EP1520042A2 - Genes des chromosomes 3,5 et 11 impliques dans la canitie precoce - Google Patents

Genes des chromosomes 3,5 et 11 impliques dans la canitie precoce

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Publication number
EP1520042A2
EP1520042A2 EP03748204A EP03748204A EP1520042A2 EP 1520042 A2 EP1520042 A2 EP 1520042A2 EP 03748204 A EP03748204 A EP 03748204A EP 03748204 A EP03748204 A EP 03748204A EP 1520042 A2 EP1520042 A2 EP 1520042A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
genes
chosen
gene
fragment
human chromosome
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03748204A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier De Lacharriere
Jean-Louis Blouin
Claire Deloche
Stylianos Antonarakis
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LOreal SA
Original Assignee
LOreal SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LOreal SA filed Critical LOreal SA
Publication of EP1520042A2 publication Critical patent/EP1520042A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61Q5/06—Preparations for styling the hair, e.g. by temporary shaping or colouring
    • A61Q5/065—Preparations for temporary colouring the hair, e.g. direct dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
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    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
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    • C12Q2600/148—Screening for cosmetic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the second obstacle in the implementation of reverse genetics methods concerns the exact definition of the phenotype.
  • a perfect definition of the phenotype studied is indeed necessary.
  • the choice and the composition of the sample used in the present invention were carried out according to a rigorous protocol for the allocation of the phenotype and the selection of families.
  • the phenotype "premature canities" was attributed to the only individuals who presented white hair before 25 years and whose half of the hair was gray at 30 years.
  • premature canities have a multigenic and not a monogenic origin, and that, on the other hand, environmental factors have an influence on the phenotype.
  • the object of the present invention relates on the one hand to the genes of the chromosomal regions identified and on the other hand to the use of derived products, such as transcription or translation products, in the fields of cosmetics, therapeutics and diagnosis.
  • the present invention successively relates to the use of polynucleotides deriving from a gene included in a chromosomal region of the invention, the use of agents capable of modifying the function attached to this gene, l use of the expression products of this gene and the use of agents capable of modifying the function of these expression products.
  • the joint or combined use of at least two of the preceding products may prove to be judicious, in particular in the therapeutic field.
  • the present invention also relates to a method for the diagnosis of premature canities based on allelic variations within the genes included in the chromosomal regions of the invention. In terms of diagnosis, it may also be particularly relevant to combine the information coming from different genes within the chromosomal areas of the invention.
  • polynucleotide fragment any molecule resulting from the linear chain of at least two nucleotides, this molecule being able to be single-stranded, double-stranded or three-stranded. It can therefore be a double-stranded DNA molecule, a single-stranded DNA, an RNA, a single-stranded DNA-RNA duplex, a DNA-RNA triplex or any other combination.
  • the polynucleotide fragment can be natural isolated, recombinant or else synthetic. When the polynucleotide fragment has complementary strands, the complementarity is not necessarily perfect, but the affinity between the different strands is sufficient to allow the establishment of a stable Watson Crick-type bond between the two strands.
  • base pairing is preferably of the Watson-Crick type, other types are not excluded, such as a Hoogsteen or reverse Hdogsteen type pairing.
  • sequence S of a molecule "corresponds" to the sequence of a given DNA molecule if we can deduce the chain of the bases of S from that of the DNA molecule given by one of the following processes 1. by identity, or 2. by identity but by changing all or part of the Thymines to Uracil, or
  • two sequences remain “corresponding” if less than one error in 10 is introduced overall in one of the preceding processes (complementarity or identity, with or without T, U exchange), preferably less of an error out of 100. Consequently, the two molecules also necessarily have similar lengths, the maximum variation in length being 10% according to the accepted error rate, they preferably have a difference in length less than 1 %.
  • RNA sequence resulting from the translation of any DNA molecule, "corresponds" to the sequence of this DNA molecule.
  • a synthetic sequence for example hybrid DNA-RNA, may correspond to a DNA sequence. The same is true between a DNA sequence and the antisense RNA targeting this sequence.
  • sequence S of a DNA molecule "corresponds" to the sequence of a given DNA molecule if we can deduce the sequence S from that of the given DNA molecule by process 1 or 3 only.
