JP2000060581A - 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 先天性類脂質副腎過形成（類脂質ＣＡＨ）
を引き起こす変異座位として認定された遺伝子配列、お
よび本疾患の診断、さらに該疾患の遺伝的伝達可能性の
指標として該変異遺伝子存在を検出する。 【解決手段】 単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子であ
ってｈＳｔＡＲｃＤＮＡ、ｈＳｔＡＲゲノムまたはｈＳ
ｔＡＲ偽遺伝子ＤＮＡから成る第一の配列、該第一の配
列に相同性の高いまたは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配
列（断片）群。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、先天性類脂質副腎
過形成（類脂質ＣＡＨ）を引き起こす変異座位として認
定された遺伝子配列、および本疾患の診断、さらに該疾
患の遺伝的伝達可能性の指標として該変異遺伝子存在を
検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ステロイドホルモン合成は、トロピック
ホルモン刺激に反応して大きく増加する。もっともステ
ロイド生成酵素をコードする遺伝子の転写増加は長期の
ホルモン反応に重要であるが、急性反応における速度制
限工程は、ミトコンドリアへのコレステロールの輸送で
ある(J.F.Crivelloら、J. Biol. Chem. 255:8144(198
0); C.R. Jefcoateら、J. Steroid Biochem. 27:721(19
87)）。この輸送に関与する幾つかの分子が提唱された
が、それらの役割は未だ明確にはなっていない。

【０００３】初期の実験によって、先天性類脂質副腎過
形成（類脂質ＣＡＨ）は、副腎および性腺ステロイドホ
ルモンの重篤な欠乏という特徴をもつ（H.J. Degenhart
ら、Acta Endochrinol. 71:215(1972); S. Koizumiら、
Clin. Chem. Acta 77:301(1977); B.P. Hauffaら、Cli
n. Endocrinol. 23:481(1985)）常染色体の劣性障害で
あることが示された（Praderら、Helv. Paed Acta 17:2
85-289(1962)）。罹患幼児は、ステロイドホルモンの修
復処置がなければ塩欠失、高カリウム血症性アシドーシ
ス、脱水のために死亡する。最初に報告された３２名の
患者の調査で、遺伝的に男女は等しい頻度で罹患するこ
とが示唆されたが、ただし性別は、しばしば性腺の外観
および組織学的状況または口腔塗抹標本から推量された
（Hauffaら、1985）。ＸＹ遺伝型の男性患者は、精巣の
テストステロン合成の欠如のために女性外性器をもつ。
障害された副腎および性腺のミトコンドリアは、コレス
テロールからプレグネノロンへの変換ができないので、
この疾患は、以前にはコレステロール側鎖切断酵素（Ｐ
４５０ｓｃｃ）における欠陥のためであると考えられ
た。しかしながら、Ｐ４５０ｓｃｃの関与は罹患者の分
子遺伝学的分析によって除外された（D. Linら、J. Cli
n. Invest. 88:1955(1991); Y. Sakaiら、J. Clin. End
ocrinol. Metab. 79:1198(1994))。本出願人らは、この
欠陥はコレステロールのミトコンドリアへの輸送に深く
かかわっているであろうと推論した（D. Linら、J. Cli
n. Invest. 88:1955(1991); D. Linら、Genomics 18:64
3(1993))。しかしながら、類脂質ＣＡＨに関する分子的
欠陥のこの最新の解釈より以前には、この疾患に付随す
る特定の欠陥は全く知られていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ヒトの先天性類脂質過形成の遺伝学的診断方法
を提供することである。

【０００５】本発明の別の目的は、遺伝学的カウンセリ
ングで使用するためにヒトの先天性類脂質副腎過形成の
原因となる遺伝子の変異の有無を検出することである。

【０００６】本発明のまた別の目的は、該疾患をもつ患
者で不完全蛋白と交換する蛋白を提供することによっ
て、ヒトの先天性類脂質副腎下過形成を治療する方法を
提供することである。

【０００７】本発明のまた別の目的は、ミトコンドリア
の異常なコレステロール代謝が本発明の蛋白に反応する
酵素によって支配されているということを条件として、
該疾患をもつ患者で不完全蛋白と交換する蛋白を提供す
ることによって、当該代謝により引き起こされる高コレ
ステロール血症または他の疾患を治療または予防する方
法を提供することである。

【０００８】本発明のさらに別の目的は、本発明の蛋白
（本発明の突然変異蛋白）の発現のためのプロモータ
ー、または哺乳類細胞もしくは遺伝子移入哺乳類での異
種遺伝子発現のためのプロモーター、または遺伝子治療
用異種遺伝子の発現のためのプロモーターを提供するこ
とである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記のような目的および
以下で一層容易に明らかになるその他の目的は、単離さ
れたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を提供することによって達
成されるが、この場合、当該分子は：（１）図１、表６
−１乃至６−３または表７−１乃至７−３で説明するヒ
トステロイド生成急性調節蛋白（ｈＳｔＡＲ）ｃＤＮ
Ａ、ｈＳｔＡＲゲノムＤＮＡ、ｈＳＴＡＲプロモーター
またはｈＳｔＡＲ偽遺伝子から成る第一の配列、（２）
少なくとも長さが１０ヌクレオチドの、第一の配列のサ
ブ配列である第二の配列、（３）第一または第二の配列
の少なくとも１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド
で置換されている第三の配列、（４）当該第一または第
二の配列で少なくとも１個のヌクレオチドが欠失してい
るか、または挿入されている第四の配列、または（５）
第一、第二または第三のいずれかに相補的な第五の配列
を含み、この場合、（１）該分子がＲＮＡ分子の場合、
この分子の配列でＴはＵと置換され、（２）第三の配列
は第一または第二の配列に対して少なくとも９５％同一
で、さらに（３）第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡ
に存在しないことを条件とする。本発明はまた、ヒトの
変異ＳｔＡＲ遺伝子（例えば先天性類脂質副腎過形成に
付随するような変異）を検出する方法を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】特定の具体例に沿って説明する。

【００１１】胎盤のプロジェステロン合成は妊娠維持に
必要であるという以前に得られた示唆（J.F. Strauss
ら、Endocrinology(内分泌学）、L.J. DeGroot編、３
巻、2171-2206ページ(W.B. Saunders, フィラデルフィ
ア、1995))を基にした研究から本発明は得られた。類脂
質ＣＡＨ胎児をもつ妊娠は出産予定日まで正常に進行
し、さらに当該胎盤はプロジェステロンも産生すること
ができる（P. Saengerら、J.Clin. Endocrinol. Metab.
80:200-205(1995)）ので、本発明者らは、探索中の因
子は副腎および性腺のステロイド生成に必要であるが、
胎盤のステロイド合成には必要でないと推論した。最近
報告された３０ｋＤａ燐酸化蛋白は、トロピック刺激に
対する急激でシクロヘキシミド感受性のステロイド生成
反応を仲介すると考えられる（D.M. Stocco & T.C. Sod
eman, J. Biol. Chem.266,19739(1991);L.F. Epstein &
N.R. Orme-Johnson, J. Biol. Chem. 266, 19739(199
1); D.M.Stocco & M. Ascoli, Endocrinology, 132, 95
9(1993)）。この蛋白、すなわちステロイド生成急性調
節蛋白（ＳｔＡＲ）がＭＡ−１０マウスリーディッヒ
（Leydig）腫瘍細胞から精製された。マウスのＳｔＡＲ
ｃＤＮＡのクローニングは科学文献に以前に報告された
（B.J. Clark, J. Wells, S.R. King, D.M. Stocco,J.
Biol. Chem. 269:28314(1994)）。我々の仮説、すなわ
ちこの蛋白の遺伝的欠陥が類脂質ＣＡＨの原因であると
いうことが正しいか否かを決定するために、ヒトのＳｔ
ＡＲｃＤＮＡをクローニングした。ヒトＳｔＡＲｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は図１に
示す。変異は図１においてヌクレオチドの番号付けシス
テムで示されている。さらに影響を受けるアミノ酸が番
号付けシステムで表されているが、この場合、ヌクレオ
チド１２７〜１２９でコードされるメチオニンがＳｔＡ
Ｒ蛋白の最初のアミノ酸である。

【００１２】ＭＡ−１０細胞およびＣＯＳ−１細胞での
マウスＳｔＡＲｃＤＮＡの一過性の発現はステロイド生
成の強化をもたらす（B.J. Clark, J. Wells, S.R. Kin
g, D.M. Stocco, J. Biol. Chem. 269:28314(1994)
）。我々は、ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡについて同様な特
性を発見し、さらにＳｔＡＲｍＲＮＡは副腎および性腺
組織で豊富であるが、胎盤では豊富ではないことを見出
した。したがって、ＳｔＡＲは、類脂質ＣＡＨに関与す
る因子として有力な候補であるように思える。これがき
っかけとなって、我々は無関係の１９人の患者のＳｔＡ
Ｒ遺伝子を調べた。患者１（白人）はこれまで当技術分
野の他の者によって報告されていない。患者２（朝鮮
人）および患者３（日本人）は以前に報告されたがＳｔ
ＡＲ遺伝子については報告されていない（患者３:B.P.
Hauffaら、Clin. Endocrinol. 23:481(1985); 患者２お
よび３：D. Linら、J. Clin. Invest. 88:1955(1991)；
患者２：D.Linら、Genomics 18:643(1993))。

【００１３】我々は、精巣ｍＲＮＡを鋳型として用いて
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって
患者１および２からＳｔＡＲｃＤＮＡを作製した。５’
および３’非翻訳領域由来のＰＣＲプライマーを用いた
とき、主要な生成物はＳｔＡＲｃＤＮＡであったが、多
数の配列の相違を含む関連種が存在した。これは、下記
実施例で報告するＳｔＡＲ偽遺伝子の発見をもたらし
た。その偽遺伝子と真正のＳｔＡＲとを区別させる５’
非翻訳領域のＳ１と称する配列を用いて、我々は、正常
コントロールおよび２人の患者の９７４ｂｐＳｔＡＲｃ
ＤＮＡを増幅させた。これらのＲＴ−ＰＣＲ生成物をｐ
ＣＲＩＩベクターを用いてサブクローニングした。それ
ぞれ別個のＲＴ−ＰＣＲ反応から得た全患者クローン
は、患者１のコドン１９３（Ａｒｇ）のＣからＴへの変
化および患者２のコドン２５８（Ｇｌｎ）のＣからＴへ
の変化を除き、野性型配列と同一であった。これらは未
成熟な終止コドンを生じ、それぞれＣ末端から９３また
は２８アミノ酸を欠く変異蛋白を生じる。

【００１４】これら変異の同一性を確認するために、我
々の患者のゲノムＤＮＡのＳｔＡＲ遺伝子を調べた。Ｓ
ｔＡＲ遺伝子の構造が不明であるので、この変異が収容
されているエクソンを含むゲノムクローンを得るために
先ずＰＣＲを用いた。これは、ｃＤＮＡ配列由来のセン
スプライマーおよびアンチセンスプライマーの種々の組
み合わせを用い、正常なゲノムＤＮＡを増幅させること
によって実施した。図４に示すように、プライマー対Ｓ
２／ＡＳ２によって、４３７ｂｐと２９０ｂｐの２つの
特異的な生成物が得られた。４３７ｂｐフラグメントの
配列は、ｃＤＮＡとその両末端で完璧に適合し、中央に
１４１ｂｐのイントロンを含み、したがってＳｔＡＲ遺
伝子に由来するものである。２９０ｂｐフラグメントは
ＳｔＡＲ偽遺伝子に由来し、イントロンを欠いていた。
続いて、Ｓ３と称されるイントロンプライマーをプライ
マーＡＳ１とともにＰＣＲに用い、２．１ｋｂの生成物
が得られた（図４）。このフラグメントのマッピングお
よびＤＮＡ配列決定（Sequencing）によって、このエク
ソンの配列はｃＤＮＡに完全に適合し、全てのイントロ
ン／エクソン境界はＧＴ／ＡＧ法則に厳密に従うことが
明らかとなった。したがってこの２．１ｋｂフラグメン
トはＳｔＡＲ遺伝子の３’半分に相当する。２．１ｋｂ
クローンから得られた配列情報によって、このエクソン
のＰＣＲ増幅のためにイントロンプライマーを作製する
ことが可能になった（図４）。

【００１５】コドン１９３および２５８におけるナンセ
ンス変異の存在は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ生成物を直接
に配列決定することによって確認された。図５に示すよ
うに、患者１はコドン１９３にＣからＴへの変化を有
し、一方、この患者の父親または母親はコドン１９３に
ＣおよびＴを有する（両親の２つの染色体の各々に１
つ）。したがって、我々は、患者１はＡｒｇ１９３→Ｓ
ｔｏｐ変異についてホモ接合型であり、その両親はとも
に、この変異のキャリアーであると結論した。同様に、
患者２はＧｌｎ２５８→Ｓｔｏｐ変異についてホモ接合
型である（図６）。期待したように患者２の母親はこの
変異についてヘテロ接合型で、一方、正常な兄弟には変
異はない。患者４もまた類脂質ＣＡＨを罹患している兄
弟で、したがって患者２と同じ対立遺伝子についてホモ
接合型である。さらに、患者３は患者２と同じ変異につ
いてホモ接合型で（図６）、その母親もまたキャリアー
である。患者２は人種として朝鮮系で患者３は日系であ
るので、この発見は、これら二人種群における本変異に
ついての共通の起源を示唆する。

【００１６】これらＳｔＡＲにおける成熟前終止コドン
が機能的変化をもたらすということを証明するために、
発現された野性型蛋白と変異蛋白のステロイド生成強化
能力について調べた。リポフェクタミンを用いて、ステ
ロイド非生成ＣＯＳ−Ｉサル腎細胞にｐＳＰＯＲＴ（ベ
クター）または正常ヒトＳｔＡＲ発現もしくは患者１お
よび２（または３）由来変異ＳｔＡＲ発現ｐＳＰＯＲＴ
をトランスフェクト（核酸導入）した。この細胞に、ウ
シＰ４５０ｓｃｃとウシアドレノドキシン（ともにウォ
ーターマン博士（Dr. Michael Waterman, Vanderbilt U
niversity)提供）を発現しているベクター、またはＦ２
と呼ぶ融合蛋白（ヒトコレステロール側鎖切断系から成
る：Ｈ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−アドレノドキシン還元酵
素−アドレノドキシン−ＣＯＯＨ（J.A. Harikrishna
ら、DNA Cell Biol. 12:371(1993))を発現しているｐＥ
ＣＥベクターの何れかを同時にトランスフェクトした。
基質は、細胞性および血清コレステロール（ｃｈｏｌ）
または５μｇ／ｍｌの添加２０α−ヒドロキシコレステ
ロール（２０α）のいずれかであった。４８時間インキ
ュベートした後、培養液を採集し、免疫アッセーでプレ
グネノロンについて調べた。結果は表１に示す。コレス
テロール側鎖切断系とＳｔＡＲとの同時発現によって、
コレステロールが基質として用いられたとき約８倍のプ
レグネノロン生成の強化がもたらされた。変異ＳｔＡＲ
蛋白は両方とも活性を示さず、このことは、この２つの
ナンセンス変異の各々は類脂質ＣＡＨをもたらすことを
示唆している。コレステロールと異なり、２０α−ヒド
ロキシコレステロールは容易にミトコンドリア内に拡散
することができ、したがって、ミトコンドリアコレステ
ロール輸送系を迂回する（M.E. Toaffら、Endocrinolog
y, III 1785(1982))。基質として２０α−ヒドロキシコ
レステロールを用いたとき、正常ＳｔＡＲと変異ＳｔＡ
Ｒとの間でプレグネノロン生成には顕著な違いは存在し
ない。コレステロールと２０α−ヒドロキシコレステロ
ールの利用におけるＳｔＡＲの影響の相違は、ＳｔＡＲ
はミトコンドリアへのコレステロールの輸送を仲介する
ということを強く示唆する。

【００１７】

【表１】

【００１８】ＳｔＡＲは、２５残基のミトコンドリア指
向配列（これはミトコンドリアへの輸送後Ｎ−末端から
切断される）をもつ２８５アミノ酸蛋白として合成され
る。前駆体および成熟ＳｔＡＲは、それぞれ分および時
間の範囲の半減期をもつ。免疫ブロットをデジタルビデ
オスキャンによって調べたところ(Clarkら、1994）、野
性型プラスミドをトランスフェクトされたＣＯＳ−１細
胞では約７０％のＳｔＡＲが成熟型であることが分かっ
た。しかしながら、患者１由来の変異蛋白については成
熟型は全く認められず、患者２については約１０％が処
理を受けていた（データは示さず）が、このことは活性
の欠如についての可能なメカニズムを示唆している。

【００１９】我々はまたＳｔＡＲ遺伝子の異常なイント
ロン変異を確認したが、これはｍＲＮＡスプライシング
でエラーを生じ、したがって類脂質ＣＡＨを引き起こす
（M.K. Teeら、Hum. Mol. Genet. 4:2299-2305(1995
c))。患者５の精巣組織から調製したＳｔＡＲｃＤＮＡ
の初期分析によって、これは正常組織から得られる９７
４ｂｐより小さいことが示されたが、このことは患者の
ＳｔＡＲｍＲＮＡにおける重要な構造的変化を示唆す
る。クローン化ｃＤＮＡの配列決定によって、この患者
のｃＤＮＡからエクソン５の全てが欠如していることが
示唆された（図７〜９）。これは、エクソン５に対応す
る１８５ｂｐを欠くわずか７８９ｂｐのより短いｃＤＮ
Ａを生じる。エクソン５の欠失は、おそらくエクソン５
から直ぐ上流のイントロン４におけるｍＲＮＡスプライ
シングエラーが存在することを示唆した。したがって、
プライマーＳ３（これはイントロン４に存在する）およ
びＡＳ２（これはエクソン５に存在する）を患者のゲノ
ムＤＮＡＰＣＲ増幅のために用いた。このＤＮＡをサブ
クローニングし、プライマーＳ３（これはイントロン４
に存在する）を用いて配列決定を行った。イントロン４
とエクソン５との接合部から１１ｂｐのイントロン４内
にただ１つのヌクレオチド変化（Ｔ→Ａ変異）が認めら
れた（図７〜９）。

