する。
図15は、放射能標識プローブ２とのハイブリダイゼー
ションによって調べた合成RNAのRNアーゼからの保護を
示す。プローブ２は、エクソン４（150bp）の３′150塩
基、変異イントロン４（141bp）、エクソン５（185b
p）、エクソン６（94bp）およびベクター配列の68bpか
ら成る。このプローブをRNアーゼで消化する前に下記の
サンプルとハイブリダイズさせた：レーン１および11は
コントロール一本鎖ヒト胎児副腎cDNA;レーン２および
３は変異体（患者）または正常StARミニ遺伝子をトラン
スフェクトしたCOS−１細胞のRNA;レーン４はtRNA;レー
ン７−10は患者または正常StARミニ遺伝子をトランスフ
ェクトしたCOS−１細胞のRNAを核分画と細胞質分画とに
分けたもの。主要な保護フラグメントのサイズおよび組
成物は表示されている。オートラジオグラムの過剰露光
は、638、570、471および270塩基フラグメントが患者の
核RNAに存在することを示している（レーン10）。
ションによって調べた合成RNAのRNアーゼからの保護を
示す。プローブ２は、エクソン４（150bp）の３′150塩
基、変異イントロン４（141bp）、エクソン５（185b
p）、エクソン６（94bp）およびベクター配列の68bpか
ら成る。このプローブをRNアーゼで消化する前に下記の
サンプルとハイブリダイズさせた：レーン１および11は
コントロール一本鎖ヒト胎児副腎cDNA;レーン２および
３は変異体（患者）または正常StARミニ遺伝子をトラン
スフェクトしたCOS−１細胞のRNA;レーン４はtRNA;レー
ン７−10は患者または正常StARミニ遺伝子をトランスフ
ェクトしたCOS−１細胞のRNAを核分画と細胞質分画とに
分けたもの。主要な保護フラグメントのサイズおよび組
成物は表示されている。オートラジオグラムの過剰露光
は、638、570、471および270塩基フラグメントが患者の
核RNAに存在することを示している（レーン10）。
図16は、図15に記載したようにプローブ２とのハイブ
リダイゼーションで調べた患者のRNAのRNアーゼからの
保護を示す。主要な保護フラグメントのサイズおよび組
成は表示されている。
リダイゼーションで調べた患者のRNAのRNアーゼからの
保護を示す。主要な保護フラグメントのサイズおよび組
成は表示されている。
特定の具体例についての説明 胎盤のプロジェステロン合成は妊娠維持に必要である
という以前に得られた示唆（J.F.Straussら、Endocrino
logy（内分泌学）、L.J.DeGroot編、３巻、2171−2206
ページ（W.B.Saunders,フィラデルフィア、1995））を
基にした研究から本発明は得られた。類脂質CAH胎児を
もつ妊娠は出産予定日まで正常に進行し、さらに当該胎
盤はプロジェステロンも産生することができる（P.Saen
gerら、J.Clin.Endocrinol.Metab.80:200−205（199
5））ので、本発明者らは、探索中の因子は副腎および
性腺のステロイド生成に必要であるが、胎盤のステロイ
ド合成には必要でないと推論した。最近報告された30kD
a燐酸化蛋白は、トロピック刺激に対する急激でシクロ
ヘキシミド感受性のステロイド生成反応を仲介すると考
えられる（D.M.Stocco ＆ T.C.Sodeman,J.Biol.Chem.26
6,19739（1991）;L.F.Epstein ＆ N.R.Orme−Johnson,
J.Biol.Chem.266,19739（1991）;D.M.Stocco ＆ M.Asco
li,Endocrinology,132,959（1993））。この蛋白、すな
わちステロイド生成急性調節蛋白（StAR）がMA−10マウ
スリーディッヒ（Leydig）腫瘍細胞から精製された。マ
ウスのStARcDNAのクローニングは科学文献に以前に報告
された（B.J.Clark,J.Wells,S.R.King,D.M.Stocco,J.Bi
ol.Chem.269:28314（1994））。我々の仮説、すなわち
この蛋白の遺伝的欠陥が類脂質CAHの原因であるという
ことが正しいか否かを決定するために、ヒトのStARcDNA
をクローニングした。ヒトStARcDNAのヌクレオチド配列
および推定アミノ酸配列は図４に示す。変異は図４にお
いてヌクレオチドの番号付けシステムで示されている。
さらに影響を受けるアミノ酸が番号付けシステムで表さ
れているが、この場合、ヌクレオチド127−129でコード
されるメチオニンがStAR蛋白の最初のアミノ酸である。
という以前に得られた示唆（J.F.Straussら、Endocrino
logy（内分泌学）、L.J.DeGroot編、３巻、2171−2206
ページ（W.B.Saunders,フィラデルフィア、1995））を
基にした研究から本発明は得られた。類脂質CAH胎児を
もつ妊娠は出産予定日まで正常に進行し、さらに当該胎
盤はプロジェステロンも産生することができる（P.Saen
gerら、J.Clin.Endocrinol.Metab.80:200−205（199
5））ので、本発明者らは、探索中の因子は副腎および
性腺のステロイド生成に必要であるが、胎盤のステロイ
ド合成には必要でないと推論した。最近報告された30kD
a燐酸化蛋白は、トロピック刺激に対する急激でシクロ
ヘキシミド感受性のステロイド生成反応を仲介すると考
えられる（D.M.Stocco ＆ T.C.Sodeman,J.Biol.Chem.26
6,19739（1991）;L.F.Epstein ＆ N.R.Orme−Johnson,
J.Biol.Chem.266,19739（1991）;D.M.Stocco ＆ M.Asco
li,Endocrinology,132,959（1993））。この蛋白、すな
わちステロイド生成急性調節蛋白（StAR）がMA−10マウ
スリーディッヒ（Leydig）腫瘍細胞から精製された。マ
ウスのStARcDNAのクローニングは科学文献に以前に報告
された（B.J.Clark,J.Wells,S.R.King,D.M.Stocco,J.Bi
ol.Chem.269:28314（1994））。我々の仮説、すなわち
この蛋白の遺伝的欠陥が類脂質CAHの原因であるという
ことが正しいか否かを決定するために、ヒトのStARcDNA
をクローニングした。ヒトStARcDNAのヌクレオチド配列
および推定アミノ酸配列は図４に示す。変異は図４にお
いてヌクレオチドの番号付けシステムで示されている。
さらに影響を受けるアミノ酸が番号付けシステムで表さ
れているが、この場合、ヌクレオチド127−129でコード
されるメチオニンがStAR蛋白の最初のアミノ酸である。
MA−10細胞およびCOS−１細胞でのマウスStARcDNAの
一過性の発現はステロイド生成の強化をもたらす（B.J.
Clark,J.Wells,S.R.King,D.M.Stocco,J.Biol.Chem.269:
28314（1994））。我々は、ヒトStARcDNAについて同様
な特性を発見し、さらにStARmRNAは副腎および性腺組織
で豊富であるが、胎盤では豊富ではないことを見出し
た。したがって、StARは、類脂質CAHに関与する因子と
して有力な候補であるように思える。これがきっかけと
なって、我々は無関係の19人の患者のStAR遺伝子を調べ
た。患者１（白人）はこれまで当技術分野の他の者によ
って報告されていない。患者２（朝鮮人）および患者３
（日本人）は以前に報告されたがStAR遺伝子については
報告されていない（患者3:B.P.Hauffaら、Clin.Endocri
nol.23:481（1985）；患者２および3:D.Linら、J.Clin.
Invest.88:1955（1991）；患者2:D.Linら、Genomics 1
8:643（1993））。
一過性の発現はステロイド生成の強化をもたらす（B.J.
Clark,J.Wells,S.R.King,D.M.Stocco,J.Biol.Chem.269:
28314（1994））。我々は、ヒトStARcDNAについて同様
な特性を発見し、さらにStARmRNAは副腎および性腺組織
で豊富であるが、胎盤では豊富ではないことを見出し
た。したがって、StARは、類脂質CAHに関与する因子と
して有力な候補であるように思える。これがきっかけと
なって、我々は無関係の19人の患者のStAR遺伝子を調べ
た。患者１（白人）はこれまで当技術分野の他の者によ
って報告されていない。患者２（朝鮮人）および患者３
（日本人）は以前に報告されたがStAR遺伝子については
報告されていない（患者3:B.P.Hauffaら、Clin.Endocri
nol.23:481（1985）；患者２および3:D.Linら、J.Clin.
Invest.88:1955（1991）；患者2:D.Linら、Genomics 1
8:643（1993））。
我々は、精巣mRNAを鋳型として用いて逆転写ポリメラ
ーゼ連鎖反応（RT−PCR）によって患者１および２からS
tARcDNAを作製した。５′および３′非翻訳領域由来のP
CRプライマーを用いたとき、主要な生成物はStARcDNAで
あったが、多数の配列の相違を含む関連種が存在した。
これは、下記実施例で報告するStAR偽遺伝子の発見をも
たらした。その偽遺伝子と真正のStARとを区別させる
５′非翻訳領域のS1と称する配列を用いて、我々は、正
常コントロールおよび２人の患者の974bpStARcDNAを増
幅させた。これらのRT−PCR生成物をpCR IIベクターを
用いてサブクローニングした。それぞれ別個のRT−PCR
反応から得た全患者クローンは、患者１のコドン193（A
rg）のＣからＴへの変化および患者２のコドン258（Gl
n）のＣからＴへの変化を除き、野性型配列と同一であ
った。これらは未成熟な終止コドンを生じ、それぞれＣ
末端から93または28アミノ酸を欠く変異蛋白を生じる。
ーゼ連鎖反応（RT−PCR）によって患者１および２からS
tARcDNAを作製した。５′および３′非翻訳領域由来のP
CRプライマーを用いたとき、主要な生成物はStARcDNAで
あったが、多数の配列の相違を含む関連種が存在した。
これは、下記実施例で報告するStAR偽遺伝子の発見をも
たらした。その偽遺伝子と真正のStARとを区別させる
５′非翻訳領域のS1と称する配列を用いて、我々は、正
常コントロールおよび２人の患者の974bpStARcDNAを増
幅させた。これらのRT−PCR生成物をpCR IIベクターを
用いてサブクローニングした。それぞれ別個のRT−PCR
反応から得た全患者クローンは、患者１のコドン193（A
rg）のＣからＴへの変化および患者２のコドン258（Gl
n）のＣからＴへの変化を除き、野性型配列と同一であ
った。これらは未成熟な終止コドンを生じ、それぞれＣ
末端から93または28アミノ酸を欠く変異蛋白を生じる。
これら変異の同一性を確認するために、我々の患者の
ゲノムDNAのStAR遺伝子を調べた。StAR遺伝子の構造が
不明であるので、この変異が収容されているエクソンを
含むゲノムクローンを得るために先ずPCRを用いた。こ
れは、cDNA配列由来のセンスプライマーおよびアンチセ
ンスプライマーの種々の組み合わせを用い、正常なゲノ
ムDNAを増幅させることによって実施した。図３に示す
ように、プライマー対S2/AS2によって、437bpと290bpの
２つの特異的な生成物が得られた。437bpフラグメント
の配列は、cDNAとその両末端で完璧に適合し、中央に14
1bpのイントロンを含み、したがってStAR遺伝子に由来
するものである。290bpフラグメントはStAR偽遺伝子に
由来し、イントロンを欠いていた。続いて、S3と称され
るイントロンプライマーをプライマーAS1とともにPCRに
用い、2.1kbの生成物が得られた（図３）。このフラグ
メントのマッピングおよびDNA配列決定（Sequencing）
によって、このエクソンの配列はcDNAに完全に適合し、
全てのイントロン／エクソン境界はGT/AG法則に厳密に
従うことが明らかとなった。したがってこの2.1kbフラ
グメントはStAR遺伝子の３′半分に相当する。2.1kbク
ローンから得られた配列情報によって、このエクソンの
PCR増幅のためにイントロンプライマーを作製すること
が可能になった（図３）。
ゲノムDNAのStAR遺伝子を調べた。StAR遺伝子の構造が
不明であるので、この変異が収容されているエクソンを
含むゲノムクローンを得るために先ずPCRを用いた。こ
れは、cDNA配列由来のセンスプライマーおよびアンチセ
ンスプライマーの種々の組み合わせを用い、正常なゲノ
ムDNAを増幅させることによって実施した。図３に示す
ように、プライマー対S2/AS2によって、437bpと290bpの
２つの特異的な生成物が得られた。437bpフラグメント
の配列は、cDNAとその両末端で完璧に適合し、中央に14
1bpのイントロンを含み、したがってStAR遺伝子に由来
するものである。290bpフラグメントはStAR偽遺伝子に
由来し、イントロンを欠いていた。続いて、S3と称され
るイントロンプライマーをプライマーAS1とともにPCRに
用い、2.1kbの生成物が得られた（図３）。このフラグ
メントのマッピングおよびDNA配列決定（Sequencing）
によって、このエクソンの配列はcDNAに完全に適合し、
全てのイントロン／エクソン境界はGT/AG法則に厳密に
従うことが明らかとなった。したがってこの2.1kbフラ
グメントはStAR遺伝子の３′半分に相当する。2.1kbク
ローンから得られた配列情報によって、このエクソンの
PCR増幅のためにイントロンプライマーを作製すること
が可能になった（図３）。
コドン193および258におけるナンセンス変異の存在
は、ゲノムDNAのPCR生成物を直接に配列決定することに
よって確認された。図4Aに示すように、患者１はコドン
193にＣからＴへの変化を有し、一方、この患者の父親
または母親はコドン193にＣおよびＴを有する（両親の
２つの染色体の各々に１つ）。したがって、我々は、患
者１はArg193→Stop変異についてホモ接合型であり、そ
の両親はともに、この変異のキャリアーであると結論し
た。同様に、患者２はGln258→Stop変異についてホモ接
合型である（図4B）。期待したように患者２の母親はこ
の変異についてヘテロ接合型で、一方、正常な兄弟には
変異はない。患者４もまた類脂質CAHを罹患している兄
弟で、したがって患者２と同じ対立遺伝子についてホモ
接合型である。さらに、患者３は患者２と同じ変異につ
いてホモ接合型で（図4B）、その母親もまたキャリアー
である。患者２は人種として朝鮮系で患者３は日系であ
るので、この発見は、これら二人種群における本変異に
ついての共通の起源を示唆する。
は、ゲノムDNAのPCR生成物を直接に配列決定することに
よって確認された。図4Aに示すように、患者１はコドン
193にＣからＴへの変化を有し、一方、この患者の父親
または母親はコドン193にＣおよびＴを有する（両親の
２つの染色体の各々に１つ）。したがって、我々は、患
者１はArg193→Stop変異についてホモ接合型であり、そ
の両親はともに、この変異のキャリアーであると結論し
た。同様に、患者２はGln258→Stop変異についてホモ接
合型である（図4B）。期待したように患者２の母親はこ
の変異についてヘテロ接合型で、一方、正常な兄弟には
変異はない。患者４もまた類脂質CAHを罹患している兄
弟で、したがって患者２と同じ対立遺伝子についてホモ
接合型である。さらに、患者３は患者２と同じ変異につ
いてホモ接合型で（図4B）、その母親もまたキャリアー
である。患者２は人種として朝鮮系で患者３は日系であ
るので、この発見は、これら二人種群における本変異に
ついての共通の起源を示唆する。
これらStARにおける成熟前終止コドンが機能的変化を
もたらすということを証明するために、発現された野性
型蛋白と変異蛋白のステロイド生成強化能力について調
べた。リポフェクタミンを用いて、ステロイド非生成CO
S−Ｉサル腎細胞にpSPORT（ベクター）または正常ヒトS
tAR発現もしくは患者１および２（または３）由来変異S
tAR発現pSPORTをトランスフェクト（核酸導入）した。
この細胞に、ウシP450sccとウシアドレノドキシン（と
もにウォーターマン博士（Dr.Michael Waterman,Vander
bilt University）提供）発現しているベクター、また
はF2と呼ぶ融合蛋白（ヒトコレステロール側鎖切断系か
ら成る:H2N−P450scc−アドレノドキシン還元酵素−ア
ドレノドキシン−COOH（J.A.Harikrishnaら、DNA Cell
Biol.12:371（1993））を発現しているpECEベクターの
何れかを同時にトランスフェクトした。基質は、細胞性
および血清コレステロール（cho1）または５μg/mlの添
加20α−ヒドロキシコレステロール（20α）のいずれか
であった。48時間インキュベートした後、培養液を採集
し、免疫アッセーでプレグネノロンについて調べた。結
果は表１に示す。コレステロール側鎖切断系とStARとの
同時発現によって、コレステロールが基質として用いら
れたとき約８倍のプレグネノロン生成の強化がもたらさ
れた。変異StAR蛋白は両方とも活性を示さず、このこと
は、この２つのナンセンス変異の各々は類脂質CAHをも
たらすことを示唆している。コレステロールと異なり、
20α−ヒドロキシコレステロールは容易にミトコンドリ
ア内に拡散することができ、したがって、ミトコンドリ
アコレステロール輸送系を迂回する（M.E.Toaffら、End
ocrinology,III 1785（1982））。基質として20α−ヒ
ドロキシコレステロールを用いたとき、正常StARと変異
StARとの間でプレグネノロン生成には顕著な違いは存在
しない。コレステロールと20α−ヒドロキシコレステロ
ールの利用におけるStARの影響の相違は、StARはミトコ
ンドリアへのコレステロールの輸送を仲介するというこ
とを強く示唆する。
もたらすということを証明するために、発現された野性
型蛋白と変異蛋白のステロイド生成強化能力について調
べた。リポフェクタミンを用いて、ステロイド非生成CO
S−Ｉサル腎細胞にpSPORT（ベクター）または正常ヒトS
tAR発現もしくは患者１および２（または３）由来変異S
tAR発現pSPORTをトランスフェクト（核酸導入）した。
この細胞に、ウシP450sccとウシアドレノドキシン（と
もにウォーターマン博士（Dr.Michael Waterman,Vander
bilt University）提供）発現しているベクター、また
はF2と呼ぶ融合蛋白（ヒトコレステロール側鎖切断系か
ら成る:H2N−P450scc−アドレノドキシン還元酵素−ア
ドレノドキシン−COOH（J.A.Harikrishnaら、DNA Cell
Biol.12:371（1993））を発現しているpECEベクターの
何れかを同時にトランスフェクトした。基質は、細胞性
および血清コレステロール（cho1）または５μg/mlの添
加20α−ヒドロキシコレステロール（20α）のいずれか
であった。48時間インキュベートした後、培養液を採集
し、免疫アッセーでプレグネノロンについて調べた。結
果は表１に示す。コレステロール側鎖切断系とStARとの
同時発現によって、コレステロールが基質として用いら
れたとき約８倍のプレグネノロン生成の強化がもたらさ
れた。変異StAR蛋白は両方とも活性を示さず、このこと
は、この２つのナンセンス変異の各々は類脂質CAHをも
たらすことを示唆している。コレステロールと異なり、
20α−ヒドロキシコレステロールは容易にミトコンドリ
ア内に拡散することができ、したがって、ミトコンドリ
アコレステロール輸送系を迂回する（M.E.Toaffら、End
ocrinology,III 1785（1982））。基質として20α−ヒ
ドロキシコレステロールを用いたとき、正常StARと変異
StARとの間でプレグネノロン生成には顕著な違いは存在
しない。コレステロールと20α−ヒドロキシコレステロ
ールの利用におけるStARの影響の相違は、StARはミトコ
ンドリアへのコレステロールの輸送を仲介するというこ
とを強く示唆する。
StARは、25残基のミトコンドリア指向配列（これはミ
トコンドリアへの輸送後Ｎ−末端から切断される）をも
つ285アミノ酸蛋白として合成される。前駆体および成
熟StARは、それぞれ分および時間の範囲の半減期をも
つ。免疫ブロットをデジタルビデオスキャンによって調
べたところ（Clarkら、1994）、野性型プラスミドをト
ランスフェクトされたCOS−１細胞では約70％のStARが
成熟型であることが分かった。しかしながら、患者１由
来の変異蛋白については成熟型は全く認められず、患者
２については約10％が処理を受けていた（データは示さ
ず）が、このことは活性の欠如についての可能なメカニ
ズムを示唆している。
トコンドリアへの輸送後Ｎ−末端から切断される）をも
つ285アミノ酸蛋白として合成される。前駆体および成
熟StARは、それぞれ分および時間の範囲の半減期をも
つ。免疫ブロットをデジタルビデオスキャンによって調
べたところ（Clarkら、1994）、野性型プラスミドをト
ランスフェクトされたCOS−１細胞では約70％のStARが
成熟型であることが分かった。しかしながら、患者１由
来の変異蛋白については成熟型は全く認められず、患者
２については約10％が処理を受けていた（データは示さ
ず）が、このことは活性の欠如についての可能なメカニ
ズムを示唆している。
我々はまたStAR遺伝子の異常なイントロン変異を確認
したが、これはmRNAスプライシングでエラーを生じ、し
たがって類脂質CAHを引き起こす（M.K.Teeら、Hum.Mol.
Genet.4:2299−2305（1995c））。患者５の精巣組織か
ら調製したStARcDNAの初期分析によって、これは正常組
織から得られる974bpより小さいことが示されたが、こ
のことは患者のStARmRNAにおける重要な構造的変化を示
唆する。クローン化cDNAの配列決定によって、この患者
のcDNAからエクソン５の全てが欠如していることが示唆
された（図５）。これは、エクソン５に対応する185bp
を欠くわずか789bpのより短いcDNAを生じる。エクソン
５の欠失は、おそらくエクソン５から直ぐ上流のイント
ロン４におけるmRNAスプライシングエラーが存在するこ
とを示唆した。したがって、プライマーS3（これはイン
トロン４に存在する）およびAS2（これはエクソン５に
存在する）を患者のゲノムDNA PCR増幅のために用い
た。このDNAをサブクローニングし、プライマーS3（こ
れはイントロン４に存在する）を用いて配列決定を行っ
た。イントロン４とエクソン５との接合部から11bpのイ
ントロン４内にただ１つのヌクレオチド変化（Ｔ→Ａ変
異）が認められた（図５）。
したが、これはmRNAスプライシングでエラーを生じ、し
たがって類脂質CAHを引き起こす（M.K.Teeら、Hum.Mol.