  • process 1 or 3 the same latitude is allowed regarding the possibility of introducing errors in these processes, that is to say that it is considered that two DNA sequences remain
  • the expression products of a DNA fragment encompass all the molecules translating the genetic information carried by this fragment.
  • the RNAs corresponding to the transcription of the DNA fragment, at all stages of maturation, are therefore products of expression; the same is true for the polypeptides, at all stages of maturation, resulting from the translation of the RNAs. If cleavages occur within the polypeptide, such as, for example, cleavage of address signals, all of the resulting polypeptides are also considered to be products of expression of the original DNA fragment.
  • the primary "function" of a DNA fragment is preferably to be transcribed and then translated into protein. The secondary function of DNA can be assimilated to the function of the protein resulting from the translation of this DNA.
  • a DNA fragment also has other meanings in the present invention.
  • a DNA fragment can belong to a regulatory region of a gene, its function is then either to be the site of binding of enhancers or inhibitors, or else to be the site of binding RNA polymerase, or to be a recognition site for the positioning of RNA polymerase, or any other function generally assimilated to a regulatory sequence.
  • a genetic marker is a detectable DNA sequence.
  • markers are specific sequences of DNA that can take different forms depending on the individual. This polymorphism of markers makes it possible to follow their transmission within the framework of family trees.
  • SNP Single nucleotide polymorphism
  • microsatellite markers are tools for locating the genes involved in premature canities. As there is much less polymorphism in genes than in markers, a gene allele will be represented by several alleles of the same microsatellite marker.
  • the physical unit of measure is the number of base pairs.
  • the centimorgan is often used, it is a unit of recombination therefore a unit of genetic measurement and not physical.
  • Two particular sequences of the same chromosome are one centimeter apart if they recombine once in a hundred during meiosis.
  • One centimorgan is approximately 10 6 base pairs.
  • Another method for locating particular DNA sequences along the chromosomes is to define their position relative to markers dotting the chromosomes and whose position is perfectly determined and known. Markers widely used are microsatellite markers of which there are very complete maps.
  • the GDB "Genome Database” is a database known worldwide for listing, among other things, the STSs (Sequence tagged sites), specific and unique bounds of DNA of which microsatellites are a part.
  • the DxSxxxx codes (for example D6S257), used to identify these markers, are their accession number in GDB. These codes are an unambiguous and universal means of identification because only GDB assigns this type of code.
  • a SNP Single Nucleotide Pholymorphism
  • SNP Single Nucleotide Pholymorphism
  • chromosomal region between two markers is meant the entire sequence between these two markers, the limits being understood, therefore the sequence of markers including.
  • the indices making it possible to locate a gene come from the comparison of the transmission of a phenotype, supposedly induced by a mutated gene or by a given allele, with the transmission of known markers, within the same family. These phenotype and marker co-segregation data make it possible to establish a genetic linkage analysis.
  • Binding is determined by analyzing the transmission pattern of a gene and a marker in families that lend themselves to it. Binding analysis is based on the co-transmission of certain forms of markers with the defective or modified form of a gene. But it is an indirect analysis in the sense that on the one hand, during a first stage, a phenotype is associated with the defective or modified form of the gene. An error in the assignment of some phenotypes distorts the study.
  • the result of the linkage analyzes obviously depends on the degree of linkage between the marker and the locus of the disease.
  • Five centimorgans (5 cM) is considered a minimum of binding for a diagnosis.
  • a binding to 5 cM means that there is a 95% chance of arriving at a correct conclusion and only 1 in 20 chances that a recombination has occurred between the marker and the locus of the disease.
  • gene in the. framework of the present invention, is meant not only the strictly coding part, but also the non-coding parts such as the introns, and the regulatory parts, in 5 ′ and 3 ′, the UTRs (UnTranslated Region), in particular the promoter (s) , "Enhancers” etc ... associated. , ;
  • the inventors have identified 3 distinct chromosomal regions, belonging to chromosomes 3, 5 and 11 and which are involved in premature canities. These 3 regions are each of the chromosomal regions or zones of the invention. The inventors have more particularly highlighted the involvement of certain genes belonging to these chromosomal regions, called genes of the invention.