【００２０】このＴ→Ａ変異(transversion)はＮｃｏＩ
部位（ＣＣＡＴＧＧ→ＣＣＡＡＧＧ）を破壊し、この塩
基変化のメンデルの分離を確認することができた。増幅
ゲノムＤＮＡのＮｃｏＩ制限消化の分析によって、患者
５はＴ→Ａ変異についてホモ接合型であることが確認さ
れた（図１）。Ｔ→Ａ変異をもつトランスフェクト細胞
から得られたＲＮＡおよび患者５の精巣ＲＮＡで実施し
たＲＮアーゼ保護アッセーによって、Ｔ→Ａ変異は異常
なｍＲＮＡスプライシングの幾つかの型をもたらすこと
が確認された（実施例９）。

【００２１】このコードされた短縮（truncated)蛋白が
活性であるか否かを決定するために、短縮ＳｔＡＲｃＤ
ＮＡを発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１でクローニ
ングし、これをステロイド非生成ＣＯＳ−１細胞にトラ
ンスフェクトするために用いた。このＣＯＳ−１細胞を
ヒトＰ４５０ｓｃｃ系の融合蛋白（Ｆ２と呼ぶ）を発現
するベクターで同時トランスフェクトした。コードされ
るＦ２蛋白は、Ｈ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−アドレノドキ
シン還元酵素−アドレノドキシン−ＣＯＯＨで、３つの
成分の分子比における変動に起因するＰ４５０ｓｃｃ活
性の変動の可能性を排除する完全に活性な酵素である(H
arikrishnaら）。Ｆ２および正常ＳｔＡＲをトランスフ
ェクトした細胞は、コレステロールからプレグネノロン
への効率的な変換を支援したが、短縮ＳｔＡＲを発現す
るベクターとＦ２との同時トランスフェクションは、ｐ
ＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクターだけをトランスフェクト
したコントロール細胞で認められた以上のコレステロー
ルからプレグネノロンへの変換を生じなかった（表
２）。トランスフェクト化細胞のＲＮＡのノザンブロッ
トによって、正常ＳｔＡＲおよび変異ＳｔＡＲを発現し
ているベクターは、予想したサイズのＳｔＡＲｍＲＮＡ
を同等量発現することが示されたが、このことはこのｍ
ＲＮＡは安定であることを示唆している。しかしなが
ら、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１により発現される正常Ｓｔ
ＡＲ蛋白を検出するマウスＳｔＡＲに対する抗血清（ス
トッコ博士（Dr. D. Stocco, Texas Tech U.）ご提供）
によるウェスタンブロットでは、変異体によってコード
された何れの短縮ＳｔＡＲも検出されなかった。したが
って、短縮ｍＲＮＡは安定で機能的な蛋白をコードしな
い。

【００２２】

【表２】

【００２３】４人の罹患患者（患者１、２、３および
４）で２つのナンセンス変異および５番目の患者(Tee
ら）でスプライシングエラーを見出し、さらにＳｔＡＲ
変異は類脂質ＣＡＨを引き起こす可能性があることを明
らかにしたので、様々な人種群から新たに１４人の患者
のＳｔＡＲ遺伝子を調べ、類脂質ＣＡＨ表現型をもつ全
ての患者がＳｔＡＲ変異をもつか否かを決定した。

【００２４】類脂質ＣＡＨをもつ１４人の患者からゲノ
ムＤＮＡを得た（表３）。エクソン１−４をそれぞれ個
々にＰＣＲ増幅させ、自動配列決定に付した結果、患者
７の１つの対立遺伝子上にただ１つの変異（ヌクレオチ
ドの挿入とフレームシフト）が明らかになった。エクソ
ン５−７をただ１つの２．１ｋｂフラグメントとして増
幅させ、これをクローニングしてその全体（イントロン
を含む）を全患者について手動で配列決定した。認定し
た変異は、罹患患者並びに可能な限り両親および兄弟の
個々のＰＣＲ増幅エクソンの直接配列決定によって確認
された。これら変異の多くはまた、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの
ＲＦＬＰ分析によって確認することができた（表４）。
これら１４人の患者および先に報告した５人の患者に関
する発見を表３に要約した。患者１１および１２並びに
患者２および４は兄弟であり、患者９は既知の血縁結婚
に基づき、したがってこれら１９人の患者は３３個の別
個の対立遺伝子を表す。

【００２５】

【表３】

【００２６】

【表４】

【００２７】Ｑ２５８Ｘは日本では殆どの類脂質ＣＡＨ
の原因である。Ｑ２５８Ｘ変異は患者２、３および４で
ホモ接合体（すなわち４つの独自の対立遺伝子のうち４
つ）で、日本人の６つの対立遺伝子（患者６−８）のう
ち４つに存在し、日本人／朝鮮人の１０個の障害対立遺
伝子の８つの全てについてである。日本人の患者で見出
されたその他の変異は他の患者では認められず、新規な
変異を表しているかもしれない。一方、Ｑ２５８Ｘ変異
は創始者効果（founder effect）を示しているように思
える。したがって、この変異は、日本でのこの障害対立
遺伝子が優勢であることの説明となり、この場合類脂質
ＣＡＨは共通である（Hauffaら; Fukamiら、Clin. Pedi
atr. Endocrinol. 4:39-46(1995); Matsuoら、Horm. Re
s. 41(付録):106(1994))。Ｑ２５８変異は、プライマー
Ｓ４およびＡＳ４によるゲノムＤＮＡの増幅(Linら、Sc
ience 267:1828-1831(1995))と、それに続くＥｃｏＲＩ
Ｉによる消化によって容易に識別できる。なぜなら原因
となるＣ→Ｔ変異（下線部）はＥｃｏＲＩＩ部位（ＣＣ
ＡＧＧ）を破壊するからである（表４）。

【００２８】Ｒ１８２Ｌはパレスチナ系アラブ人で一般
的な変異である。類脂質ＣＡＨは、２集団（日本人およ
びドイツ系スイス人（Hauffaら))でより普遍的に不均衡
に発生するとして以前に記載されたが、この疾患はアラ
ブ人では報告がなかった。しかしながら、われわれの患
者のうち６人がパレスチナ系アラブ人起源であった。患
者１０および１１は兄弟で、患者９は既知の血縁結婚の
結果であった。その結果、これら６人の患者は、９つの
独自の対立遺伝子を示した。これら９つの対立遺伝子の
７つ（７８％）は、変異Ｒ１８２Ｌを含んでいた。これ
らの患者の出身地はヨルダン、イスラエル、クェートお
よびデンマークであり、したがって関連はないようであ
る。イントロン多形現象とＳｔＡＲ遺伝子内の他の変異
との識別により、７つの障害対立遺伝子が完全には同一
ではないことが明らかになった。兄弟の患者１０および
１１、または患者１２では他の変異は認められなかっ
た。Ｒ１８２Ｌについてヘテロ接合体である患者１３は
また、ΔＣ６５０のフレームシフト変異についてもホモ
接合体であった。患者１４は、フレームシフト変異ΔＴ
５９３およびＲ１８２Ｌについて二重にホモ接合体であ
った。したがって、Ｒ１８２Ｌ変異は種々の配列で見出
され、アラブパレスチナ人集団と密接に関係していた。
Ｒ１８２Ｌ変異は、プライマーＥｘ５ＳおよびＥｘ５Ａ
ＳによるゲノムＤＮＡの増幅とそれに続くＴｓｐ４５Ｉ
による消化によって容易に認識される（表３）。

【００２９】ＳｔＡＲ変異はエクソン５−７に集中す
る。我々は、日本人でもアラブ人でもない別の５人の患
者を調べた。患者１５（土着のアメリカ人であるメキシ
コ人）は、Ｒ２７２を欠く３ｂｐ欠失についてホモ接合
体であるが、その他の点ではＳｔＡＲ蛋白は無傷であっ
た。患者１６（ギリシャ人）はフレームシフト変異につ
いてホモ接合体であった。患者１７（イギリス出身の白
人）はエクソン５で始まる外来ＤＮＡセグメントの挿入
についてホモ接合体であった。これら３事例でＳｔＡＲ
遺伝子はそれぞれの変異についてホモ接合体であった
が、これら家族から家系について情報を得ることはでき
なかった。患者１８（カナダ出身の白人）は、Ｌ２７５
ＰおよびＡ２１８Ｖについて合成ヘテロ接合体であっ
た。表２で調査した３３の対立遺伝子において合計１４
の変異を見出したが、それらのうち１つを除く全てがエ
クソン５、６または７に障害を与えていた。

【００３０】これら認定した変異が患者の類脂質ＣＡＨ
を引き起こしていることを証明するために、実施例３で
述べるように種々のＳｔＡＲ変異をトランスフェクトし
たステロイド非生成ＣＯＳ−１細胞の条件付け培養液に
よるコレステロールのプレグネノロン変換を分析した。

【００３１】ＳｔＡＲ機能はＳｔＡＲプロセッシングと
は関係がない。ＳｔＡＲ蛋白の活性型はミトコンドリア
内の切断型よりむしろ前駆体分子であり、ＳｔＡＲ前駆
体は、それがミトコンドリアに入るときに外膜と内膜と
の間に接触部位を形成することによってステロイド生成
を刺激するように機能すると提唱された(Clarkら、J.Bi
ol. Chem. 269:28314-28322(1994); Stoccoら、^Cellul
ar and Molecular Rulation of Testicular Cells”
（精巣細胞の細胞調節と分子調節）、C. Desjardins
編、Springer-Verlag,ニューヨーク(1996)）。しかしな
がら、日本人の共通の変異Ｑ２５８Ｘで認められるよう
なＳｔＡＲのカルボキシ末端の僅か２８アミノ酸の欠失
が全ての活性を欠失させ(Linら、1995）、さらに表４の
結果は、Ｒ２７２の欠失または、１６９位、１８２位、
２１８位および２７５位のアミノ酸の置換は全ての活性
を除去することを示す。患者７のエクソン２のフレーム
シフトの例外を除き、我々が発見した変異の全てはエク
ソン５−７に存在する。したがってエクソン１−４のい
ずれも偶発的変異の傾向が少なく、またこの領域のミス
センス変異は非表現型である。我々は後者の説明を好
む。

【００３２】ヒトＳｔＡＲ遺伝子の転写領域の変異は、
ＳｔＡＲ蛋白の変化またはその産生制御の変化をもたら
す場合は類脂質ＣＡＨを引き起こすであろう。類脂質Ｃ
ＡＨの分子的基礎が確立されるまで、この疾患は症候
群、場合によってただ１つの共通の表現型をもつ異なる
遺伝的疾患群と考えられねばならなかった。種々の人種
的および遺伝的背景から得た類脂質ＣＡＨの患者のＳｔ
ＡＲ蛋白に対する遺伝子の変異が明らかになったことに
よって、この遺伝子の変異は、類脂質ＣＡＨの患者の全
てではないとしても圧倒的多数にとって原因となること
が初めて明らかになった。１人のＣＡＨ患者（患者１
９）でＳｔＡＲ変異の検出ができなかったということ
は、突然変異、プロモーター変異、未調査上流スプライ
シング変異、反復配列決定エラーの検出における技術的
な問題のためかもしれない。また、患者１９は、区別で
きない表現型を生じるまた別の遺伝子の変異を有するか
もしれない。障害された胎児の胎盤はＣＡＨにおいて正
常にステロイドを産生するという実験(Saengerら、J. C
lin. Endocrinol. Metab. 80:200-205(1995)）、および
妊娠期間中胎児はプロジェステロンを要求するというこ
とによって、類脂質ＣＡＨについて以前に考慮された因
子の何れも（Ｐ４５０ｓｃｃ、Ａｄｘ、ＡｄＲｅｄ、Ｓ
ＡＰエンドゼピン、ＰＢＲ）、患者１９の疾患の原因と
は考えがたい。

【００３３】類脂質ＣＡＨの遺伝型性別は最も普遍的な
ものは男性で、これは、遺伝的性別は等しい頻度で影響
を受けるとした初期の研究（しかしながら、この時は遺
伝的性別は生殖腺の外観および組織学の記述から、また
は口腔塗抹標本からしばしば推論された（Hauffaら）と
は一致しない。表２は、我々の系では１９人の患者のわ
ずか３人（１５．８％）が４６，ＸＸで、さらに日本の
初期の報告（Matsuoら、1994))では６３人の確定された
核型をもつ類脂質ＡＣＨ患者のうち僅か１６人（２５．
４％）が４６，ＸＸであることが分かった。このこと
は、障害された４６，ＸＸの胎児の大半が妊娠初期に失
われるか、または障害された２３Ｘの精子が卵子を受精
させる可能性が少ないか、または障害された２３Ｙ精子
よりも低い頻度で障害２３Ｘ精子が産生されるかのいず
れかであることを示唆している。幾つかの予備的実験に
よれば、ステロイド生成は精原細胞で生じることが示唆
され受精前に性別の偏りは生じるという仮説を支持でき
る。しかしながら、未知の性状に関する把握の偏りも現
時点では除外できない。

【００３４】類脂質ＣＡＨは、不完全なステロイド生成
酵素によって惹起されないステロイドホルモン合成に関
する唯一の先天性疾患である。類脂質ＣＡＨの変異Ｓｔ
ＡＲの確認によって、この激烈な疾患の出生前分子診断
が初めて可能になった。非機能的ＳｔＡＲによる類脂質
ＡＣＨはＳｔＡＲ遺伝子ノックアウト効果に匹敵し、Ｓ
ｔＡＲは副腎および性腺ステロイド生成に必須であるこ
とを示している。したがって、ＳｔＡＲは、Ｐ４５０ｓ
ｃｃへのコレステロールのアクセスのために不可欠の役
割を果たす確認された最初の蛋白である。正常な胎盤の
ステロイド生成の存在並びに、胎盤（われわれが発見し
たように）および他のステロイド生成組織（例えば脳
（P. Robel & E.E. Baulieu, Trends Endocrinol. Meta
bo. 5:1(1994); S.H. Mellon, J. Clin. Endocrinol. M
etab. 78:1003(1994))におけるＳｔＡＲ発現が存在しな
いことの結果として類脂質ＡＣＨをもつ胎児が無事であ
ることは、これらの組織においてはミトコンドリアへの
コレステロール輸送を促進する異なるメカニズムが存在
することを示唆する。類脂質ＡＣＨにおけるＳｔＡＲの
この重要な役割をこのように明瞭にすることによって、
ＳｔＡＲは、ステロイドホルモン合成の急性トロピック
調節を仲介する長い間捜し求めてきた分子であるという
仮説の最初の遺伝的証拠が提供される（D.M. Stocco &
T.C. Sodeman,J. Biol. Chem. 266:19739(1991); L.F.
Epstein & N.R. Orme-Johnson, J. Biol. Chem. 266:19
739(1991); D.M. Stocco & M. Ascoli, Endocrinolgy 1
32:959(1993))。

【００３５】しかし、ＳｔＡＲの作用はステロイド生成
に特異的ではなく、さらにＳｔＡＲはミトコンドリアの
２７−ヒドロキシラーゼ活性を刺激することができる。
ミトコンドリアコレステロール２７−ヒドロキシラーゼ
（Ｐ４５０ｃ２７）は２７−ヒドロキシコレステロール
およびＣ２７酸、３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸
の形成を触媒する（Andersonら、J. Biol. Chem. 264:8
222-8229(1989); Suら、DNA Cell Bio. 9:657-665(199
0))。Ｐ４５０ｃ２７およびアドレノドキシンを同時に
トランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞でのＳｔＡＲの発
現は、実施例１０に示すように３β−ヒドロキシ−５−
コレステン酸(3βhydroxy-5-cholestenoicacid）の生成
を６倍以上増加させた（３群対４群の比較についてｐ＜
０.００５)。Ｐ４５０ｃ２７によるコレステロール代謝
のこのＳｔＡＲ仲介増加は、コレステロール側鎖切断の
ＳｔＡＲ刺激について我々が観察したものと同じ次数規
模であった（Sugawaraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:4778-4782(1995))。これらの観察は、ＳｔＡＲは、
ステロイド生成チトクロームＰ４５０ｓｃｃ以外の酵素
によってミトコンドリアコレステロール代謝を強化する
ことができることを明示している。

【００３６】Ｐ４５０ｃ２７は、ＳｔＡＲを発現する卵
巣を含む多数の組織で認められる（Andersonら；Su
ら）。したがって、ＳｔＡＲはステロイド生成細胞でコ
レステロールの２７−ヒドロキシコレステロールおよび
Ｃ２７酸への代謝に寄与できるであろう。そのようにし
て形成されたヒドロキシステロールは細胞性コレステロ
ールの恒常性を管理する役割を持つことができるであろ
う(Rennertら、Endocrinology 127:738-746(1990))。Ｐ
４５０ｃ２７は肝臓で強く発現されるが、それは肝で胆
汁酸合成における役割を果たす。ＳｔＡＲ遺伝子は肝で
は発現されない（Sugawaraら、PNAS(1995)）ので、他の
因子または過程が肝性２７−ヒドロキシラーゼへのコレ
ステロールアクセスを管理する必要がある。ＳｔＡＲ遺
伝子は肝に導入され、２７−ヒドロキシラーゼ経路を介
して胆汁酸生成を強化し、したがってコレステロールの
廃棄を促進できる。

【００３７】コード領域の外で生じる変異もまた、例え
ば患者５で観察されたように類脂質ＣＡＨを惹起するこ
とができるので、我々はさらにゲノムＤＮＡおよびＳｔ
ＡＲ遺伝子のプロモーター領域について調べた。患者１
９では、類脂質ＣＡＨは転写に干渉するプロモーター内
の変異によって生じる可能性がある。５’および３’非
翻訳領域内に生じる変異は、同様に、例えばｍＲＮＡの
安定性を変えることによって、または翻訳開始に影響を
及ぼすことによって転写または翻訳に干渉することがあ
るかもしれない。