Genet.4:2299−2305（1995c））。患者５の精巣組織か
ら調製したStARcDNAの初期分析によって、これは正常組
織から得られる974bpより小さいことが示されたが、こ
のことは患者のStARmRNAにおける重要な構造的変化を示
唆する。クローン化cDNAの配列決定によって、この患者
のcDNAからエクソン５の全てが欠如していることが示唆
された（図５）。これは、エクソン５に対応する185bp
を欠くわずか789bpのより短いcDNAを生じる。エクソン
５の欠失は、おそらくエクソン５から直ぐ上流のイント
ロン４におけるmRNAスプライシングエラーが存在するこ
とを示唆した。したがって、プライマーS3（これはイン
トロン４に存在する）およびAS2（これはエクソン５に
存在する）を患者のゲノムDNA PCR増幅のために用い
た。このDNAをサブクローニングし、プライマーS3（こ
れはイントロン４に存在する）を用いて配列決定を行っ
た。イントロン４とエクソン５との接合部から11bpのイ
ントロン４内にただ１つのヌクレオチド変化（Ｔ→Ａ変
異）が認められた（図５）。
このＴ→Ａ変異（transversion）はNco I部位（CCATG
G→CCAAGG）を破壊し、この塩基変化のメンデルの分離
を確認することができた。増幅ゲノムDNAのNco I制限消
化の分析によって、患者５はＴ→Ａ変異についてホモ接
合型であることが確認された（図６）。Ｔ→Ａ変異をも
つトランスフェクト細胞から得られたRNAおよび患者５
の精巣RNAで実施したRNアーゼ保護アッセーによって、
Ｔ→Ａ変異は異常なmRNAスプライシングの幾つかの型を
もたらすことが確認された（実施例９）。
G→CCAAGG）を破壊し、この塩基変化のメンデルの分離
を確認することができた。増幅ゲノムDNAのNco I制限消
化の分析によって、患者５はＴ→Ａ変異についてホモ接
合型であることが確認された（図６）。Ｔ→Ａ変異をも
つトランスフェクト細胞から得られたRNAおよび患者５
の精巣RNAで実施したRNアーゼ保護アッセーによって、
Ｔ→Ａ変異は異常なmRNAスプライシングの幾つかの型を
もたらすことが確認された（実施例９）。
このコードされた短縮（truncated）蛋白が活性であ
るか否かを決定するために、短縮StARcDNAを実現ベクタ
ーpSV−SPORT−１でクローニングし、これをステロイド
非生成COS−１細胞にトランスフェクトするために用い
た。このCOS−１細胞をヒトP450scc系の融合蛋白（F2と
呼ぶ）を発現するベクターで同時トランスフェクトし
た。コードされるF2蛋白は、H2N−P450scc−アドレノド
キシン還元酵素−アドレノドキシン−COOHで、３つの成
分の分子比における変動に起因するP450scc活性の変動
の可能性を排除する完全に活性な酵素である（Harikris
hnaら）。F2および正常StARをトランスフェクトした細
胞は、コレステロールからプレグネノロンへの効率的な
変換を支援したが、短縮StARを発現するベクターとF2と
の同時トランスフェクションは、pSV−SPORT−１ベクタ
ーだけをトランスフェクトしたコントロール細胞で認め
られた以上のコレステロールからプレグネノロンへの変
換を生じなかった（表２）。トランスフェクト化細胞の
RNAのノザンブロットによって、正常StARおよび変異StA
Rを発現しているベクターは、予想したサイズのStARmRN
Aを同等量発現することが示されたが、このことはこのm
RNAは安定であることを示唆している。しかしながら、p
SV−SPORT−１により発現される正常StAR蛋白を検出す
るマウスStARに対する抗血清（ストッコ博士（Dr.D.Sto
cco,Texas Tech U.）ご提供）によるウェスタンブロッ
トでは、変異体によってコードされた何れの短縮StARも
検出されなかった。したがって、短縮mRNAは安定で機能
的な蛋白をコードしない。
るか否かを決定するために、短縮StARcDNAを実現ベクタ
ーpSV−SPORT−１でクローニングし、これをステロイド
非生成COS−１細胞にトランスフェクトするために用い
た。このCOS−１細胞をヒトP450scc系の融合蛋白（F2と
呼ぶ）を発現するベクターで同時トランスフェクトし
た。コードされるF2蛋白は、H2N−P450scc−アドレノド
キシン還元酵素−アドレノドキシン−COOHで、３つの成
分の分子比における変動に起因するP450scc活性の変動
の可能性を排除する完全に活性な酵素である（Harikris
hnaら）。F2および正常StARをトランスフェクトした細
胞は、コレステロールからプレグネノロンへの効率的な
変換を支援したが、短縮StARを発現するベクターとF2と
の同時トランスフェクションは、pSV−SPORT−１ベクタ
ーだけをトランスフェクトしたコントロール細胞で認め
られた以上のコレステロールからプレグネノロンへの変
換を生じなかった（表２）。トランスフェクト化細胞の
RNAのノザンブロットによって、正常StARおよび変異StA
Rを発現しているベクターは、予想したサイズのStARmRN
Aを同等量発現することが示されたが、このことはこのm
RNAは安定であることを示唆している。しかしながら、p
SV−SPORT−１により発現される正常StAR蛋白を検出す
るマウスStARに対する抗血清（ストッコ博士（Dr.D.Sto
cco,Texas Tech U.）ご提供）によるウェスタンブロッ
トでは、変異体によってコードされた何れの短縮StARも
検出されなかった。したがって、短縮mRNAは安定で機能
的な蛋白をコードしない。
４人の罹患患者（患者１、２、３および４）で２つの
ナンセンス変異および５番目の患者（Teeら）でスプラ
イシングエラーを見出し、さらにStAR変異は類脂質CAH
を引き起こす可能性があることを明らかにしたので、様
々な人種群から新たに14人の患者のStAR遺伝子を調べ、
類脂質CAH表現型をもつ全ての患者がStAR変異をもつか
否かを決定した。
ナンセンス変異および５番目の患者（Teeら）でスプラ
イシングエラーを見出し、さらにStAR変異は類脂質CAH
を引き起こす可能性があることを明らかにしたので、様
々な人種群から新たに14人の患者のStAR遺伝子を調べ、
類脂質CAH表現型をもつ全ての患者がStAR変異をもつか
否かを決定した。
類脂質CAHをもつ14人の患者からゲノムDNAを得た（表
３）。エクソン１−４をそれぞれ個々にPCR増幅させ、
自動配列決定に付した結果、患者７の１つの対立遺伝子
上にただ１つの変異（ヌクレオチドの挿入とフレームシ
フト）が明らかになった。エクソン５−７をただ１つの
2.1kbフラグメントとして増幅させ、これをクローニン
グしてその全体（イントロンを含む）を全患者について
手動で配列決定した。認定した変異は、罹患患者並びに
可能な限り両親および兄弟の個々のPCR増幅エクソンの
直接配列決定によって確認された。これら変異の多くは
また、PCR増幅DNAのRFLP分析によって確認することがで
きた（表４）。これら14人の患者および先に報告した５
人の患者に関する発見を表３に要約した。患者11および
12並びに患者２および４は兄弟であり、患者９は既知の
血縁結婚に基づき、したがってこれら19人の患者は33個
の別個の対立遺伝子を表す。
３）。エクソン１−４をそれぞれ個々にPCR増幅させ、
自動配列決定に付した結果、患者７の１つの対立遺伝子
上にただ１つの変異（ヌクレオチドの挿入とフレームシ
フト）が明らかになった。エクソン５−７をただ１つの
2.1kbフラグメントとして増幅させ、これをクローニン
グしてその全体（イントロンを含む）を全患者について
手動で配列決定した。認定した変異は、罹患患者並びに
可能な限り両親および兄弟の個々のPCR増幅エクソンの
直接配列決定によって確認された。これら変異の多くは
また、PCR増幅DNAのRFLP分析によって確認することがで
きた（表４）。これら14人の患者および先に報告した５
人の患者に関する発見を表３に要約した。患者11および
12並びに患者２および４は兄弟であり、患者９は既知の
血縁結婚に基づき、したがってこれら19人の患者は33個
の別個の対立遺伝子を表す。
Q258Xは日本では殆どの類脂質CAHの原因である。Q258
X変異は患者２、３および４でホモ接合体（すなわち４
つの独自の対立遺伝子のうち４つ）で、日本人の６つの
対立遺伝子（患者６−８）のうち４つに存在し、日本人
／朝鮮人の10個の障害対立遺伝子の８つの全てについて
である。日本人の患者で見出されたその他の変異は他の
患者では認められず、新規な変異を表しているかもしれ
ない。一方、Q258X変異は創始者効果（founder effec
t）を示しているように思える。したがって、この変異
は、日本でのこの障害対立遺伝子が優勢であることの説
明となり、この場合類脂質CAHは共通である（Hauffaら;
Fukamiら、Clin.Pediatr.Endocrinol.4:39−46（199
5）:Matsuoら、Horm.Res.41（付録）:106（1994））。Q
258変異は、プライマーS4およびAS4によるゲノムDNAの
増幅（Linら、Science 267:1828−1831（1995））と、
それに続くEcoR IIによる消化によって容易に識別でき
る。なぜなら原因となるＣ→Ｔ変異（下線部）はEcoR I
I部位（CCAGG）を破壊するからである（表４）。
X変異は患者２、３および４でホモ接合体（すなわち４
つの独自の対立遺伝子のうち４つ）で、日本人の６つの
対立遺伝子（患者６−８）のうち４つに存在し、日本人
／朝鮮人の10個の障害対立遺伝子の８つの全てについて
である。日本人の患者で見出されたその他の変異は他の
患者では認められず、新規な変異を表しているかもしれ
ない。一方、Q258X変異は創始者効果（founder effec
t）を示しているように思える。したがって、この変異
は、日本でのこの障害対立遺伝子が優勢であることの説
明となり、この場合類脂質CAHは共通である（Hauffaら;
Fukamiら、Clin.Pediatr.Endocrinol.4:39−46（199
5）:Matsuoら、Horm.Res.41（付録）:106（1994））。Q
258変異は、プライマーS4およびAS4によるゲノムDNAの
増幅（Linら、Science 267:1828−1831（1995））と、
それに続くEcoR IIによる消化によって容易に識別でき
る。なぜなら原因となるＣ→Ｔ変異（下線部）はEcoR I
I部位（CCAGG）を破壊するからである（表４）。
R182Lはパレスチナ系アラブ人で一般的な変異であ
る。類脂質CAHは、２集団（日本人およびドイツ系スイ
ス人（Hauffaら））でより普遍的に不均衡に発生すると
して以前に記載されたが、この疾患はアラブ人では報告
がなかった。しかしながら、われわれの患者のうち６人
がパレスチナ系アラブ人起源であった。患者10および11
は兄弟で、患者９は既知の血縁結婚の結果であった。そ
の結果、これら６人の患者は、９つの独自の対立遺伝子
を示した。これら９つの対立遺伝子の７つ（78％）は、
変異R182Lを含んでいた。これらの患者の出身地はヨル
ダン、イスラエル、クェートおよびデンマークであり、
したがって関連はないようである。イントロン多形現象
とStAR遺伝子内の他の変異との識別により、７つの障害
対立遺伝子が完全には同一ではないことが明らかになっ
た。兄弟の患者10および11、または患者12では他の変異
は認められなかった。R182Lについてヘテロ接合体であ
る患者13はまた、ΔC650のフレームシフト変異について
もホモ接合体であった。患者14は、フレームシフト変異
ΔT593およびR182Lについて二重にホモ接合体であっ
た。したがって、R182Lは変異は種々の配列で見出さ
れ、アラブパレスチナ人集団と密接に関係していた。R1
82L変異は、プライマーEx5SおよびEx5ASによるゲノムDN
Aの増幅とそれに続くTsp45 Iによる消化によって容易に
認識される（表３）。
る。類脂質CAHは、２集団（日本人およびドイツ系スイ
ス人（Hauffaら））でより普遍的に不均衡に発生すると
して以前に記載されたが、この疾患はアラブ人では報告
がなかった。しかしながら、われわれの患者のうち６人
がパレスチナ系アラブ人起源であった。患者10および11
は兄弟で、患者９は既知の血縁結婚の結果であった。そ
の結果、これら６人の患者は、９つの独自の対立遺伝子
を示した。これら９つの対立遺伝子の７つ（78％）は、
変異R182Lを含んでいた。これらの患者の出身地はヨル
ダン、イスラエル、クェートおよびデンマークであり、
したがって関連はないようである。イントロン多形現象
とStAR遺伝子内の他の変異との識別により、７つの障害
対立遺伝子が完全には同一ではないことが明らかになっ
た。兄弟の患者10および11、または患者12では他の変異
は認められなかった。R182Lについてヘテロ接合体であ
る患者13はまた、ΔC650のフレームシフト変異について
もホモ接合体であった。患者14は、フレームシフト変異
ΔT593およびR182Lについて二重にホモ接合体であっ
た。したがって、R182Lは変異は種々の配列で見出さ
れ、アラブパレスチナ人集団と密接に関係していた。R1
82L変異は、プライマーEx5SおよびEx5ASによるゲノムDN
Aの増幅とそれに続くTsp45 Iによる消化によって容易に
認識される（表３）。
StAR変異はエクソン５−７に集中する。我々は、日本
人でもアラブ人でもない別の５人の患者を調べた。患者
15（土着のアメリカ人であるメキシコ人）は、R272を欠
く3bp欠失についてホモ接合体であるが、その他の点で
はStAR蛋白は無傷であった。患者16（ギリシャ人）はフ
レームシフト変異についてホモ接合体であった。患者17
（イギリス出身の白人）はエクソン５で始まる外来DNA
セグメントの挿入についてホモ接合体であった。これら
３事例でStAR遺伝子はそれぞれの変異についてホモ接合
体であったが、これら家族から家系について情報を得る
ことはできなかった。患者18（カナダ出身の白人）は、
L275PおよびA218Vについて合成ヘテロ接合体であった。
表２で調査した33の対立遺伝子において合計14の変異を
見出したが、それらのうち１つを除く全てがエクソン
５、６または７に障害を与えていた。
人でもアラブ人でもない別の５人の患者を調べた。患者
15（土着のアメリカ人であるメキシコ人）は、R272を欠
く3bp欠失についてホモ接合体であるが、その他の点で
はStAR蛋白は無傷であった。患者16（ギリシャ人）はフ
レームシフト変異についてホモ接合体であった。患者17
（イギリス出身の白人）はエクソン５で始まる外来DNA
セグメントの挿入についてホモ接合体であった。これら
３事例でStAR遺伝子はそれぞれの変異についてホモ接合
体であったが、これら家族から家系について情報を得る
ことはできなかった。患者18（カナダ出身の白人）は、
L275PおよびA218Vについて合成ヘテロ接合体であった。
表２で調査した33の対立遺伝子において合計14の変異を
見出したが、それらのうち１つを除く全てがエクソン
５、６または７に障害を与えていた。
これら認定した変異が患者の類脂質CAHを引き起こし
ていることを証明するために、実施例３で述べるように
種々のStAR変異をトランスフェクトしたステロイド非生
成COS−１細胞の条件付け培養液によるコレステロール
のプレグネノロン変換を分析した。
ていることを証明するために、実施例３で述べるように
種々のStAR変異をトランスフェクトしたステロイド非生
成COS−１細胞の条件付け培養液によるコレステロール
のプレグネノロン変換を分析した。
StAR機能はStARプロセッシングとは関係がない。StAR
蛋白の活性型はミトコンドリア内の切断型よりむしろ前
駆体分子であり、StAR前駆体は、それがミトコンドリア
に入るときに外膜と内膜との間に接触部位を形成するこ
とによってステロイド生成を刺激するように機能すると
提唱された（Clarkら、J.Biol.Chem.269:28314−28322
（1994）;Stoccoら、“Cellular and Molecular R ulat
ion of Testicular Cells"（精巣細胞の細胞調節と分子
調節）、C.Desjardins編、Springer−Verlag,ニューヨ
ーク（1996））。しかしながら、日本人の共通の変異Q2
58Xで認められるようなStARのカルボキシ末端の僅か28
アミノ酸の欠失が全ての活性を欠失させ（Linら、199
5）、さらに表４の結果は、R272の欠失または、169位、
182位、218位および275位のアミノ酸の置換は全ての活
性を除去することを示す。患者７のエクソン２のフレー
ムシフトの例外を除き、我々が発見した変異の全てはエ
クソン５−７に存在する。したがってエクソン１−４の
いずれも偶発的変異の傾向が少なく、またこの領域のミ
スセンス変異は非表現型である。我々は後者の説明を好
む。
蛋白の活性型はミトコンドリア内の切断型よりむしろ前
駆体分子であり、StAR前駆体は、それがミトコンドリア
に入るときに外膜と内膜との間に接触部位を形成するこ
とによってステロイド生成を刺激するように機能すると
提唱された（Clarkら、J.Biol.Chem.269:28314−28322
（1994）;Stoccoら、“Cellular and Molecular R ulat
ion of Testicular Cells"（精巣細胞の細胞調節と分子
調節）、C.Desjardins編、Springer−Verlag,ニューヨ
ーク（1996））。しかしながら、日本人の共通の変異Q2
58Xで認められるようなStARのカルボキシ末端の僅か28
アミノ酸の欠失が全ての活性を欠失させ（Linら、199
5）、さらに表４の結果は、R272の欠失または、169位、
182位、218位および275位のアミノ酸の置換は全ての活
性を除去することを示す。患者７のエクソン２のフレー
ムシフトの例外を除き、我々が発見した変異の全てはエ
クソン５−７に存在する。したがってエクソン１−４の
いずれも偶発的変異の傾向が少なく、またこの領域のミ
スセンス変異は非表現型である。我々は後者の説明を好
む。
ヒトStAR遺伝子の転写領域の変異は、StAR蛋白の変化
またはその産生制御の変化をもたらす場合は類脂質CAH
を引き起こすであろう。類脂質CAHの分子的基礎が確立
されるまで、この疾患は症候群、場合によってただ１つ
の共通の表現型をもつ異なる遺伝的疾患群と考えられね
ばならなかった。種々の人種的および遺伝的背景から得
た類脂質CAHの患者のStAR蛋白に対する遺伝子の変異が
明らかになったことによって、この遺伝子の変異は、類
脂質CAHの患者の全てではないとしても圧倒的多数にと
って原因となることが初めて明らかになった。１人のCA
H患者（患者19）でStAR変異の検出ができなかったとい
うことは、突然変異、プロモーター変異、未調査上流ス
プライシング変異、反復配列決定エラーの検出における
技術的な問題のためかもしれない。また、患者19は、区
別できない表現型を生じるまた別の遺伝子の変異を有す
るかもしれない。障害された胎児の胎盤はCAHにおいて
正常にステロイドを産生するという実験（Saengerら、
J.Clin.Endocrinol.Metab.80:200−205（1995））、お
よび妊娠期間中胎児はプロジェステロンを要求するとい
うことによって、類脂質CAHについて以前に考慮された
因子の何れも（P450scc、Adx、AdRed、SAPエンドゼピ
ン、PBR）、患者19の疾患の原因とは考えがたい。
またはその産生制御の変化をもたらす場合は類脂質CAH
を引き起こすであろう。類脂質CAHの分子的基礎が確立
されるまで、この疾患は症候群、場合によってただ１つ
の共通の表現型をもつ異なる遺伝的疾患群と考えられね
ばならなかった。種々の人種的および遺伝的背景から得
た類脂質CAHの患者のStAR蛋白に対する遺伝子の変異が
明らかになったことによって、この遺伝子の変異は、類
脂質CAHの患者の全てではないとしても圧倒的多数にと
って原因となることが初めて明らかになった。１人のCA
H患者（患者19）でStAR変異の検出ができなかったとい
うことは、突然変異、プロモーター変異、未調査上流ス
プライシング変異、反復配列決定エラーの検出における
技術的な問題のためかもしれない。また、患者19は、区
別できない表現型を生じるまた別の遺伝子の変異を有す
るかもしれない。障害された胎児の胎盤はCAHにおいて
正常にステロイドを産生するという実験（Saengerら、
J.Clin.Endocrinol.Metab.80:200−205（1995））、お
よび妊娠期間中胎児はプロジェステロンを要求するとい
うことによって、類脂質CAHについて以前に考慮された
因子の何れも（P450scc、Adx、AdRed、SAPエンドゼピ
ン、PBR）、患者19の疾患の原因とは考えがたい。
類脂質CAHの遺伝型性別は最も普遍的なものは男性
で、これは、遺伝的性別は等しい頻度で影響を受けると
した初期の研究（しかしながら、この時は遺伝的性別は
生殖腺の外観および組織学の記述から、または口腔塗抹
標本からしばしば推論された（Hauffaら）とは一致しな
い。表２は、我々の系では19人の患者のわずか３人（1
5.8％）が46,XXで、さらに日本の初期の報告（Matsuo
ら、1994））では63人の確定された核型をもつ類脂質AC
H患者のうち僅か16人（25.4％）が46,XXであることが分
かった。このことは、障害された46,XXの胎児の大半が
妊娠初期に失われるか、または障害された23Xの精子が
卵子を受精させる可能性が少ないか、または障害された
23Y精子よりも低い頻度で障害23X精子が産生されるかの
いずれかであることを示唆している。幾つかの予備的実
験によれば、ステロイド生成は精原細胞で生じることが
示唆され受精前に性別の偏りは生じるという仮説を支持
できる。しかしながら、未知の性状に関する把握の偏り
も現時点では除外できない。
で、これは、遺伝的性別は等しい頻度で影響を受けると
した初期の研究（しかしながら、この時は遺伝的性別は
生殖腺の外観および組織学の記述から、または口腔塗抹
標本からしばしば推論された（Hauffaら）とは一致しな
い。表２は、我々の系では19人の患者のわずか３人（1
5.8％）が46,XXで、さらに日本の初期の報告（Matsuo
ら、1994））では63人の確定された核型をもつ類脂質AC
H患者のうち僅か16人（25.4％）が46,XXであることが分
かった。このことは、障害された46,XXの胎児の大半が
妊娠初期に失われるか、または障害された23Xの精子が
卵子を受精させる可能性が少ないか、または障害された
23Y精子よりも低い頻度で障害23X精子が産生されるかの
いずれかであることを示唆している。幾つかの予備的実
験によれば、ステロイド生成は精原細胞で生じることが
示唆され受精前に性別の偏りは生じるという仮説を支持
できる。しかしながら、未知の性状に関する把握の偏り
も現時点では除外できない。
類脂質CAHは、不完全なステロイド生成酵素によって
惹起されないステロイドホルモン合成に関する唯一の先
天性疾患である。類脂質CAHの変異StARの確認によっ
て、この激烈な疾患の出生前分子診断が初めて可能にな
った。非機能的StARによる類脂質ACHはStAR遺伝子ノッ
クアウト効果に匹敵し、StARは副腎および性腺ステロイ
ド生成に必須であることを示している。したがって、St
ARは、P450sccへのコレステロールのアクセスのために
不可欠の役割を果たす確認された最初の蛋白である。正
常な胎盤のステロイド生成の存在並びに、胎盤（われわ
れが発見したように）および他のステロイド生成組織
（例えば脳（P.Robel ＆ E.E.Baulieu,Trends Endocrin
ol.Metabo.5:1（1994）;S.H.Mellon,J.Clin.Endocrino
l.Metab.78:1003（1994））におけるStAR発現が存在し
ないことの結果として類脂質ACHをもつ胎児が無事であ
ることは、これらの組織においてはミトコンドリアへの
コレステロール輸送を促進する異なるメカニズムが存在
することを示唆する。類脂質ACHにおけるStARのこの重
要な役割をこのように明瞭にすることによって、StAR
は、ステロイドホルモン合成の急性トロピック調節を仲
介する長い間捜し求めてきた分子であるという仮説の最
初の遺伝的証拠が提供される（D.N.Stocco ＆ T.C.Sode
man,J.Biol.Chem.266:19739（1991）;L.F.Epstein ＆
N.R.Orme−Johnson,J.Biol.Chem.266:19739（1991）;D.