  • the invention relates to the genes KIAA1042, CCK-, CACNA1D, ARHGEF3 and AL133097 of the human chromosome 3, identified by the inventors as being involved in premature canities and the uses of products derived from these genes, such as transcription or expression products.
  • These genes belong to the first chromosomal zone of the invention which is delimited on chromosome 3 by the microsatellite markers D3S1277 and D3S1285. This area will more particularly be called “first chromosomal area of the invention”.
  • the 5 genes mentioned will be more particularly called the 5 genes of the invention of chromosome 3.
  • the invention relates to the genes KLHL3, HNRPAO,
  • CDC25C EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI to PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFTI1 chromopn, and by the inventors as being involved in early canities and the uses of products derived from these genes, such as transcription or expression products.
  • These genes belong to the second chromosomal zone of the invention which is delimited on chromosome 5 by the microsatelhtes markers D5S2115 and D5S422. This area will be more particularly called “second chromosomal area of the invention”.
  • the genes mentioned will be more particularly called the genes of the invention of chromosome 5.
  • the invention relates to the genes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 and ENS300 chromosome identified by the inventors as being involved in premature canities and the uses of products derived from these genes, such as transcription or expression products.
  • These genes belong to the third chromosomal zone of the invention which is dehmited on chromosome 11 by the microsatellite markers D11S898 and D11S925. This zone will more particularly be called "third chromosomal zone of the invention".
  • the 18 genes mentioned will be more particularly called the 28 genes of the invention of chromosome 11.
  • the present invention covers polynucleotide fragments having a minimum length of 18 nucleotides, corresponding at least partially to one of the genes of the invention, these DNA fragments having the functional characteristic of 'be involved in canities, or in premature canities, and possibly in both phenomena.
  • a fragment involved in canities or early canities and having a sequence meeting the requirements mentioned above can be used in therapy.
  • the first aspect of the invention relates to the genes of human chromosome 3 identified by the inventors as being involved in premature canities.
  • a fragment as covered by the invention has a sequence corresponding to all or part of a gene from human chromosome 3 chosen from the genes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 and AL133097. These genes are included in the first chromosomal area of the invention which is delimited on chromosome 3 by the microsatelhtes markers D3S1277 and D3S1285.
  • the second aspect of the invention relates to the genes of human chromosome 5 identified by the inventors as being involved in premature canities.
  • a fragment as covered by the invention has a sequence corresponding to all or part of a gene from human chromosome 5 chosen from the genes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B , PCDHAI to PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNTIO and FLJ11715.
  • These genes are included in the second chromosomal zone of the invention which is delimited on chromosome 5 by the microsatellite markers D5S2115 and D5S422.
  • the third aspect of the invention relates to the genes of human chromosome 11 identified by the inventors as being involved in premature canities.
  • a fragment as covered by the invention has a sequence corresponding to all or part of a gene from human chromosome 11 chosen from the genes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536 , FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 and ENS300650.
  • the polynucleotide fragment referred to in the context of the invention corresponds to a fragment of a chromosome. This fragment has a minimum length of 18 nucleotides, and a maximum length which can go up to the total length of the gene in question, or of several genes of the invention. Preferably, the fragment has a number of nucleotides greater than 18. A particularly preferred length is between 18 and 10,000 nucleotides, preferably between 30 and 8000 nucleotides.
  • fragments whose length is between 30 and 5000 nucleotides, preferably between 50 and 3000 nucleotides, for example between 100 and 2000 nucleotides, or between 200 and 1000 nucleotides.
  • the invention also relates to the use in cosmetics or in therapy of a polynucleotide fragment or of the expression product of a fragment or of an agent modulating the function of a fragment, or else of an agent modulating the function of the expression product of a fragment, where the fragment in question corresponds to all or part of a gene from chromosome 11 chosen from the genes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535 , DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 and ENS300650, or all or part of a gene from chromosome 5 chosen from the genes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFB, HSP PCDHAI to PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOF
  • products of the invention the fragment, the expression product of a fragment, the agent modulating the function of a fragment, and the agent modulating the function of expression of a polynucleotide fragment corresponding to all or part of one of the genes of the invention.
  • the present invention relates first of all to uses in the field of cosmetics.
  • Cosmetic means any application which only tends to modify the aesthetic and has no therapeutic aim.