【００３８】ＳｔＡＲ遺伝子配列は７つのエクソンと、
全てＧＴ／ＡＧ法則に従う（Mount,1982)エクソン−イ
ントロン接合部を含む。

【００３９】

【表５】

【００４０】本出願がその一部継続出願となっている米
国特許出願第０８／４１０５４０号に開示した最初のゲ
ノムクローンについて我々は詳細な配列分析を実施し
た。親出願で開示したとおりコード領域およびイントロ
ン４の配列は正確であったが、さらに本発明のＤＮＡ分
子の性状を調べたところ、配列決定の誤りが認められ、
コード領域の配列５’を訂正した。

【００４１】

【表６】

【表７】

【表８】

【００４２】ＳｔＡＲ遺伝子の主要な転写開始部位（Ｒ
Ｎアーゼ保護分析によって決定し、さらにプライマー伸
長分析（primer extension analysis)によって確認し
た）は、翻訳開始部位の前方１５４ｂｐに位置する（図
１１）。主要転写開始部位から上流のＤＮＡ配列は、Ｔ
ＡＴＡ様成分（ＴＴＴＡＡ）を−２４から−２０ｂｐに
含む。幾つかの推定Ｓｐ１接合部位がまたプロモーター
内に配列ＡＴＴＴおよび（Ｔ)ｎＣＴの繰り返しと同様
に存在する。一続きのトリヌクレオチドの繰り返しは転
写された５’非翻訳領域に認められた。我々は反対鎖
（ＴＧＡＣＣＴＴＧＡ）上に１つのコンセンサス配列の
位置を決定した。みなしご核因子、ステロイド生成因子
−１（ＳＦ−１、ＡｄＢＰ４とも称される）がこの配列
を認識することができるが、これはまた多数のステロイ
ド生成酵素遺伝子の発現に必須のようである(Hondaら、
J. Biochem. (Tokyo)112:573-575(1990); Riceら、Mol.
Endocrinol. 5: 1552-1561(1991) ）。

【００４３】この転写開始部位から上流１．３ｋｂのＤ
ＮＡは、マウスＹ−１副腎皮質腫瘍細胞にトランスフェ
クトされたときルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現
を誘導した（実施例１１）が、反対の向きで挿入された
同じフラグメントはプロモーターのないコントロールプ
ラスミドと同じ程度のルシフェラーゼ発現を誘導しただ
けであった。

【００４４】ＳｔＡＲｃＤＮＡの配列と認定した偽遺伝
子の配列を比較するために、この偽遺伝子の性状をさら
に調べた。その配列を表７−１乃至７−３に示す。親出
願に開示したこの偽遺伝子配列は少数の配列決定の誤り
を含んでいたが、表７−１乃至７−３に示す配列では訂
正されている。

【００４５】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【００４６】したがって、本発明は、以下の（１）−
（５）を含む単離ＤＮＡ分子を提供する：（１）図１、
表６−１乃至６−３または表７−１乃至７−３で説明し
たｈＳｔＡＲｃＤＮＡ、ｈＳｔＡＲゲノムＤＮＡ、ｈＳ
ｔＡＲプロモーターまたはｈＳｔＡＲ偽遺伝子から成る
第一の配列；（２）第一の配列のサブ配列である少なく
とも長さが１０ヌクレオチドの第二の配列；（３）第一
または第二の配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異
なるヌクレオチドで置換されている第三の配列；（４）
当該第一または第二の配列で少なくとも１つのヌクレオ
チドが欠失もしくは挿入されている第四の配列；または
（５）第一、第二または第三の配列のいずれかに対して
相補的な配列であって、（１）当該分子は、当該配列
（１）−（５）のいずれかにおいてＴがＵに置き換えら
れているＲＮＡ分子であってもよく、（２）該第三の配
列は第一または第二の配列と少なくとも９５％同一であ
り、（３）該第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡに存
在せず、さらに（４）当該第四の配列が２０個より多い
挿入ヌクレオチドおよび２００個より多い欠失ヌクレオ
チドを含まないということを条件とする。これらの配列
の何れもヒトのＳｔＡＲ遺伝子の変異の有無の認定に用
いることができ、したがって個々人（例えば先天性類脂
質副腎過形成の家族歴をもつ人々）の遺伝カウンセリン
グに用いることができる（ただし一般集団のスクリーニ
ングも同様に可能である）。特に、本発明は既に確認さ
れた特定の変異の認定の使用に限定されないことは注記
されるべきであろう。本明細書で識別される正常遺伝子
配列から外れたＳｔＡＲ遺伝子のいずれの変異も、潜在
的に致死的な遺伝的欠陥を示唆するものである。たと
え、変異位置に異なるアミノ酸をコードしないいわゆる
“非発現性（サイレント）”変異も潜在的な疾患変異
である。なぜならば、そのような変異は、当該遺伝子
に、または当該遺伝子からその翻訳または転写に干渉す
る翻訳されない遺伝信号を導入または除去する能力を有
するからである。本明細書で明らかにされた遺伝子配列
を基にした効用の１つは、類脂質ＣＡＨ歴をもつ家族の
遺伝カウンセリングにあるので、ＳｔＡＲ遺伝子に何ら
かの変異が存在する場合は類脂質ＣＡＨの伝搬の可能性
に関して患者に助言を与えることができる。問題の変異
をもつ子孫が類脂質ＣＡＨの徴候を示してもまたは示さ
なくとも、当該疾患の潜在的な存在に対して患者の適切
なケアとモニタリングを選択できる。正常な遺伝子との
違いがなければ、そのような新たなケアおよび／または
モニタリングも（同時に発生する費用とともに）除外で
きるであろう。新たな情報（もし何らかの情報が有る場
合には）が入手できるので（例えばある非発現性変異ま
たは保存的置換変異が類脂質ＣＡＨを生じるか、または
生じないかという情報）、特定の変異について与えられ
る助言は変化しうるであろう。しかしながら、提供され
る助言における変化が、類脂質ＣＡＨの十分な原因であ
ることを本発明が初めて示したＳｔＡＲ遺伝子における
変異の有無についての最初の決定を変えることはない。

【００４７】完全な長さのＳｔＡＲｃＤＮＡ配列を含む
分子は、サブ配列の素として（下記で考察）またはＳｔ
ＡＲ分子自体の調製の出発材料として有用である。
“サブ配列”は、表示した完全な長さの配列の１つから
得られる連続ヌクレオチド群である。そのようなサブ配
列は、出発ヌクレオチドから化学合成によって（例えば
自動遺伝子合成装置で）、または完全な長さの配列の生
化学的操作によって調製することができる。後者の生化
学的操作では、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いフ
ラグメントを調製し、場合によって（１）エキソヌクレ
アーゼによる末端ヌクレオチド切断、および／または
（２）所望の配列を選別するためにサイズ仕分けおよび
／または親和性補足が続く。用いられる条件下で固有で
あるために十分な長さのＳｔＡＲｃＤＮＡ配列の何れの
サブ配列も、あるＳｔＡＲ遺伝子変異（例えば本明細書
に記載されたような変異）の有無を確認する方法の一部
分として、ゲノムのＳｔＡＲ遺伝子の全部または一部分
のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅で用いられる２
つのプライマーのうちの１つとして有用である。第二の
プライマーは、増幅されるべき変異または他の配列がこ
の２つのプライマーの間に配置されるように反対鎖の配
列から簡単に選択することができる。別の好ましいサブ
配列は本明細書で述べる正常な配列からの変異を含む配
列で、そのような配列は、特定の変異体の存在を検出す
るために対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション技術
で用いることができる。好ましいサブ配列はまた、正常
なＳｔＡＲ遺伝子と偽遺伝子とを識別することができる
もの（すなわち表６−１乃至６−３の正常ＳｔＡＲ遺伝
子ＤＮＡまたは表７−１乃至７−３のＳｔＡＲ偽遺伝子
ＤＮＡの両方には見出されないもの、または図７〜９に
示したまた別のスプライス領域に広がるもの）を含む。

【００４８】所望の標的配列との固有のハイブリダイゼ
ーションに必要なサブ配列の長さは、用いられる特定の
方法によって変動するが、遺伝的材料について日常的確
認を実施している通常の技術を有する者の範囲内にあ
る。典型的なプライマーは、長さが少なくとも１０、好
ましくは少なくとも１４より好ましくは少なくとも１
７、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドで、
典型的には長さが２００未満、好ましくは１００未満、
より好ましくは７０未満、さらに好ましくは５０ヌクレ
オチド未満である。最も好ましいサブ配列は、表６−１
乃至６−３および表７−１乃至７−３に述べるヒトＳｔ
ＡＲ配列の少なくとも１つに見出されるが、マウスＳｔ
ＡＲＤＮＡには認められない。

【００４９】ＳｔＡＲ遺伝子の配列およびサブ配列と同
一のものを含むそのような分子に加え、変異配列を含む
分子もまた、変異について特定のプローブとして用いる
ことができるので有用である。例えば、アミノ酸をコー
ドするコドンの終止コドン（すなわちナンセンス変異）
へのいくつかの変異は以下の実施例および本明細書の他
の場所で明らかにされるが、例えば、Ａｒｇ１９３→Ｓ
ｔｏｐおよびＧｌｎ２５８→Ｓｔｏｐ変異である。（本
明細書では “コドン”は、文脈から明示されない限り
遺伝子のリーディングフレーム（読み枠）における核酸
の３つ組みを指す。）したがって、好ましい種類の変異
配列分子は、コード配列の３’末端以外の場所でコドン
を終止コドンに変化させ、その結果、短縮された非機能
的ＳｔＡＲポリペプチド分子がコードされるヌクレオチ
ド置換（１つ以上の置換）を含むものである。変異コド
ンは、正常なコード配列の３’末端から好ましくは少な
くとも５、より好ましくは１０、さらに好ましくは２
０、さらに好ましくは３０コドン離れていて、その結果
標的内に十分な欠失が生じ、機能のない生成物が得られ
る。別の好ましい種類の変異配列分子は、少なくとも１
つのヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド、より好
ましくは１００ヌクレオチドを越え、最も好ましくは１
８５ヌクレオチドまでの欠失を含むが、しかし２００ヌ
クレオチドを越えない欠失を含む。別の好ましい種類の
変異配列分子は、２０ヌクレオチド未満、より好ましく
は５ヌクレオチド未満、最も好ましくは１ヌクレオチド
の挿入を含む。他の好ましい種類の変異配列分子は、非
機能的ＳｔＡＲ分子を生じることが分かっているもの、
例えば非保存アミノ酸置換を生じるもの、および該遺伝
子に存在する翻訳もしくは転写信号配列を変更するも
の、または不適切な翻訳もしくは転写信号配列を導入す
るものである。

【００５０】直ぐ上の考察は、ゲノムＤＮＡのセンス鎖
の配列またはサブ配列についてであることは理解されよ
う。そのような配列は、それらの相補的性質の結果とし
てゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖の存在を検出するため
に用いることができる。しかしながら、上記で考察した
配列の何れかと相補的な配列を用いることもまた可能で
ある。なぜならば、それらはセンス鎖と相補的で、それ
らを検出することができるからである。

【００５１】本発明の分子は、マウスのゲノムＳｔＡＲ
遺伝子配列と異なる配列を（ＳｔＡＲ遺伝子産物のため
の開始コドンから終止コドンまでの領域内に）含み、さ
らにヒトＳｔＡＲｃＤＮＡまたはゲノム配列と少なくと
も９５％同一である。９５％同一とは、問題の配列が、
ヌクレオチドの各挿入、欠失または置換をただ１つの違
いとして数えたとき、比較しようとしている配列と５％
未満の異なるヌクレオチドを含むことを意味する。長さ
が２０ヌクレオチド未満の配列は、それが９５％より高
い同一の場合には標準配列と同一でなければならないこ
とは明白であろう。

【００５２】同一性および相対的同一性は、以下の例を
参照することによって容易に理解できよう。例えば、仮
想配列、 abcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcd （これは長さが４０ “ヌクレオチド”）がそれに対し
て測定を実施しようとしている基準であると考えると、
以下の仮想ヌクレオチド配列の各々は該基準配列に対し
て９５％同一である（すなわち各々は、標準４０ヌクレ
オチド配列と単一ヌクレオチド２個の違いを有する）。

【００５３】 abcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdab 〔３’末端に２つの欠失〕 abcabcdabcdabcdabcabcdabcdabcdabcdabcd 〔２つのランダム位の欠失〕 ababcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcdabcd 〔５’末端に２つの挿入〕 abcdabcdabcdabdabcdabcdabcdabcdaabcdabcd 〔１つのランダム挿入および１つのランダム欠失〕 abcdabcdbbcdabcdabcdabcdabcdabcdbbcdabcd 〔２つの “a”ヌクレオチドの “b”ヌクレオチドによ
る置換] abcdabcbabcdabcdabcdabcdabcadabcdabcdabcd 〔１つの置換および１つの挿入〕 特に本発明の分子に関して同様な多くの例（それらはし
ばしばこの例よりサイズが大きい）が提供できることは
明白であろう。しかしながら、これらの例は当業者に本
明細書で用いる “％相違”の意味を教示するためには
十分であろう。また、相違を計算する前に比較されるべ
き配列は最大の同一性を与えるために並べられることは
容易に理解されよう。コンピュータープログラム（例え
ば文献に記載されたＦＡＳＴＡプログラム（W.R. Pears
on & D.J. Lipman, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 85:24
44-2448(1988)を用いることができるが、一方、必要と
される高い相同性は目で見た配列比較によって最大限の
相同性を得る並べ方を容易に見出すことができることを
示している。好ましい具体例では、並べ方決定プログラ
ムでは、２００塩基対までのギャップの幅が許される。

【００５４】ＳｔＡＲ遺伝子に由来するかまたは関連す
ると上記で示唆された特定の配列は、ポリヌクレオチド
の配列全体であってもよく、またより大きな配列の一部
分でもよい。例えば、サンドイッチハイブリダイゼーシ
ョンアッセーがよく知られているが、これは、異なる分
子（例えば標的ゲノム配列または固形支持体に対して固
定装置として作用する第二のポリヌクレオチドに存在す
る配列）とともにハイブリダイズするサブ配列を含む長
いポリヌクレオチド配列を利用する。例えば、米国特許
第５２８８６０９号および５１２４２４６号を参照され
たい。

【００５５】本明細書で説明する配列によって性状を明
らかにされるポリヌクレオチドを指すために用いられる
場合、 “単離（された）”という言葉は、通常はＳｔ
ＡＲ遺伝子に付随しているゲノムＤＮＡの少なくとも一
部分から分離されたことを意味し、好ましくはポリヌク
レオチド以外の全てのヒト細胞性物質から分離されたこ
とを意味する。ＳｔＡＲ遺伝子を包含するゲノムＤＮＡ
の未確認セグメントを含有するベクターを含んでいた可
能性がある遺伝子ライブラリーは、ＳｔＡＲ遺伝子が存
在することが分かっていないので、さらに／または他の
ヒトＤＮＡを含むベクターから分離されていないので
“単離”されていない。殆どの場合、本発明の単離分子
は、５０ｋｂ未満、好ましくは３０ｋｂ未満、より好ま
しくは２０ｋｂ未満の長さを有するであろう。最低限の
長さは上記で考察した。

【００５６】一般には、本発明の組成物は、人間に先天
性類脂質副腎過形成を惹起し、もしくは惹起する可能性
がある、または人間の子孫に先天性類脂質副腎過形成を
伝達し、もしくは伝達する可能性がある遺伝的欠陥の存
在を検出する方法で使用されるが、この場合、当該組成
物はヒトのＳｔＡＲ遺伝子の変異を識別するために用い
られる。先ず初めに、遺伝カウンセラーらは、今や正常
であることが確認され、さらに疾患と関連がないと分か
ったＳｔＡＲ遺伝子との違いを簡単に調べるであろう。
なぜならば、この正常な配列からの逸脱であるものはい
ずれも疾患を惹起する潜在性を有するからである。異な
る（しかし未だ確認はされていない）遺伝子が先天性類
脂質副腎過形成の家族歴をもつ者に見出された場合は特
に、ＳｔＡＲ遺伝子は遺伝カウンセリングのために必要
にして十分な基準である。特定の遺伝子（またはそれが
存在しないこと）が、先天性類脂質副腎過形成について
正の関係を持つことが確認されたので、いくつかの事例
において遺伝カウンセラーは、ＳｔＡＲ遺伝子の蛋白産
物の配列を変化させる、または転写もしくは翻訳されな
いＳｔＡＲ遺伝子を生じるＳｔＡＲ遺伝子の１つまたは
２つ以上の特定の変異を確認することに焦点を合わせる
であろう。しかしながら、患者のＳｔＡＲ遺伝子の何ら
かの変異の有無を単純に確認することは遺伝分析および
カウンセリングの重要な部分であり続けるであろう。

【００５７】Ｑ２５８ＸおよびＲ１８２Ｌは、日本人お
よびパレスチナ人の障害対立遺伝子のそれぞれ７０−８
０％の原因であり、有効な遺伝的スクリーニングの機会
を提供する。したがって、我々はこれらの変異および他
の変異の診断を促進させるためにＰＣＲに準じた方法を
考案した（図12〜13）。各々の場合において、ＤＮＡを
疑わしい変異を包含する一対のプライマーで増幅し、続
いて変異によってその認識配列が作出されるかまたは破
壊される制限酵素でこのＰＣＲ生成物を切断する。表４
は、Ｑ２５８ＸおよびＲ１８２Ｌ変異の他、同様に診断
が可能な他の６つの変異について、そのオリゴヌクレオ
チド対、制限エンドヌクレアーゼおよび切断パターンを
示す。全てのオリゴヌクレオチドの配列は表８に示す。