M.Stocco ＆ M.Ascoli.Endocrinolgy 132:959（199
3））。
惹起されないステロイドホルモン合成に関する唯一の先
天性疾患である。類脂質CAHの変異StARの確認によっ
て、この激烈な疾患の出生前分子診断が初めて可能にな
った。非機能的StARによる類脂質ACHはStAR遺伝子ノッ
クアウト効果に匹敵し、StARは副腎および性腺ステロイ
ド生成に必須であることを示している。したがって、St
ARは、P450sccへのコレステロールのアクセスのために
不可欠の役割を果たす確認された最初の蛋白である。正
常な胎盤のステロイド生成の存在並びに、胎盤（われわ
れが発見したように）および他のステロイド生成組織
（例えば脳（P.Robel ＆ E.E.Baulieu,Trends Endocrin
ol.Metabo.5:1（1994）;S.H.Mellon,J.Clin.Endocrino
l.Metab.78:1003（1994））におけるStAR発現が存在し
ないことの結果として類脂質ACHをもつ胎児が無事であ
ることは、これらの組織においてはミトコンドリアへの
コレステロール輸送を促進する異なるメカニズムが存在
することを示唆する。類脂質ACHにおけるStARのこの重
要な役割をこのように明瞭にすることによって、StAR
は、ステロイドホルモン合成の急性トロピック調節を仲
介する長い間捜し求めてきた分子であるという仮説の最
初の遺伝的証拠が提供される（D.N.Stocco ＆ T.C.Sode
man,J.Biol.Chem.266:19739（1991）;L.F.Epstein ＆
N.R.Orme−Johnson,J.Biol.Chem.266:19739（1991）;D.
M.Stocco ＆ M.Ascoli.Endocrinolgy 132:959（199
3））。
しかし、StARの作用はステロイド生成に特異的ではな
く、さらにStARはミトコンドリアの27−ヒドロキシラー
ゼ活性を刺激することができる。ミトコンドリアコレス
テロール27−ヒドロキシラーゼ（P450c27）は27−ヒド
ロキシコレステロールおよびC27酸、３β−ヒドロキシ
−５−コレステン酸の形成を触媒する（Andersonら、J.
Biol.Chem.264:8222−8229（1989）;Suら、DNA Cell Bi
o.9:657−665（1990））。P450c27およびアドレノドキ
シンを同時にトランスフェクトしたCOS−１細胞でのStA
Rの発現は、実施例10に示すように３β−ヒドロキシ−
５−コレステン酸（３β−hydroxy−５−cholestenoica
cid）の生成を６倍以上増加させた（３群対４群の比較
についてｐ＜0.005）。P450c27によりコレステロール代
謝のこのStAR仲介増加は、コレステロール側鎖切断のSt
AR刺激について我々が観察したものと同じ次数規模であ
った（Sugawaraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4778−
4782（1995））。これらの観察は、StARは、ステロイド
生成チトクロームP450scc以外の酵素によってミトコン
ドリアコレステロール代謝を強化することができること
を明示している。
く、さらにStARはミトコンドリアの27−ヒドロキシラー
ゼ活性を刺激することができる。ミトコンドリアコレス
テロール27−ヒドロキシラーゼ（P450c27）は27−ヒド
ロキシコレステロールおよびC27酸、３β−ヒドロキシ
−５−コレステン酸の形成を触媒する（Andersonら、J.
Biol.Chem.264:8222−8229（1989）;Suら、DNA Cell Bi
o.9:657−665（1990））。P450c27およびアドレノドキ
シンを同時にトランスフェクトしたCOS−１細胞でのStA
Rの発現は、実施例10に示すように３β−ヒドロキシ−
５−コレステン酸（３β−hydroxy−５−cholestenoica
cid）の生成を６倍以上増加させた（３群対４群の比較
についてｐ＜0.005）。P450c27によりコレステロール代
謝のこのStAR仲介増加は、コレステロール側鎖切断のSt
AR刺激について我々が観察したものと同じ次数規模であ
った（Sugawaraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4778−
4782（1995））。これらの観察は、StARは、ステロイド
生成チトクロームP450scc以外の酵素によってミトコン
ドリアコレステロール代謝を強化することができること
を明示している。
P450c27は、StARを発現する卵巣を含む多数の組織で
認められる（Andersonら;Suら）。したがって、StARは
ステロイド生成細胞でコレステロールの27−ヒドロキシ
コレステロールおよびC27酸への代謝に寄与できるであ
ろう。そのようにして形成されたヒドロキシステロール
は細胞性コレステロールの恒常性を管理する役割を持つ
ことができるであろう（Rennertら、Endocrinology 12
7:738−746（1990））。P450c27は肝臓で強く発現され
るが、それは肝で胆汁酸合成における役割を果たす。St
AR遺伝子は肝では発現されない（Sugawaraら、PNAS（19
95））ので、他の因子または過程が肝性27−ヒドロキシ
ラーゼへのコレステロールアクセスを管理する必要があ
る。StAR遺伝子は肝に導入され、27−ヒドロキシラーゼ
経路を介して胆汁酸生成を強化し、したがってコレステ
ロールの廃棄を促進できる。
認められる（Andersonら;Suら）。したがって、StARは
ステロイド生成細胞でコレステロールの27−ヒドロキシ
コレステロールおよびC27酸への代謝に寄与できるであ
ろう。そのようにして形成されたヒドロキシステロール
は細胞性コレステロールの恒常性を管理する役割を持つ
ことができるであろう（Rennertら、Endocrinology 12
7:738−746（1990））。P450c27は肝臓で強く発現され
るが、それは肝で胆汁酸合成における役割を果たす。St
AR遺伝子は肝では発現されない（Sugawaraら、PNAS（19
95））ので、他の因子または過程が肝性27−ヒドロキシ
ラーゼへのコレステロールアクセスを管理する必要があ
る。StAR遺伝子は肝に導入され、27−ヒドロキシラーゼ
経路を介して胆汁酸生成を強化し、したがってコレステ
ロールの廃棄を促進できる。
コード領域の外で生じる変異もまた、例えば患者５で
観察されたように類脂質CAHを惹起することができるの
で、我々はさらにゲノムDNAおよびStAR遺伝子のプロモ
ーター領域について調べた。患者19では、類脂質CAHは
転写に干渉するプロモーター内の変異によって生じる可
能性がある。５′および３′非翻訳領域内に生じる変異
は、同様に、例えばmRNAの安定性を変えることによっ
て、または翻訳開始に影響を及ぼすことによって転写ま
たは翻訳に干渉することがあるかもしれない。
観察されたように類脂質CAHを惹起することができるの
で、我々はさらにゲノムDNAおよびStAR遺伝子のプロモ
ーター領域について調べた。患者19では、類脂質CAHは
転写に干渉するプロモーター内の変異によって生じる可
能性がある。５′および３′非翻訳領域内に生じる変異
は、同様に、例えばmRNAの安定性を変えることによっ
て、または翻訳開始に影響を及ぼすことによって転写ま
たは翻訳に干渉することがあるかもしれない。
StAR遺伝子配列は７つのエクソンと、全てGT/AG法則
に従う（Mount,1982）エクソン−イントロン接合部を含
む。
に従う（Mount,1982）エクソン−イントロン接合部を含
む。
本出願がその一部継続出願となっている米国特許出願
第08/410540号に開示した最初のゲノムクローンについ
て我々は詳細な配列分析を実施した。親出願で開示した
とおりコード領域およびイントロン４の配列は正確であ
ったが、さらに本発明のDNA分子の性状を調べたとこ
ろ、配列決定の誤りが認められ、コード領域の配列５′
を訂正した。
第08/410540号に開示した最初のゲノムクローンについ
て我々は詳細な配列分析を実施した。親出願で開示した
とおりコード領域およびイントロン４の配列は正確であ
ったが、さらに本発明のDNA分子の性状を調べたとこ
ろ、配列決定の誤りが認められ、コード領域の配列５′
を訂正した。
StAR遺伝子の主要な転写開始部位（RNアーゼ保護分析
によって決定し、さらにプライマー伸長分析（primer e
xtension analysis）によって確認した）は、翻訳開始
部位の前方154bpに位置する（図７）。主要転写開始部
位から上流のDNA配列は、TATA様成分（TTTAA）を−24か
ら−20bpに含む。幾つかの推定Sp1接合部位がまたプロ
モーター内に配列ATTTおよび（Ｔ）nCTの繰り返しと同
様に存在する。一続きのトリヌクレオチドの繰り返しは
転写された５′非翻訳領域に認められた。我々は反対鎖
（TGACCTTGA）上に１つのコンセンサス配列の位置を決
定した。みなしご核因子、ステロイド生成因子−１（SF
−１、AdBP4とも称される）がこの配列を認識すること
ができるが、これはまた多数のステロイド生成酵素遺伝
子の発現に必須のようである（Hondaら、J.Biochem.（T
okyo）112:573−575（1990）;Riceら、Mol.Endocrinol.
5:1552−1561（1991））。
によって決定し、さらにプライマー伸長分析（primer e
xtension analysis）によって確認した）は、翻訳開始
部位の前方154bpに位置する（図７）。主要転写開始部
位から上流のDNA配列は、TATA様成分（TTTAA）を−24か
ら−20bpに含む。幾つかの推定Sp1接合部位がまたプロ
モーター内に配列ATTTおよび（Ｔ）nCTの繰り返しと同
様に存在する。一続きのトリヌクレオチドの繰り返しは
転写された５′非翻訳領域に認められた。我々は反対鎖
（TGACCTTGA）上に１つのコンセンサス配列の位置を決
定した。みなしご核因子、ステロイド生成因子−１（SF
−１、AdBP4とも称される）がこの配列を認識すること
ができるが、これはまた多数のステロイド生成酵素遺伝
子の発現に必須のようである（Hondaら、J.Biochem.（T
okyo）112:573−575（1990）;Riceら、Mol.Endocrinol.
5:1552−1561（1991））。
この転写開始部位から上流1.3kbのDNAは、マウスＹ−
１副腎皮質腫瘍細胞にトランスフェクトされたときルシ
フェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導した（実施例
11）が、反対の向きで挿入された同じフラグメントはプ
ロモーターのないコントロールプラスミドと同じ程度の
ルシフェラーゼ発現を誘導しただけであった。
１副腎皮質腫瘍細胞にトランスフェクトされたときルシ
フェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導した（実施例
11）が、反対の向きで挿入された同じフラグメントはプ
ロモーターのないコントロールプラスミドと同じ程度の
ルシフェラーゼ発現を誘導しただけであった。
StARcDNAの配列と認定した偽遺伝子の配列を比較する
ために、この偽遺伝子の性状をさらに調べた。その配列
を表７に示す。親出願に開示したこの偽遺伝子配列は少
数の配列決定の誤りを含んでいたが、表７に示す配列で
は訂正されている。
ために、この偽遺伝子の性状をさらに調べた。その配列
を表７に示す。親出願に開示したこの偽遺伝子配列は少
数の配列決定の誤りを含んでいたが、表７に示す配列で
は訂正されている。
したがって、本発明は、以下の（１）−（５）を含む
単離DNAを提供する：（１）図１、表６または表７で説
明したhStARcDNA、hStARゲノムDNA、hStARプロモーター
またはhStAR偽遺伝子から成る第一の配列；（２）第一
の配列のサブ配列である少なくとも長さが10ヌクレオチ
ドの第二の配列；（３）第一または第二の配列の少なく
とも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換さ
れている第三の配列；（４）当該第一または第二の配列
で少なくとも１つのヌクレオチドが欠失もしくは挿入さ
れている第四の配列；または（５）第一、第二または第
三の配列のいずれかに対して相補的な配列であって、
（１）当該分子は、当該配列（１）−（５）のいずれか
においてＴがＵに置き換えられているRNA分子であって
もよく、（２）該第三の配列は第一または第二の配列と
少なくとも95％同一であり、（３）該第二の配列はマウ
スStARcDNAに存在せず、さらに（４）当該第四の配列が
20個より多い挿入ヌクレオチドおよび200個より多い欠
失ヌクレオチドを含まないということを条件とする。こ
れらの配列の何れもヒトのStAR遺伝子の変異の有無の認
定に用いることができ、したがって個々人（例えば先天
性類脂質副腎過形成の家族歴をもつ人々）の遺伝カウン
セリングに用いることができる（ただし一般集団のスク
リーニングも同様に可能である）。特に、本発明は既に
確認された特定の変異の認定の使用に限定されないこと
は注記されるべきであろう。本明細書で識別される正常
遺伝子配列から外れたStAR遺伝子のいずれの変異も、潜
在的に致死的な遺伝的欠陥を示唆するものである。たと
え、変異位置に異なるアミノ酸をコードしないいわゆる
“非発現性（サイレント）”変異も潜在的な疾患変異で
ある。なぜならば、そのような変異は、当該遺伝子に、
または当該遺伝子からその翻訳または転写に干渉する翻
訳されない遺伝信号を導入または除去する能力を有する
からである。本明細書で明らかにされた遺伝子配列を基
にした効用の１つは、類脂質CAH歴をもつ家族の遺伝カ
ウンセリングにあるので、StAR遺伝子に何らかの変異が
存在する場合は類脂質CAHの伝搬の可能性に関して患者
に助言を与えることができる。問題の変異をもつ子孫が
類脂質CAHの徴候を示してもまたは示さなくとも、当該
疾患の潜在的な存在に対して患者の適切なケアとモニタ
リングを選択できる。正常な遺伝子との違いがなけれ
ば、そのような新たなケアおよび／またはモニタリング
も（同時に発生する費用とともに）除外できるであろ
う。新たな情報（もし何らかの情報が有る場合には）が
入手できるので（例えばある非発現性変異または保存的
置換変異が類脂質CAHを生じるか、または生じないかと
いう情報）、特定の変異について与えられる助言は変化
しうるであろう。しかしながら、提供される助言におけ
る変化が、類脂質CAHの十分な原因であることを本発明
が初めて示したStAR遺伝子における変異の有無について
の最初の決定を変えることはない。
単離DNAを提供する：（１）図１、表６または表７で説
明したhStARcDNA、hStARゲノムDNA、hStARプロモーター
またはhStAR偽遺伝子から成る第一の配列；（２）第一
の配列のサブ配列である少なくとも長さが10ヌクレオチ
ドの第二の配列；（３）第一または第二の配列の少なく
とも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換さ
れている第三の配列；（４）当該第一または第二の配列
で少なくとも１つのヌクレオチドが欠失もしくは挿入さ
れている第四の配列；または（５）第一、第二または第
三の配列のいずれかに対して相補的な配列であって、
（１）当該分子は、当該配列（１）−（５）のいずれか
においてＴがＵに置き換えられているRNA分子であって
もよく、（２）該第三の配列は第一または第二の配列と
少なくとも95％同一であり、（３）該第二の配列はマウ
スStARcDNAに存在せず、さらに（４）当該第四の配列が
20個より多い挿入ヌクレオチドおよび200個より多い欠
失ヌクレオチドを含まないということを条件とする。こ
れらの配列の何れもヒトのStAR遺伝子の変異の有無の認
定に用いることができ、したがって個々人（例えば先天
性類脂質副腎過形成の家族歴をもつ人々）の遺伝カウン
セリングに用いることができる（ただし一般集団のスク
リーニングも同様に可能である）。特に、本発明は既に
確認された特定の変異の認定の使用に限定されないこと
は注記されるべきであろう。本明細書で識別される正常
遺伝子配列から外れたStAR遺伝子のいずれの変異も、潜
在的に致死的な遺伝的欠陥を示唆するものである。たと
え、変異位置に異なるアミノ酸をコードしないいわゆる
“非発現性（サイレント）”変異も潜在的な疾患変異で
ある。なぜならば、そのような変異は、当該遺伝子に、
または当該遺伝子からその翻訳または転写に干渉する翻
訳されない遺伝信号を導入または除去する能力を有する
からである。本明細書で明らかにされた遺伝子配列を基
にした効用の１つは、類脂質CAH歴をもつ家族の遺伝カ
ウンセリングにあるので、StAR遺伝子に何らかの変異が
存在する場合は類脂質CAHの伝搬の可能性に関して患者
に助言を与えることができる。問題の変異をもつ子孫が
類脂質CAHの徴候を示してもまたは示さなくとも、当該
疾患の潜在的な存在に対して患者の適切なケアとモニタ
リングを選択できる。正常な遺伝子との違いがなけれ
ば、そのような新たなケアおよび／またはモニタリング
も（同時に発生する費用とともに）除外できるであろ
う。新たな情報（もし何らかの情報が有る場合には）が
入手できるので（例えばある非発現性変異または保存的
置換変異が類脂質CAHを生じるか、または生じないかと
いう情報）、特定の変異について与えられる助言は変化
しうるであろう。しかしながら、提供される助言におけ
る変化が、類脂質CAHの十分な原因であることを本発明
が初めて示したStAR遺伝子における変異の有無について
の最初の決定を変えることはない。
完全な長さのStARcDNA配列を含む分子は、サブ配列の
素として（下記で考察）またはStAR分子自体の調製の出
発材料として有用である。“サブ配列”は、表示した完
全な長さの配列の１つから得られる連続ヌクレオチド群
である。そのようなサブ配列は、出発ヌクレオチドから
化学合成によって（例えば自動遺伝子合成装置で）、ま
たは完全な長さの配列の生化学的操作によって調製する
ことができる。後者の生化学的操作では、例えば制限エ
ンドヌクレアーゼを用いフラグメントを調製し、場合に
よって（１）エキソヌクレアーゼによる末端ヌクレオチ
ド切断、および／または（２）所望の配列を選別するた
めにサイズ仕分けおよび／または親和性補足が続く。用
いられる条件下で固有であるために十分な長さのStARcD
NA配列の何れのサブ配列も、あるStAR遺伝子変異（例え
ば本明細書に記載されたような変異）の有無を確認する
方法の一部分として、ゲノムのStAR遺伝子の全部または
一部分のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅で用いられ
る２つのプライマーのうちの１つとして有用である。第
二のプライマーは、増幅されるべき変異または他の配列
がこの２つのプライマーの間に配置されるように反対鎖
の配列から簡単に選択することができる。別の好ましい
サブ配列は本明細書で述べる正常な配列からの変異を含
む配列で、そのような配列は、特定の変異体の存在を検
出するために対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション
技術で用いることができる。好ましいサブ配列はまた、
正常なStAR遺伝子と偽遺伝子とを識別することができる
もの（すなわち表６の正常StAR遺伝子DNAまたは表７のS
tAR偽遺伝子DNAの両方には見出されないもの、または図
５に示したまた別のスプライス領域に広がるもの）を含
む。
素として（下記で考察）またはStAR分子自体の調製の出
発材料として有用である。“サブ配列”は、表示した完
全な長さの配列の１つから得られる連続ヌクレオチド群
である。そのようなサブ配列は、出発ヌクレオチドから
化学合成によって（例えば自動遺伝子合成装置で）、ま
たは完全な長さの配列の生化学的操作によって調製する
ことができる。後者の生化学的操作では、例えば制限エ
ンドヌクレアーゼを用いフラグメントを調製し、場合に
よって（１）エキソヌクレアーゼによる末端ヌクレオチ
ド切断、および／または（２）所望の配列を選別するた
めにサイズ仕分けおよび／または親和性補足が続く。用
いられる条件下で固有であるために十分な長さのStARcD
NA配列の何れのサブ配列も、あるStAR遺伝子変異（例え
ば本明細書に記載されたような変異）の有無を確認する
方法の一部分として、ゲノムのStAR遺伝子の全部または
一部分のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅で用いられ
る２つのプライマーのうちの１つとして有用である。第
二のプライマーは、増幅されるべき変異または他の配列
がこの２つのプライマーの間に配置されるように反対鎖
の配列から簡単に選択することができる。別の好ましい
サブ配列は本明細書で述べる正常な配列からの変異を含
む配列で、そのような配列は、特定の変異体の存在を検
出するために対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション
技術で用いることができる。好ましいサブ配列はまた、
正常なStAR遺伝子と偽遺伝子とを識別することができる
もの（すなわち表６の正常StAR遺伝子DNAまたは表７のS
tAR偽遺伝子DNAの両方には見出されないもの、または図
５に示したまた別のスプライス領域に広がるもの）を含
む。
所望の標的配列との固有のハイブリダイゼーションに
必要なサブ配列の長さは、用いられる特定の方法によっ
て変動するが、遺伝的材料について日常的確認を実施し
ている通常の技術を有する者の範囲内にある。典型的な
プライマーは、長さが少なくとも10、好ましくは少なく
とも14より好ましくは少なくとも17、さらに好ましくは
少なくとも20ヌクレオチドで、典型的には長さが200未
満、好ましくは100未満、より好ましくは70未満、さら
に好ましくは50ヌクレオチド未満である。最も好ましい
サブ配列は、表６および７に述べるヒトStAR配列の少な
くとも１つに見出されるが、マウスStARDNAには認めら
れない。
必要なサブ配列の長さは、用いられる特定の方法によっ
て変動するが、遺伝的材料について日常的確認を実施し
ている通常の技術を有する者の範囲内にある。典型的な
プライマーは、長さが少なくとも10、好ましくは少なく
とも14より好ましくは少なくとも17、さらに好ましくは
少なくとも20ヌクレオチドで、典型的には長さが200未
満、好ましくは100未満、より好ましくは70未満、さら
に好ましくは50ヌクレオチド未満である。最も好ましい
サブ配列は、表６および７に述べるヒトStAR配列の少な
くとも１つに見出されるが、マウスStARDNAには認めら
れない。
StAR遺伝子の配列およびサブ配列と同一のものを含む
そのような分子に加え、変異配列を含む分子もまた、変
異について特定のプローブとして用いることができるの
で有用である。例えば、アミノ酸をコードするコドンの
終止コドン（すなわちナンセンス変異）へのいくつかの
変異は以下の実施例および本明細書の他の場所で明らか
にされるが、例えば、Arg193→StopおよびGln258→Stop
変異である。（本明細書では“コドン”は、文脈から明
示されない限り遺伝子のリーディングフレーム（読み
枠）における核酸の３つ組みを指す。）したがって、好
ましい種類の変異配列分子は、コード配列の３′末端以
外の場所でコドンを終止コドンに変化させ、その結果、
短縮された非機能的StARポリペプチド分子がコードされ
るヌクレオチド置換（１つ以上の置換）を含むものであ
る。変異コドンは、正常なコード配列の３′末端から好
ましくは少なくとも５、より好ましくは10、さらに好ま
しくは20、さらに好ましくは30コドン離れていて、その
結果標的内に十分な欠失が生じ、機能のない生成物が得
られる。別の好ましい種類の変異配列分子は、少なくと
も１つのヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド、よ
り好ましくは100ヌクレオチドを越え、最も好ましくは1
85ヌクレオチドまでの欠失を含むが、しかし200ヌクレ
オチドを越えない欠失を含む。別の好ましい種類の変異
配列分子は、20ヌクレオチド未満、より好ましくは５ヌ
クレオチド未満、最も好ましくは１ヌクレオチドの挿入
を含む。他の好ましい種類の変異配列分子は、非機能的
StAR分子を生じることが分かっているもの、例えば非保
存アミノ酸置換を生じるもの、および該遺伝子に存在す
る翻訳もしくは転写信号配列を変更するもの、または不
適切な翻訳もしくは転写信号配列を導入するものであ
る。
そのような分子に加え、変異配列を含む分子もまた、変
異について特定のプローブとして用いることができるの
で有用である。例えば、アミノ酸をコードするコドンの
終止コドン（すなわちナンセンス変異）へのいくつかの
変異は以下の実施例および本明細書の他の場所で明らか
にされるが、例えば、Arg193→StopおよびGln258→Stop
変異である。（本明細書では“コドン”は、文脈から明
示されない限り遺伝子のリーディングフレーム（読み
枠）における核酸の３つ組みを指す。）したがって、好
ましい種類の変異配列分子は、コード配列の３′末端以
外の場所でコドンを終止コドンに変化させ、その結果、
短縮された非機能的StARポリペプチド分子がコードされ
るヌクレオチド置換（１つ以上の置換）を含むものであ
る。変異コドンは、正常なコード配列の３′末端から好
ましくは少なくとも５、より好ましくは10、さらに好ま
しくは20、さらに好ましくは30コドン離れていて、その
結果標的内に十分な欠失が生じ、機能のない生成物が得
られる。別の好ましい種類の変異配列分子は、少なくと
も１つのヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド、よ
り好ましくは100ヌクレオチドを越え、最も好ましくは1
85ヌクレオチドまでの欠失を含むが、しかし200ヌクレ
オチドを越えない欠失を含む。別の好ましい種類の変異
配列分子は、20ヌクレオチド未満、より好ましくは５ヌ
クレオチド未満、最も好ましくは１ヌクレオチドの挿入
を含む。他の好ましい種類の変異配列分子は、非機能的
StAR分子を生じることが分かっているもの、例えば非保
存アミノ酸置換を生じるもの、および該遺伝子に存在す
る翻訳もしくは転写信号配列を変更するもの、または不
適切な翻訳もしくは転写信号配列を導入するものであ
る。
直ぐ上の考察は、ゲノムDNAのセンス鎖の配列または
サブ配列についてであることは理解されよう。そのよう
な配列は、それらの相補的性質の結果としてゲノムDNA
のアンチセンス鎖の存在を検出するために用いることが
できる。しかしながら、上記で考察した配列の何れかと
相補的な配列を用いることもまた可能である。なぜなら
ば、それらはセンス鎖と相補的で、それらを検出するこ
とができるからである。
サブ配列についてであることは理解されよう。そのよう
な配列は、それらの相補的性質の結果としてゲノムDNA
のアンチセンス鎖の存在を検出するために用いることが
できる。しかしながら、上記で考察した配列の何れかと
相補的な配列を用いることもまた可能である。なぜなら
ば、それらはセンス鎖と相補的で、それらを検出するこ
とができるからである。
本発明の分子は、マウスのゲノムStAR遺伝子配列と異
なる配列を（StAR遺伝子産物のための開始コドンから終
止コドンまでの領域内に）含み、さらにヒトStARcDNAま
たはゲノム配列と少なくとも95％同一である。95％同一