  • the product of the invention can be packaged in different suitable forms, alone or in combination with other agents.
  • preferred forms are intended for local applications and they relate to creams, lotions, gels, emulsions, ointments and shampoos.
  • Other forms can also be envisaged for uses according to the invention, in particular in the form of pills for oral administration.
  • a particularly preferred field is that of pigmentation.
  • the pigmentation can be that of the skin or of the integuments. It can be the color of the pigmentation as well as the absence of pigmentation; problems relating to the quality and intensity of pigmentation are also concerned with the present invention.
  • the subject of the invention relates to the use of at least one product of the invention to prevent and / or limit and / or stop the development of canities.
  • the object of the invention also relates to the use of at least one product of the invention to promote the natural pigmentation of hair and / or gray hair.
  • Another object of the present invention relates to a cosmetic treatment process for canities characterized in that a composition comprising at least one product of the invention is applied to the area to be treated.
  • the invention also relates to a cosmetic treatment process intended to promote the natural pigmentation of gray and white hair and / or body hair, characterized in that a composition comprising at least one product of the invention is applied to the area to be treated . . -; - •
  • the areas to be treated can be, for example and without any limitation, the scalp, the eyebrows, the mustache and / or the beard. . ⁇ -. • More particularly, the methods for treating canities and natural pigmentation of gray or white hair and / or hair consist in applying a composition comprising at least one product of the invention.
  • the treatment methods for combating canities and / or for stimulating the natural pigmentation of gray and white hair and / or body hair may for example consist in applying the composition to the hair and the scalp, in the evening, keeping the entire composition. at night in contact and optionally carry out a shampoo in the morning or wash the hair using this composition and leave it in contact again for a few minutes before rinsing.
  • the composition according to the invention has proved to be particularly advantageous when it is applied in the form of a hair lotion, optionally rinsed or even in the form of a shampoo.
  • the present invention relates to therapeutic uses in the field of pigmentation.
  • the type of pigmentation which must be modified relates to the pigmentation of the integuments, in particular the nails or the hairs.
  • the pigmentation whose characteristics one seeks to modify is that of the hair system in general and of the hair, mustache and eyebrows in particular.
  • the present invention makes it possible to modify the phenomenon of stopping the pigmentation of the hair, that is to say, canities, in particular when the latter occurs prematurely in a person and when we speak of premature canities.
  • the active products used in the composition of a medicament are preferably associated with pharmaceutically acceptable excipients.
  • All the routes of administration considered acceptable can be used within the framework of the invention, in particular intradermal, intravenous, muscular, oral, otic, nasal, optical route.
  • the formulation is preferably adapted to the chosen route of administration.
  • the uses for the manufacture of a medicament according to the invention can include other active ingredients in their formulation.
  • administration of a medicament as defined in the invention can be combined with the administration of another medicament, whether this administration is simultaneous, sequential or separate.
  • the various products which are used within the framework of uses in therapy can be combined and enter into the composition of a single medicament or else can be used for the manufacture of different medicaments.
  • they form part of the composition of separate drugs they can be administered at different frequencies.
  • the preferred characteristics and variants of the products which are used in the uses according to the invention may be identical in the context of uses in cosmetology and for uses of the same product in the manufacture of a medicament.
  • the use of products according to the invention may require that the product be introduced into a body fluid, or into tissues, or into cells.
  • the product is active in the cytoplasm of the cells, or else in the cell nucleus.
  • the first use, cosmetic or therapeutic, envisaged in the context of the invention is the use of a polynucleotide fragment whose sequence corresponds, at least in part, to one of the genes of the invention.
  • the polynucleotide fragment is used in the manufacture of a medicament.
  • this polynucleotide fragment can be a DNA molecule, single or double strand, circular or linear, an RNA molecule drunk from any other molecule envisaged in the definition of polynucleotide fragment given above.
  • this fragment can be or be part of a plasmid, a viral genome or another type of vector. It can, in other cases, be part of the genome of a cell, or else of a cell genetically modified to contain this fragment in its genome. It can also be an isolated molecule.
  • the fragment is preferably under the control of regulatory sequences.
  • said vector preferably comprises all the sequences necessary for transcription and optionally translation of the fragment.