【００５８】

【表１２】

【００５９】ＳｔＡＲ遺伝子またはＳｔＡＲ遺伝子変異
体を確認するために用いられる実際の技術自体は本発明
の部分ではない。遺伝子変異を識別するために用いられ
る多くの技術の何れも（現時点で既知であるか後に開発
されるかにかかわらず）用いることができる。例えば特
異的なプローブによるハイブリダイゼーションで、これ
は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーション（増幅しないか、または検出された領域の例
えばＰＣＲによる増幅の後のいずれか）、制限フラグメ
ント長多形現象（ＲＦＬＰ）分析（ristriction fragme
nt length polymorphism analysis)、またはランダム増
幅多形性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析(random amplified po
lymorphic DNA analysis）を含む。他の分析技術には、
酵素不適合スキャンニングおよび転写／翻訳分析が含ま
れる。これらの技術は全て多くの特許および他の出版物
に記載されている。例えば以下を参照されたい。ＲＦＬ
Ｐ:D. Botstein ら、American Journal of Human Genet
ics32:314-321(1980)、ＲＡＰＤ:J.G.K. Williamsら、N
ucleic Acids Research 18:6531-6535(1990） 特に有
利な結果を達成するために、検査する患者によって異な
る識別技術を選択することができる。例えば、特定のＳ
ｔＡＲ遺伝子変異と関係があることが分かっている特定
の人種または民族群には、対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションが好ましい
技術である。大型で混在型集団のスクリーニングのため
には、一本鎖形態多形現象が好ましい。各個人について
は、遺伝子および／またはｃＤＮＡの全体的な配列決定
および基準配列との比較（例えば本明細書に示されたよ
うなもの）が好ましい。

【００６０】多くの確認技術でホストのゲノムＤＮＡ
（またはメッセンジャーＲＮＡ）の何らかの増幅が、よ
り高い感度を分析に付与するために実施されるであろ
う。そのような場合には、ＳｔＡＲ遺伝子全体を増幅す
る必要はなく、単に検出される該遺伝子の一部分または
該遺伝子内の特定の場所が増幅される。したがって、本
発明の方法は一般に、診断医によって実施される特定の
分析のために選択されたセグメントともにＳｔＡＲ遺伝
子の少なくともセグメントの増幅（例えばＰＣＲによ
る）を含む。

【００６１】類脂質ＣＡＨは常染色体の劣性遺伝疾患で
あるので、いくつかの場合には本発明の方法は、正常な
ＳｔＡＲ遺伝子もしくは変異ＳｔＡＲ遺伝子に対してホ
モ接合体として、または正常ＳｔＡＲ遺伝子もしくは変
異ＳｔＡＲ遺伝子に対してヘテロ接合体として患者を分
類するであろう。なぜならばこのような情報は遺伝カウ
ンセリングのために有益な情報だからである。

【００６２】診断が行われる患者は、遺伝カウンセリン
グの通常の事例のように成人または新生児であってもよ
いが、出生前診断も胎児で実施できる。成人または新生
児の遺伝分析のためには、通常は血液サンプルが用いら
れる（例えば濾紙上の乾燥血のスクリーニング）が、一
方、出生前診断用サンプルは通常は羊水穿刺または絨毛
膜絨毛生検によって得られる。

【００６３】ヒトの完全な長さのＳｔＡＲ遺伝子は、機
能をもつＳｔＡＲ蛋白を生じるより短い遺伝子と同じよ
うに患者の先天性類脂質副腎過形成を修正するために用
いることができるが、これは、遺伝子治療によるかまた
はＳｔＡＲ蛋白のインビトロ生成とそれに続く該蛋白の
投与により患者にヒトＳｔＡＲ遺伝子の遺伝子産物の有
効量を供給することによって実施される。類脂質ＣＡＨ
は劣性であるので、したがってＳｔＡＲの補充的供給に
よって治療でき、そのような治療は容易に利用できる。
同様に、高コレステロール血症の治療および予防は、遺
伝子治療またはインビトロ生成ＳｔＡＲ蛋白の投与のい
ずれかによって、ヒトのＳｔＡＲ遺伝子の遺伝子産物の
有効量を患者の肝臓に供給することによって達成でき
る。

【００６４】遺伝物質または遺伝子産物を投与する種々
の技術は周知であり、それ自体は本発明の部分を構成し
ないことは理解されるところであろう。本発明は単に、
本発明の遺伝材料または蛋白を、先に投与されている遺
伝材料または蛋白の代わりに供給することを含む。例え
ば、遺伝子産物を産生するように細胞をトランスフォー
ムする技術は、米国特許第５２８３１８５号（題名は
“細胞に核酸を送達する方法”）の他に多数の科学論
文、例えばフェルガーらの論文に記載されている（Felg
erら、”Lipofectin: A Highly Efficient, Lipid-Medi
ated DNA-Transfection Procedure”(リポフェクチン：
極めて効果的な脂質仲介ＤＮＡトランスフェクション方
法）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(198
7)）。インビボ蛋白産生についての技術は、例えばミュ
ーラーらの論文に記載されている(Muellerら、”Labora
tory Methods − Efficient Transfection and Express
ionof Heterologous Genes in PC12 Cells”(実験室手
技−ＰＣ１２細胞における異種遺伝子の効果的トランス
フェクションと発現）、DNA & Cell Biol. 9(3):221-22
9(1990))。欠乏症を克服するために蛋白を投与すること
は周知であるので（例えば糖尿病における高血糖修正の
ためのインシュリン投与）、この技術のこれ以上の考察
は不要であろう。現存する技術のある程度の修正は特定
の応用について必要かもしれないが、このような修正
は、本明細書で提供する現存の知識およびガイダンスを
用いる当該技術分野の通常の医師の技術レベルの範囲内
にあるであろう。

【００６５】ＳｔＡＲプロモーターは、哺乳類細胞、遺
伝子導入哺乳動物でのＳｔＡＲ遺伝子、ＳｔＡＲ変異体
または異種遺伝子を発現させるために、または遺伝子治
療で異種遺伝子の発現のために用いることができる。組
織特異的遺伝子発現が、通常はＳｔＡＲｍＲＮＡを産生
しないような細胞型（例えば胎盤、肝、絨毛上皮腫細
胞）の多くで、異種遺伝子の場合は発現されないような
程度まで達成され、さらに、通常ＳｔＡＲｍＲＮＡを産
生する細胞（例えば副腎および性腺細胞）でも発現され
る。好ましいプロモーターフラグメントには、図１１の
Ａ−１３００ＧＣＴＴからＧＧＴＣＣ−１までの配列が
含まれる。さらに小さなフラグメントも用いることがで
きるが、好ましさは低下する。

【００６６】本発明はこれまで一般的に説明してきた
が、詳述のためで限定を目的としない以下の詳細な実施
例でより一層理解されよう。

【００６７】

【実施例】[実施例１]：ＳｔＡＲｃＤＮＡクローンの単
離とＤＮＡ配列分析 １８才の男性の副腎皮質から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａで調製された、ラムダｇｔ２２Ａ中のヒト副腎皮質ｃ
ＤＮＡライブラリーはラクロア、ベレンガーおよびトレ
ンブレー博士(Dr. Andre Lacroix, Dr. Alain Belange
r, Yves Tremblay, University of Laval, ケベック、
カナダ）から提供された。部分的な長さのマウスＳｔＡ
ＲｃＤＮＡ(Clarkら、1994）を用いてこのライブラリー
をスクリーニングした。５０個以上の陽性クローンを６
０００００個のプラークのスクリーニングで検出した。
２つのプラーク精製ファージクローンを配列分析のため
に選んだ。各々は約１．６ｋｂの挿入物を含んでいた。
両挿入物はｐＳＰＯＲＴ（GIBO-BRL, ベセスダ、メリー
ランド）でサブクローニングし、Ｔａｑジデオキシ配列
決定試薬を使って自動ＤＮＡ配列決定装置（Applied Bi
osystems, Inc.）で配列を調べた。

【００６８】ＤＮＡ配列分析で性状を調べたこの２つの
ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡは、同一の１２６ヌクレオチド
５’非翻訳領域を有していた。両クローンは２８５アミ
ノ酸蛋白をコードする８５５ヌクレオチドのオープンリ
ーディングフレームを含んでいた。１．６ｋｂのｃＤＮ
Ａ（そのヌクレオチド配列は図１に示す）は６２３ヌク
レオチドの３’非翻訳配列を有し、これは、２３ヌクレ
オチド上流でＡＡＴＡＡＡ配列が前に付いたポリ（Ａ）
＋テールで終わっていた。

【００６９】推定ヒトＳｔＡＲアミノ酸配列は、マウス
のそれと８４％同一である(Clarkら、1994）（図１）。
この配列は、塩基性および疎水性アミノ酸で構成される
２５アミノ酸Ｎ−末端配列を含むが、これはミトコンド
リアを標的とする配列に特徴的である。ｃＡＭＰ依存蛋
白キナーゼによる燐酸化のための７つのコンセンサス部
位および３つの蛋白キナーゼＣ燐酸化部位が成熟蛋白配
列に存在する。遺伝子工学的に操作したＣＯＳ−１細胞
でのＳｔＡＲの発現によってステロイド生成は増加す
る。

【００７０】[実施例２]ＣＯＳ−１細胞でのＳｔＡＲｃ
ＤＮＡの発現 ヒトＳｔＡＲ蛋白の機能活性を調べるために、ステロイ
ド生成におけるステロールキャリア蛋白２の機能を調べ
るために以前に用いた方法を利用した（R. Yamamoto,
C.B. Kallen, G.O. Babalola, H. Rennert, J.T. Billh
eimer, III J.F.Syraus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:463-467(1991)）。簡単に記せば、ＣＯＳ−１細胞に
１０μｌ／培養皿を使用し、リポフェクタミン（GIBCO-
BRL)を用いて種々の発現ベクターをトランスフェクトし
た。このベクターは、ｃＤＮＡ挿入物を含まないｐＳＰ
ＯＲＴ、１．６ｋｂＳｔＡＲｃＤＮＡを含むｐＳＰＯＲ
Ｔ（ｐＳｔＡＲ）、並びにウシＰ４５０ｓｃｃおよびア
ドレノドキシンのための発現ベクター（ｐＣＤＡＤＸ）
（ウォーターマン博士(Dr. Michael Waterman, Vanderb
ilt University, ナッシュビル、テネシー）提供）を含
む。トランスフェクション後４８時間してから、培養液
を先に記載したように（R. Yamamoto, C.B.Kallen, G.
O. Babalola, H. Rennert, J.T. Billheimer, III J.F.
Syraus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:463-467(199
1)）プレグネノロンの放射能免疫アッセーのために採集
した。１つの実験では、ヒドロキシステロール（２０α
−ヒドロキシステロール）を培養液に添加した（５μｇ
／ｍｌ）。このヒドロキシステロールはより可溶性のプ
レグネノロン前駆体で、コレステロール側鎖切断反応の
中間体である。２０α−ヒドロキシコレステロールのよ
うにヒドロキシステロールは、コレステロール移動の調
節移動メカニズムを飛び越え、したがって一般に最大の
コレステロール側鎖切断活性を提供する（M.E. Toaff,
H. Scleyer, J.F.Straus,III, Endocrinology 1785-179
0(1982)）。予備実験によって、トランスフェクト化Ｃ
ＯＳ細胞は、プロジェステロンの約１０倍のプレグネノ
ロンを分泌し、さらにプロジェステロン測定レベルはプ
レグネノロンと平行して変化することが明らかになっ
た。したがって、我々のステロイド生成の指標としてプ
レグネノロン分泌をモニターした。

【００７１】ＣＯＳ−１細胞は、ｃＤＮＡ挿入物を欠く
ｐＳＰＯＲＴベクターまたはＳｔＡＲｃＤＮＡを含むｐ
ＳＰＯＲＴをトランスフェクトしたときプレグネノロン
を分泌しなかった（表９）。しかしながら、ウシＰ４５
０ｓｃｃおよびアドレノドキシンの発現を誘導するプラ
スミドを細胞に同時トランスフェクションしたとき、ス
テロイド生成活性が細胞に付与された。Ｐ４５０ｓｃ
ｃ、アドレノドキシンおよびＳｔＡＲ発現プラスミドに
よるＣＯＳ−１細胞の三重トランスフェクションによっ
て、ステロイド分泌は、ｐ４５０ＳＣＣ、アドレノドキ
シンおよびコントロールｐＳＰＯＲＴプラスミドをトラ
ンスフェクトした細胞より４から２０倍増加した。ｐＰ
４５０ｓｃｃ、ｐＡＤＸおよびｐＳＰＯＲＴをトランス
フェクトした細胞を２０α−ヒドロキシコレステロール
（比較的可溶性のコレステロール側鎖切断反応中間体）
とともに培養することによって、ｐＳｔＡＲと同じ程度
にプレグネノロン分泌が刺激されたが、Ｐ４５０ｓｃｃ
およびアドレノドキシンプラスミドで同時トランスフェ
クトしたＣＯＳ細胞におけるｐＳｔＡＲ応答は増大され
なかった。Ｐ４５０ｓｃｃおよびアドレノドキシン発現
が無い場合、２０α−ヒドロキシコレステロールの存在
下でのプレグネノロン合成は検出できなかった。これら
の発見は、ｐＳＰＯＲＴプラスミド “コントロール”
はステロイド生成酵素の発現に干渉しなかったことを表
している。外因性ヒドロキシコレステロールはＳｔＡＲ
によって刺激されるステロイド産生を増大させなかった
という事実はまた、ＳｔＡＲはトランスフェクト化ＣＯ
Ｓ細胞においてステロイド生成活性をほぼ最大限まで促
進することを示唆する。

【００７２】ＣＯＳ細胞系におけるＳｔＡＲの発現によ
って促進されるステロイド生成の４倍以上の増化は、ス
テロイド生成強化の手段としてステロールキャリア蛋白
２発現プラスミドをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした
とき我々が観察した２倍の増化より実質的に大である
（R. Yamamoto, C.B. Kallen, G.O. Babalola, H. Renn
ert, J.T. Billheimer, III J.F. Syraus, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:463-467(1991)）。これらの発見は
ＳｔＡＲはステロイド生成を促進するという考えと一致
するが、一方、これらの実験はＳｔＡＲの作用の正確な
メカニズムを明らかにはしない。

【００７３】

【表１３】

【００７４】ＣＯＳ−１細胞に表示のプラスミド（２μ
ｇプラスミド／３５ｍｍ培養皿）をリポフェクチンを用
いてトランスフェクトした。４８時間後に培養液を採集
し、放射能免疫アッセーでプレグネノロンを調べた。２
０α−ヒドロキシコレステロール（２０α−ＯＨ−Ｃ；
５μｇ／ｍｌ）を幾つかの培養皿に添加した。４回の別
々の実験結果を示す。値は±ＳＥで、各実験につき複製
はＮ＝３−４。

【００７５】[実施例３] ＳｔＡＲ変異体の同定 経験的に決定した４つのＰＣＲプログラムの１つにした
がって種々のプライマーを用いて、白血球から調製した
ゲノムＤＮＡを増幅した（これらは全て９５°Ｃ２分変
成させることによって開始させた）。プログラム１：９
４°Ｃ５０秒、６４°Ｃ３０秒、７２°Ｃ９０秒の３４
サイクル。プログラム２：９４°Ｃ４５秒、５７°Ｃ４
５秒、７２°Ｃ６０秒。プログラム３：９４°Ｃ５０
秒、６０°Ｃ４５秒、７２°Ｃ９０秒。プログラム４：
９４°Ｃ６０秒、５５°Ｃ６０秒、７２°Ｃ１２０秒の
２９サイクル。全てのプログラムでパーキン・エルマー
・シータスのＴａｑポリメラーゼが用いられ、７２°Ｃ
１５分の最終伸長で終了させた。ＰＣＲ生成物はアガロ
ースゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーン（Gene Ckl
ean)(BIO 101）またはキアゲン（Qiagen）樹脂（Qiage
n）で精製した。エクソン１−４は表８に示すプライマ
ー対で増幅し、記載にしたがって（Ohbaら、1994）アプ
ライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）自動配
列決定装置で直接配列を決定した。エクソン１は、自動
配列決定のためにはＥｘ１Ｓ−Ｓ（短）およびＥｘ１Ａ
Ｓを用いて、さらに手動配列決定のためにはＥｘ１ＳＬ
（長）およびＥｘ１ＡＳを用いて増幅した。エクソン５
−７を含む２．１ｋｂＰＣＲフラグメントはプライマー
Ｓ３およびＡＳ１で増幅し、ウィザードミニプレップ
（Wizard miniprep)(Promega）で単離したｐＣＲＩＩ
（インビトロゲン）でクローニングし、さらに３５Ｓ
〔ｄＣＴＰ〕を用いてシークェナーゼ（Sequenase)２．
０（USB)によるジデオキシ鎖終結によって配列決定し
た。自動配列決定の曖昧さは手動配列決定によって解決
された（全ての手動配列決定は両方の鎖について実施し
た）。表３に記載したように、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの制限
エンドヌクレアーゼ消化によっていくつかの変異が確認
された。