とは、問題の配列が、ヌクレオチドの各挿入、欠失また
は置換をただ１つの違いとして数えたとき、比較しよう
としている配列と５％未満の異なるヌクレオチドを含む
ことを意味する。長さが20ヌクレオチド未満の配列は、
それが95％より高い同一の場合には標準配列と同一でな
ければならないことは明白であろう。
なる配列を（StAR遺伝子産物のための開始コドンから終
止コドンまでの領域内に）含み、さらにヒトStARcDNAま
たはゲノム配列と少なくとも95％同一である。95％同一
とは、問題の配列が、ヌクレオチドの各挿入、欠失また
は置換をただ１つの違いとして数えたとき、比較しよう
としている配列と５％未満の異なるヌクレオチドを含む
ことを意味する。長さが20ヌクレオチド未満の配列は、
それが95％より高い同一の場合には標準配列と同一でな
ければならないことは明白であろう。
同一性および相対的同一性は、以下の例を参照するこ
とによって容易に理解できよう。例えば、仮想配列、 （これは長さが40“ヌクレオチド”）がそれに対して測
定を実施しようとしている基準であると考えると、以下
の仮想ヌクレオチド配列の各々は該基準配列に対して95
％同一である（すなわち各々は、標準40ヌクレオチド配
列と単一ヌクレオチド２個の違いを有する）。
とによって容易に理解できよう。例えば、仮想配列、 （これは長さが40“ヌクレオチド”）がそれに対して測
定を実施しようとしている基準であると考えると、以下
の仮想ヌクレオチド配列の各々は該基準配列に対して95
％同一である（すなわち各々は、標準40ヌクレオチド配
列と単一ヌクレオチド２個の違いを有する）。
特に本発明の分子に関して同様な多くの例（それらは
しばしばこの例よりサイズが大きい）が提供できること
は明白であろう。しかしながら、これらの例は当業者に
本明細書で用いる“％相違”の意味を教示するためには
十分であろう。また、相違を計算する前に比較されるべ
き配列は最大の同一性を与えるために並べられることは
容易に理解されよう。コンピュータープログラム（例え
ば文献に記載されたFASTAプログラム（W.R.Pearson ＆
D.J.Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444−2448（1
988）を用いることができるが、一方、必要とされる高
い相同性は目で見た配列比較によって最大限の相同性を
得る並べ方を容易に見出すことができることを示してい
る。好ましい具体例では、並べ方決定プログラムでは、
200塩基対までのギャップの幅が許される。
しばしばこの例よりサイズが大きい）が提供できること
は明白であろう。しかしながら、これらの例は当業者に
本明細書で用いる“％相違”の意味を教示するためには
十分であろう。また、相違を計算する前に比較されるべ
き配列は最大の同一性を与えるために並べられることは
容易に理解されよう。コンピュータープログラム（例え
ば文献に記載されたFASTAプログラム（W.R.Pearson ＆
D.J.Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444−2448（1
988）を用いることができるが、一方、必要とされる高
い相同性は目で見た配列比較によって最大限の相同性を
得る並べ方を容易に見出すことができることを示してい
る。好ましい具体例では、並べ方決定プログラムでは、
200塩基対までのギャップの幅が許される。
StAR遺伝子に由来するかまたは関連すると上記で示唆
された特定の配列は、ポリヌクレオチドの配列全体であ
ってもよく、またより大きな配列の一部分でもよい。例
えば、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセーが
よく知られているが、これは、異なる分子（例えば標的
ゲノム配列または固形支持体に対して固定装置として作
用する第二のポリヌクレオチドに存在する配列）ととも
にハイブリダイズするサブ配列を含む長いポリヌクレオ
チド配列を利用する。例えば、米国特許第5288609号お
よび5124246号を参照されたい。
された特定の配列は、ポリヌクレオチドの配列全体であ
ってもよく、またより大きな配列の一部分でもよい。例
えば、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセーが
よく知られているが、これは、異なる分子（例えば標的
ゲノム配列または固形支持体に対して固定装置として作
用する第二のポリヌクレオチドに存在する配列）ととも
にハイブリダイズするサブ配列を含む長いポリヌクレオ
チド配列を利用する。例えば、米国特許第5288609号お
よび5124246号を参照されたい。
本明細書で説明する配列によって性状を明らかにされ
るポリヌクレオチドを指すために用いられる場合、“単
離（された）”という言葉は、通常はStAR遺伝子に付随
しているゲノムDNAの少なくとも一部分から分離された
ことを意味し、好ましくはポリヌクレオチド以外の全て
のヒト細胞性物質から分離されたことを意味する。StAR
遺伝子を包含するゲノムDNAの未確認セグメントを含有
するベクターを含んでいた可能性がある遺伝子ライブラ
リーは、StAR遺伝子が存在することが分かっていないの
で、さらに／または他のヒトDNAを含むベクターから分
離されていないので“単離”されていない。殆どの場
合、本発明の単離分子は、50kb未満、好ましくは30kb未
満、より好ましくは20kb未満の長さを有するであろう。
最低限の長さは上記で考察した。
るポリヌクレオチドを指すために用いられる場合、“単
離（された）”という言葉は、通常はStAR遺伝子に付随
しているゲノムDNAの少なくとも一部分から分離された
ことを意味し、好ましくはポリヌクレオチド以外の全て
のヒト細胞性物質から分離されたことを意味する。StAR
遺伝子を包含するゲノムDNAの未確認セグメントを含有
するベクターを含んでいた可能性がある遺伝子ライブラ
リーは、StAR遺伝子が存在することが分かっていないの
で、さらに／または他のヒトDNAを含むベクターから分
離されていないので“単離”されていない。殆どの場
合、本発明の単離分子は、50kb未満、好ましくは30kb未
満、より好ましくは20kb未満の長さを有するであろう。
最低限の長さは上記で考察した。
一般には、本発明の組成物は、人間に先天性類脂質副
腎過形成を惹起し、もしくは惹起する可能性がある、ま
たは人間の子孫に先天性類脂質副腎過形成を伝達し、も
しくは伝達する可能性がある遺伝的欠陥の存在を検出す
る方法で使用されるが、この場合、当該組成物はヒトの
StAR遺伝子の変異を識別するために用いられる。先ず初
めに、遺伝カウンセラーらは、今や正常であることが確
認され、さらに疾患と関連がないと分かったStAR遺伝子
との違いを簡単に調べるであろう。なぜならば、この正
常な配列からの逸脱であるものはいずれも疾患を惹起す
る潜在性を有するからである。異なる（しかし未だ確認
はされていない）遺伝子が先天性類脂質副腎過形成の家
族歴をもつ者に見出された場合は特に、StAR遺伝子は遺
伝カウンセリングのために必要にして十分な基準であ
る。特定の遺伝子（またはそれが存在しないこと）が、
先天性類脂質副腎過形成について正の関係を持つことが
確認されたので、いくつかの事例において遺伝カウンセ
ラーは、StAR遺伝子の蛋白産物の配列を変化させる、ま
たは転写もしくは翻訳されないStAR遺伝子を生じるStAR
遺伝子の１つまたは２つ以上の特定の変異を確認するこ
とに焦点を合わせるであろう。しかしながら、患者のSt
AR遺伝子の何らかの変異の有無を単純に確認することは
遺伝分析およびカウンセリングの重要な部分であり続け
るであろう。
腎過形成を惹起し、もしくは惹起する可能性がある、ま
たは人間の子孫に先天性類脂質副腎過形成を伝達し、も
しくは伝達する可能性がある遺伝的欠陥の存在を検出す
る方法で使用されるが、この場合、当該組成物はヒトの
StAR遺伝子の変異を識別するために用いられる。先ず初
めに、遺伝カウンセラーらは、今や正常であることが確
認され、さらに疾患と関連がないと分かったStAR遺伝子
との違いを簡単に調べるであろう。なぜならば、この正
常な配列からの逸脱であるものはいずれも疾患を惹起す
る潜在性を有するからである。異なる（しかし未だ確認
はされていない）遺伝子が先天性類脂質副腎過形成の家
族歴をもつ者に見出された場合は特に、StAR遺伝子は遺
伝カウンセリングのために必要にして十分な基準であ
る。特定の遺伝子（またはそれが存在しないこと）が、
先天性類脂質副腎過形成について正の関係を持つことが
確認されたので、いくつかの事例において遺伝カウンセ
ラーは、StAR遺伝子の蛋白産物の配列を変化させる、ま
たは転写もしくは翻訳されないStAR遺伝子を生じるStAR
遺伝子の１つまたは２つ以上の特定の変異を確認するこ
とに焦点を合わせるであろう。しかしながら、患者のSt
AR遺伝子の何らかの変異の有無を単純に確認することは
遺伝分析およびカウンセリングの重要な部分であり続け
るであろう。
Q258XおよびR182Lは、日本人およびパレスチナ人の障
害対立遺伝子のそれぞれ70−80％の原因であり、有効な
遺伝子スクリーニングの機会を提供する。したがって、
我々はこれらの変異および他の変異の診断を促進させる
ためにPCRに準じた方法を考案した（図８）。各々の場
合において、DNAを疑わしい変異を包含する一対のプラ
イマーで増幅し、続いて変異によってその認識配列が作
出されるかまたは破壊される制限酵素でこのPCR生成物
を切断する。表４は、Q258XおよびR182L変異の他、同様
に診断が可能な他の６つの変異について、そのオリゴヌ
クレオチド対、制限エンドヌクレアーゼおよび切断パタ
ーンを示す。全てのオリゴヌクレオチドの配列は表８に
示す。
害対立遺伝子のそれぞれ70−80％の原因であり、有効な
遺伝子スクリーニングの機会を提供する。したがって、
我々はこれらの変異および他の変異の診断を促進させる
ためにPCRに準じた方法を考案した（図８）。各々の場
合において、DNAを疑わしい変異を包含する一対のプラ
イマーで増幅し、続いて変異によってその認識配列が作
出されるかまたは破壊される制限酵素でこのPCR生成物
を切断する。表４は、Q258XおよびR182L変異の他、同様
に診断が可能な他の６つの変異について、そのオリゴヌ
クレオチド対、制限エンドヌクレアーゼおよび切断パタ
ーンを示す。全てのオリゴヌクレオチドの配列は表８に
示す。
StAR遺伝子またはStAR遺伝子変異体を確認するために
用いられる実際の技術自体は本発明の部分ではない。遺
伝子変異を識別するために用いられる多くの技術の何れ
も（現時点で既知であるか後に開発されるかにかかわら
ず）用いることができる。例えば特異的なプローブによ
るハイブリダイゼーションで、これは、対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（増幅し
ないか、または検出された領域の例えばPCRによる増幅
の後のいずれか）、制限フラグメント長多形現象（RFL
P）分析（ristriction fragment length polymorphism
analysis）、またはランダム増幅多形性DNA（RAPD）分
析（random amplified polymorphic DNA analysis）を
含む。他の分析技術には、酵素不適合スキャンニングお
よび転写／翻訳分析が含まれる。これらの技術は全て多
くの特許および他の出版物に記載されている。例えば以
下を参照されたい。RFLP:D.Botsteinら、American Jour
nal of Human Genetics32:314−321（1980）、RAPD:J.
G.K.Williamsら、Nucleic Acids Research 18:6531−65
35（1990）特に有利な結果を達成するために、検査する
患者によって異なる識別技術を選択することができる。
例えば、特定のStAR遺伝子変異と関係があることが分か
っている特定の人種または民族群には、対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチド（ASO）ハイブリダイゼーション
が好ましい技術である。大型で混在型集団のスクリーニ
ングのためには、一本鎖形態多形現象が好ましい。各個
人については、遺伝子および／またはcDNAの全体的な配
列決定および基準配列との比較（例えば本明細書に示さ
れたようなもの）が好ましい。
用いられる実際の技術自体は本発明の部分ではない。遺
伝子変異を識別するために用いられる多くの技術の何れ
も（現時点で既知であるか後に開発されるかにかかわら
ず）用いることができる。例えば特異的なプローブによ
るハイブリダイゼーションで、これは、対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（増幅し
ないか、または検出された領域の例えばPCRによる増幅
の後のいずれか）、制限フラグメント長多形現象（RFL
P）分析（ristriction fragment length polymorphism
analysis）、またはランダム増幅多形性DNA（RAPD）分
析（random amplified polymorphic DNA analysis）を
含む。他の分析技術には、酵素不適合スキャンニングお
よび転写／翻訳分析が含まれる。これらの技術は全て多
くの特許および他の出版物に記載されている。例えば以
下を参照されたい。RFLP:D.Botsteinら、American Jour
nal of Human Genetics32:314−321（1980）、RAPD:J.
G.K.Williamsら、Nucleic Acids Research 18:6531−65
35（1990）特に有利な結果を達成するために、検査する
患者によって異なる識別技術を選択することができる。
例えば、特定のStAR遺伝子変異と関係があることが分か
っている特定の人種または民族群には、対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチド（ASO）ハイブリダイゼーション
が好ましい技術である。大型で混在型集団のスクリーニ
ングのためには、一本鎖形態多形現象が好ましい。各個
人については、遺伝子および／またはcDNAの全体的な配
列決定および基準配列との比較（例えば本明細書に示さ
れたようなもの）が好ましい。
多くの確認技術でホストのゲノムDNA（またはメッセ
ンジャーRNA）の何らかの増幅が、より高い感度を分析
に付与するために実施されるであろう。そのような場合
には、StAR遺伝子全体を増幅する必要はなく、単に検出
される該遺伝子の一部分または該遺伝子内の特定の場所
が増幅される。したがって、本発明の方法は一般に、診
断医によって実施される特定の分析のために選択された
セグメントともにStAR遺伝子の少なくともセグメントの
増幅（例えばPCRによる）を含む。
ンジャーRNA）の何らかの増幅が、より高い感度を分析
に付与するために実施されるであろう。そのような場合
には、StAR遺伝子全体を増幅する必要はなく、単に検出
される該遺伝子の一部分または該遺伝子内の特定の場所
が増幅される。したがって、本発明の方法は一般に、診
断医によって実施される特定の分析のために選択された
セグメントともにStAR遺伝子の少なくともセグメントの
増幅（例えばPCRによる）を含む。
類脂質CAHは常染色体の劣性遺伝疾患であるので、い
くつかの場合には本発明の方法は、正常なStAR遺伝子も
しくは変異StAR遺伝子に対してホモ接合体として、また
は正常StAR遺伝子もしくは変異StAR遺伝子に対してヘテ
ロ接合体として患者を分類するであろう。なぜならばこ
のような情報は遺伝カウンセリングのために有益な情報
だからである。
くつかの場合には本発明の方法は、正常なStAR遺伝子も
しくは変異StAR遺伝子に対してホモ接合体として、また
は正常StAR遺伝子もしくは変異StAR遺伝子に対してヘテ
ロ接合体として患者を分類するであろう。なぜならばこ
のような情報は遺伝カウンセリングのために有益な情報
だからである。
診断が行われる患者は、遺伝カウンセリングの通常の
事例のように成人または新生児であってもよいが、出生
前診断も胎児で実施できる。成人または新生児の遺伝分
析のためには、通常は血液サンプルが用いられる（例え
ば濾紙上の乾燥血のスクリーニング）が、一方、出生前
診断用サンプルは通常は羊水穿刺または絨毛膜絨毛生検
によって得られる。
事例のように成人または新生児であってもよいが、出生
前診断も胎児で実施できる。成人または新生児の遺伝分
析のためには、通常は血液サンプルが用いられる（例え
ば濾紙上の乾燥血のスクリーニング）が、一方、出生前
診断用サンプルは通常は羊水穿刺または絨毛膜絨毛生検
によって得られる。
ヒトの完全な長さのStAR遺伝子は、機能をもつStAR蛋
白を生じるより短い遺伝子と同じように患者の先天性類
脂質副腎過形成を修正するために用いることができる
が、これは、遺伝子治療によるかまたはStAR蛋白のイン
ビトロ生成とそれに続く該蛋白の投与により患者にヒト
StAR遺伝子の遺伝子産物の有効量を供給することによっ
て実施される。類脂質CAHは劣性であるので、したがっ
てStARの補充的供給によって治療でき、そのような治療
は容易に利用できる。同様に、高コレステロール血症の
治療および予防は、遺伝子治療またはインビトロ生成St
AR蛋白の投与のいずれかによって、ヒトのStAR遺伝子の
遺伝子産物の有効量を患者の肝臓に供給することによっ
て達成できる。
白を生じるより短い遺伝子と同じように患者の先天性類
脂質副腎過形成を修正するために用いることができる
が、これは、遺伝子治療によるかまたはStAR蛋白のイン
ビトロ生成とそれに続く該蛋白の投与により患者にヒト
StAR遺伝子の遺伝子産物の有効量を供給することによっ
て実施される。類脂質CAHは劣性であるので、したがっ
てStARの補充的供給によって治療でき、そのような治療
は容易に利用できる。同様に、高コレステロール血症の
治療および予防は、遺伝子治療またはインビトロ生成St
AR蛋白の投与のいずれかによって、ヒトのStAR遺伝子の
遺伝子産物の有効量を患者の肝臓に供給することによっ
て達成できる。
遺伝物質または遺伝子産物を投与する種々の技術は周
知であり、それ自体は本発明の部分を構成しないことは
理解されるところであろう。本発明は単に、本発明の遺
伝材料または蛋白を、先に投与されている遺伝材料また
は蛋白の代わりに供給することを含む。例えば、遺伝子
産物を産生するように細胞をトランスフォームする技術
は、米国特許第5283185号（題名は“細胞に核酸を送達
する方法”）の他に多数の科学論文、例えばフェルガー
らの論文に記載されている（Felgerら、“Lipofectin:A
Highly Efficient,Lipid−Mediated DNA−Transfectio
n Procedure"（リポフェクチン：極めて効果的な脂質仲
介DNAトランスフェクション方法）、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,84:7413−7417（1987））。インビボ蛋白産生に
ついての技術は、例えばミューラーらの論文に記載され
ている（Muellerら、“Laboratory Methods−Efficient
Transfection and Expression of Heterologous Genes
in PC12 Cells"（実験室手技−PC12細胞における異種
遺伝子の効果的トランスフェクションと発現）、DNA ＆
Cell Biol.9（３）:221−229（1990））。欠乏症を克
服するために蛋白を投与することは周知であるので（例
えば糖尿病における高血糖修正のためのインシュリン投
与）、この技術のこれ以上の考察は不要であろう。現存
する技術のある程度の修正は特定の応用について必要か
もしれないが、このような修正は、本明細書で提供する
現存の知識およびガイダンスを用いる当該技術分野の通
常の医師の技術レベルの範囲内にあるであろう。
知であり、それ自体は本発明の部分を構成しないことは
理解されるところであろう。本発明は単に、本発明の遺
伝材料または蛋白を、先に投与されている遺伝材料また
は蛋白の代わりに供給することを含む。例えば、遺伝子
産物を産生するように細胞をトランスフォームする技術
は、米国特許第5283185号（題名は“細胞に核酸を送達
する方法”）の他に多数の科学論文、例えばフェルガー
らの論文に記載されている（Felgerら、“Lipofectin:A
Highly Efficient,Lipid−Mediated DNA−Transfectio
n Procedure"（リポフェクチン：極めて効果的な脂質仲
介DNAトランスフェクション方法）、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,84:7413−7417（1987））。インビボ蛋白産生に
ついての技術は、例えばミューラーらの論文に記載され
ている（Muellerら、“Laboratory Methods−Efficient
Transfection and Expression of Heterologous Genes
in PC12 Cells"（実験室手技−PC12細胞における異種
遺伝子の効果的トランスフェクションと発現）、DNA ＆
Cell Biol.9（３）:221−229（1990））。欠乏症を克
服するために蛋白を投与することは周知であるので（例
えば糖尿病における高血糖修正のためのインシュリン投
与）、この技術のこれ以上の考察は不要であろう。現存
する技術のある程度の修正は特定の応用について必要か
もしれないが、このような修正は、本明細書で提供する
現存の知識およびガイダンスを用いる当該技術分野の通
常の医師の技術レベルの範囲内にあるであろう。
StARプロモーターは、哺乳類細胞、遺伝子導入哺乳動
物でのStAR遺伝子、StAR変異体または異種遺伝子を発現
させるために、または遺伝子治療で異種遺伝子の発現の
ために用いることができる。組織特異的遺伝子発現が、
通常はStARmRNAを産生しないような細胞型（例えば胎
盤、肝、絨毛上皮腫細胞）の多くで、異種遺伝子の場合
は発現されないような程度まで達成され、さらに、通常
StARmRNAを産生する細胞（例えば副腎および性腺細胞）
でも発現される。好ましいプロモーターフラグメントに
は、図７のA-1300GCTTからGGTCC-1までの配列が含まれ
る。さらに小さなフラグメントも用いることができる
が、好ましさは低下する。
物でのStAR遺伝子、StAR変異体または異種遺伝子を発現
させるために、または遺伝子治療で異種遺伝子の発現の
ために用いることができる。組織特異的遺伝子発現が、
通常はStARmRNAを産生しないような細胞型（例えば胎
盤、肝、絨毛上皮腫細胞）の多くで、異種遺伝子の場合
は発現されないような程度まで達成され、さらに、通常
StARmRNAを産生する細胞（例えば副腎および性腺細胞）
でも発現される。好ましいプロモーターフラグメントに
は、図７のA-1300GCTTからGGTCC-1までの配列が含まれ
る。さらに小さなフラグメントも用いることができる
が、好ましさは低下する。
本発明はこれまで一般的に説明してきたが、詳述のた
めで限定を目的としない以下の詳細な実施例でより一層
理解されよう。
めで限定を目的としない以下の詳細な実施例でより一層
理解されよう。
実施例 実施例1:StARcDNAクローンの単離とDNA配列分析 18才の男性の副腎皮質から単離したポリ（Ａ）＋RNA
で調製された、ラムダgt22A中のヒト副腎皮質cDNAライ
ブラリーはラクロア、ベレンガーおよびトレンブレー博
士（Dr.Andre Lacroix,Dr.Alain Belanger,Yves Trembl
ay,University of Laval,ケベック、カナダ）から提供
された。部分的な長さのマウスStARcDNA（Clarkら、199
4）を用いてこのライブラリーをスクリーニングした。5
0個以上の陽性クローンを600000個のプラークのスクリ
ーニングで検出した。２つのプラーク精製ファージクロ
ーンを配列分析のために選んだ。各々は約1.6kbの挿入
物を含んでいた。両挿入物はpSPORT（GIBO−BRL,ベセス
ダ、メリーランド）でサブクローニングし、Taqジデオ
キシ配列決定試薬を使って自動DNA配列決定装置（Appli
ed Biosystems,Inc.）で配列を調べた。
で調製された、ラムダgt22A中のヒト副腎皮質cDNAライ
ブラリーはラクロア、ベレンガーおよびトレンブレー博
士（Dr.Andre Lacroix,Dr.Alain Belanger,Yves Trembl
ay,University of Laval,ケベック、カナダ）から提供
された。部分的な長さのマウスStARcDNA（Clarkら、199
4）を用いてこのライブラリーをスクリーニングした。5
0個以上の陽性クローンを600000個のプラークのスクリ
ーニングで検出した。２つのプラーク精製ファージクロ
ーンを配列分析のために選んだ。各々は約1.6kbの挿入
物を含んでいた。両挿入物はpSPORT（GIBO−BRL,ベセス
ダ、メリーランド）でサブクローニングし、Taqジデオ
キシ配列決定試薬を使って自動DNA配列決定装置（Appli
ed Biosystems,Inc.）で配列を調べた。
DNA配列分析で性状を調べたこの２つのヒトStARcDNA
は、同一の126ヌクレオチド５′非翻訳領域を有してい
た。両クローンは285アミノ酸蛋白をコードする855ヌク
レオチドのオープンリーディングフレームを含んでい
た。1.6kbのcDNA（そのヌクレオチド配列は図１に示
す）は623ヌクレオチドの３′非翻訳配列を有し、これ
は、23ヌクレオチド上流でAATAAA配列が前に付いたポリ
（Ａ）＋テールで終わっていた。
は、同一の126ヌクレオチド５′非翻訳領域を有してい
た。両クローンは285アミノ酸蛋白をコードする855ヌク
レオチドのオープンリーディングフレームを含んでい
た。1.6kbのcDNA（そのヌクレオチド配列は図１に示
す）は623ヌクレオチドの３′非翻訳配列を有し、これ
は、23ヌクレオチド上流でAATAAA配列が前に付いたポリ
（Ａ）＋テールで終わっていた。
推定ヒトStARアミノ酸配列は、マウスのそれと84％同
一である（Clarkら、1994）（図１）。この配列は、塩
基性および疎水性アミノ酸で構成される25アミノ酸Ｎ−
末端配列を含むが、これはミトコンドリアを標的とする
配列に特徴的である。cAMP依存蛋白キナーゼによる燐酸
化のための７つのコンセンサス部位および３つの蛋白キ
ナーゼＣ燐酸化部位が成熟蛋白配列に存在する。遺伝子
工学的に操作したCOS−１細胞でのStARの発現によって
ステロイド生成は増加する。
一である（Clarkら、1994）（図１）。この配列は、塩
基性および疎水性アミノ酸で構成される25アミノ酸Ｎ−
末端配列を含むが、これはミトコンドリアを標的とする
配列に特徴的である。cAMP依存蛋白キナーゼによる燐酸
化のための７つのコンセンサス部位および３つの蛋白キ
ナーゼＣ燐酸化部位が成熟蛋白配列に存在する。遺伝子
工学的に操作したCOS−１細胞でのStARの発現によって
ステロイド生成は増加する。
実施例2:COS−１細胞でのStARcDNAの発現 ヒトStAR蛋白の機能活性を調べるために、ステロイド
生成におけるステロールキャリア蛋白２の機能を調べる
ために以前に用いた方法を利用した（R.Yamamoto,C.B.K
allen,G.O.Babalola,H.Rennert,J.T.Billheimer,III J.