  • This fragment can also be surrounded by flanking regions allowing a step of homologous recombination with another polynucleotide fragment, possibly leading to the insertion of the fragment of the invention in the genomic DNA of a target cell.
  • the polynucleotide fragment as described may be in natural form or else be of a synthetic nature, or else be partly one and partly the other, in particular if it is a “duplex” molecule constituted of two strands with different origins.
  • the polynucleotide fragment can be isolated, it can have undergone a purification step. It can also be a recombinant fragment, for example synthesized in another organism. According to a preferred example, it is a DNA fragment which has been amplified by PCR (Polymerization Chain Reaction) and then purified.
  • the first use makes use of a polynucleotide fragment associated with a probe.
  • This characteristic can make it possible, among other things, to follow the location of the fragment, from the extracellular medium to the cell, or from the cytoplasm to the nucleus, or else to specify its interaction with DNA, or RNA or proteins.
  • the probe can also make it possible to follow the degradation of the fragment.
  • the nature of the probe is preferably fluorescent, radioactive or enzymatic. Those skilled in the art will know which probe is best suited as a function of the characteristic that they want to be able to follow.
  • polynucleotide fragment which is used in the context of this first use according to the invention, can be used in a hybridization test, sequencing, microsequencing or else a test for detection of mismatching.
  • This fragment according to the invention contains at least 18 successive nucleotides, these
  • a fragment according to the invention may contain only 18 bases complementary to 18 successive bases of one of the genes of the invention.
  • the fragment described can be the cDNA or the RNA of one of the genes previously described. It can correspond to one or more exons of one of the genes of the invention, it can correspond to a regulatory sequence of one of these genes identified on chromosomes 3, 5 and 11.
  • the number of polynucleotide fragments as defined above is not limited and is not necessarily limited to one.
  • polynucleotide fragments whose sequence corresponds, at least in part, to one of the genes of the invention within the chromosomal regions of the invention.
  • sequences of the different fragments correspond to distinct genes of the invention or to distinct exons.
  • This first use according to the invention is preferably in the field of cosmetics.
  • the first use described involves a genetic modification, whether it is induced by a nucleotide fragment as described or not.
  • this first use according to the invention makes it possible to restore the function of this gene by introducing a polynucleotide fragment which represents a new wild copy of the defective endogenous gene.
  • this first use according to the invention makes it possible to abolish the function of this gene by introducing an antisense RNA which will block the translation of said gene.
  • a second use envisaged by the present invention is the use of an agent modulating the function of a DNA fragment corresponding at least in part to a gene chosen from the genes of the invention.
  • the agent thus defined is used in the manufacture of a medicament.
  • the DNA fragment has at least 18 nucleotides.
  • Such an agent according to the invention may be capable of modulating the function of an exogenous DNA fragment of which part of the sequence corresponds to one of the genes of the invention identified by the inventors, or else it may be capable modulate the function of an endogenous sequence included in one of these genes of the invention.
  • an agent serving for this second use according to the invention modulates not only the function of an exogenous DNA fragment as defined, but also of the corresponding endogenous DNA fragment.
  • the DNA fragment whose function is modulated can partially correspond to one of the 5 genes of the invention of chromosome 3.
  • the DNA fragment whose function is modulated can partially correspond to one of the genes of the invention of chromosome 5, or one of the 18 genes of the invention of chromosome 11.
  • it may be a plasmid having only a short sequence corresponding to one of the genes mentioned.
  • the sequence correspondence is established on at least 18 successive nucleotides.
  • modulating such a function consists in promoting or inhibiting the capacity of said fragment to be transcribed. It can also consist in modifying the site of initiation and termination of transcription, or else in modifying the rate of initiation of transcription. In another case, modulating the function can also consist in modifying the splicing of the RNA, for example by modifying the DNA recognition signals responsible for the distribution between introns and exons.
  • modifying its function can consist of inhibiting the binding of enhancers or inhibitors. On the contrary, it may consist in promoting their fixation, or else in promoting the fixation of other transcription factors. It is the same when it comes to sequences used by RNA polymerase.
  • the number of products, in this case agents modulating the function of a DNA fragment corresponding at least in part to one of the genes of the invention is not limited and may be greater than one.