【００７６】[実施例４] ＳｔＡＲ変異体の活性 確認された変異が実際に患者の類脂質ＣＡＨの原因であ
るか否かを決定するために、さらにＳｔＡＲ蛋白の構造
／機能要件の解明を開始するために、識別変異の各々を
インビトロで調べた。種々のＳｔＡＲ変異を位置特異的
変異誘発によって再現し、ｐＭＴ２またはｐＳＰＯＲＴ
いずれかのＳｔＡＲ発現ベクターでクローニングし、ス
テロイド非生成ＣＯＳ−１細胞に導入した。正常なヒト
ＳｔＡＲｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＭＶ４(Anderss
onら）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローニン
グした。センスおよびアンチセンスプライマー、ＦＬ−
ＳおよびＦＬ−ＡＳ（これらは完全な長さ（Full-Lengt
h)のＳｔＡＲｃＤＮＡのそれぞれ５’および３’末端に
対応し、それぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位
を含む）並びに、変更されるべき配列を含む相補的プラ
イマー対の一方を用いてオーバーラップＰＣＲによって
識別された変異を再現した（表１０）。各変異の構築の
ために、ＰＣＲプログラム４およびＰＦＵポリメラーゼ
（Stratagene）を用いて２つのＰＣＲ反応を別々に実施
したが、このとき最初にＦＬ−Ｓおよびアンチセンス変
異誘発性オリゴヌクレオチドを用い、二番目にＦＬ−Ａ
Ｓおよびセンス変異誘発性オリゴヌクレオチドを用い
た。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動、続いてジ
ーンクリーンまたはキアゲンカラムで精製した。１００
倍に希釈した後、反応の各組みの１μｌ量を合わせ、Ｆ
Ｌ−ＳおよびＦＬ−ＡＳによるＰＣＲ（プログラム４）
の鋳型として用いた。最終的なＰＣＲ生成物をＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−切断ｐＣＭＶ４で切断し、さ
らに構築の正確さを立証するために配列決定した。ΔＲ
２７２および９４７／ＩｎｓＡ／９４８変異（これは
３’末端近くに存在する）は、オリゴヌクレオチドＦＬ
−Ｓおよび第一のＰＣＲ反応のためにはΔＲ２７２−Ａ
Ｓまたは９４７／ＩｎｓＡ−ＡＳのいずれかを、さらに
ＦＬＳおよび第二の反応の各々のためには３’ブリッジ
オリゴヌクレオチドを用いて単独セグメント内に構築し
た。全てにおいてプログラム４を用いた。

【００７７】

【表１４】

【００７８】コレステロールのプレグネノロンへの変換
に対する正常ＳｔＡＲまたは変異ＳｔＡＲの作用を調べ
るために、コレステロール側鎖切断系の３成分を単一の
単分子融合蛋白（Ｈ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−ＡｄＲｅｄ
−ＡＤｘ−ＣＯＯＨ、Ｆ２と呼ぶ）として発現するベク
ターを細胞に同時トランスフェクトした。これによって
Ｐ４５０ｓｃｃ活性は最適化され、Ｐ４５０ｓｃｃのそ
の電子伝達蛋白（特にアドレノドキシン）に対する分子
比の変動によるＰ４５０ｓｃｃ活性における一切の変動
が排除される(Harikrishnaら;Zuberら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 85:699-703(1988))。可溶性コレステロー
ル類似体（例えば２０α−ヒドロキシコレステロールま
たは２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール）で細胞を培養
することによって、ミトコンドリアのステロイド生成能
は迂回される(Toaffら、Endocrinology 111:1785-1790
(1982))。したがって、基質としてＬＤＬコレステロー
ルを用いた場合のステロイド生成能に対する基質として
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを用いた場合のステ
ロイド生成能の比は、ミトコンドリアのコレステロール
輸送効率の指標を提供する。表１１に示すように、野性
型ＳｔＡＲはステロイド生成が１０倍増加し、我々が以
前に見出したものと一致し(Linら、1995）、さらに、変
異体のいずれもベクターコントロールより大きな活性は
示さなかった。したがって、これら認定された変異の各
々は完全に不活性なＳｔＡＲ蛋白を生じた。

【００７９】

【表１５】

【００８０】[実施例５] ＳｔＡＲｍＲＮＡの発現 種々のヒト組織に由来するポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを
含むノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Cl
ontech Laboratorie(Palo Alto, カリフォルニア))から
購入し、供給元のプロトコルにしたがって１．６ｋｂの
ＳｔＡＲｃＤＮＡおよびβ−アクチンｃＤＮＡをプロー
ブとして調べた。

【００８１】ＳｔＡＲｍＲＮＡはヒトの卵巣、精巣およ
び腎で検出された。最も多い転写物は１．６ｋｂで、そ
れより少ない量で４．４ｋｂおよび７．５ｋｂのｍＲＮ
Ａが卵巣および精巣で認められた（図16）。出産可能年
令の女性から得られた５つの卵巣を合わせて調製した卵
巣サンプルは殆どのＳｔＡＲｍＲＮＡを含み、続いて精
巣さらに腎臓がこれに続いた。同じ３２Ｐ標識ｃＤＮＡ
調製物をプローブとして調べた図16に示したノザンブロ
ットでは、卵巣および精巣を含むブロットはＳｔＡＲ発
現について６時間露光し、一方、腎サンプルを含むブロ
ットはＳｔＡＲについて２４時間露光した。両方のブロ
ットをさらに長時間露光しても、胎盤、膵、骨格筋、
肝、肺、脳、心臓、末梢血白血球、大腸、小腸、前立
腺、胸腺および脾臓ではＳｔＡＲｍＲＮＡを明示するこ
とができなかった。しかしながら、β−アクチンｍＲＮ
Ａは、同じブロットのこれら組織の全てで容易に検出で
きた。ヒト副腎皮質におけるＳｔＡＲの発現は、ヒトＳ
ｔＡＲｃＤＮＡを単離するために用いられたライブラリ
ーで多数のＳｔＡＲファージクローンが検出されたとい
う事実から推論される。

【００８２】これらの観察は、ＳｔＡＲ発現は、ｃＡＭ
Ｐの仲介性によって作用するトロピックホルモンによる
急性調節下にあるミトコンドリアのステロールヒドロキ
シル付加反応を起こす臓器に限られるということを示唆
する。このことは副腎および性腺について正しい。これ
らの臓器はそれぞれの下垂体トロピックホルモン（ＡＣ
ＴＨおよびＬＨ）に応答してコレステロール側鎖切断を
強化させ、さらに腎臓についても同様で、これはＰＴＨ
に応答してビタミンＤの１α−ヒドロキシル付加を増加
させる。別のステロイド生成臓器である胎盤はＳｔＡＲ
を発現しないらしいことは注目に値する。しかしなが
ら、胎盤のプロジェステロンはｃＡＭＰによる急性調節
下にあるようには思えない。胎盤栄養膜のｃＡＭＰレベ
ルまたはｃＡＭＰ類似体を増加させる薬剤の報告された
促進作用は、ステロイド生成酵素をコードする遺伝子の
発現を増加させる（何時間または何日かを要する過程）
ことに関係がありそうである（T.G. Golos, W.L. Mille
r J.F. Straus,III J. Clin.Invest. 80:896-899(198
7))。脳（これもまたステロイド生成部位である（D. Pa
tterson, C. Jones, I. Hart, J. Bleskan, R. Berger,
D. Geyer, S.P. Eisenberg, M.F. Smith Jr., W.P. Ar
end, Genomics 15:173-176(1993))もＳｔＡＲを発現し
ていないようであった。胎盤および脳でＳｔＡＲ発現が
ないことは、これら臓器のステロイドホルモン合成が他
のメカニズムによって調節されていることを示唆してい
るが、これは以前にリーバーマンおよびその共同研究者
らが提唱した（S. Lieberman, V.V.K. Prasad, Endoc.
Rev. 11:469-493(1990))。

【００８３】インビトロ受精／胎児移転を受けた女性か
ら得たヒト顆粒層細胞培養から、または精製ヒト栄養膜
細胞層細胞から全ＲＮＡを単離した。ヒト顆粒層細胞は
４日間培養し、続いて１．５ｍＭの８−ブロモ−ｃＡＭ
Ｐで２４時間処理した。栄養膜細胞層細胞は１．５ｍＭ
の８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下または非存在下で２４
時間培養した。この調製、培養並びに顆粒層細胞および
栄養膜細胞層細胞の全ＲＮＡの単離についての詳細なプ
ロトコルは以前に記載された（T.G. Golos, W.L. Mille
r J.F. Straus,III J. Clin. Invest. 80:896-899(198
7); G.E. Ringler, L.-C. Kao, W.L. Miller, J.F. Str
aus, III, Mol. Cell. Endocrinol. 61:13-21(198
9)）。ＳｔＡＲｃＤＮＡおよびヒト２８ＳｒＲＮＡをコ
ードするｃＤＮＡでノザンブロットを調べた。

【００８４】１．５ｍＭの８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在
下でヒト顆粒層細胞を２４時間培養することによって、
ＳｔＡＲｍＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡと較べて３から７倍
増加した（図１７）。対照的に、ＳｔＡＲｍＲＮＡは、
サイクリックＡＭＰ類似体の存在下または非存在下で２
４時間インキュベートしたヒト栄養膜細胞層細胞の初代
培養では検出できなかった。ＳｔＡＲｍＲＮＡはまた、
８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下（Ｐ４５０ｓｃｃおよび
アドレノドキシン遺伝子のアップレギュレーションのた
めの処置）または非存在下で２４時間培養したＪＥＧ−
３絨毛上皮腫細胞から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノ
ザンブロットでも検出されなかった（結果は示さず）
（J. Picado-Leonard, R. Voutilainen, L.-C. Kao, B.
-C. Chung,J.F. Strauss, III, W.L. Miller, J. Biol.
Chem. 263:3240-3244(1988))。これらの観察は、トロ
ピックホルモンは、蛋白をコードするｍＲＮＡを増加さ
せ、したがって蛋白合成を増加させることによって部分
的にＳｔＡＲレベルを制御するかもしれないということ
を示唆している。

【００８５】[実施例６] ＳｔＡＲ構造遺伝子および偽
遺伝子のマッピング 体細胞ハイブリッドから得たＤＮＡのサザンブロットの
ハイブリダイゼーションにより、さらに構造遺伝子また
は偽遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応分析によって、ＳｔＡＲ遺伝子およびその偽遺
伝子をマッピングした。ＮＩＧＭＳヒト遺伝子変異細胞
集積所(1992/1993細胞株カタログ、アメリカ予防衛生研
究所）から得たヒト×ハムスターおよびヒト×マウス体
細胞ハイブリッド系の高分子量ＤＮＡ、およびビオス社
（BIOS Corporation, ニューヘブン、コネチカット）か
ら購入したヒト×ハムスター体細胞ハイブリッドのＤＮ
Ａを用いて、構造遺伝子および偽遺伝子の染色体上の配
置を特定した。

【００８６】ＳｔＡＲ構造遺伝子の局部マッピングは以
下から成る染色体８の局部マッピングパネルを用いて実
施された：ハイブリッド９ＨＬ１０、ＩＳＨＬ２７およ
び２０ＸＰ０４３５−２（ワグナー博士提供（Y.J. Cha
ng, R.T. McCabe, H. Budarf,R. Sayegh, B.S. Emanue
l, P. Skolnick, J.F. Straus,III, DNA Cell Biol. 1
1:471-480(1992)))、８ｑ−、２１ｑ＋およびＣ１１７
（M.J. Wagner, Y. Ge, M. Siciliano, D.E. Wells, Ge
nomics 10:114-125(1991); R. Dalla-Favera, M.Bregn
i, J. Erikson, D. Patterson, R.C. Gallo, C.M. Croc
e, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:464-468(1982);
H.A. Drabkin, M. Diaz, C.M. Bradley, MM.Le Beau,
J.D. Rowley, D. Patterson, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82:464-468(1985))並びにＲｅｃ８（これはＧｌｙ
ＢＣＨＯ−Ｋ１変異体と組換え体８症候群の患者の細胞
との融合によって生成されたハイブリッドである)(N. S
acchi,S. V. Cheng, R.E. Tanzi, J.F. Gusella, H.A.
Drabkin, D. Patterson, J.H.Haines, T.S. Papas, Gen
omics 3:110-116(1988) ）。Ｒｅｃ８は組換え体８染色
体を含むが、正常なヒト染色体８は含まない。

【００８７】ハイブリッドパネルのゲノムＤＮＡをＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化し、サザンブロット（サザンブロット
の詳細な技術は下記で説明する）に付したとき、約８ｋ
ｂの強いハイブリダイゼーションバンドが、ヒトゲノム
ＤＮＡコントロールおよびハイブリッドＧＭ１０１５６
（これはヒト染色体８のみを含む）で検出された（図１
８）。微かなバンドが、ＧＭ１０４７８（これはヒト染
色体２０の他にヒト染色体８ｐのフラグメントもまた含
む）でもまた検出された。これらの発見は、ファイルＳ
ｔＡＲ遺伝子は染色体８に存在することを示唆した。

【００８８】ＳｔＡＲ遺伝子が染色体８に局在すること
を確認するために、構造遺伝子を特異的に増幅するプラ
イマーを用いるＰＣＲにより体細胞ハイブリッドを調べ
た。染色体８を含むハイブリッドは陽性の信号を生じ、
一方、他の全てのハイブリッド（ヒト染色体２０を含む
が染色体８は含まないことが分かっているハイブリッド
を含む）は特異的な増幅生成物を生じなかった。

【００８９】ヒト染色体８の局部マッピングパネルの分
析によって、ＳｔＡＲ遺伝子は８ｐ上に位置決定された
（図１９）。機能的ＳｔＡＲ遺伝子の局部マッピングの
確認と純化は、ＳｔＡＲ機能的遺伝子を含むＹＡＣを単
離し、このＹＡＣをＦＩＳＨでプローブとして用いるこ
とによって実施した（図２０）。局部マッピングは、連
続的バンド形成とそれに続くＦＩＳＨによって実施し
た。この方法によって、ＳｔＡＲ座位は８ｐ１１．２に
特定された。長さ分別測定と同様に、ＳｔＡＲＹＡＣお
よび８動原体特異的プローブを用いた同時ＦＩＳＨによ
って、この座位の特定は確認された。

【００９０】逆転写されたヒト精巣ＲＮＡのＰＣＲ分析
およびヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって、発現Ｓ
ｔＡＲ偽遺伝子の存在が示唆された。増幅偽遺伝子生成
物のＤＮＡ配列はイントロンを含まず、ヌクレオチドの
挿入、欠失および置換に関して多くの場所で機能的Ｓｔ
ＡＲ遺伝子配列とは異なっていた。増幅配列は個々の幾
つかの配列間で異なり、顕著な多形現象を示唆してい
た。偽遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて、Ｓｔ
ＡＲ偽遺伝子は染色体１３に存在することを決定した
（図２１）。

【００９１】[実施例７] サザンブロッティングとＰＣ
Ｒ分析 ２４個の体細胞ハイブリッド、完全なヒト、ハムスター
（ＲＪＫ８８）およびマウス（ＧＭＣｌ１−Ｄ）から得
た１２μｇのゲノムＤＮＡ１０種をＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、０．８％アガロースで電気泳動し、ハイボンド
（Hybond）Ｎ＋（Amersham, エールスベリー、イギリ
ス）膜にブロットした。ＳｔＡＲｃＤＮＡによるハイブ
リダイゼーションは、先に述べた条件で実施した（Y.J.
Chang, R.T.McCabe, H. Budarf, R. Sayegh, B.S. Ema
nuel, P. Skolnick, J.F. Straus,III, DNA Cell Biol.
11:471-480(1992)）。

【００９２】ＳｔＡＲ構造遺伝子および偽遺伝子は、配
列特異的プライマーを用いて体細胞ハイブリッドＤＮＡ
のＰＣＲ分析によってマッピングした。構造遺伝子のた
めに用いられた前進方向プライマーは５’−ＧＴＧＡＧ
ＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧ−３’で、逆方向プラ
イマーは５’−ＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧ
ＣＡ−３’であった。これらの配列は小さなイントロン
を含み、３００ヌクレオチドの生成物を生じる。ＰＣＲ
増幅発現偽遺伝子のＤＮＡ配列に由来するプライマー
（その配列は他の箇所に記載する）を偽遺伝子の配置決
定に用いた。その前進方向プライマーは５’−ＡＧＣＣ
ＴＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧ−３’で、逆方向プ
ライマーは５’−ＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＧ
ＣＣＴＴＧ−３’であった。これらのプライマーは８０
０ヌクレオチドの偽遺伝子特異的生成物生じる。ＰＣＲ
の条件は、９４°Ｃで５分の変成、続いて９４°Ｃ４５
秒の変成、６５°Ｃ４５秒のアニーリングおよび７２°
Ｃ２分の伸長が３０サイクルで、２ｍＭのＭｇＣｌ２を
含む緩衝液中の１０ｐＭのプライマーを用いた。ＰＣＲ
生成物は、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析
し、臭化エチジウムで染色した。構造的ＳｔＡＲ遺伝子
の局部マッピングを確認するために、染色体８ｐの遺伝
地図を作製できることが分かっている幾つかの遺伝子に
ついての局部マッピングパネルを調べた。これらの遺伝
子には、クラストリン遺伝子(clustringene, ＣＬ１）
（A.C.M. Smith, K. Spuhler, T.M. Wiliams, T. McCon
nell, E.Sujansky, A. Robinson, Am. J. Human. Genet
ics 41:1083-1103(1987); H.V.de Silva, J.A. Harmon
y, W.D. Stuart, C.M. Gil, J. Ribbins, Biochemistry
29:5380-5389(1990); D.E. Jenne, J. Tschopp, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,86:7123-7127(1989); L. Kirszb
aum, J.A. Sharpe, J. Murphy, A.J. d'Apice,B. Class
on, P. Hudson, I.D. Walker, EMBO J. 8:711-718(198
9))、リポ蛋白リパーゼ遺伝子（ＬＰＬ）（J.M. Pineau
lt, M. Tenniswood, J. Biol. Chem. 268: 5021-5031(1
993) ）およびスクアレンシンターゼ遺伝子（ＳＳ）
（K.L. Wion,T. G. Kirchgessner, A.J. Lusis, M.c. S
chotz, R.M. Lawn, Science 235:1638-1641(1987)) が
含まれる。ＰＣＲプライマーは文献に発表された配列か
ら作製した。ＣＬ１特異的プライマーは５’−ＡＧＡＡ
ＡＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＣＣ−３’および５’
−ＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣ−３’で、そ
れぞれヌクレオチド２５０４−２５２４および２８３６
−２８５４を表す。ＬＰＬ特異的プライマーは、５’−
ＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＴＡＣ−３’および
５’−ＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧ−
３’で、ヌクレオチド１６０１−１６２０および１６８
７−１７０６をそれぞれ表す。ＳＳ特異的プライマー
は、５’−ＡＡＡＡＧＡＡＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＩＧ
ＧＧＡＣ−３’および５’−ＡＣＣＴＡＡＡＣＣＧＴＧ
ＧＣＡＡＡＴ−３’で、それぞれヌクレオチド１４０５
−１４２８および１５４７−１５６８を表す。