F.Syraus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:463−467（199
1））。簡単に記せば、COS−１細胞に10μl/培養皿を使
用し、リポフェクタミン（GIBCO−BRL）を用いて種々の
発現ベクターをトランスフェクトした。このベクター
は、cDNA挿入物を含まないpSPORT、1.6kbStARcDNAを含
むpSPORT（pStAR）、並びにウシP450sccおよびアドレノ
ドキシンのための発現ベクター（pCDADX）（ウォーター
マン博士（Dr.Michael Waterman,Vanderbilt Universit
y,ナッシュビル、テネシー）提供）を含む。トランスフ
ェクション後48時間してから、培養液を先に記載したよ
うに（R.Yamamoto,C.B.Kallen,G.O.Babalola,H.Renner
t,J.T.Billheimer,III J.F.Syraus,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 88:463−467（1991））プレグネノロンの放射能
免疫アッセーのために採集した。１つの実験では、ヒド
ロキシステロール（20α−ヒドロキシステロール）を培
養液に添加した（５μg/ml）。このヒドロキシステロー
ルはより可溶性のプレグネノロン前駆体で、コレステロ
ール側鎖切断反応の中間体である。20α−ヒドロキシコ
レステロールのようにヒドロキシステロールは、コレス
テロール移動の調節移動メカニズムを飛び越え、したが
って一般に最大のコレステロール側鎖切断活性を提供す
る（M.E.Toaff,H.Scleyer,J.F.Straus,III,Endocrinolo
gy 1785−1790（1982））。予備実験によって、トラン
スフェクト化COS細胞は、プロジェステロンの約10倍の
プレグネノロンを分泌し、さらにプロジェステロン測定
レベルはプレグネノロンと平行して変化することが明ら
かになった。したがって、我々のステロイド生成の指標
としてプレグネトロン分泌をモニターした。
生成におけるステロールキャリア蛋白２の機能を調べる
ために以前に用いた方法を利用した（R.Yamamoto,C.B.K
allen,G.O.Babalola,H.Rennert,J.T.Billheimer,III J.
F.Syraus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:463−467（199
1））。簡単に記せば、COS−１細胞に10μl/培養皿を使
用し、リポフェクタミン（GIBCO−BRL）を用いて種々の
発現ベクターをトランスフェクトした。このベクター
は、cDNA挿入物を含まないpSPORT、1.6kbStARcDNAを含
むpSPORT（pStAR）、並びにウシP450sccおよびアドレノ
ドキシンのための発現ベクター（pCDADX）（ウォーター
マン博士（Dr.Michael Waterman,Vanderbilt Universit
y,ナッシュビル、テネシー）提供）を含む。トランスフ
ェクション後48時間してから、培養液を先に記載したよ
うに（R.Yamamoto,C.B.Kallen,G.O.Babalola,H.Renner
t,J.T.Billheimer,III J.F.Syraus,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 88:463−467（1991））プレグネノロンの放射能
免疫アッセーのために採集した。１つの実験では、ヒド
ロキシステロール（20α−ヒドロキシステロール）を培
養液に添加した（５μg/ml）。このヒドロキシステロー
ルはより可溶性のプレグネノロン前駆体で、コレステロ
ール側鎖切断反応の中間体である。20α−ヒドロキシコ
レステロールのようにヒドロキシステロールは、コレス
テロール移動の調節移動メカニズムを飛び越え、したが
って一般に最大のコレステロール側鎖切断活性を提供す
る（M.E.Toaff,H.Scleyer,J.F.Straus,III,Endocrinolo
gy 1785−1790（1982））。予備実験によって、トラン
スフェクト化COS細胞は、プロジェステロンの約10倍の
プレグネノロンを分泌し、さらにプロジェステロン測定
レベルはプレグネノロンと平行して変化することが明ら
かになった。したがって、我々のステロイド生成の指標
としてプレグネトロン分泌をモニターした。
COS−１細胞は、cDNA挿入物を欠くpSPORTベクターま
たはStARcDNAを含むpSPORTをトランスフェクトしたとき
プレグネノロンを分泌しなかった（表９）。しかしなが
ら、ウシP450sccおよびアドレノドキシンの発現を誘導
するプラスミドを細胞に同時トランスフェクションした
とき、ステロイド生成活性が細胞に付与された。P450sc
c、アドレノドキシンおよびStAR発現プラスミドによるC
OS−１細胞の三重トランスフェクションによって、ステ
ロイド分泌は、p450SCC、アドレノドキシンおよびコン
トロールpSPORTプラスミドをトランスフェクトした細胞
より４から20倍増加した。pP450scc、pADXおよびpSPORT
をトランスフェクトした細胞を20α−ヒドロキシコレス
テロール（比較的可溶性のコレステロール側鎖切断反応
中間体）とともに培養することによって、pStARと同じ
程度にプレグネノロン分泌が刺激されたが、P450sccお
よびアドレノドキシンプラスミドで同時トランスフェク
トしたCOS細胞におけるpStAR応答は増大されなかった。
P450sccおよびアドレノドキシン発現が無い場合、20α
−ヒドロキシコレステロールの存在下でのプレグネノロ
ン合成は検出できなかった。これらの発見は、pSPORTプ
ラスミド“コントロール”はステロイド生成酵素の発現
に干渉しなかったことを表している。外因性ヒドロキシ
コレステロールはStARによって刺激されるステロイド産
生を増大させなかったという事実はまた、StARはトラン
スフェクト化COS細胞においてステロイド生成活性をほ
ぼ最大限まで促進することを示唆する。
たはStARcDNAを含むpSPORTをトランスフェクトしたとき
プレグネノロンを分泌しなかった（表９）。しかしなが
ら、ウシP450sccおよびアドレノドキシンの発現を誘導
するプラスミドを細胞に同時トランスフェクションした
とき、ステロイド生成活性が細胞に付与された。P450sc
c、アドレノドキシンおよびStAR発現プラスミドによるC
OS−１細胞の三重トランスフェクションによって、ステ
ロイド分泌は、p450SCC、アドレノドキシンおよびコン
トロールpSPORTプラスミドをトランスフェクトした細胞
より４から20倍増加した。pP450scc、pADXおよびpSPORT
をトランスフェクトした細胞を20α−ヒドロキシコレス
テロール（比較的可溶性のコレステロール側鎖切断反応
中間体）とともに培養することによって、pStARと同じ
程度にプレグネノロン分泌が刺激されたが、P450sccお
よびアドレノドキシンプラスミドで同時トランスフェク
トしたCOS細胞におけるpStAR応答は増大されなかった。
P450sccおよびアドレノドキシン発現が無い場合、20α
−ヒドロキシコレステロールの存在下でのプレグネノロ
ン合成は検出できなかった。これらの発見は、pSPORTプ
ラスミド“コントロール”はステロイド生成酵素の発現
に干渉しなかったことを表している。外因性ヒドロキシ
コレステロールはStARによって刺激されるステロイド産
生を増大させなかったという事実はまた、StARはトラン
スフェクト化COS細胞においてステロイド生成活性をほ
ぼ最大限まで促進することを示唆する。
COS細胞系におけるStARの発現によって促進されるス
テロイド生成の４倍以上の増化は、ステロイド生成強化
の手段としてステロールキャリア蛋白２発現プラスミド
をCOS細胞にトランスフェクトしたとき我々が観察した
２倍の増化より実質的に大である（R.Yamamoto,C.B.Kal
len,G.O.Babalola,H.Rennert,J.T.Billheimer,III J.F.
Syraus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:463−467（199
1））。これらの発見はStARはステロイド生成を促進す
るという考えと一致するが、一方、これらの実験はStAR
の作用の正確なメカニズムを明らかにはしない。
テロイド生成の４倍以上の増化は、ステロイド生成強化
の手段としてステロールキャリア蛋白２発現プラスミド
をCOS細胞にトランスフェクトしたとき我々が観察した
２倍の増化より実質的に大である（R.Yamamoto,C.B.Kal
len,G.O.Babalola,H.Rennert,J.T.Billheimer,III J.F.
Syraus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:463−467（199
1））。これらの発見はStARはステロイド生成を促進す
るという考えと一致するが、一方、これらの実験はStAR
の作用の正確なメカニズムを明らかにはしない。
COS−１細胞に表示のプラスミド（２μｇプラスミド/
35mm培養皿）をリポフェクチンを用いてトランスフェク
トした。48時間後に培養液を採集し、放射能免疫アッセ
ーでプレグネノロンを調べた。20α−ヒドロキシコレス
テロール（20α−OH−C;5μg/ml）を幾つかの培養皿に
添加した。４回の別々の実験結果を示す。値は±SEで、
各実験につき複製はＮ＝３−４。
35mm培養皿）をリポフェクチンを用いてトランスフェク
トした。48時間後に培養液を採集し、放射能免疫アッセ
ーでプレグネノロンを調べた。20α−ヒドロキシコレス
テロール（20α−OH−C;5μg/ml）を幾つかの培養皿に
添加した。４回の別々の実験結果を示す。値は±SEで、
各実験につき複製はＮ＝３−４。
実施例3:StAR変異体の同定 経験的に決定した４つのPCRプログラムの１つにした
がって種々のプライマーを用いて、白血球から調製した
ゲノムDNAを増幅した（これらは全て95℃２分変成させ
ることによって開始させた）。プログラム1:94℃50秒、
64℃30秒、72℃90秒の34サイクル。プログラム2:94℃45
秒、57℃45秒、72℃60秒。プログラム3:94℃50秒、60℃
45秒、72℃90秒。プログラム4:94℃60秒、55℃60秒、72
℃120秒の29サイクル。全てのプログラムでパーキン・
エルマー・シータスのTaqポリメラーゼが用いられ、72
℃15分の最終伸長で終了させた。PCR生成物はアガロー
スゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーン（Gene Cklea
n）（BIO 101）またはキアゲン（Qiagen）樹脂（Qiage
n）で精製した。エクソン１−４は表８に示すプライマ
ー対で増幅し、記載にしたがって（Ohbaら、1994）アプ
ライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）自動配
列決定装置で直接配列を決定した。エクソン１は、自動
配列決定のためにはEx1S−Ｓ（短）およびEx1ASを用い
て、さらに手動配列決定のためにはEx1SL（長）およびE
x1ASを用いて増幅した。エクソン５−７を含む2.1kbPCR
フラグメントはプライマーS3およびAS1で増幅し、ウィ
ザードミニプレップ（Wizard miniprep）（Promega）で
単離したpCR II（インビトロゲン）でクローニングし、
さらに35S〔dCTP〕を用いてシークェナーゼ（Sequenas
e）2.0（USB）によるジデオキシ鎖終結によって配列決
定した。自動配列決定の曖昧さは手動配列決定によって
解決された（全ての手動配列決定は両方の鎖について実
施した）。表３に記載したように、PCR増幅DNAの制限エ
ンドヌクレアーゼ消化によっていくつかの変異が確認さ
れた。
がって種々のプライマーを用いて、白血球から調製した
ゲノムDNAを増幅した（これらは全て95℃２分変成させ
ることによって開始させた）。プログラム1:94℃50秒、
64℃30秒、72℃90秒の34サイクル。プログラム2:94℃45
秒、57℃45秒、72℃60秒。プログラム3:94℃50秒、60℃
45秒、72℃90秒。プログラム4:94℃60秒、55℃60秒、72
℃120秒の29サイクル。全てのプログラムでパーキン・
エルマー・シータスのTaqポリメラーゼが用いられ、72
℃15分の最終伸長で終了させた。PCR生成物はアガロー
スゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーン（Gene Cklea
n）（BIO 101）またはキアゲン（Qiagen）樹脂（Qiage
n）で精製した。エクソン１−４は表８に示すプライマ
ー対で増幅し、記載にしたがって（Ohbaら、1994）アプ
ライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）自動配
列決定装置で直接配列を決定した。エクソン１は、自動
配列決定のためにはEx1S−Ｓ（短）およびEx1ASを用い
て、さらに手動配列決定のためにはEx1SL（長）およびE
x1ASを用いて増幅した。エクソン５−７を含む2.1kbPCR
フラグメントはプライマーS3およびAS1で増幅し、ウィ
ザードミニプレップ（Wizard miniprep）（Promega）で
単離したpCR II（インビトロゲン）でクローニングし、
さらに35S〔dCTP〕を用いてシークェナーゼ（Sequenas
e）2.0（USB）によるジデオキシ鎖終結によって配列決
定した。自動配列決定の曖昧さは手動配列決定によって
解決された（全ての手動配列決定は両方の鎖について実
施した）。表３に記載したように、PCR増幅DNAの制限エ
ンドヌクレアーゼ消化によっていくつかの変異が確認さ
れた。
実施例4:StAR変異体の活性 確認された変異が実際に患者の類脂質CAHの原因であ
るか否かを決定するために、さらにStAR蛋白の構造／機
能要件の解明を開始するために、識別変異の各々をイン
ビトロで調べた。種々のStAR変異を位置特異的変異誘発
によって再現し、pMT2またはpSPORTいずれかのStAR発現
ベクターでクローニングし、ステロイド非生成COS−１
細胞に導入した。正常なヒトStARcDNAを、発現ベクター
pCMV4（Anderssonら）のEcoR I/Hind III部位でクロー
ニングした。センスおよびアンチセンスプライマー、FL
−ＳおよびFL−AS（これらは完全な長さ（Full−Lengt
h）のStARcDNAのそれぞれ５′および３′末端に対応
し、それぞれEcoR IおよびHind III部位を含む）並び
に、変更されるべき配列を含む相補的プライマー対の一
方を用いてオーバーラップPCRによって識別された変異
を再現した（表10）。各変異の構築のために、PCRプロ
グラム４およびPFUポリメラーゼ（Stratagene）を用い
て２つのPCR反応を別々に実施したが、このとき最初にF
L−Ｓおよびアンチセンス変異誘発性オリゴヌクレオチ
ドを用い、二番目にFL−ASおよびセンス変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドを用いた。PCR生成物はアガロースゲル
電気泳動、続いてジーンクリーンまたはキアゲンカラム
で精製した。100倍に希釈した後、反応の各組みの１μ
ｌ量を合わせ、FL−ＳおよびFL−ASによるPCR（プログ
ラム４）の鋳型として用いた。最終的なPCR生成物をEco
R IおよびHind III−切断pCMV4で切断し、さらに構築の
正確さを立証するために配列決定した。ΔR272および94
7/InsA/948変異（これは３′末端近くに存在する）は、
オリゴヌクレオチドFL−Ｓおよび第一のPCR反応のため
にはΔR272−ASまたは947/InsA−ASのいずれかを、さら
にFLSおよび第二の反応の各々のためには３′ブリッジ
オリゴヌクレオチドを用いて単独セグメント内に構築し
た。全てにおいてプログラム４を用いた。
るか否かを決定するために、さらにStAR蛋白の構造／機
能要件の解明を開始するために、識別変異の各々をイン
ビトロで調べた。種々のStAR変異を位置特異的変異誘発
によって再現し、pMT2またはpSPORTいずれかのStAR発現
ベクターでクローニングし、ステロイド非生成COS−１
細胞に導入した。正常なヒトStARcDNAを、発現ベクター
pCMV4（Anderssonら）のEcoR I/Hind III部位でクロー
ニングした。センスおよびアンチセンスプライマー、FL
−ＳおよびFL−AS（これらは完全な長さ（Full−Lengt
h）のStARcDNAのそれぞれ５′および３′末端に対応
し、それぞれEcoR IおよびHind III部位を含む）並び
に、変更されるべき配列を含む相補的プライマー対の一
方を用いてオーバーラップPCRによって識別された変異
を再現した（表10）。各変異の構築のために、PCRプロ
グラム４およびPFUポリメラーゼ（Stratagene）を用い
て２つのPCR反応を別々に実施したが、このとき最初にF
L−Ｓおよびアンチセンス変異誘発性オリゴヌクレオチ
ドを用い、二番目にFL−ASおよびセンス変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドを用いた。PCR生成物はアガロースゲル
電気泳動、続いてジーンクリーンまたはキアゲンカラム
で精製した。100倍に希釈した後、反応の各組みの１μ
ｌ量を合わせ、FL−ＳおよびFL−ASによるPCR（プログ
ラム４）の鋳型として用いた。最終的なPCR生成物をEco
R IおよびHind III−切断pCMV4で切断し、さらに構築の
正確さを立証するために配列決定した。ΔR272および94
7/InsA/948変異（これは３′末端近くに存在する）は、
オリゴヌクレオチドFL−Ｓおよび第一のPCR反応のため
にはΔR272−ASまたは947/InsA−ASのいずれかを、さら
にFLSおよび第二の反応の各々のためには３′ブリッジ
オリゴヌクレオチドを用いて単独セグメント内に構築し
た。全てにおいてプログラム４を用いた。
コレステロールのプレグネノロンへの変換に対する正
常StARまたは変異StARの作用を調べるために、コレステ
ロール側鎖切断系の３成分を単一の単分子融合蛋白（H2
N−P450scc−AdRed−ADx−COOH、F2と呼ぶ）として発現
するベクターを細胞に同時トランスフェクトした。これ
によってP450scc活性は最適化され、P450sccのその電子
伝達蛋白（特にアドレノドキシン）に対する分子比の変
動によるP450scc活性における一切の変動が排除される
（Harikrishnaら;Zuberら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5:699−703（1988））。可溶性コレステロール類似体
（例えば20α−ヒドロキシコレステロールまたは22R−
ヒドロキシコレステロール）で細胞を培養することによ
って、ミトコンドリアのステロイド生成能は迂回される
（Toaffら、Endocrinology 111:1785−1790（198
2））。したがって、基質としてLDLコレステロールを用
いた場合のステロイド生成能に対する基質として22R−
ヒドロキシコレステロールを用いた場合のステロイド生
成能の比は、ミトコンドリアのコレステロール輸送効率
の指標を提供する。表11に示すように、野性型StARはス
テロイド生成が10倍増加し、我々が以前に見出したもの
と一致し（Linら、1995）、さらに、変異体のいずれも
ベクターコントロールより大きな活性は示さなかった。
したがって、これら認定された変異の各々は完全に不活
性なStAR蛋白を生じた。
常StARまたは変異StARの作用を調べるために、コレステ
ロール側鎖切断系の３成分を単一の単分子融合蛋白（H2
N−P450scc−AdRed−ADx−COOH、F2と呼ぶ）として発現
するベクターを細胞に同時トランスフェクトした。これ
によってP450scc活性は最適化され、P450sccのその電子
伝達蛋白（特にアドレノドキシン）に対する分子比の変
動によるP450scc活性における一切の変動が排除される
（Harikrishnaら;Zuberら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5:699−703（1988））。可溶性コレステロール類似体
（例えば20α−ヒドロキシコレステロールまたは22R−
ヒドロキシコレステロール）で細胞を培養することによ
って、ミトコンドリアのステロイド生成能は迂回される
（Toaffら、Endocrinology 111:1785−1790（198
2））。したがって、基質としてLDLコレステロールを用
いた場合のステロイド生成能に対する基質として22R−
ヒドロキシコレステロールを用いた場合のステロイド生
成能の比は、ミトコンドリアのコレステロール輸送効率
の指標を提供する。表11に示すように、野性型StARはス
テロイド生成が10倍増加し、我々が以前に見出したもの
と一致し（Linら、1995）、さらに、変異体のいずれも