  • the various agents which are used have in common all modulating the function of DNA fragments whose sequence belongs to or corresponds to at least part of the same chromosomal region of l 'invention.
  • this region is that of the human chromosome 3 identified by the inventors.
  • the chromosomal region in question is that identified by the inventors on chromosomes 5 and 11 respectively.
  • the different agents can modulate the same gene from one of the regions, or else different genes within a region of the invention.
  • Agents according to the invention are, for example, single-stranded DNA molecules capable of binding to defined subregions of one of the genes of the invention, to form triple helices. Under these conditions, agents according to the invention abolish the function of the sub-region to which they hybridize.
  • agents according to the invention are preferably polypeptides capable of interacting with defined sub-regions of one of the genes of the invention.
  • agents according to the invention are enhancers or inhibitors which bind to regions regulators of one of the genes of the invention of human chromosome 3, or of one of those of human chromosome 5, or of one of those of chromosome 11.
  • Another category of agents according to the invention relates to molecules capable of interacting with precise regions of DNA to change its conformation.
  • Another category relates to molecules interacting with inhibitors or enhancers to modify their function, inhibitors or enhancers having the initial function of modifying the expression of DNA fragments belonging to one of the genes of the invention.
  • An agent which is used according to this second use of the invention can in particular modulate the function of a DNA fragment corresponding to 18 successive bases of one of the genes previously described.
  • This second use according to the invention is preferably in the field of cosmetics. This use can also allow the manufacture of a medicament for a therapeutic action, in the field of pigmentation. ",
  • the second use described involves a genetic modification, whether it is induced by an agent modulating the function of a DNA fragment as described or not.
  • this second use according to the invention makes it possible to abolish the function of this gene by introducing an agent which will block the translation of said gene by binding, for example , to its promoter region.
  • this second use according to the invention makes it possible to restore the function of this gene by introducing an agent which will activate the transcription of said gene, for example by binding to its promoter region, or else by attaching itself to a possible inhibitor which will thereby cease inactivating said gene.
  • a third use envisaged by the present invention is the use of an agent modulating the function of the expression product of a DNA fragment corresponding at least in part to one of the genes of the invention.
  • the agent thus defined is used in the manufacture of a medicament.
  • the DNA fragment has at least 18 nucleotides.
  • an agent according to the invention modulates the function of a transcript derived from a DNA fragment corresponding at least in part to one of the 5 genes of the invention of chromosome 3.
  • an agent according to the invention modulates the function of a polypeptide resulting from the translation of one of the transcripts mentioned.
  • the DNA fragment whose function of the expression product is modulated can correspond at least in part to a gene of the invention of chromosome 5, or else to a gene of the invention of chromosome 11.
  • Such an agent according to the invention may be capable of modulating the function of the expression product of an exogenous DNA fragment of which part of the sequence corresponds to one of the genes of the invention identified by the inventors, or although it may be able to modulate the function of the expression product of an endogenous sequence of one of these genes of the invention.
  • an agent serving for this third use according to the invention modulates not only the function of an expression product of an exogenous DNA fragment as defined, but also of the corresponding endogenous DNA fragment.
  • Modulating the function of a polypeptide can be achieved in different ways. In particular, it is possible to increase or decrease its activity, its yield, its specificity, its greed for an antibody, it is possible to modify its substrate for an enzyme, its conversion rate.
  • Agents according to the invention are preferably RNA molecules, called antisense RNA, which hybridize with at least one transcript derived from a DNA fragment corresponding at least in part to one of the genes of the invention.
  • Other agents fulfilling the same roles can be single-stranded DNA molecules, or hybrid DNA-RNA molecules.
  • the role of these agents according to the invention is preferably to promote, prevent, delay, accelerate or introduce errors in the translation of said transcript.
  • agents according to the invention belong to the class of polypeptides.
  • the invention relates to proteins capable of binding to said transcript and thus of modulating its translation.
  • agents from the class of polypeptides can be of natural or synthetic origin (synthesized chemically or by biotechnology). In particular, they may be antibodies.
  • this modulation can result in the action of promoting, preventing, delaying, accelerating or introducing errors in the translation of said transcript.
  • the interaction between the polypeptide and said transcript can constitute an obstacle to the normal fixation of ribosomes.