【００９３】[実施例８] 蛍光in situ ハイブリダイ
ゼーション（ＦＩＳＨ）マッピング ３’非翻訳配列に対応するＳｔＡＲ特異的プライマーを
用いるＰＣＲスクリーニングによって、セントルイスラ
イブラリーからＳｔＡＲ構造的遺伝子を含む個々の酵母
人工染色体（ＹＡＣ）を単離した。センスプライマー
は、５’−ＣＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴ
ＣＴＡＡＧ−３’（ヌクレオチド１０４８−１０７２）
であった。アンチセンスプライマーは、５’−ＴＧＧＴ
ＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＴＡＡＧＧＧ−３’（ヌ
クレオチド１２８７−１２６４）であった。ＹＡＣのＤ
ＮＡ中のＳｔＡＲ配列を、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１
０μｌの標準的なＰＣＲ反応容積中で増幅させた。ＹＡ
ＣＤＮＡを先ず９４°Ｃで５分変成させた。増幅は、９
４°Ｃ３０秒の変成、５５°Ｃ３０秒のアニーリングお
よび７２°Ｃ３０秒の伸長の３５サイクルで実施した。
２％アガロースゲル（臭化エチジウムによる染色を伴
う）で予想される２４０ヌクレオチドの増幅生成物の存
在について、反応生成物を調べた。

【００９４】ＹＡＣのＦＩＳＨは、以下のように変更を
加えながら先の記載（G. Jiang, T.L. McKenzie, D.G.
Conrad, I. Schechter, J. Biol. Chem. 268:12818-128
24(1993); P. Lichter, C.-J. Tang, K. Call, G. Herm
anson, A.E. Glen, D. Housman, D.C. Ward, Science 2
47:64-69(1990)）にしたがって実施した。ビオチン標識
プローブは７５°Ｃで５分変成させ、ヒトＣｏｔ−１Ｄ
ＮＡで１時間３７°Ｃ予備アニーリングを施し、さらに
先に変成させ脱水したヒト染色体のスライド調製物に適
用した。スライドをカバースリップで覆い、湿潤チャン
バー内で３７°Ｃで一晩ハイブリダイズさせた。いくつ
かの実験では、染色体８の動原体特異的プローブ（Ｄ８
Ｚ２：Oncor Inc., ガイザースバーグ、メリーランド）
をこのハイブリダイゼーション混合物に加えた。ハイブ
リダイゼーション後洗浄は、５０％ホルムアミド／２×
ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．
０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）で１５分さらに２×Ｓ
ＳＣで８分、４５°Ｃで実施した。検出は、製造元（On
cor, Inc.)の指示によって１回の増幅を用いてアビジン
−ＦＩＴＣによって実施した。染色体は沃化プロピジウ
ムで対比染色した。

【００９５】ＦＩＳＨに先立って、１２の分裂中期分散
標本をトリプシンによるＧバンド染色し写真を撮った。
スライドをヘムデ（Heme-De, Fisher Scientific, フェ
アーローン、ニュージャージー）で洗浄し油を除去し
て、無水メタノールで２度１０分脱染色し、さらに７０
％続いて８０％エタノールでそれぞれ２分ずつ脱水し、
無水メタノール中に１０分置いて風乾させた。続いてＦ
ＩＳＨを上記のように実施した。分裂中期分散標本を新
しい場所に置き、プローブシグナルによってバンドパタ
ーンを比較してプローブの配置を特定した。断片の長さ
の測定によってこの配置特定を確認した（G. Jiang, T.
L. McKenzie, D.G. Conrad, I. Schechter,J. Biol. Ch
em. 268:12818-12824(1993)）。

【００９６】分裂中期分散標本は、エクタクローム４０
０スライドフィルムを用いてツァイスアキソフォト（Ze
iss Axiophot）顕微鏡で撮影するか、またはコンピュー
ターでデジタル処理しカラープリンターで印刷した。

【００９７】[実施例９] 患者の無傷のＲＮＡとインビ
トロ生成ＲＮＡのＲＮアーゼ保護 Ｔ→Ａ変異のＲＮＡスプライシングに対する影響を決定
するために、ヒトＳｔＡＲミニジーンのためのｐＣＭＶ
４発現ベクターを構築した。このベクターは、エクソン
１、２、３、４、イントロン４、エクソン５、イントロ
ン５、エクソン６、イントロン６およびエクソン７から
成る（すなわち最初の４つはｃＤＮＡ由来で、残りの構
築物は天然の遺伝子由来である）一次ＲＮＡ転写物を発
現する。

【００９８】ミニジーン構築物：正常および変異ミニジ
ーン構築物は、５’エクソン１−２−３−４、イントロ
ン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イント
ロン６エクソン７、３’を含み、ｐＣＭＶ４でクローニ
ングされた。ｃＤＮＡ部分（エクソン１−２−３−４）
は、５’−ＡＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣ
ＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧ（塩基４１−６０）および５’
−ＣＣＣＣＡＴＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＣＴＣ（塩
基４２１−４４２）による増幅によって生成された。ゲ
ノム部分（エクソン４、イントロン４、エクソン５、イ
ントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７）
は、５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＡ
ＡＧＴＧ（塩基４３９−４６２）および５’−ＡＴＡＴ
ＣＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧ
（塩基１０２１−１０４０）を用いて増幅された。ＰＣ
Ｒの後、過剰なヌクレオチドをセントリコン−１００で
遠心沈澱させて除去した。ＤＮＡフラグメントを、５０
μＭのｄＴＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノーフラグメントで処理し、ＣＭＶプロモーターから下
流でクローニングした。各構築物の５μｇを燐酸カルシ
ウム沈澱によって、１０％ウシ胎児血清補充ＤＭＥＭ−
Ｈ２１中で増殖させたＣＯＳ−１細胞にトランスフェク
トした。ＲＳＶ−ＬＵＣ構築物（０．５μｇ）を用いて
各プレートでトランスフェクション効率をモニターし
た。トランスフェクション後１２時間して培養液を交換
し、細胞を採集前にさらに４８時間増殖させた。ルシフ
ェラーゼアッセー系（Promega)を１５秒用いてルシフェ
ラーゼ活性を測定した。チオシアン酸グアニジン抽出に
よって全ＲＮＡを調製し、一方、細胞ＲＮＡおよび核Ｒ
ＮＡはＮＰ４０による細胞溶解によって調製した。

【００９９】続いてこのＲＮＡのスプライシングをエク
ソン４および５（プローブ１）またはエクソン４、イン
トロン４、エクソン５およびエクソン６（プローブ２）
から成るリボプローブを用いてＲＮアーゼ保護アッセー
により調べた。ＤＮＡフラグメントは、第一のプローブ
のための構築物のためにはセンスプライマー（Ｓ５）と
して５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴ
ＧＡＧＴＡＡＡＧＴＧ（塩基４４２−４６２）および、
アンチセンスプライマー（ＡＳ６）５’−ＣＴＧＡＴＧ
ＡＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣ（塩基７５７−７７６）
を用い、さらに第二のプローブのための構築物のために
はアンチセンスプライマー（ＡＳ７）５’−ＣＴＴＧＡ
ＧＧＴＣＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣＴＡＧＧＡＴＡ
（塩基８５０−８７０）を用いて増幅させた。これらの
フラグメントはｐＫＳのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部
位でクローニングした。第三のプローブのための構築物
はＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩゲノムフラグメントの第二の構
築物のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントへの連結によ
って生成された。ＲＮアーゼ保護実験は記載のように実
施した（Mol. Cell Biol. 12:2124-2134(1992)）。プロ
ーブ１は、正常なミニジーンベクターをトランスフェク
トした細胞から単一の３３５ｂｐバンドを検出し、これ
は一切の介在イントロン配列を含まないエクソン４およ
び５に対応する（図２２）。しかしながら、イントロン
４のＴ→Ａ変異を含むベクターでトランスフェクトされ
た細胞では、３３５ｂｐバンドは認められず、それに代
わってエクソン５（１８５ｂｐ）およびエクソン４（１
５０ｂｐ）が別々のバンドとして検出され、エクソン４
および５を分離させる別のＲＮＡ配列（おそらくスプラ
イスされないイントロン４）が存在することを示唆して
いる。エクソン４は一貫して断続的な（Stuttered)保護
パターンを生じるが、この原因は不明である。

【０１００】患者の性腺から得たＲＴ−ＰＣＲデータが
示唆するように、イントロン４のＴ→Ａ変異がスプライ
シング機構がエクソン５に跳ぶ原因であるならば、変異
ミニジーン構築物をトランスフェクトされた細胞のＲＮ
Ａでエクソン６に融合したエクソン４が見出され、野性
型ミニジーン構築物をトランスフェクトされたＲＮＡに
は見出されないであろうと予想される。これを調べるた
めに、プローブ２についてＲＮアーゼ保護アッセーを実
施した（図２３）。このプローブは、正常または変異体
構築物をトランスフェクトした細胞から得たＲＮＡおよ
びコントロールｃＤＮＡで、１５０塩基フラグメント
（エクソン４に対応）および２７９塩基フラグメント
（エクソン５および６に対応）を検出する。トランスフ
ェクト化細胞のＲＮＡはまた５７０ｂｐ（エクソン４、
イントロン４、エクソン５および６）および４７６ｂｐ
（エクソン４、イントロン４、エクソン５）のスプライ
スされていないフラグメントを保護する。１５０および
２７９ｂｐのスプライスされた形態は正常構築物によっ
て発現されたスプライスされていない形態よりもはるか
に多いが、変異体構築物からは同等な濃度である。した
がって、Ｔ→Ａ変異は正常なスプライシングに干渉す
る。核ＲＮＡおよび細胞質ＲＮＡが分離されると、イン
トロン種の殆どは核ＲＮＡであるが、幾らかのイントロ
ン種は細胞質に存在し、さらにいくらかのスプライスさ
れた形態が核に存在する。これは、細胞内漏出または細
胞分画中の各分画の他のものによる汚染のいずれかを反
映している。また、非常に高レベルのｐＣＭＶ４ベクタ
ーからの発現がスプライシング機構を飽和させる可能性
も考えられる。したがって、ミニジーン発現構築物の分
析は、イントロン４／エクソン５スプライス部位から１
１ｂｐの単独Ｔ→Ａ変異は、ＳｔＡＲ前駆体ＲＮＡの適
切なスプライシングを破壊し、類脂質ＣＡＨを惹起する
ことを示唆する。

【０１０１】天然ＲＮＡのＲＮアーゼ保護：患者の少量
の精巣ＲＮＡがプローブ２による直接試験のために入手
できた（図２４）。図５及び図６で先に観察されたよう
に、正常なヒト胎児副腎ＲＮＡのみが２７９塩基（エク
ソン５および６に対応）および１５０塩基（エクソン４
に対応）の予期されたフラグメントを保護した。したが
って、エクソン５を欠くＰＣＲ生成物（場合によって正
常ＲＮＡで認められる）は、極めてまれな事象を表す。
患者のＲＮＡはいくつかの別な種を保護した。少量の５
７０および４７６塩基種が存在したが、これらは、エク
ソン４、５および６に付随する（５７０ｂｐ）か、また
はエクソン４および５にのみ付随する（４７６ｂｐ）ス
プライスされていないイントロン４の保持に対応する。
１５０塩基種の豊富さは、正常ＲＮＡの場合よりわずか
に少ないが、２７９塩基種の豊富さはるかに少なく、患
者のＲＮＡの多くでエクソン５のスキップを生じるＴ→
Ａ変異と一致する。患者のＲＮＡはまた、１００ｂｐの
ＤＮＡマーカーの近くに移動する多量の種（おそらくエ
クソン６（９４塩基）に対応）を生じたが、これは保護
されることが予想されるが、もしＴ→Ａ変異がエクソン
５のスキップを生じるとしたら他の配列に結合しないで
あろう。最後に患者のＲＮＡは、エクソン６に付随しな
い単離されたエクソン５に対応する少量の１８５ｂｐ種
を含む。したがって、Ｔ→Ａ変異は不規則なＲＮＡスプ
ライシングのいくつかの型を生じるようである。ＰＣＲ
増幅ｃＤＮＡで認められたようにエクソン５のスキップ
は顕著なエラーであるが、イントロン４の保持および１
８５塩基種によって反映されるまた別の下流でのスプラ
イシングエラーもまた生じる。

【０１０２】[実施例１０] トランスフェクション実験
と３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸の分析 ＣＯＳ−１細胞にｐＣＭＶ４（Suら、1990）中のラット
Ｐ４５０ｃ２７ｃＤＮＡおよびウシアドレノドキシン発
現プラスミド（マイケル・ウォターマン博士（Dr. Mich
ael Waterman(Vanderbilt University))ご提供）を、空
のｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクター(BRL, ベセスダ、メ
リーランド）または先に述べたヒトＳｔＡＲｃＤＮＡを
含むベクター（Sugawaraら、PNAS 1995)でトランスフェ
クトした。

【０１０３】Ｐ４５０ｃ２７によるコレステロール代謝
の最終産物である３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸
(cholestenoic acid) の生成（Andersonら、1989）を先
に記載されたように同位元素質量分析法で調べた(Reiss
ら、J. Lipid Res. 35:1026-1030(1994)）。簡単に記せ
ば、ジューテロ化スタンダード（５００ｎｇ）を１ｍｌ
容量の媒体に加え、酸性化し酢酸エチルで抽出した後、
生成物を薄層クロマトグラフィーにより単離した。Ｃ２
７酸のメチル化後、溶出物をアセチル化しヒューレット
パッカードＧＬＣ−ＭＳ中の融合シリカカラム（ＣＰ−
ｓｉｌ１９ＣＢ、内径０．２５ｍｍ、長さ２５ｍ）上に
注入した。同位元素比プログラムを用いて、ｍ／ｚ４／
４〔３β−ヒドロキシ−５−コレステン酸メチルエステ
ルアセテート、分子イオン＝４７２−６０（アセテー
ト）〕の面積をモニターし、内因性ステロール量の計算
用積分によってそれぞれの面積を求めた。結果は表１２
に示す。

【０１０４】

【表１６】

【０１０５】[実施例１１] ＳｔＡＲプロモーターを用
いた異種遺伝子の発現 ＳｔＡＲプロモーターのプロモーター活性を分析するた
めに、ＳｔＡＲ遺伝子の１．３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメント（ｂｐ−１２９３＋２５）を正方向および逆方
向で、ホタルのルシフェラーゼをレポーター遺伝子とし
て含むプラスミドベクターｐＧＬ２（Promega)でクロー
ニングした。これらの実験で用いられる他のプラスミド
にはｐＧＬ２基本ベクター（これはプロモーター配列を
含まない)、ｐＧＬ２ コントロール（これはルシフェ
ラーゼ遺伝子をＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサ
ーの制御下に置く）、およびｐＣＨ１１０（ｌａｃＺ遺
伝子が初期ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるプラス
ミド）（Pharmacia)が含まれる。

【０１０６】ネズミＹ−１副腎腫瘍細胞およびＢｅＷｏ
絨毛上皮腫細胞を、１０％ウシ胎児血清およびゲンタマ
イシン５０μｇ／ｍｌを補充したダルベッコ（Dulbecc
o）の最小必須培養液から成る培養液で３５ｍｍのプラ
スチック培養皿で成育させた。トランスフェクションに
用いたプラスミドマクシプレップ（Maxiprep）試薬系
（Qiagen）を用いて精製した。１μｇのｐＧＬ２ プラ
スミド構築物および１μｇのｐＣＨ１１０プラスミドを
１０μｌのリポフェクタミン（GIBCO/BRL)とともに含む
血清非含有培養液１ｍｌを加える前に、４０％−６０％
コンフレント状態の細胞培養を血清非含有培養液で２度
洗浄した。５時間のインキュベーション後、２０％の血
清を含む培養液１ｍｌと交換した。４８時間培養した後
細胞を採集した。いくつかの実験では、８−Ｂｒ−ｃＡ
ＭＰ（１ｍＭ）を培養の最後の２４時間培養液に加え
た。

【０１０７】トランスフェクション後４８時間で細胞を
採集し、抽出はプロメガ（Promega)溶解緩衝液中で実施
した。一定量（全抽出容積４００μｌのうち４０μｌ）
をプロメガ試薬によるルシフェラーゼアッセーに用い、
別の１５０μｌをプロメガ試薬によるβ−ガラクトシダ
ーゼアッセーに用いた。トランスフェクトされていない
細胞抽出物で測定した “ブランク”ルシフェラーゼ値
をトランスフェクト化細胞の抽出物のルシフェラーゼの
読みから差し引いた。トランスフェクション効率におけ
る変動を補正するために、ルシフェラーゼアッセーの結
果はβ−ガラクトシダーゼ活性に対して基準化した。各
実験で、ｐＧＬ２コントロールベクターの活性を１００
％と規定した。各処置群は少なくとも３培養を含み、さ
らに各実験は２または３回繰り返された。結果は表１３
に示す。

【０１０８】

【表１７】

【０１０９】８−Ｂｒ−ｃＡＭＰによるＹ−１細胞処理
は、ＳｔＡＲプロモーター活性を２．３倍増加させ（ｐ
＜０．００２ 対ｔ検定によるログ変換データ分析）、
このＤＮＡセグメントはｃＡＭＰ感応エレメントを含む
ことを示唆した。ＳｔＡＲプロモーター活性におけるこ
の増化は、ｃＡＭＰで４時間処理したヒト顆粒層細胞の
ＳｔＡＲｍＲＮＡの定常状態レベルの３倍の増化に一致
する(Sugawaraら、1995）。これは、ｃＡＭＰに応答す
るＳｔＡＲｍＲＮＡの増化は少なくとも部分的には転写
増化の結果であることを示唆する。