ベクターコントロールより大きな活性は示さなかった。
したがって、これら認定された変異の各々は完全に不活
性なStAR蛋白を生じた。
実施例5:StARmRNAの発現 種々のヒト組織に由来するポリ（Ａ）＋RNA2μｇを含
むノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Clon
tech Laboratorie（Palo Alto,カリフォルニア））から
購入し、供給元のプロトコルにしたがって1.6kbのStARc
DNAおよびβ−アクチンcDNAをプローブとして調べた。
むノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Clon
tech Laboratorie（Palo Alto,カリフォルニア））から
購入し、供給元のプロトコルにしたがって1.6kbのStARc
DNAおよびβ−アクチンcDNAをプローブとして調べた。
StARmRNAはヒトの卵巣、精巣および腎で検出された。
最も多い転写物は1.6kbで、それより少ない量で4.4kbお
よび7.5kbのmRNAが卵巣および精巣で認められた（図
９）。出産可能年令の女性から得られた５つの卵巣を合
わせて調製した卵巣サンプルは殆どのStARmRNAを含み、
続いて精巣さらに腎臓がこれに続いた。同じ32P標識cDN
A調製物をプローブとして調べた図９に示したノザンブ
ロットでは、卵巣および精巣を含ブロットはStAR発現に
ついて６時間露光し、一方、腎サンプルを含むブロット
はStARについて24時間露光した。両方のブロットをさら
に長時間露光しても、胎盤、膵、骨格筋、肝、肺、脳、
心臓、末梢血白血球、大腸、小腸、前立腺、胸腺および
脾臓ではStARmRNAを明示することができなかった。しか
しながら、β−アクチンmRNAは、同じブロットのこれら
組織の全てで容易に検出できた。ヒト副腎皮質における
StARの発現は、ヒトStARcDNAを単離するために用いられ
たライブラリーで多数のStARファージクローンが検出さ
れたという事実から推論される。
最も多い転写物は1.6kbで、それより少ない量で4.4kbお
よび7.5kbのmRNAが卵巣および精巣で認められた（図
９）。出産可能年令の女性から得られた５つの卵巣を合
わせて調製した卵巣サンプルは殆どのStARmRNAを含み、
続いて精巣さらに腎臓がこれに続いた。同じ32P標識cDN
A調製物をプローブとして調べた図９に示したノザンブ
ロットでは、卵巣および精巣を含ブロットはStAR発現に
ついて６時間露光し、一方、腎サンプルを含むブロット
はStARについて24時間露光した。両方のブロットをさら
に長時間露光しても、胎盤、膵、骨格筋、肝、肺、脳、
心臓、末梢血白血球、大腸、小腸、前立腺、胸腺および
脾臓ではStARmRNAを明示することができなかった。しか
しながら、β−アクチンmRNAは、同じブロットのこれら
組織の全てで容易に検出できた。ヒト副腎皮質における
StARの発現は、ヒトStARcDNAを単離するために用いられ
たライブラリーで多数のStARファージクローンが検出さ
れたという事実から推論される。
これらの観察は、StAR発現は、cAMPの仲介性によって
作用するトロピックホルモンによる急性調節下にあるミ
トコンドリアのステロールヒドロキシル付加反応を起こ
す臓器に限られるということを示唆する。このことは副
腎および性腺について正しい。これらの臓器はそれぞれ
の下垂体トロピックホルモン（ACTHおよびLH）に応答し
てコレステロール側鎖切断を強化させ、さらに腎臓につ
いても同様で、これはPTHに応答してビタミンＤの１α
−ヒドロキシル付加を増加させる。別のステロイド生成
臓器である胎盤はStARを発現しないらしいことは注目に
値する。しかしながら、胎盤のプロジェステロンはcAMP
による急性調節下にあるようには思えない。胎盤栄養膜
のcAMPレベルまたはcAMP類似体を増加させる薬剤の報告
され促進作用は、ステロイド生成酵素をコードする遺伝
子の発現を増加させる（何時間または何日かを要する過
程）ことに関係がありそうである（T.G.Golos,W.L.Mill
er J.F.Straus,III J.Clin.Invest.80:896−899（198
7））。脳（これもまたステロイド生成部位である（D.P
atterson,C.Jones,I.Hart,J.Bleskan,R.Berger,D.Geye
r,S.P.Eisenberg,M.F.Smith Jr.,W.P.Arend,Genomics 1
5:173−176（1993））もStARを発現していないようであ
った。胎盤および脳でStAR発現がないことは、これら臓
器のステロイドホルモン合成が他のメカニズムによって
調節されていることを示唆しているが、これは以前にリ
ーバーマンおよびその共同研究者らが提唱した（S.Lieb
erman,V.V.K.Prasad,Endoc.Rev.11:469−493（199
0））。
作用するトロピックホルモンによる急性調節下にあるミ
トコンドリアのステロールヒドロキシル付加反応を起こ
す臓器に限られるということを示唆する。このことは副
腎および性腺について正しい。これらの臓器はそれぞれ
の下垂体トロピックホルモン（ACTHおよびLH）に応答し
てコレステロール側鎖切断を強化させ、さらに腎臓につ
いても同様で、これはPTHに応答してビタミンＤの１α
−ヒドロキシル付加を増加させる。別のステロイド生成
臓器である胎盤はStARを発現しないらしいことは注目に
値する。しかしながら、胎盤のプロジェステロンはcAMP
による急性調節下にあるようには思えない。胎盤栄養膜
のcAMPレベルまたはcAMP類似体を増加させる薬剤の報告
され促進作用は、ステロイド生成酵素をコードする遺伝
子の発現を増加させる（何時間または何日かを要する過
程）ことに関係がありそうである（T.G.Golos,W.L.Mill
er J.F.Straus,III J.Clin.Invest.80:896−899（198
7））。脳（これもまたステロイド生成部位である（D.P
atterson,C.Jones,I.Hart,J.Bleskan,R.Berger,D.Geye
r,S.P.Eisenberg,M.F.Smith Jr.,W.P.Arend,Genomics 1
5:173−176（1993））もStARを発現していないようであ
った。胎盤および脳でStAR発現がないことは、これら臓
器のステロイドホルモン合成が他のメカニズムによって
調節されていることを示唆しているが、これは以前にリ
ーバーマンおよびその共同研究者らが提唱した（S.Lieb
erman,V.V.K.Prasad,Endoc.Rev.11:469−493（199
0））。
インビトロ受精／胎児移転を受けた女性から得たヒト
顆粒層細胞培養から、または精製ヒト栄養膜細胞層細胞
から全RNAを単離した。ヒト顆粒層細胞は４日間培養
し、続いて1.5mMの８−ブロモ−cAMPで24時間処理し
た。栄養膜細胞層細胞は1.5mMの８−ブロモ−cAMPの存
在下または非存在下で24時間培養した。この調製、培養
並びに顆粒層細胞および栄養膜細胞層細胞の全RNAの単
離についての詳細なプロトコルは以前に記載された（T.
G.Golos,W.L.Miller J.F.Straus,III J.Clin.Invest.8
0:896−899（1987）;G.E.Ringler,L.−C.Kao,W.L.Mille
r,J.F.Straus,III,Mol.Cell.Endocrinol.61:13−21（19
89））。StARcDNAおよびヒト28SrRNAをコードするcDNA
でノザンブロットを調べた。
顆粒層細胞培養から、または精製ヒト栄養膜細胞層細胞
から全RNAを単離した。ヒト顆粒層細胞は４日間培養
し、続いて1.5mMの８−ブロモ−cAMPで24時間処理し
た。栄養膜細胞層細胞は1.5mMの８−ブロモ−cAMPの存
在下または非存在下で24時間培養した。この調製、培養
並びに顆粒層細胞および栄養膜細胞層細胞の全RNAの単
離についての詳細なプロトコルは以前に記載された（T.
G.Golos,W.L.Miller J.F.Straus,III J.Clin.Invest.8
0:896−899（1987）;G.E.Ringler,L.−C.Kao,W.L.Mille
r,J.F.Straus,III,Mol.Cell.Endocrinol.61:13−21（19
89））。StARcDNAおよびヒト28SrRNAをコードするcDNA
でノザンブロットを調べた。
1.5mMの８−ブロモ−cAMPの存在下でヒト顆粒層細胞
を24時間培養することによって、StARmRNAは28SrRNAと
較べて３から７倍増加した（図10）。対照的に、StARmR
NAは、サイクリックAMP類似体の存在下または非存在下
で24時間インキュベートしたヒト栄養膜細胞層細胞の初
代培養では検出できなかった。StARmRNAはまた、８−ブ
ロモ−cAMPの存在下（P450sccおよびアドレノドキシン
遺伝子のアップレギュレーションのための処置）または
非存在下で24時間培養したJEG−３絨毛上皮腫細胞から
単離したポリ（Ａ）＋RNAのノザンブロットでも検出さ
れなかった（結果は示さず）（J.Picado−Leonard,R.Vo
utilainen,L.−C.Kao,B.−C.Chung,J.F.Strauss,III,W.
L.Miller,J.Biol.Chem.263:3240−3244（1988））。こ
れらの観察は、トロピックホルモンは、蛋白をコードす
るmRNAを増加させ、したがって蛋白合成を増加させるこ
とによって部分的にStARレベルを制御するかもしれない
ということを示唆している。
を24時間培養することによって、StARmRNAは28SrRNAと
較べて３から７倍増加した（図10）。対照的に、StARmR
NAは、サイクリックAMP類似体の存在下または非存在下
で24時間インキュベートしたヒト栄養膜細胞層細胞の初
代培養では検出できなかった。StARmRNAはまた、８−ブ
ロモ−cAMPの存在下（P450sccおよびアドレノドキシン
遺伝子のアップレギュレーションのための処置）または
非存在下で24時間培養したJEG−３絨毛上皮腫細胞から
単離したポリ（Ａ）＋RNAのノザンブロットでも検出さ
れなかった（結果は示さず）（J.Picado−Leonard,R.Vo
utilainen,L.−C.Kao,B.−C.Chung,J.F.Strauss,III,W.
L.Miller,J.Biol.Chem.263:3240−3244（1988））。こ
れらの観察は、トロピックホルモンは、蛋白をコードす
るmRNAを増加させ、したがって蛋白合成を増加させるこ
とによって部分的にStARレベルを制御するかもしれない
ということを示唆している。
実施例6:StAR構造遺伝子および偽遺伝子のマッピング 体細胞ハイブリッドから得たDNAのサザンブロットの
ハイブリダイゼーションにより、さらに構造遺伝子また
は偽遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応分析によって、StAR遺伝子およびその偽遺伝子
をマッピングした。NIGMSヒト遺伝子変異細胞集積所（1
992/1993細胞株カタログ、アメリカ予防衛生研究所）か
ら得たヒト×ハムスターおよびヒト×マウス体細胞ハイ
ブリッド系の高分子量DNA、およびビオス社（BIOS Corp
oration,ニューヘブン、コネチカット）から購入したヒ
ト×ハムスター体細胞ハイブリッドのDNAを用いて、構
造遺伝子および偽遺伝子の染色体上の配置を特定した。
ハイブリダイゼーションにより、さらに構造遺伝子また
は偽遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応分析によって、StAR遺伝子およびその偽遺伝子
をマッピングした。NIGMSヒト遺伝子変異細胞集積所（1
992/1993細胞株カタログ、アメリカ予防衛生研究所）か
ら得たヒト×ハムスターおよびヒト×マウス体細胞ハイ
ブリッド系の高分子量DNA、およびビオス社（BIOS Corp
oration,ニューヘブン、コネチカット）から購入したヒ
ト×ハムスター体細胞ハイブリッドのDNAを用いて、構
造遺伝子および偽遺伝子の染色体上の配置を特定した。
StAR構造遺伝子の局部マッピングは以下から成る染色
体８の局部マッピングパネルを用いて実施された：ハイ
ブリッド9HL10、ISHL27および20XP0435−２（ワグナー
博士提供（Y.J.Chang,R.T.McCabe,H.Budarf,R.Sayegh,
B.S.Emanuel,P.Skolnick,J.F.Straus,III,DNA Cell Bio
l.11:471−480（1992）））,8q−、21q＋およびC117
（M.J.Wagner,Y.Ge,M.Siciliano,D.E.Wells,Genomics 1
0:114−125（1991）;R.Dalla−Favera,M.Bregni,J.Erik
son,D.Patterson,R.C.Gallo,C.M.Croce,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82:464−468（1982）;H.A.Drabkin,M.Diaz,
C.M.Bradley,MM.Le Beau,J.D.Rowley,D.Patterson,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:464−468（1985））並びにRec
8（これはGlyBCHO−K1変異体と組換え体８症候群の患者
の細胞との融合によって生成されたハイブリッドであ
る）（N.Sacchi,S.V.Cheng,R.E.Tanzi,J.F.Gusella,H.
A.Drabkin,D.Patterson,J.H.Haines,T.S.Papas,Genomic
s 3:110−116（1988））。Rec8は組換え体８染色体を含
むが、正常なヒト染色体８は含まない。
体８の局部マッピングパネルを用いて実施された：ハイ
ブリッド9HL10、ISHL27および20XP0435−２（ワグナー
博士提供（Y.J.Chang,R.T.McCabe,H.Budarf,R.Sayegh,
B.S.Emanuel,P.Skolnick,J.F.Straus,III,DNA Cell Bio
l.11:471−480（1992）））,8q−、21q＋およびC117
（M.J.Wagner,Y.Ge,M.Siciliano,D.E.Wells,Genomics 1
0:114−125（1991）;R.Dalla−Favera,M.Bregni,J.Erik
son,D.Patterson,R.C.Gallo,C.M.Croce,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82:464−468（1982）;H.A.Drabkin,M.Diaz,
C.M.Bradley,MM.Le Beau,J.D.Rowley,D.Patterson,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:464−468（1985））並びにRec
8（これはGlyBCHO−K1変異体と組換え体８症候群の患者
の細胞との融合によって生成されたハイブリッドであ
る）（N.Sacchi,S.V.Cheng,R.E.Tanzi,J.F.Gusella,H.
A.Drabkin,D.Patterson,J.H.Haines,T.S.Papas,Genomic
s 3:110−116（1988））。Rec8は組換え体８染色体を含
むが、正常なヒト染色体８は含まない。
ハイブリッドパネルのゲノムDNAをHind IIIで消化
し、サザンブロット（サザンブロットの詳細な技術は下
記で説明する）に付したとき、約8kbの強いハイブリダ
イゼーションバンドが、ヒトゲノムDNAコントロールお
よびハイブリッドGM10156（これはヒト染色体８のみを
含む）で検出された（図11）。微かなバンドが、GM1047
8（これはヒト染色体20の他にヒト染色体8pのフラグメ
ントもまた含む）でもまた検出された。これらの発見
は、ファイルStAR遺伝子は染色体８に存在することを示
唆した。
し、サザンブロット（サザンブロットの詳細な技術は下
記で説明する）に付したとき、約8kbの強いハイブリダ
イゼーションバンドが、ヒトゲノムDNAコントロールお
よびハイブリッドGM10156（これはヒト染色体８のみを
含む）で検出された（図11）。微かなバンドが、GM1047
8（これはヒト染色体20の他にヒト染色体8pのフラグメ
ントもまた含む）でもまた検出された。これらの発見
は、ファイルStAR遺伝子は染色体８に存在することを示
唆した。
StAR遺伝子が染色体８に局在することを確認するため
に、構造遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いる
PCRにより体細胞ハイブリッドを調べた。染色体８を含
むハイブリッドは陽性の信号を生じ、一方、他の全ての
ハイブリッド（ヒト染色体20を含むが染色体８は含まな
いことが分かっているハイブリッドを含む）は特異的な
増幅生成物を生じなかった。
に、構造遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いる
PCRにより体細胞ハイブリッドを調べた。染色体８を含
むハイブリッドは陽性の信号を生じ、一方、他の全ての
ハイブリッド（ヒト染色体20を含むが染色体８は含まな
いことが分かっているハイブリッドを含む）は特異的な
増幅生成物を生じなかった。
ヒト染色体８の局部マッピングパネルの分析によっ
て、StAR遺伝子は8p上に位置決定された（図12A）。機
能的StAR遺伝子の局部マッピングの確認と純化は、StAR
機能的遺伝子を含むYACを単離し、このYACをFISHでプロ
ーブとして用いることによって実施した（図12B）。局
部マッピングは、連続的バンド形成とそれに続くFISHに
よって実施した。この方法によって、StAR座位は8p11.2
に特定された。長さ分別測定と同様に、StARYACおよび
８動原体特異的プローブを用いた同時FISHによって、こ
の座位の特定は確認された。
て、StAR遺伝子は8p上に位置決定された（図12A）。機
能的StAR遺伝子の局部マッピングの確認と純化は、StAR
機能的遺伝子を含むYACを単離し、このYACをFISHでプロ
ーブとして用いることによって実施した（図12B）。局
部マッピングは、連続的バンド形成とそれに続くFISHに
よって実施した。この方法によって、StAR座位は8p11.2
に特定された。長さ分別測定と同様に、StARYACおよび
８動原体特異的プローブを用いた同時FISHによって、こ
の座位の特定は確認された。
逆転写されたヒト精巣RNAのPCR分析およびヒトゲノム
DNAのPCR分析によって、発現StAR偽遺伝子の存在が示唆
された。増幅偽遺伝子生成物のDNA配列はイントロンを
含まず、ヌクレオチドの挿入、欠失および置換に関して
多くの場所で機能的StAR遺伝子配列とは異なっていた。
増幅配列は個々の幾つかの配列間で異なり、顕著な多形
現象を示唆していた。偽遺伝子配列に特異的なプライマ
ーを用いて、StAR偽遺伝子は染色体13に存在することを
決定した（図13）。
DNAのPCR分析によって、発現StAR偽遺伝子の存在が示唆
された。増幅偽遺伝子生成物のDNA配列はイントロンを
含まず、ヌクレオチドの挿入、欠失および置換に関して
多くの場所で機能的StAR遺伝子配列とは異なっていた。
増幅配列は個々の幾つかの配列間で異なり、顕著な多形
現象を示唆していた。偽遺伝子配列に特異的なプライマ
ーを用いて、StAR偽遺伝子は染色体13に存在することを
決定した（図13）。
実施例7:サザンブロッティングとPCR分析 24個の体細胞ハイブリッド、完全なヒト、ハムスター
（RJK88）およびマウス（GMC11−Ｄ）から得た12μｇの
ゲノムDNA10種をHind IIIで消化し、0.8％アガロースで
電気泳動し、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋（Amersham,エ
ールスベリー、イギリス）膜にブロットした。StARcDNA
によるハイブリダイゼーションは、先に述べた条件で実
施した（Y.J.Chang,R.T.McCabe,H.Budarf,R.Sayegh,B.
S.Emanuel,P.Skolnick,J.F.Straus,III,DNA Cell Biol.
11:471−480（1992））。
（RJK88）およびマウス（GMC11−Ｄ）から得た12μｇの
ゲノムDNA10種をHind IIIで消化し、0.8％アガロースで
電気泳動し、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋（Amersham,エ
ールスベリー、イギリス）膜にブロットした。StARcDNA
によるハイブリダイゼーションは、先に述べた条件で実
施した（Y.J.Chang,R.T.McCabe,H.Budarf,R.Sayegh,B.
S.Emanuel,P.Skolnick,J.F.Straus,III,DNA Cell Biol.