  • Agents as defined in the present invention can modulate the function of the protein encoded by a DNA fragment corresponding at least in part to one of the 5 genes of the invention of chromosome 3 or one of the genes of l invention of chromosome 5 or one of the 18 genes of invention of chromosome 11. These agents may or may not be protein in nature.
  • An agent according to the invention can intervene at an early stage by preventing the correct folding of the protein.
  • An agent according to the invention can also modify the function of said protein by modifying its three-dimensional structure after folding. It is also conceivable that this agent is an inhibitor of the protein, in particular a competitive inhibitor.
  • the agents which may be suitable in the context of the present invention are not limited to those mentioned above. *
  • the number of agents modifying the function of an expression product as defined above is not limited and is not necessarily limited to one.
  • the various agents which are used have in common all modulating the function of expression products of DNA fragments whose sequence belongs to or corresponds to at least part of a gene from the same chromosomal region of the invention.
  • this region is that of the human chromosome 3 identified by the inventors.
  • the chromosomal region in question is that identified by the inventors on chromosomes 5 and 11 respectively.
  • This third use according to the invention is preferably in the field of cosmetics. This use can also allow the manufacture of a medicament for a therapeutic action, in the field of pigmentation.
  • the third use described involves a genetic modification, whether it is induced by an agent modulating the function of the expression product of a DNA fragment as described or not.
  • this third use according to the invention makes it possible to abolish the function of this gene by introducing an antisense RNA which will block the translation of said gene by preventing the RNA-protein passage.
  • Another preferred situation consists in choosing for agent an antibody capable of binding to the protein resulting from the translation of said gene.
  • a fourth use envisaged by the present invention, in the field of therapy and in that of cosmetics, is the use of an expression product of a DNA fragment corresponding at least in part to one of the genes of the invention.
  • the agent thus defined is used in the manufacture of a medicament.
  • the DNA fragment has at least 18 nucleotides.
  • such an expression product is the RNA transcript derived from a DNA fragment corresponding at least in part to one of the 5 genes of the invention of chromosome 3, or else one of the genes of l he invention of chromosome 5, or one of the 18 genes for the invention of chromosome 11, whatever the stage of maturation of said transcript.
  • the transcript may therefore be smaller than the DNA fragment from which it originates.
  • the expression product is an RNA molecule, it contains at least 18 nucleotides.
  • an expression product according to the invention results from the translation of one of the transcripts mentioned.
  • Such an expression product can therefore contain less than 6 amino acids if the transcript from which it is derived has undergone splicing steps.
  • a peptide expression product contains at least 6 amino acids.
  • an expression product used according to the invention does not necessarily come from the steps of transcription or translation of genomic DNA.
  • an expression product used according to the invention may be an expression product derived from exogenous DNA of which at least part of the sequence corresponds to a part of one of the genes of the invention.
  • Expression products as used by the present invention are preferably RNA molecules, called antisense RNA, which hybridize with at least one transcript derived from a DNA fragment corresponding at least in part to the one of the genes of the invention.
  • antisense RNAs targeting a specific RNA it is possible to use RNAs derived from the transcription of the same DNA sequence as the target but not from the leader strand, but from its sequence complementary carried by the other strand. RNA fragments are thus obtained complementary to the target fragments normally synthesized by the cell.
  • the expected role of these expression products according to the invention is preferably to promote, prevent, delay, accelerate or introduce errors in the translation of the transcripts normally synthesized by the cell.
  • Other preferred expression products according to the invention belong to the class of polypeptides.
  • the invention relates to proteins capable of introducing a change in the functioning of the cell in which they act.
  • the number of products of expression of a DNA fragment whose sequence belongs to or corresponds at least in part to one of the genes of the invention is not limited and may be greater than one.
  • the various products which are used have in common that they are all products of expression of DNA fragments whose sequence belongs to or corresponds to at least part of a gene. of the same chromosomal region of the invention.
  • this region is that of the human chromosome 3 identified by the inventors.
  • the chromosomal region in question is that identified by the inventors on chromosomes 5 and 11 respectively.
  • This fourth use according to the invention is preferably in the field of cosmetics. This use can also allow the manufacture of a medicament for a therapeutic action, in the field of pigmentation.