【０１１０】Ｙ−１細胞に関する我々の発見と対照的
に、ＳｔＡＲプロモーターは、ＢｅＷｏ絨毛上皮腫（こ
れはＳｔＡＲ遺伝子を発現しない）における顕著なレポ
ーター遺伝子の発現をもたらさなかった。これは、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を基準状態で調べようと、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ
で刺激後調べようと変わらなかった。このことは、胎盤
および絨毛上皮腫での検出可能なＳｔＡＲｍＲＮＡの欠
如、および胎児が類脂質ＣＡＨに冒される妊娠中の胎盤
のステロイド生成の持続と矛盾しない（Sugawaraら、19
95）。したがって、ＳｔＡＲの組織特異的発現およびｃ
ＡＭＰによる調節を誘導するｃｉｓ成分は、キャップ部
位から上流の１．３ｋｂのＤＮＡ内に位置するように思
える。

【０１１１】本明細書で言及した全ての文献および特許
出願は、個々の文献または特許出願が個々にかつ具体的
に本明細書に示すのと同程度に援用して本明細書に含ま
れる。

【０１１２】本発明は十分に説明されたが、当業者に
は、添付の請求の範囲から外れることなく多くの変更お
よび修飾を行うことができることは明白であろう。

【０１１３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California; The Trustees of the U niversity of Pennsylvania <120> 先天性類脂質副腎過形成に付随する遺伝子変異の認定 <130> IRBF9617D <150> US 08/410,540 <151> 1995-03-23 <160> 2 <210> 1 <211> 1618 <212> DNA <213> human <220> <221> CDS <222> (1) ... (1618) <223> hStAR gene cDNA <400> 1 CCACGCGTCC GCGAAGCTTG AGGGGCTCAG GAAGGACGAA GCAACCACCC TTGAGAGAAG 60 AGGCAGCAGC AGCGGCGGCA GCAGCAGCGG CAGCGACCCC ACCACTGCCA CATTTGCCAG 120 GAAACA ATG CTG CTA GCG ACA TTC AAG CTG TGC GCT GGG AGC TCC TAC 168 Met Leu Leu Ala Thr Phe Lys Leu Cys Ala Gly Ser Ser Tyr 1 5 10 AGA CAC ATG CGC AAC ATG AAG GGG CTG AGG CAA CAG GCT GTG ATG GCC 216 Arg Mis Met Arg Asn Met Lys Gly Leu Arg Gln Gln Ala Val Met Ala 15 20 25 30 ATC AGC CAG GAG CTG AAC CGG AGG GCC CTG GGG GGC CCC ACC CCT AGC 264 Ile Ser Gln Glu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser 35 40 45 ACG TGG ATT AAC CAG GTT CGG CGG CGG AGC TCT CTA CTC GGT TCT CGC 312 Thr Trp Ile Asn Gln Val Arg Arg Arg Ser Ser Leu Leu Gly Ser Arg 50 55 60 CTG GAA GAG ACT CTC TAC AGT GAC CAG GAG CTG GCC TAT CTC CAG CAG 360 Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Ser Asp Gln Glu Leu Ala Tyr Leu Gln Gln 65 70 75 GGG GAG GAG GCC ATG CAG AAG GCC TTG GGC ATC CTT AGC AAC CAA GAG 408 Gly Glu Glu Ala Met Gln Lys Ala Leu Gly Ile Leu Ser Asn Gln Glu 80 85 90 GGC TGG AAG AAG GAG AGT CAG CAG GAC AAT GGG GAC AAA GTG ATG AGT 456 Gly Trp Lys Lys Glu Ser Gln Gln Asp Asn Gly Asp Lys Val Met Ser 95 100 105 110 AAA GTG GTC CCA GAT GTG GGC AAG GTG TTC CGG CTG GAG GTC GTG GTG 504 Lys Val Val Pro Asp Val Gly Lys Val Phe Arg Leu Glu Val Val Val 115 120 125 GAC CAG CCC ATG GAG AGG CTC TAT GAA GAG CTC GTG GAG CGC ATG GAA 552 Asp Gln Pro Met Glu Arg Leu Tyr Glu Glu Leu Val Glu Arg Met Glu 130 135 140 GCA ATG GGG GAG TGG AAC CCC AAT GTC AAG GAG ATC AAG GTC CTG CAG 600 Ala Met Gly Glu Trp Asn Pro Asn Val Lys Glu Ile Lys Val Leu Gln 145 150 155 AAG ATC GGA AAA GAT ACA TTC ATT ACT CAC GAG CTG GCT GCC GAG GCA 648 Lys Ile Gly Lys Asp Thr Phe Ile Thr His Glu Leu Ala Ala Glu Ala 160 165 170 GCA GGA AAC CTG GTG GGG CCC CGT GAC TTT GTG AGC GTG CGC TGT GCC 696 Ala Gly Asn Leu Val Gly Pro Arg Asp Phe Val Ser Val Arg Cys Ala 175 180 185 190 AAG CGC CGA GGC TCC ACC TGT GTG CTG GCT GGC ATG GAC ACA GAC TTC 744 Lys Arg Arg Gly Ser Thr Cys Val Leu Ala Gly Met Asp Thr Asp Phe 195 200 205 GGG AAC ATG CCT GAG CAG AAG GGT GTC ATC AGG GCG GAG CAC GGT CCC 792 Gly Asn Met Pro Glu Gln Lys Gly Val Ile Arg Ala Glu His Gly Pro 210 215 220 ACT TGC ATG GTG CTT CAC CCG TTG GCT GGA AGT CCC TCT AAG ACC AAA 840 Thr Cys Met Val Leu His Pro Leu Ala Gly Ser Pro Ser Lys Thr Lys 225 230 235 CTT ACG TGG CTA CTC AGC ATC GAC CTC AAG GGG TGG CTG CCC AAG AGC 888 Leu Thr Trp Leu Leu Ser Ile Asp Leu Lys Gly Trp Leu Pro Lys Ser 240 245 250 ATC ATC AAC CAG GTG CTG TCC CAG ACC CAG GTG GAT TTT GCC AAC CAC 936 Ile Ile Asn Gln Val Leu Ser Gln Thr Gln Val Asp Phe Ala Asn His 255 260 265 270 CTG CGC AAG CGC CTG GAG TCC CAC CCT GCC TCT GAA GCC AGG TGT TGAAGACCAG 9 91 Leu Arg Lys Arg Leu Glu Ser His Pro Ala Ser Glu Ala Arg Cys 275 280 285 CCTGCTGTTC CCAACTGTGC CCAGCTGCAC TGGTACACAC GCTCATCAGG AGAATCCCTA 1051 CTGGAAGCCT GCAAGTCTAA GATCTCCATC TGGTGACAGT GGGATGGGTG GGGTTCGTGT 1111 TTAGAGTATG ACACTAGGAT TCAGATTGGT GAAGTTTTTA GTACCAAGAA AACAGGGATG 1171 AGGCTCTTGG ATTAAAAGGT AACTTCATTC ACTGATTAGC TATGACATGA GGGTTCAGGC 1231 CCCTAAAATA ATTGTAAAAC TTTTTTTCTG GGCCCTTATG TACCCACCTA AAACCATCTT 1291 TAAAATGCTA GTGGCTGATA TGGGTGTGGG GGATGCTAAC CACAGGGCCT GAGAAGTCTT 1351 GCTTTATGGG CTCAAGAATG CCATGCGCTG GCAGTACATG TGCACAAAGC AGAATCTCAG 1411 AGGGTCTCCT GCAGCCCTCT GCTCCTCCCG GCCGCTGCAC AGCAACACCA CAGAACAAGC 1471 AGCACCCCAC AGTGGGTGCC TTCCAGAAAT ATAGTCCAAG CTTTCTCTGT GGAAAAAGAC 1531 AAAACTCATT AGTAGACATG TTTCCCTATT GCTTTCATAG GCACCAGTCA GAATAAAGAA 1591 TCATAATTCA CACCAAAAAA AAAAAAA 1618 <210> 2 <211> 285 <212> PRT <213> human <220> <221> CDS <222> (1) ... (285) <223> hStAR deduced amino acid sequence <400> 2 Met Leu Leu Ala Thr Phe Lys Leu Cys Ala Gly Ser Ser Tyr Arg His 1 5 10 15 Met Arg Asn Met Lys Gly Leu Arg Gln Gln Ala Val Met Ala Ile Ser 20 25 30 Gln Glu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser Thr Trp 35 40 45 Ile Asn Gln Val Arg Arg Arg Ser Ser Leu Leu Gly Ser Arg Leu Glu 50 55 60 Glu Thr Leu Tyr Ser Asp Gln Glu Leu Ala Tyr Leu Gln Gln Gly Glu 65 70 75 80 Glu Ala Met Gln Lys Ala Leu Gly Ile Leu Ser Asn Gln Glu Gly Trp 85 90 95 Lys Lys Glu Ser Gln Gln Asp Asn Gly Asp Lys Val Met Ser Lys Val 100 105 110 Val Pro Asp Val Gly Lys Val Phe Arg Leu Glu Val Val Val Asp Gln 115 120 125 Pro Met Glu Arg Leu Tyr Glu Glu Leu Val Glu Arg Met Glu Ala Met 130 135 140 Gly Glu Trp Asn Pro Asn Val Lys Glu Ile Lys Val Leu Gln Lys Ile 145 150 155 160 Gly Lys Asp Thr Phe Ile Thr His Glu Leu Ala Ala Glu Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Leu Val Gly Pro Arg Asp Phe Val Ser Val Arg Cys Ala Lys Arg 180 185 190 Arg Gly Ser Thr Cys Val Leu Ala Gly Met Asp Thr Asp Phe Gly Asn 195 200 205 Met Pro Glu Gln Lys Gly Val Ile Arg Ala Glu His Gly Pro Thr Cys 210 215 220 Met Val Leu His Pro Leu Ala Gly Ser Pro Ser Lys Thr Lys Leu Thr 225 230 235 240 Trp Leu Leu Ser Ile Asp Leu Lys Gly Trp Leu Pro Lys Ser Ile Ile 245 250 255 Asn Gln Val Leu Ser Gln Thr Gln Val Asp Phe Ala Asn His Leu Arg 260 265 270 Lys Arg Leu Glu Ser His Pro Ala Ser Glu Ala Arg Cys 275 280 285

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡ（ｈＳｔＡＲＤＮＡ）の
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。蛋白キナー
ゼＡおよび蛋白キナーゼＣ仲介燐酸化の可能な部位には
それぞれ一本下線および二本下線が付されている。

【図２】ヒトＳｔＡＲｃＤＮＡ（ｈＳｔＡＲＤＮＡ）の
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。蛋白キナー
ゼＡおよび蛋白キナーゼＣ仲介燐酸化の可能な部位には
それぞれ一本下線および二本下線が付されている。

【図３】患者のＳｔＡＲｃＤＮＡのナンセンス変異の検
出。上：正常（ＮＬ）ヒト胎児副腎および精巣ＲＮＡ、
患者１および２の精巣ＲＮＡ並びに無ＲＮＡコントロー
ルから得たＳｔＡＲのＲＴ−ＰＣＲ生成物を１％臭化エ
チジウム染色アガロースゲル上に表示。分子サイズマー
カーはＨｉｎｄＩＩＩ切断バクテリオファージλであ
る。下：ＳｔＡＲｃＤＮＡのマップ。Ｒ１９３→Ｓｔｏ
ｐは、Ａｒｇ１９３（ＣＧＡ）に代わりに終止暗号（Ｔ
ＧＡ）への置換、さらにＱ２５８→Ｓｔｏｐは、Ｇｌｎ
２５８に代わり終止暗号（ＴＧＡ）への置換である。中
が白い四角はＳｔＡＲｃＤＮＡのコード領域を表す。マ
ップ下の短い棒線はＰＣＲプライマーを示す。センスプ
ライマーＳ１の配列は５’−ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧ
ＧＣＡＧＣＡ−３’（ｃＤＮＡ内の位置は６６−８４）
で、アンチセンスプライマーＡＳ１は５’−ＡＴＧＡＧ
ＣＧＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＧ−３’（１０１６
−１０３７）であった。ＰＣＲプログラムは、９４°
Ｃ、４５秒；６４°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、６０秒で３
０サイクルであった。

【図４】ＳｔＡＲ遺伝子のＰＣＲマッピング。上：左の
パネルは、２％臭化エチジウム染色アガロースゲル上に
表示したプライマーＳ２／ＡＳ２で増幅したゲノムＰＣ
Ｒ生成物。分子サイズマーカーはＨａｅＩＩＩ切断バク
テリオファージΦｘ１７４である。右パネルは、１％ア
ガロースゲル上に表示したプライマーＳ３／ＡＳ１で増
幅したゲノムＰＣＲ生成物。分子サイズマーカーはＨｉ
ｎｄＩＩＩ切断バクテリオファージλである。両方のゲ
ルで、ＰＣＲの鋳型としてゲノムＤＮＡを加えた場合が
レーン１で、添加しなかったのがレーン２である。下：
ＳｔＡＲ遺伝子の３’半分のマップを示す。中が白い四
角はエクソンを示し、各エクソンの最後に記した数字は
ｃＤＮＡ配列の対応するヌクレオチドの位置を示す（B.
J. Clark, J. Wells, S.R. King, D.M. Stocco, J. Bio
l. Chem. 269:28314(1994)）。種々のＰＣＲプライマー
および生成物の位置はマップの下に示す。センスプライ
マーＳ２は、５’ＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＡ
ＡＧＴＧ−３’（４４２−４６２）で、アンチセンスプ
ライマーＡＳ２は、５’−ＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＣＡ−３’（７１７−７３８）であった。Ｓ
２／ＡＳ２を用いるＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、４
５秒；５８°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、６０秒で３５サイ
クルであった。センスプライマーＳ３は５’ＧＴＧＡＧ
ＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧ−３’であった。Ｓ３
／ＡＳＩを用いるＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、５０
秒；６４°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、９０秒で３５サイク
ルであった。

【図５】ＰＣＲ生成物の直接的な配列決定（seaquencin
g)を示す。（上）正常コントロール、患者１および患者
の両親の直接ＰＣＲ配列決定（ダイナル社の方法(Dyna
l, Inc., Lake Success, ニューヨーク))である。矢印
はナンセンス変異に含まれるヌクレオチドを示す：コン
トロールではＣ、患者１ではＴ、両親ではＣおよびＴ。
（下）ＤＮＡとアミノ酸配列。

【図６】ＰＣＲ生成物の直接的な配列決定（seaquencin
g)を示す。正常コントロール、患者２および患者３の直
接ＰＣＲ配列決定である。矢印はコントロールのＣ並び
の患者２および患者２の両者のＴを示す。図５では、セ
ンスＰＣＲプライマー（Ｓ３）は図３で述べたが、ビオ
チン化アンチセンスプライマー（ＡＳ３）は５’ＧＧＡ
ＴＧＣＡＧＴＣＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧ−３’であっ
た。ＰＣＲプログラムは、９４°Ｃ、４５秒；６４°
Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、４５秒で３５サイクルであっ
た。センスプライマー、５’ＧＡＴＡＣＡＴＴＣＡＴＴ
ＡＣＴＣＡＣ−３’（６１３−６３０）を配列決定に用
いた。図６では、センスビオチン化プライマー（Ｓ４）
は５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴＡ
Ｇ−３’（１２０１−１２２３）であった。ＰＣＲプロ
グラムは、９４°Ｃ、４５秒；６３°Ｃ、３０秒；７２
°Ｃ、４５秒で３５サイクルであった。アンチセンスプ
ライマーＡＳ１を直接配列決定に用いた。

【図７】類脂質ＣＡＨを引き起こす変異を示す。ＤＮＡ
配列決定。下に示した正常配列は、エクソン５および６
の接合部を示すが、一方、患者の配列はエクソン６に連
結されたエクソン４を示している。

【図８】類脂質ＣＡＨを引き起こす変異を示す。イント
ロン変異。矢印は、イントロン４とエクソン５との接合
部から１１ｂｐのＴ→Ａ変化を示す。

【図９】類脂質ＣＡＨを引き起こす変異を示す。患者の
遺伝子とコードされるｍＲＮＡの概略図。イントロン４
のＴ→Ａ変化（Ｘとして示す）は前駆体ｍＲＮＡのスプ
ライシングを破壊し、エクソン５の欠失をもたらす。

【図１０】家族調査である。正常コントロール（Ｎ
１）、患者（Ｐｔ）、父親（Ｆａ）および母親（Ｍｏ）
のゲノムＤＮＡをプライマーＳ２およびＡＳ５で増幅
し、４３２ｂｐの生成物を得た。ＤＮＡを未切断または
ＮｃｏＩ（＋）で消化後電気泳動し、１００ｂｐラダー
マーカーと比較し、臭化エチジウムで染色した。ＤＮＡ
のマップは下に示す。５’末端から７４ｂｐのＮｃｏＩ
部位は、該ＤＮＡのＮｃｏによる完全消化の内部コント
ロールとして役立つことに留意されたい。

【図１１】ＳｔＡＲ遺伝子プロモーターのＤＮＡ配列で
ある。主要な転写開始部位から転写された配列は肉太活
字で示される。翻訳された配列には下線を施し、アミノ
酸は一文字コードで示されている。ＴＡＴＡ様成分は枠
で囲んだ。反復配列には下線を施した。

【図１２】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。プライマ
ーＨＢ５５とＨＢ３４を用いた患者４の家族のゲノムＤ
ＮＡのＰＣＲ増幅とそれに続くＡｌｕＩ消化。患者のサ
ンプルから２６５ｂｐバンドが得られ、その両親は２６
５と１６２＋１０３ｂｐバンドについてヘテロ接合型
で、正常コントロールは１６２および１０３ｂｐバンド
のみを有する。

【図１３】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。患者５と
６の家族、ＨＢ５５とＨＢ３４で増幅しＴｓｐ４５Ｉで
切断した。患者は切断されない２９５ｂｐフラグメント
を有し、コントロールは１７３ｂｐおよび１２２ｂｐフ
ラグメントを有し、両親はヘテロ接合型である。