11:471−480（1992））。
StAR構造遺伝子および偽遺伝子は、配列特異的プライ
マーを用いて体細胞ハイブリッドDNAのPCR分析によって
マッピングした。構造遺伝子のために用いられた前進方
向プライマーは５′−GTGAGCAAAGTCCAGGTGCG−３′で、
逆方向プライマーは５′−TGTGGCCATGCCAGCCAGCA−３′
であった。これらの配列は小さなイントロンを含み、30
0ヌクレオチドの生成物を生じる。PCR増幅発現偽遺伝子
のDNA配列に由来するプライマー（その配列は他の箇所
に記載する）を偽遺伝子の配置決定に用いた。その前進
方向プライマーは５′−AGCCTCACCGGCGTTGGCGG−３′
で、逆方向プライマーは５′−CTGCAAGACCTTGATCGCCTTG
−３′であった。これらのプライマーは800ヌクレオチ
ドの偽遺伝子特異的生成物生じる。PCRの条件は、94℃
で５分の変成、続いて94℃45秒の変成、65℃45秒のアニ
ーリングおよび72℃２分の伸長が30サイクルで、2mMのM
gCl2を含む緩衝液中の10pMのプライマーを用いた。PCR
生成物は、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析
し、臭化エチジウムで染色した。構造的StAR遺伝子の局
部マッピングを確認するために、染色体8pの遺伝地図を
作製できることが分かっている幾つかの遺伝子について
の局部マッピングパネルを調べた。これらの遺伝子に
は、クラストリン遺伝子（clustrin gene,CL1）（A.C.
M.Smith,K.Spuhler,T.M.Wiliams,T.McConnell,E.Sujans
ky,A.Robinson,Am.J.Human.Genetics 41:1083−1103（1
987）;H.V.de Silva,J.A.Harmony,W.D.Stuart,C.M.Gil,
J.Ribbins,Biochemistry 29:5380−5389（1990）;D.E.J
enne,J.Tschopp,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7123−712
7（1989）;L.Kirszbaum,J.A.Sharpe,J.Murphy,A.J.d'Ap
ice,B.Classon,P.Hudson,I.D.Walker,EMBO J.8:711−71
8（1989））、リポ蛋白リパーゼ遺伝子（LPL）（J.M.Pi
neault,M.Tenniswood,J.Biol.Chem.268:5021−5031（19
93））およびスクアレンシンターゼ遺伝子（SS）（K.L.
Wion,T.G.Kirchgessner,A.J.Lusis,M.c.Schotz,R.M.Law
n,Science 235:1638−1641（1987））が含まれる。PCR
プライマーは文献に発表された配列から作製した。CL1
特異的プライマーは５′−AGAAAGCGCTGCAGGAATACC−
３′および５′−GTGACGTGCAGAGCTCTC−３′で、それぞ
れヌクレオチド2504−2524および2836−2854を表す。LP
L特異的プライマーは、５′−GAAACTGGGCGAATCTAC−
３′および５′−TTGAAACACCCCAAACACTG−３′で、ヌク
レオチド1601−1620および1687−1706をそれぞれ表す。
SS特異的プライマーは、５′−AAAAGAACGCTGTGTGGCIGGG
AC−３′および５′−ACCTAAACCGTGGCAAAT−３′で、そ
れぞれヌクレオチド1405−1428および1547−1568を表
す。
マーを用いて体細胞ハイブリッドDNAのPCR分析によって
マッピングした。構造遺伝子のために用いられた前進方
向プライマーは５′−GTGAGCAAAGTCCAGGTGCG−３′で、
逆方向プライマーは５′−TGTGGCCATGCCAGCCAGCA−３′
であった。これらの配列は小さなイントロンを含み、30
0ヌクレオチドの生成物を生じる。PCR増幅発現偽遺伝子
のDNA配列に由来するプライマー（その配列は他の箇所
に記載する）を偽遺伝子の配置決定に用いた。その前進
方向プライマーは５′−AGCCTCACCGGCGTTGGCGG−３′
で、逆方向プライマーは５′−CTGCAAGACCTTGATCGCCTTG
−３′であった。これらのプライマーは800ヌクレオチ
ドの偽遺伝子特異的生成物生じる。PCRの条件は、94℃
で５分の変成、続いて94℃45秒の変成、65℃45秒のアニ
ーリングおよび72℃２分の伸長が30サイクルで、2mMのM
gCl2を含む緩衝液中の10pMのプライマーを用いた。PCR
生成物は、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析
し、臭化エチジウムで染色した。構造的StAR遺伝子の局
部マッピングを確認するために、染色体8pの遺伝地図を
作製できることが分かっている幾つかの遺伝子について
の局部マッピングパネルを調べた。これらの遺伝子に
は、クラストリン遺伝子（clustrin gene,CL1）（A.C.
M.Smith,K.Spuhler,T.M.Wiliams,T.McConnell,E.Sujans
ky,A.Robinson,Am.J.Human.Genetics 41:1083−1103（1
987）;H.V.de Silva,J.A.Harmony,W.D.Stuart,C.M.Gil,
J.Ribbins,Biochemistry 29:5380−5389（1990）;D.E.J
enne,J.Tschopp,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7123−712
7（1989）;L.Kirszbaum,J.A.Sharpe,J.Murphy,A.J.d'Ap
ice,B.Classon,P.Hudson,I.D.Walker,EMBO J.8:711−71
8（1989））、リポ蛋白リパーゼ遺伝子（LPL）（J.M.Pi
neault,M.Tenniswood,J.Biol.Chem.268:5021−5031（19
93））およびスクアレンシンターゼ遺伝子（SS）（K.L.
Wion,T.G.Kirchgessner,A.J.Lusis,M.c.Schotz,R.M.Law
n,Science 235:1638−1641（1987））が含まれる。PCR
プライマーは文献に発表された配列から作製した。CL1
特異的プライマーは５′−AGAAAGCGCTGCAGGAATACC−
３′および５′−GTGACGTGCAGAGCTCTC−３′で、それぞ
れヌクレオチド2504−2524および2836−2854を表す。LP
L特異的プライマーは、５′−GAAACTGGGCGAATCTAC−
３′および５′−TTGAAACACCCCAAACACTG−３′で、ヌク
レオチド1601−1620および1687−1706をそれぞれ表す。
SS特異的プライマーは、５′−AAAAGAACGCTGTGTGGCIGGG
AC−３′および５′−ACCTAAACCGTGGCAAAT−３′で、そ
れぞれヌクレオチド1405−1428および1547−1568を表
す。
実施例8: 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）マッピン
グ ３′非翻訳配列に対応するStAR特異的プライマーを用
いるPCRスクリーニングによって、セントルイスライブ
ラリーからStAR構造的遺伝子を含む個々の酵母人工染色
体（YAC）を単離した。センスプライマーは、５′−CCT
ACTGGAAGCCTGCAAGTCTAAG−３′（ヌクレオチド1048−10
72）であった。アンチセンスプライマーは、５′−TGGT
TTTAGGTGGGTACATAAGGG−３′（ヌクレオチド1287−126
4）であった。YACのDNA中のStAR配列を、1mMのMgCl2を
含む10μｌの標準的なPCR反応容積中で増幅させた。YAC
DNAを先ず94℃で５分変成させた。増幅は、94℃30秒の
変成、55℃30秒のアニーリングおよび72℃30秒の伸長の
35サイクルで実施した。２％アガロースゲル（臭化エチ
ジウムによる染色を伴う）で予想される240ヌクレオチ
ドの増幅生成物の存在について、反応生成物を調べた。
グ ３′非翻訳配列に対応するStAR特異的プライマーを用
いるPCRスクリーニングによって、セントルイスライブ
ラリーからStAR構造的遺伝子を含む個々の酵母人工染色
体（YAC）を単離した。センスプライマーは、５′−CCT
ACTGGAAGCCTGCAAGTCTAAG−３′（ヌクレオチド1048−10
72）であった。アンチセンスプライマーは、５′−TGGT
TTTAGGTGGGTACATAAGGG−３′（ヌクレオチド1287−126
4）であった。YACのDNA中のStAR配列を、1mMのMgCl2を
含む10μｌの標準的なPCR反応容積中で増幅させた。YAC
DNAを先ず94℃で５分変成させた。増幅は、94℃30秒の
変成、55℃30秒のアニーリングおよび72℃30秒の伸長の
35サイクルで実施した。２％アガロースゲル（臭化エチ
ジウムによる染色を伴う）で予想される240ヌクレオチ
ドの増幅生成物の存在について、反応生成物を調べた。
YACのFISHは、以下のように変更を加えながら先の記
載（G.Jiang,T.L.McKenzie,D.G.Conrad,I.Schechter,J.
Biol.Chem.268:12818−12824（1993）;P.Licheter,C.−
J.Tang,K.Call,G.Hermanson,A.E.Glen,D.Housman,D.C.W
ard,Science 247:64−69（1990））にしたがって実施し
た。ビオチン標識プローブは75℃で５分変成させ、ヒト
Cot−1DNAで１時間37℃予備アニーリングを施し、さら
に先に変成させ脱水したヒト染色体のスライド調製物に
適用した。スライドをカバースリップで覆い、湿潤チャ
ンバー内で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。いくつか
の実験では、染色体８の動原体特異的プローブ（D8Z2:O
ncor Inc.,ガイザースバーグ、メリーランド）をこのハ
イブリダイゼーション混合物に加えた。ハイブリダイゼ
ーション後洗浄は、50％ホルムアミド/2×SSC（１×SSC
＝0.15MのNaClおよび0.015Mのクエン酸ナトリウム）で1
5分さらに２×SSCで８分、45℃で実施した。検出は、製
造元（Oncor,Inc.）の指示によって１回の増幅を用いて
アビジン−FITCによって実施した。染色体は沃化プロピ
ジウムで対比染色した。
載（G.Jiang,T.L.McKenzie,D.G.Conrad,I.Schechter,J.
Biol.Chem.268:12818−12824（1993）;P.Licheter,C.−
J.Tang,K.Call,G.Hermanson,A.E.Glen,D.Housman,D.C.W
ard,Science 247:64−69（1990））にしたがって実施し
た。ビオチン標識プローブは75℃で５分変成させ、ヒト
Cot−1DNAで１時間37℃予備アニーリングを施し、さら
に先に変成させ脱水したヒト染色体のスライド調製物に
適用した。スライドをカバースリップで覆い、湿潤チャ
ンバー内で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。いくつか
の実験では、染色体８の動原体特異的プローブ（D8Z2:O
ncor Inc.,ガイザースバーグ、メリーランド）をこのハ
イブリダイゼーション混合物に加えた。ハイブリダイゼ
ーション後洗浄は、50％ホルムアミド/2×SSC（１×SSC
＝0.15MのNaClおよび0.015Mのクエン酸ナトリウム）で1
5分さらに２×SSCで８分、45℃で実施した。検出は、製
造元（Oncor,Inc.）の指示によって１回の増幅を用いて
アビジン−FITCによって実施した。染色体は沃化プロピ
ジウムで対比染色した。
FISHに先立って、12の分裂中期分散標本をトリプシン
によるＧバンド染色し写真を撮った。スライドをヘムデ
（Heme−De,Fisher Scientific,フェアーローン、ニュ
ージャージー）で洗浄し油を除去して、無水メタノール
で２度10分脱染色し、さらに70％続いて80％エタノール
でそれぞれ２分ずつ脱水し、無水メタノール中に10分置
いて風乾させた。続いてFISHを上記のように実施した。
分裂中期分散標本を新しい場所に置き、プローブシグナ
ルによってバンドパターンを比較してプローブの配置を
特定した。断片の長さの測定によってこの配置特定を確
認した（G.Jiang,T.L.McKenzie,D.G.Conrad,I.Schechte
r,J.Biol.Chem.268:12818−12824（1993））。
によるＧバンド染色し写真を撮った。スライドをヘムデ
（Heme−De,Fisher Scientific,フェアーローン、ニュ
ージャージー）で洗浄し油を除去して、無水メタノール
で２度10分脱染色し、さらに70％続いて80％エタノール
でそれぞれ２分ずつ脱水し、無水メタノール中に10分置
いて風乾させた。続いてFISHを上記のように実施した。
分裂中期分散標本を新しい場所に置き、プローブシグナ
ルによってバンドパターンを比較してプローブの配置を
特定した。断片の長さの測定によってこの配置特定を確
認した（G.Jiang,T.L.McKenzie,D.G.Conrad,I.Schechte
r,J.Biol.Chem.268:12818−12824（1993））。
分裂中期分散標本は、エクタクローム400スライドフ
ィルムを用いてツァイスアキソフォト（Zeiss Axiopho
t）顕微鏡で撮影するか、またはコンピューターでデジ
タル処理しカラープリンターで印刷した。
ィルムを用いてツァイスアキソフォト（Zeiss Axiopho
t）顕微鏡で撮影するか、またはコンピューターでデジ
タル処理しカラープリンターで印刷した。
実施例9:患者の無傷のRNAとインビトロ生成RNAのRNアー
ゼ保護 Ｔ→Ａ変異のRNAスプライシングに対する影響を決定
するために、ヒトStARミニジーンのためのpCMV4発現ベ
クターを構築した。このベクターは、エクソン１、２、
３、４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エ
クソン６、イントロン６およびエクソン７から成る（す
なわち最初の４つはcDNA由来で、残りの構築物は天然の
遺伝子由来である）一次RNA転写物を発現する。
ゼ保護 Ｔ→Ａ変異のRNAスプライシングに対する影響を決定
するために、ヒトStARミニジーンのためのpCMV4発現ベ
クターを構築した。このベクターは、エクソン１、２、
３、４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エ
クソン６、イントロン６およびエクソン７から成る（す
なわち最初の４つはcDNA由来で、残りの構築物は天然の
遺伝子由来である）一次RNA転写物を発現する。
ミニジーン構築物：正常および変異ミニジーン構築物
は、５′エクソン１−２−３−４、イントロン４、エク
ソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６エク
ソン７、３′を含み、pCMV4でクローニングされた。cDN
A部分（エクソン１−２−３−４）は、５′−ATACTAAGC
TTGCAACCACCCTTGAGAGAAG（塩基41−60）および５′−CC
CCATTGTCCTGCTGACTCTC（塩基421−442）による増幅によ
って生成された。ゲノム部分（エクソン４、イントロン
４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロ
ン６、エクソン７）は、５′−GGGGACAAAGTGATGAGTAAAG
TG（塩基439−462）および５′−ATATCTAGACTGATGAGCGT
GTGTACCAG（塩基1021−1040）を用いて増幅された。PCR
の後、過剰なヌクレオチドをセントリコン−100で遠心
沈澱させて除去した。DNAフラグメントを、50μＭのdTT
Pの存在下でDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメント
で処理し、CMVプロモーターから下流でクローニングし
た。各構築物の５μｇを燐酸カルシウム沈澱によって、
10％ウシ胎児血清補充DMEM−H21中で増殖させたCOS−１
細胞にトランスフェクトした。RSV−LUC構築物（0.5μ
ｇ）を用いて各プレートでトランスフェクション効率を
モニターした。トランスフェクション後12時間して培養
液を交換し、細胞を採集前にさらに48時間増殖させた。
ルシフェラーゼアッセー系（Promega）を15秒用いてル
シフェラーゼ活性を測定した。チオシアン酸グアニジン
抽出によって全RNAを調製し、一方、細胞RNAおよび核RN
AはNP40による細胞溶解によって調製した。
は、５′エクソン１−２−３−４、イントロン４、エク
ソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６エク
ソン７、３′を含み、pCMV4でクローニングされた。cDN
A部分（エクソン１−２−３−４）は、５′−ATACTAAGC
TTGCAACCACCCTTGAGAGAAG（塩基41−60）および５′−CC
CCATTGTCCTGCTGACTCTC（塩基421−442）による増幅によ
って生成された。ゲノム部分（エクソン４、イントロン
４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロ
ン６、エクソン７）は、５′−GGGGACAAAGTGATGAGTAAAG
TG（塩基439−462）および５′−ATATCTAGACTGATGAGCGT
GTGTACCAG（塩基1021−1040）を用いて増幅された。PCR
の後、過剰なヌクレオチドをセントリコン−100で遠心
沈澱させて除去した。DNAフラグメントを、50μＭのdTT
Pの存在下でDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメント
で処理し、CMVプロモーターから下流でクローニングし
た。各構築物の５μｇを燐酸カルシウム沈澱によって、
10％ウシ胎児血清補充DMEM−H21中で増殖させたCOS−１
細胞にトランスフェクトした。RSV−LUC構築物（0.5μ
ｇ）を用いて各プレートでトランスフェクション効率を
モニターした。トランスフェクション後12時間して培養
液を交換し、細胞を採集前にさらに48時間増殖させた。
ルシフェラーゼアッセー系（Promega）を15秒用いてル
シフェラーゼ活性を測定した。チオシアン酸グアニジン
抽出によって全RNAを調製し、一方、細胞RNAおよび核RN
AはNP40による細胞溶解によって調製した。
続いてこのRNAのスプライジングをエクソン４および
５（プローブ１）またはエクソン４、イントロン４、エ
クソン５およびエクソン６（プローブ２）から成るリボ
プローブを用いてRNアーゼ保護アッセーにより調べた。
DNAフラグメントは、第一のプローブのための構築物の
ためにはセンスプライマー（S5）として５′−ATAGAATT
CGACAAAGTGATGAGTAAAGTG（塩基442−462）および、アン
チセンスプライマー（AS6）５′−CTGATGACACCCTTCTGCT
C（塩基757−776）を用い、さらに第二のプローブのた
めの構築物のためにはアンチセンスプライマー（AS7）
５′−CTTGAGGTCGATGCTGAGTAGCCTAGGATA（塩基850−87
0）を用いて増幅させた。これらのフラグメントはpKSの
EcoR IおよびBamH I部位でクローニングした。第三のプ
ローブのための構築物はPst I/EcoR Iゲノムフラグメン
トの第二の構築物のPst I/EcoR Iフラグメントへの連結
によって生成された。RNアーゼ保護実験は記載のように
実施した（Mol.Cell Biol.12:2124−2134（1992））。
プローブ１は、正常なミニジーンベクターをトランスフ
ェクトした細胞から単一の335bpバンドを検出し、これ
は一切の介在イントロン配列を含まないエクソン４およ
び５に対応する（図14）。しかしながら、イントロン４
のＴ→Ａ変異を含むベクターでトランスフェクトされた
細胞では、335bpバンドは認められず、それに代わって
エクソン５（185bp）およびエクソン４（150bp）が別々
のバンドとして検出され、エクソン４および５を分離さ
せる別のRNA配列（おそらくスプラインされないイント
ロン４）が存在することを示唆している。エクソン４は
一貫して断続的な（Stuttered）保護パターンを生じる
が、この原因は不明である。
５（プローブ１）またはエクソン４、イントロン４、エ
クソン５およびエクソン６（プローブ２）から成るリボ
プローブを用いてRNアーゼ保護アッセーにより調べた。
DNAフラグメントは、第一のプローブのための構築物の
ためにはセンスプライマー（S5）として５′−ATAGAATT
CGACAAAGTGATGAGTAAAGTG（塩基442−462）および、アン
チセンスプライマー（AS6）５′−CTGATGACACCCTTCTGCT
C（塩基757−776）を用い、さらに第二のプローブのた
めの構築物のためにはアンチセンスプライマー（AS7）
５′−CTTGAGGTCGATGCTGAGTAGCCTAGGATA（塩基850−87
0）を用いて増幅させた。これらのフラグメントはpKSの
EcoR IおよびBamH I部位でクローニングした。第三のプ
ローブのための構築物はPst I/EcoR Iゲノムフラグメン
トの第二の構築物のPst I/EcoR Iフラグメントへの連結
によって生成された。RNアーゼ保護実験は記載のように
実施した（Mol.Cell Biol.12:2124−2134（1992））。
プローブ１は、正常なミニジーンベクターをトランスフ
ェクトした細胞から単一の335bpバンドを検出し、これ
は一切の介在イントロン配列を含まないエクソン４およ
び５に対応する（図14）。しかしながら、イントロン４
のＴ→Ａ変異を含むベクターでトランスフェクトされた
細胞では、335bpバンドは認められず、それに代わって
エクソン５（185bp）およびエクソン４（150bp）が別々
のバンドとして検出され、エクソン４および５を分離さ
せる別のRNA配列（おそらくスプラインされないイント
ロン４）が存在することを示唆している。エクソン４は
一貫して断続的な（Stuttered）保護パターンを生じる
が、この原因は不明である。
患者の性腺から得たRT−PCRデータが示唆するよう
に、イントロン４のＴ→Ａ変異がスプライジング機構が
エクソン５に跳ぶ原因であるならば、変異ミニジーン構
築物をトランスフェクトされた細胞のRNAでエクソン６
に融合したエクソン４が見出され、野性型ミニジーン構
築物をトランスフェクトされたRNAには見出されないで
あろうと予想される。これを調べるために、プローブ２
についてRNアーゼ保護アッセーを実施した（図15）。こ
のプローブは、正常または変異体構築物をトランスフェ
クトした細胞から得たRNAおよびコントロールcDNAで、1
50塩基フラグメント（エクソン４に対応）および279塩
基フラグメント（エクソン５および６に対応）を検出す
る。トランスフェクト化細胞のRNAはまた570bp（エクソ
ン４、イントロン４、エクソン５および６）および476b
p（エクソン４、イントロン４、エクソン５）のスプラ
イスされていないフラグメントを保護する。150および2
79bpのスプライスされた形態は正常構築物によって発現
されたスプライスされていない形態よりもはるかに多い
が、変異体構築物からは同等な濃度である。したがっ
て、Ｔ→Ａ変異は正常なスプライシングに干渉する。核
RNAおよび細胞質RNAが分離されると、イントロン種の殆
どは核RNAであるが、幾らかのイントロン種は細胞質に
存在し、さらにいくらかのスプライスされた形態が核に
存在する。これは、細胞内漏出または細胞分画中の各分
画の他のものによる汚染のいずれかを反映している。ま
た、非常に高レベルのpCMV4ベクターからの発現がスプ
ライシング機構を飽和させる可能性も考えられる。した
がって、ミニジーン発現構築物の分析は、イントロン4/
エクソン５スプライス部位から11bpの単独Ｔ→Ａ変異
は、StAR前駆体RNAの適切なスプライシングを破壊し、
類脂質CAHを惹起することを示唆する。
に、イントロン４のＴ→Ａ変異がスプライジング機構が
エクソン５に跳ぶ原因であるならば、変異ミニジーン構
築物をトランスフェクトされた細胞のRNAでエクソン６
に融合したエクソン４が見出され、野性型ミニジーン構
築物をトランスフェクトされたRNAには見出されないで
あろうと予想される。これを調べるために、プローブ２
についてRNアーゼ保護アッセーを実施した（図15）。こ
のプローブは、正常または変異体構築物をトランスフェ
クトした細胞から得たRNAおよびコントロールcDNAで、1
50塩基フラグメント（エクソン４に対応）および279塩
基フラグメント（エクソン５および６に対応）を検出す
る。トランスフェクト化細胞のRNAはまた570bp（エクソ
ン４、イントロン４、エクソン５および６）および476b
p（エクソン４、イントロン４、エクソン５）のスプラ
イスされていないフラグメントを保護する。150および2
79bpのスプライスされた形態は正常構築物によって発現
されたスプライスされていない形態よりもはるかに多い
が、変異体構築物からは同等な濃度である。したがっ
て、Ｔ→Ａ変異は正常なスプライシングに干渉する。核
RNAおよび細胞質RNAが分離されると、イントロン種の殆
どは核RNAであるが、幾らかのイントロン種は細胞質に
存在し、さらにいくらかのスプライスされた形態が核に
存在する。これは、細胞内漏出または細胞分画中の各分
画の他のものによる汚染のいずれかを反映している。ま
た、非常に高レベルのpCMV4ベクターからの発現がスプ
ライシング機構を飽和させる可能性も考えられる。した
がって、ミニジーン発現構築物の分析は、イントロン4/
エクソン５スプライス部位から11bpの単独Ｔ→Ａ変異
は、StAR前駆体RNAの適切なスプライシングを破壊し、
類脂質CAHを惹起することを示唆する。
天然RNAのRNアーゼ保護：患者の少量の精巣RNAがプロ
ーブ２による直接試験のために入手できた（図16）。
（図４）で先に観察されたように、正常なヒト胎児副腎
RNAのみが279塩基（エクソン５および６に対応）および
150塩基（エクソン４に対応）の予期されたフラグメン
トを保護した。したがって、エクソン５を欠くPCR生成
物（場合によって正常RNAで認められる）は、極めてま
れな事象を表す。患者のRNAはいくつかの別な種を保護
した。少量の570および476塩基種が存在したが、これら
は、エクソン４、５および６に付随する（570bp）か、
またはエクソン４および５にのみ付随する（476bp）ス
プライスされていないイントロン４の保持に対応する。
150塩基種の豊富さは、正常RNAの場合よりわずかに少な
いが、279塩基種の豊富さははるかに少なく、患者のRNA
の多くでエクソン５のスキップを生じるＴ→Ａ変異と一
致する。患者のRNAはまた、100bpのDNAマーカーの近く
に移動する多量の種（おそらくエクソン６（94塩基）に
対応）を生じたが、これは保護されることが予想される
が、もしＴ→Ａ変異がエクソン５のスキップを生じると
したら他の配列に結合しないであろう。最後に患者のRN
Aは、エクソン６に付随しない単離されたエクソン５に
対応する少量の185bp種を含む。したがって、Ｔ→Ａ変
異は不規則なRNAスプライシングのいくつかの型を生じ
るようである。PCR増幅cDNAで認められたようにエクソ
ン５のスキップは顕著なエラーであるが、イントロン４
の保持および185塩基種によって反映されるまた別の下
流でのスプライシングエラーもまた生じる。
ーブ２による直接試験のために入手できた（図16）。
（図４）で先に観察されたように、正常なヒト胎児副腎
RNAのみが279塩基（エクソン５および６に対応）および
150塩基（エクソン４に対応）の予期されたフラグメン
トを保護した。したがって、エクソン５を欠くPCR生成
物（場合によって正常RNAで認められる）は、極めてま
れな事象を表す。患者のRNAはいくつかの別な種を保護
した。少量の570および476塩基種が存在したが、これら
は、エクソン４、５および６に付随する（570bp）か、
またはエクソン４および５にのみ付随する（476bp）ス
プライスされていないイントロン４の保持に対応する。
150塩基種の豊富さは、正常RNAの場合よりわずかに少な
いが、279塩基種の豊富さははるかに少なく、患者のRNA
の多くでエクソン５のスキップを生じるＴ→Ａ変異と一
致する。患者のRNAはまた、100bpのDNAマーカーの近く
に移動する多量の種（おそらくエクソン６（94塩基）に
対応）を生じたが、これは保護されることが予想される
が、もしＴ→Ａ変異がエクソン５のスキップを生じると
したら他の配列に結合しないであろう。最後に患者のRN
Aは、エクソン６に付随しない単離されたエクソン５に
対応する少量の185bp種を含む。したがって、Ｔ→Ａ変
異は不規則なRNAスプライシングのいくつかの型を生じ
るようである。PCR増幅cDNAで認められたようにエクソ
ン５のスキップは顕著なエラーであるが、イントロン４
の保持および185塩基種によって反映されるまた別の下
流でのスプライシングエラーもまた生じる。
実施例10:トランスフェクション実験と３β−ヒドロキ
シ−５−コレステン酸の分析 COS−１細胞にpCMV4（Suら、1990）中のラットP450c2
7cDNAおよびウシアドレノドキシン発現プラスミド（マ
イケル・ウォターマン博士（Dr.Michael Waterman（Van
derbilt University））ご提供）を、空のpSV−SPORT−
１ベクター（BRL,ベセスダ、メリーランド）または先に
述べたヒトStARcDNAを含むベクター（Sugawaraら、PNAS
1995）でトランスフェクトした。
シ−５−コレステン酸の分析 COS−１細胞にpCMV4（Suら、1990）中のラットP450c2
7cDNAおよびウシアドレノドキシン発現プラスミド（マ
イケル・ウォターマン博士（Dr.Michael Waterman（Van
derbilt University））ご提供）を、空のpSV−SPORT−
１ベクター（BRL,ベセスダ、メリーランド）または先に
述べたヒトStARcDNAを含むベクター（Sugawaraら、PNAS
1995）でトランスフェクトした。
P450c27によるコレステロール代謝の最終産物である
３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸（cholestenoic a
cid）の生成（Andersonら、1989）を先に記載されたよ
うに同位元素質量分析法で調べた（Reissら、J.Lipid R
es.35:1026−1030（1994））。簡単に記せば、ジューテ
ロ化スタンダード（500ng）を1ml容量の媒体に加え、酸
性化し酢酸エチルで抽出した後、生成物を薄層クロマト
グラフィーにより単離した。C27酸のメチル化後、溶出
物をアセチル化しヒューレットパッカードGLC−MS中の
融合シリカカラム（CP−si119CB、内径0.25mm、長さ25
m）上に注入した。同位元素比プログラムを用いて、m/z
4/4〔３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸メチルエス
テルアセテート、分子イオン＝472−60（アセテー
ト）〕の面積をモニターし、内因性ステロール量の計算
用積分によってそれぞれの面積を求めた。結果は表12に
示す。
３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸（cholestenoic a
cid）の生成（Andersonら、1989）を先に記載されたよ
うに同位元素質量分析法で調べた（Reissら、J.Lipid R
es.35:1026−1030（1994））。簡単に記せば、ジューテ
ロ化スタンダード（500ng）を1ml容量の媒体に加え、酸
性化し酢酸エチルで抽出した後、生成物を薄層クロマト
グラフィーにより単離した。C27酸のメチル化後、溶出
物をアセチル化しヒューレットパッカードGLC−MS中の
融合シリカカラム（CP−si119CB、内径0.25mm、長さ25
m）上に注入した。同位元素比プログラムを用いて、m/z
4/4〔３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸メチルエス
テルアセテート、分子イオン＝472−60（アセテー
ト）〕の面積をモニターし、内因性ステロール量の計算
用積分によってそれぞれの面積を求めた。結果は表12に
示す。
実施例11:StARプロモーターを用いた異種遺伝子の発現 StARプロモーターのプロモーター活性を分析するため
に、StAR遺伝子の1.3kbHind IIIフラグメント（bp−129
3＋25）を正方向および逆方向で、ホタルのルシフェラ
ーゼをレポーター遺伝子として含むプラスミドベクター
pGL2（Promega）でクローニングした。これらの実験で
用いられる他のプラスミドにはpGL2基本ベクター（これ
はプロモーター配列を含まない）、pGL2コントロール
（これはルシフェラーゼ遺伝子をSV40プロモーターおよ
びエンハンサーの制御下に置く）、およびpCH110（lacZ
遺伝子が初期SV40プロモーターの制御下にあるプラスミ
ド）（Pharmacia）が含まれる。
に、StAR遺伝子の1.3kbHind IIIフラグメント（bp−129
3＋25）を正方向および逆方向で、ホタルのルシフェラ
ーゼをレポーター遺伝子として含むプラスミドベクター
pGL2（Promega）でクローニングした。これらの実験で
用いられる他のプラスミドにはpGL2基本ベクター（これ
はプロモーター配列を含まない）、pGL2コントロール
（これはルシフェラーゼ遺伝子をSV40プロモーターおよ
びエンハンサーの制御下に置く）、およびpCH110（lacZ
遺伝子が初期SV40プロモーターの制御下にあるプラスミ
ド）（Pharmacia）が含まれる。
ネズミＹ−１副腎腫瘍細胞およびBeWo絨毛上皮腫細胞
を、10％ウシ胎児血清およびゲンタマイシン50μg/mlを
補充したダルベッコ（Dulbecco）の最小必須培養液から
成る培養液で35mmのプラスチック培養皿で成育させた。
トランスフェクションに用いたプラスミドマクシプレッ
プ（Maxiprep）試薬系（Qiagen）を用いて精製した。１
μｇのpGL2プラスミド構築物および１μｇのpCH110プラ
スミドを10μｌのリポフェクタミン（GIBCO/BRL）とと
もに含む血清非含有培養液1mlを加える前に、40％−60
％コンフレント状態の細胞培養を血清非含有培養液で２
度洗浄した。５時間のインキュベーション後、20％の血
清を含む培養液1mlと交換した。48時間培養した後細胞
を採集した。いくつかの実験では、８−Br−cAMP（1m
M）を培養の最後の24時間培養液に加えた。
を、10％ウシ胎児血清およびゲンタマイシン50μg/mlを
補充したダルベッコ（Dulbecco）の最小必須培養液から
成る培養液で35mmのプラスチック培養皿で成育させた。
トランスフェクションに用いたプラスミドマクシプレッ
プ（Maxiprep）試薬系（Qiagen）を用いて精製した。１
μｇのpGL2プラスミド構築物および１μｇのpCH110プラ
スミドを10μｌのリポフェクタミン（GIBCO/BRL）とと
もに含む血清非含有培養液1mlを加える前に、40％−60
％コンフレント状態の細胞培養を血清非含有培養液で２
度洗浄した。５時間のインキュベーション後、20％の血
清を含む培養液1mlと交換した。48時間培養した後細胞
を採集した。いくつかの実験では、８−Br−cAMP（1m
M）を培養の最後の24時間培養液に加えた。
トランスフェクション後48時間で細胞を採集し、抽出
はプロメガ（Promega）溶解緩衝液中で実施した。一定
量（全抽出容積400μｌのうち40μｌ）をプロメガ試薬
によるルシフェラーゼアッセーに用い、別の150μｌを
プロメガ試薬によるβガラクトシダーゼアッセーに用い
た。トランスフェクトされていない細胞抽出物で測定し
た“ブランク”ルシフェラーゼ値をトランスフェクト化
細胞の抽出物のルシフェラーゼの読みから差し引いた。
トランスフェクション効率における変動を補正するため
に、ルシフェラーゼアッセーの結果はβ−ガラクトシダ
ーゼ活性に対して基準化した。各実験で、pGL2コントロ
ールベクターの活性を100％と規定した。各処置群は少
なくとも３培養を含み、さらに各実験は２または３回繰
り返された。結果は表13に示す。
はプロメガ（Promega）溶解緩衝液中で実施した。一定
量（全抽出容積400μｌのうち40μｌ）をプロメガ試薬
によるルシフェラーゼアッセーに用い、別の150μｌを
プロメガ試薬によるβガラクトシダーゼアッセーに用い
た。トランスフェクトされていない細胞抽出物で測定し
た“ブランク”ルシフェラーゼ値をトランスフェクト化
細胞の抽出物のルシフェラーゼの読みから差し引いた。
トランスフェクション効率における変動を補正するため
に、ルシフェラーゼアッセーの結果はβ−ガラクトシダ
ーゼ活性に対して基準化した。各実験で、pGL2コントロ
ールベクターの活性を100％と規定した。各処置群は少
なくとも３培養を含み、さらに各実験は２または３回繰
り返された。結果は表13に示す。
８−Br−cAMPによるＹ−１細胞処理は、StARプロモー
ター活性を2.3倍増加させ（ｐ＜0.002対ｔ検定によるロ
グ変換データ分析）、このDNAセグメントはcAMP感応エ
レメントを含むことを示唆した。StARプロモーター活性
におけるこの増化は、cAMPで４時間処理したヒト顆粒層
細胞のStARmRNAの定常状態レベルの３倍の増化に一致す
る（Sugawaraら、1995）。これは、cAMPに応答するStAR
mRNAの増化は少なくとも部分的には転写増化の結果であ
ることを示唆する。
ター活性を2.3倍増加させ（ｐ＜0.002対ｔ検定によるロ
グ変換データ分析）、このDNAセグメントはcAMP感応エ
レメントを含むことを示唆した。StARプロモーター活性
におけるこの増化は、cAMPで４時間処理したヒト顆粒層
細胞のStARmRNAの定常状態レベルの３倍の増化に一致す
る（Sugawaraら、1995）。これは、cAMPに応答するStAR
mRNAの増化は少なくとも部分的には転写増化の結果であ
ることを示唆する。
Ｙ−１細胞に関する我々の発見と対照的に、StARプロ
モーターは、BeWo絨毛上皮腫（これはStAR遺伝子を発現
しない）における顕著なレポーター遺伝子の発現をもた
らさなかった。これは、BeWo細胞を基準状態で調べよう
と、８−Br−cAMPで刺激後調べようと変わらなかった。
このことは、胎盤および絨毛上皮腫での検出可能なStAR
mRNAの欠如、および胎児が類脂質CAHに冒される妊娠中
の胎盤のステロイド生成の持続と矛盾しない（Sugawara
ら、1995）。したがって、StARの組織特異的発現および
cAMPによる調節を誘導するcis成分は、キャップ部位か
ら上流の1.3kbのDNA内に位置するように思える。
モーターは、BeWo絨毛上皮腫（これはStAR遺伝子を発現
しない）における顕著なレポーター遺伝子の発現をもた
らさなかった。これは、BeWo細胞を基準状態で調べよう
と、８−Br−cAMPで刺激後調べようと変わらなかった。
このことは、胎盤および絨毛上皮腫での検出可能なStAR
mRNAの欠如、および胎児が類脂質CAHに冒される妊娠中
の胎盤のステロイド生成の持続と矛盾しない（Sugawara
ら、1995）。したがって、StARの組織特異的発現および
cAMPによる調節を誘導するcis成分は、キャップ部位か
ら上流の1.3kbのDNA内に位置するように思える。
本明細書で言及した全ての文献および特許出願は、個
々の文献または特許出願が個々にかつ具体的に本明細書
に示すのと同程度に援用して本明細書に含まれる。
々の文献または特許出願が個々にかつ具体的に本明細書
に示すのと同程度に援用して本明細書に含まれる。
本発明は十分に説明されたが、当業者には、添付の請
求の範囲から外れることなく多くの変更および修飾を行
うことができることは明白であろう。
求の範囲から外れることなく多くの変更および修飾を行
うことができることは明白であろう。
フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバ ーシティ オブ ベンシルベニア アメリカ合衆国 19104−3147 ペンシ ルベニア州 フィラデルフィア マーケ ット ストリート 3700 スイート 300 (72)発明者 ミラー、ウォルター エル. アメリカ合衆国 94122 カリフォルニ ア州 サンフランシスコ エイス アベ ニュ 1683 (72)発明者 リン、ドング アメリカ合衆国 94122 カリフォルニ ア州 サンフランシスコ テンス アベ ニュ 1672 (72)発明者 ストラウス、ジェローム エフ．ザ サ ード アメリカ合衆国 19038 ペンシルベニ ア州 ワインドムール イースト ジラ バーズ レーン 805 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】ヒトに先天性類脂質副腎過形成を引き起こ
すか、または当該ヒトの子孫に先天性類脂質副腎過形成
を伝達する可能性を有する遺伝的欠陥を検出する方法で
あって： （１）当該ヒトからステロイド生成急性調節蛋白をコー
ドする遺伝子を含む核酸を得て； （２）当該遺伝子の変異の有無について当該核酸を分析
し、その場合、当該変異は、表６に説明したヒトステロ
イド生成急性調節蛋白ゲノムDNA配列と異なる配列を提
供し、それによって、当該変異の存在が先天性類脂質副
腎過形成を引き起こす可能性がある遺伝的欠陥を示唆す
る ことを含む当該方法。 - 【請求項２】ヒトに先天性類脂質副腎過形成を引き起こ
すか、または当該ヒトの子孫に先天性類脂質副腎過形成
を伝達する可能性がある遺伝的欠陥を検出する方法であ
って： （１）当該ヒトからステロイド生成急性調節蛋白をコー
ドする遺伝子を含む核酸を得て； （２）当該遺伝子の変異の有無について当該核酸を分析
し、この場合、当該変異は表６に説明したヒトステロイ
ド生成急性調節蛋白ゲノムDNA配列と異なる配列を提供
し、さらに、表６に説明したゲノムDNA配列を有するヘ
テロ接合体ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子の非存在
下で当該ヒトに存在するとき、当該変異は先天性類脂質
副腎過形成を引き起こす遺伝的欠陥を示唆することが分
かっている ことを含む当該方法。 - 【請求項３】ヒトに先天性類脂質副腎過形成を引き起こ
すか、または当該ヒトの子孫に先天性類脂質副腎過形成
を伝達する可能性を有する遺伝的欠陥を検出する方法で
あって： （１）当該ヒトからステロイド生成急性調節蛋白をコー
ドする遺伝子を含む核酸を得て； （２）当該遺伝子の変異の有無について当該核酸を分析
するが、その場合、当該変異は、エクソン１、エクソン
２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン
６、エクソン７またはイントロン４のヒトステロイド生
成急性調節蛋白ゲノムDNA配列と異なる配列を提供し、
それによって、当該変異の存在が先天性類脂質副腎過形
成を引き起こす可能性がある遺伝的欠陥を示唆する ことを含む当該方法。 - 【請求項４】前記変異が、前記ステロイド生成急性調節
蛋白遺伝子の蛋白産物の配列に変化を生じる請求の範囲
第１項の方法。 - 【請求項５】前記変異が、転写されないかまたは翻訳さ
れない前記ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子を生じる
請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項６】前記変異が前記ステロイド生成急性調節蛋
白遺伝子に終止コドンを作出する請求の範囲第１項の方
法。 - 【請求項７】前記変異が、Arg193→Stop変異またはGln
258→Stop変異である請求の範囲第６項の方法。 - 【請求項８】前記方法が、前記ステロイド生成急性調節
蛋白遺伝子の少なくとも１つのセグメントのPCR増幅を
含む請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項９】前記方法が、前記変異の結果としての制限
部位の変化を確認することを含む請求の範囲第１項の方
法。 - 【請求項１０】前記方法が、制限フラグメント長多形現
象分析、対立遺伝形質特異的オリゴヌクレオチドハイブ
リダイゼーションまたはヌクレオチド配列決定を含む請
求の範囲第１項の方法。 - 【請求項１１】前記方法が、前記ステロイド生成急性調
節蛋白遺伝子について、もしくは前記変異ステロイド生
成急性調節蛋白遺伝子についてのホモ接合体として、ま
たは前記ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子について、
もしくは前記変異ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子に
ついてのヘテロ接合体として前記ヒトを分類する請求の
範囲第１項の方法。 - 【請求項１２】前記変異が、Glu169→Gly変異、Arg182
→Leu変異、Glu169→Lys変異、Ala218→Val変異またはL
eu275→Pro変異である請求の範囲第４項の方法。 - 【請求項１３】前記変異が、少なくとも１つの欠失ヌク
レオチド、少なくとも１つの挿入ヌクレオチド、または
少なくとも１つの挿入および少なくとも１つの欠失ヌク
レオチドを含む欠失もしくは挿入変異である請求の範囲
第１項の方法。 - 【請求項１４】前記変異がフレームシフト変異である請
求の範囲第13項の方法。 - 【請求項１５】前記欠失ヌクレオチドがT593またはC650
である請求の範囲第14項の方法。 - 【請求項１６】前記挿入ヌクレオチドが、G247およびG
248の間のＧ、またはG947およびC948の間のＡである請
求の範囲第14項の方法。 - 【請求項１７】前記欠失ヌクレオチドが、C940、G941お
よびC942である請求の範囲第13項の方法。 - 【請求項１８】前記変異が、ステロイド生成急性調節蛋
白遺伝子によりコードされるmRNAの異常なスプライシン
グを引き起こす請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項１９】前記変異が、前記ステロイド生成急性調
節蛋白遺伝子の転写を抑制する請求の範囲第１項の方
法。 - 【請求項２０】前記変異が、前記ステロイド生成急性調
節蛋白のmRNAの翻訳を抑制する請求の範囲第１項の方
法。 - 【請求項２１】前記変異が、前記ステロイド生成急性調
節蛋白のmRNAの安定性を減少させる請求の範囲第１項の
方法。 - 【請求項２２】前記制限部位が、Sau96 I、Fsp I、Hha
I、Hae II、Nco I、Alu I、Tsp45 I、Ava II、Hae II
I、EcoR IIから成る群から選ばれる請求の範囲第９項の
方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US410,540 | 1995-03-23 | ||
| US08/410,540 US5807678A (en) | 1995-03-23 | 1995-03-23 | Identification of gene mutations associated with congenital lipoid adrenal hyperplasia |
| US08/410,540 | 1995-03-23 | ||
| PCT/US1996/003896 WO1996029338A1 (en) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Identification of gene mutations associated with congenital lipoid adrenal hyperplasia |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP23205499A Division JP3759346B2 (ja) | 1995-03-23 | 1999-08-18 | 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 |
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|---|---|
| JPH10501702A JPH10501702A (ja) | 1998-02-17 |
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Family
ID=23625169
Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP08528624A Expired - Lifetime JP3099896B2 (ja) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 |
| JP23205499A Expired - Lifetime JP3759346B2 (ja) | 1995-03-23 | 1999-08-18 | 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23205499A Expired - Lifetime JP3759346B2 (ja) | 1995-03-23 | 1999-08-18 | 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 |
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| JP (2) | JP3099896B2 (ja) |
| AU (1) | AU5427596A (ja) |
| WO (1) | WO1996029338A1 (ja) |
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| US7462605B2 (en) | 1998-01-23 | 2008-12-09 | Celmed Oncology (Usa), Inc. | Phosphoramidate compounds and methods of use |
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| US7485714B2 (en) * | 2000-06-20 | 2009-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Transcription factor having zinc finger domain |
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| KR20020023733A (ko) * | 2001-12-13 | 2002-03-29 | 진동규 | 선천성 부신성기 증후군의 진단 방법 및올리고뉴클레오타이드 칩 |
| US20070118913A1 (en) * | 2002-05-17 | 2007-05-24 | Thomas Hesterkamp | Diagnostic and therapeutic use of steroidogenic acute regulatory protein for neurodegenerative diseases |
| KR100926899B1 (ko) | 2007-06-08 | 2009-11-17 | (주)예비티 | 선천성 부신피질 과형성증 진단키트 |
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-
1995
- 1995-03-23 US US08/410,540 patent/US5807678A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-22 WO PCT/US1996/003896 patent/WO1996029338A1/en active Application Filing
- 1996-03-22 AU AU54275/96A patent/AU5427596A/en not_active Abandoned
- 1996-03-22 JP JP08528624A patent/JP3099896B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-18 JP JP23205499A patent/JP3759346B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| US5807678A (en) | 1998-09-15 |
| JPH10501702A (ja) | 1998-02-17 |
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