【図１４】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。患者７お
よび９のＲ１８２Ｌをもつ対立遺伝子の遺伝的変動を示
す。ＰＣＲはパネルＢの通りであった。すなわち、いず
れの患者のＤＮＡもＴｓｐ４５Ｉでは切断されず、患者
９はまたΔＴ５９３フレームシフト変異についてホモ接
合型で、この変異はＡｖａＩＩ／Ｓａｕ９６Ｉ部位を破
壊する（これはまた一定しない消化をもたらすＳｔｕＩ
部位を生じる）。

【図１５】類脂質ＣＡＨのＰＣＲ診断である。プライマ
ーＢ２およびＡＳ１を用いた患者１０のＤＮＡのＰＣＲ
増幅とそれに続くＥｓｐＩ消化。患者の２０３ｂｐフラ
グメントは消化されず、一方、コントロールは１０７お
よび９６ｂｐ生成物に切断される。

【図１６】種々のヒト組織のＳｔＡＲｍＲＮＡの発現を
示す。表示の組織から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μ
ｇを含むノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ
（Clontech Laboratories)から購入し、ＳｔＡＲおよび
β−アクチンｃＤＮＡプローブで連続的に調べた。左の
パネルＡのＳｔＡＲについてのオートラジオグラムは２
４時間露光され、右のパネルＡのＳｔＡＲについてのオ
ートラジオグラムは４時間露光された。アクチン（Ｂ）
についてはブロットは両方とも２時間露光した。

【図１７】ｃＡＭＰによるヒト顆粒層細胞におけるＳｔ
ＡＲｍＲＮＡ発現の調節である。ヒト顆粒層細胞の初代
培養を４日間行ない、さらに８−ブロモ−ｃＡＭＰ
（１．５ｍＭ）を２４時間いくつかのプレート（＋）に
添加した。ヒト栄養膜細胞の初代培養もまた、１．５ｍ
Ｍ、２４時間の８−ブロモ−ｃＡＭＰの存在下（＋）ま
たは非存在下（−）で樹立した。全ＲＮＡを抽出し、ノ
ザンブロットを実施し（５μｇＲＮＡ／レーン）、さら
にブロットをＳｔＡＲおよび２８ＳｒＲＮＡｃＤＮＡプ
ローブで連続的に調べた。オートラジオグラムを画像分
析システム(Resource Technology, ナッシュビル、テネ
シー）で調べ、２８ＳｒＲＮＡと比較してヒト顆粒層細
胞におけるＳｔＡＲｍＲＮＡの増加を決定した。この増
加はある実験では３倍、別の実験では７倍であった。

【図１８】染色体８におけるＳｔＡＲ遺伝子の配置決定
である。ゲノムＤＮＡを体細胞ハイブリッドパネルから
単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、サザンブロットを実
施した。ハイブリッドの名称と優勢なヒト染色体を表示
するが、これは幾つかの事例では、該ハイブリッドに存
在するただ１つのヒト染色体である。ヒトゲノムＤＮＡ
で見出されるものと一致するハイブリダイゼーションバ
ンドは、ヒト染色体８を含むハイブリッドでのみ見出さ
れた。薄いバンドがハイブリッドＧＭ１０４７８で認め
られたが、これは、染色体２０の他に８ｐフラグメント
を含むことが分かっている。

【図１９】体細胞ハイブリッドマッピングによるＳｔＡ
Ｒ遺伝子の８ｐに対する局部マッピングである。染色体
８のイディオグラムをフランクの文献（U. Francke, Cy
togenetics & Cell Genetics 65:206-219(1994))にした
がって修飾する。イディオグラムの右側は、それぞれの
細胞株に存在するヒト染色体８の部分の概略を示す。当
該染色体の細胞遺伝学地図上のこれらＤＮＡの境界の正
確な位置はおおよそのものである。ＳｔＡＲ、ＬＰＬ、
ＳＳおよびＣＬ１遺伝子はＰＣＲによって位置が決定さ
れた。遺伝子の存在は “＋”で示し、存在しない場合
は“−”で示す。陰性コントロール細胞株、ＣＨＯ−Ｋ
１（これはハムスターＤＮＡのみを含む）もまたこの実
験に含めた（結果は示さず）。ＬＰＬ、ＳＳおよびＣＬ
１のこの位置決定は先に報告された結果と一致する（K.
L. Wion, T.G. Kirchgessner, A.J. Lusis, M.c., Scho
tz, R.M. Lawn, Science 235:1638-1641(1987); T.M. F
ink, M. Zimmer, J. Tschopp, J. Etienne, D.E. Jeen
e, P. Lichter, Genomics 16:526-528(1993); I. Schec
hter, D.G. Conrad, I. Hart, R.C. Berger, T.L. McKe
nzie, J. Bleskan, D. Patterson, Genomics 20:116-11
8(1994)）。

【図２０】ＹＡＣＦＩＳＨによるＳｔＡＲの機能的遺伝
子座の８ｐ１１．２への配置決定。ＹＡＣＤＮＡをｄＵ
ＴＰおよびｄＣＴＰを用いてニックトランスレーション
を行ない、本文中に記載したようにスライド当たり１μ
ｇの酵母ＤＮＡを用いて分裂中期分散標本とハイブリダ
イズさせた。このプローブをアビジン−ＦＩＴＣ（黄
色）で検出し、染色体には沃化プロピジウム（赤色）で
対比染色を施した。パネルＡのイディオグラムの左側の
矢印は、８ｐ１１．２領域へのＡ１０Ｇ５ＹＡＣのＦＩ
ＳＨ占有場所を示す

【図２１】ＳｔＡＲ偽遺伝子のヒト染色体１３への配置
決定である。体細胞ハイブリッドＤＮＡのＰＣＲ分析
は、ＳｔＡＲ偽遺伝子に特異的なプライマーで実施し
た。パネル左側にあるレーンの数字は、図１１で調べた
ハイブリッドを指す。ハイブリッド “１”（ＧＭ１０
８８０）はヒト染色体１とともに１３および１４を含
む。ハイブリッドＧＭ０７２９９Ａはヒト染色体Ｘおよ
び１を含み、Ｒ３７０−２２Ａはヒト染色体１および１
３を含む。 “１３”と呼ばれるハイブリッドはヒト染
色体１３のみを含む。コントロールは、ｐBluescript
（Stratagene, ラホイヤ、カリフォルニア）でクローニ
ングした偽遺伝子配列を指す。８００ヌクレオチドＳｔ
ＡＲ偽遺伝子増幅生成物は、ヒト染色体１３を含むハイ
ブリッドでのみ認められる。

【図２２】合成ＲＮＡのＲＮアーゼからの保護を示す。
これは、エクソン４（１５０ｂｐ）の３’１５０塩基、
エクソン５（１８５ｂｐ）およびベクター配列の５８ｂ
ｐから成る放射能標識プローブにハイブリダイズさせる
ことによって調べられた。３３５ｂｐ保護生成物はエク
ソン４および５に一致し、１８５ｂｐ生成物はエクソン
５に、さらに１５０ｂｐのバンド群はエクソン４に一致
する。

【図２３】放射能標識プローブ２とのハイブリダイゼー
ションによって調べた合成ＲＮＡのＲＮアーゼからの保
護を示す。プローブ２は、エクソン４（１５０ｂｐ）の
３’１５０塩基、変異イントロン４（１４１ｂｐ）、エ
クソン５（１８５ｂｐ）、エクソン６（９４ｂｐ）およ
びベクター配列の６８ｂｐから成る。このプローブをＲ
Ｎアーゼで消化する前に下記のサンプルとハイブリダイ
ズさせた：レーン１および１１はコントロール一本鎖ヒ
ト胎児副腎ｃＤＮＡ；レーン２および３は変異体（患
者）または正常ＳｔＡＲミニ遺伝子をトランスフェクト
したＣＯＳ−１細胞のＲＮＡ；レーン４はｔＲＮＡ；レ
ーン７−１０は患者または正常ＳｔＡＲミニ遺伝子をト
ランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のＲＮＡを核分画と
細胞質分画とに分けたもの。主要な保護フラグメントの
サイズおよび組成物は表示されている。オートラジオグ
ラムの過剰露光は、６３８、５７０、４７１および２７
９塩基フラグメントが患者の核ＲＮＡに存在することを
示している（レーン１０）。

【図２４】図２３に記載したようにプローブ２とのハイ
ブリダイゼーションで調べた患者のＲＮＡのＲＮアーゼ
からの保護を示す。主要な保護フラグメントのサイズお
よび組成は表示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 599117196 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバー シティ オブ ペンシルベニア アメリカ合衆国 19104−3147 ペンシル ベニア州 フィラデルフィア マーケット ストリート 3700 スイート 300 (72)発明者 ミラー、ウォルター エル. アメリカ合衆国 94122 カリフォルニア 州 サンフランシスコ エイス アベニュ 1683 (72)発明者 リン、ドング アメリカ合衆国 94122 カリフォルニア 州 サンフランシスコ テンス アベニュ 1672 (72)発明者 ストラウス、ジェローム エフ．ザ サー ド アメリカ合衆国 19038 ペンシルベニア 州 ワインドムール イースト ジラバー ズ レーン 805

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子であっ
   て： （１）図１、表６−１乃至６−３または表７−１乃至７
   −３で説明するｈＳｔＡＲｃＤＮＡ、ｈＳｔＡＲゲノム
   ＤＮＡまたはｈＳｔＡＲ偽遺伝子ＤＮＡから成る第一の
   配列； （２）長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、当該
   第一の配列のサブ配列である第二の配列； （３）当該第一または第二の配列の少なくとも１つのヌ
   クレオチドが異なるヌクレオチドで置換される第三の配
   列； （４）当該第一もしくは第二の配列から少なくとも１つ
   のヌクレオチドが欠失しているか、または当該第一もし
   くは第二の配列に少なくとも１つのヌクレオチドが挿入
   される第四の配列；または （５）当該第一、第二または第三の配列のいずれかに対
   して相補的な第五の配列、を含み、 ここで、（１）当該分子が、当該配列（１）〜（５）の
   いずれかにおいてＴがＵに置換されているＲＮＡ分子で
   あることが可能で、（２）当該第三の配列は当該第一ま
   たは第二の配列に対して少なくとも９５％同一であり、
   （３）当該第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡに存在
   せず、さらに（４）当該第四の配列は、２０より多い挿
   入ヌクレオチドおよび２００より多い欠失ヌクレオチド
   を含まないことを条件とする当該単離されたＤＮＡまた
   はＲＮＡ分子。
2. 【請求項２】単離されたＤＮＡ分子であって： （１）図１、表６−１乃至６−３または表７−１乃至７
   −３に説明されたｈＳｔＡＲｃＤＮＡ、ｈＳｔＡＲゲノ
   ムＤＮＡまたはｈＳｔＡＲ偽遺伝子ＤＮＡから成る第一
   の配列； （２）長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、当該
   第一の配列のサブ配列である第二の配列； （３）当該第一または第二の配列のエクソン１、エクソ
   ン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン
   ６、エクソン７もしくはイントロン４内の少なくとも１
   つのヌクレオチドが、異なるヌクレオチドで置換される
   か、または当該第一もしくは第二の配列から欠失または
   当該第一もしくは第二の配列に挿入される第三の配列； （４）当該第一または第二の配列のエクソン１、エクソ
   ン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン
   ６、エクソン７もしくはイントロン４内の少なくとも１
   つのヌクレオチドが当該第一もしくは第二の配列から欠
   失しているか、または当該第一もしくは第二の配列に挿
   入されている第四の配列；または （５）当該第一、第二または第三の配列のいずれかに対
   して相補的な第五の配列、を含み、 ここで、（１）当該分子が、当該配列（１）−（５）の
   いずれかにおいてＴがＵに置換されているＲＮＡ分子で
   あることができ、（２）当該第三の配列は当該第一また
   は第二の配列に対して少なくとも９５％同一であり、
   （３）当該第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡに存在
   せず、さらに（４）当該第四の配列は、２０より多い挿
   入ヌクレオチドおよび２００より多い欠失ヌクレオチド
   を含まないことを条件とする当該単離されたＤＮＡ分
   子。
3. 【請求項３】 単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子であ
   って： （１）図１または表６−１乃至６−３で説明するｈＳｔ
   ＡＲｃＤＮＡまたはｈＳｔＡＲゲノムＤＮＡから成る第
   一の配列； （２）長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、当該
   第一の配列のサブ配列である第二の配列； （３）当該第一または第二の配列の少なくとも１つのヌ
   クレオチドが異なるヌクレオチドで置換される第三の配
   列； （４）当該第一もしくは第二の配列から少なくとも１つ
   のヌクレオチドが欠失しているか、または当該第一もし
   くは第二の配列に少なくとも１つのヌクレオチドが挿入
   される第四の配列；または （５）当該第一、第二または第三の配列のいずれかに対
   して相補的な第五の配列、を含み、 ここで、（１）当該分子が、当該配列（１）〜（５）の
   いずれかにおいてＴがＵに置換されているＲＮＡ分子で
   あることが可能で、（２）当該第三の配列は当該第一ま
   たは第二の配列に対して少なくとも９５％同一であり、
   （３）当該第二の配列はマウスＳｔＡＲｃＤＮＡに存在
   せず、さらに（４）当該第四の配列は、２０より多い挿
   入ヌクレオチドおよび２００より多い欠失ヌクレオチド
   を含まないことを条件とする当該単離されたＤＮＡまた
   はＲＮＡ分子。
4. 【請求項４】 前記分子が、前記第一の配列を含む請求
   の範囲第３項の単離された分子。
5. 【請求項５】 前記分子が、前記第二の配列を含む請求
   の範囲第３項の単離された分子。
6. 【請求項６】 前記分子が、前記第三または第四の配列
   を含む請求の範囲第３項の単離された分子。
7. 【請求項７】 前記異なるヌクレオチド、前記欠失ヌク
   レオチドまたは前記挿入ヌクレオチドが、エクソンに存
   在する請求の範囲第６項の単離された分子。
8. 【請求項８】 前記異なるヌクレオチド、前記欠失ヌク
   レオチドまたは前記挿入ヌクレオチドが、エクソン５、
   エクソン６またはエクソン７に存在する請求の範囲第６
   項の単離された分子。
9. 【請求項９】 前記異なるヌクレオチド、前記欠失ヌク
   レオチドまたは前記挿入ヌクレオチドが、イントロン４
   に存在する請求の範囲第６項の単離された分子。
10. 【請求項10】 前記異なるヌクレオチドが、イントロン
    ４およびエクソン５の結合部から１１ｂｐのＴ→Ａ変換
    である請求の範囲第９項の単離された分子。
11. 【請求項11】 前記異なるヌクレオチドが、それが位置
    されて、コドンをＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ終止コド
    ンにする請求の範囲第６項の単離された分子。
12. 【請求項12】 前記異なるヌクレオチドがＡｒｇ¹⁹³→
    Ｓｔｏｐ変異またはＧｌｎ²⁵⁸→Ｓｔｏｐ変異である請
    求の範囲第７項の単離された分子。
13. 【請求項13】 前記異なるヌクレオチドがアミノ酸置換
    を生じる請求の範囲第７項の単離された分子。
14. 【請求項14】 前記異なるヌクレオチドがＧｌｕ¹⁶⁹→
    Ｇｌｙ置換、Ａｒｇ¹⁸²→Ｌｅｕ置換、Ｇｌｕ¹⁶⁹→Ｌｙ
    ｓ置換、Ａｌａ²¹⁸→Ｖａｌ置換またはＬｅｕ^{27 5}→Ｐｒ
    ｏ置換を生じる請求の範囲第１３項の単離された分子。
15. 【請求項15】 前記欠失ヌクレオチドがＴ⁵⁹³である請
    求の範囲第７項の単離された分子。
16. 【請求項16】 前記欠失ヌクレオチドがＣ⁹⁴⁰、Ｇ⁹⁴¹お
    よびＣ⁹⁴²である請求の範囲第７項の単離された分子。
17. 【請求項17】 前記挿入ヌクレオチドが、Ｇ²⁴⁷および
    Ｇ²⁴⁸の間のＧ、またはＧ⁹⁴⁷およびＣ⁹⁴⁸の間のＡであ
    る請求の範囲第７項の単離された分子。
18. 【請求項18】 前記異なるヌクレオチド、前記欠失ヌク
    レオチドまたは前記挿入ヌクレオチドが、直接的または
    間接的に、ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子の転写を
    抑制する請求の範囲第６項の単離された分子。
19. 【請求項19】 前記異なるヌクレオチド、前記欠失ヌク
    レオチドまたは前記挿入ヌクレオチドが、直接的または
    間接的に、ステロイド生成急性調節蛋白遺伝子のｍＲＮ
    Ａの翻訳を抑制する請求の範囲第６項の単離された分
    子。
20. 【請求項20】 前記異なるヌクレオチド、前記欠失ヌク
    レオチドまたは前記挿入ヌクレオチドが、直接的または
    間接的に、ステロイド生成急性調節蛋白のｍＲＮＡの安
    定性を減少させる請求の範囲第６項の単離された分子。
21. 【請求項21】 前記分子が、Ｓａｕ９６Ｉ、ＦｓｐＩ、
    ＨｈａＩ、ＨａｅＩＩ、ＮｃｏＩ、ＡｌｕＩ、Ｔｓｐ４
    ５Ｉ、ＡｖａＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＥｃｏＲＩＩから成
    る群から選ばれる制限酵素の制限部位を有する請求項１
    の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
22. 【請求項22】 前記分子が、Ｓａｕ９６Ｉ、ＦｓｐＩ、
    ＨｈａＩ、ＨａｅＩＩ、ＮｃｏＩ、ＡｌｕＩ、Ｔｓｐ４
    ５Ｉ、ＡｖａＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＥｃｏＲＩＩから成
    る群から選ばれる制限酵素により切断された請求項１の
    単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
23. 【請求項23】 前記分子が塩基長14〜200のプライマー
    である、請求項１の単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分
    子。