  • the fourth use described involves a genetic modification, whether it is induced by an expression product of a DNA fragment as described or not.
  • this fourth use according to the invention makes it possible to abolish the function of this gene by introducing an antisense RNA which will block the translation of said gene by fixing itself , to the transcript synthesized by the cell.
  • this fourth use according to the invention makes it possible to restore the function of this gene by introducing into the cell or else an RNA molecule allowing the synthesis of the protein. encoded by the gene or the protein encoded by the gene.
  • the cosmetic uses are preferably in the field of pigmentation.
  • the product of the invention can be incorporated into a cosmetic or pharmaceutical composition.
  • Such a composition comprises, in a pharmaceutically or cosmetically acceptable medium, an amount of products of the invention of between 0.001 and 10% by weight by volume.
  • composition can be administered orally or applied to the skin (on any cutaneous zone of the body) and / or the scalp or the hair.
  • the composition may contain the product or products of the invention in solution in a food liquid such as an aqueous or hydroalcoholic solution, optionally flavored. They can also be incorporated in a solid ingestible excipient and be presented for example in the form of granules, pills, tablets or dragees. They can also be placed in solution in a liquid food itself possibly packaged in ingestible capsules.
  • a food liquid such as an aqueous or hydroalcoholic solution
  • a solid ingestible excipient and be presented for example in the form of granules, pills, tablets or dragees. They can also be placed in solution in a liquid food itself possibly packaged in ingestible capsules.
  • the composition may be in all the dosage forms normally used, particularly in cosmetology.
  • a preferred composition of the invention is a cosmetic composition suitable for topical application to the scalp and / or the skin.
  • the composition which can be used can in particular be in the form of an aqueous, hydroalcoholic or oily solution or of dispersion of the lotion or serum type, of emulsions of liquid or semi-liquid consistency of the milk type, obtained by dispersion of '' an oily phase in an aqueous phase (O / W) or vice versa (W / O), or suspensions or emulsions of soft consistency of the aqueous or anhydrous cream or gel type, or alternatively of microcapsules or microparticles, or of vesicular dispersions of ionic and / or non-ionic type.
  • ointment can thus be in the form of an ointment, a tincture, a cream, an ointment, a powder, a patch, a soaked tampon, a solution, an emulsion or a vesicular dispersion, a lotion, a gel, a spray, suspension, shampoo, aerosol or foam.
  • ointment can be in the form of an ointment, a tincture, a cream, an ointment, a powder, a patch, a soaked tampon, a solution, an emulsion or a vesicular dispersion, a lotion, a gel, a spray, suspension, shampoo, aerosol or foam.
  • They can be anhydrous or aqueous. It can also consist of solid preparations constituting soaps or cleaning bars.
  • compositions are prepared according to the usual methods.
  • the composition may in particular be a composition for hair care, and in particular a shampoo, a styling lotion, a treatment lotion, a styling cream or gel, a composition of dyes (in particular oxidation dyes) optionally in the form of coloring shampoos, restructuring hair lotions, masks.
  • the composition will preferably be a cream, a hair lotion, a shampoo or a conditioner.
  • the amounts of the various constituents of the compositions which can be used are those conventionally used in the fields under consideration.
  • the proportion of the fatty phase can range from 5% to 80% by weight, and preferably from 5% to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the oils, waxes, emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition in the form of an emulsion are chosen from those conventionally used in the cosmetic field.
  • the emulsifier and the co-emulsifier are present in the composition in a proportion ranging from 0.3% to 30% by weight, and preferably from 0.5 to 20% by weight relative to the total weight of the composition .
  • the emulsion can, in addition, contain lipid vesicles.
  • the fatty phase can represent more than
  • the composition will be such that the product or products of the invention are encapsulated in a coating such as microspheres, nanospheres, oleosomes or nanocapsules, the coating will be chosen according to the chemical nature of the product of the invention.
  • the microspheres can be prepared according to the method described in patent application EP 0 375 520.
  • the nanospheres can be in the form of an aqueous suspension and can be prepared according to the methods described in patent applications FR 0015686 and FR 0101438.
  • Oleosomes consist of an oil-in-water emulsion formed by oily globules provided with a lamellar liquid crystal coating. dispersed in an aqueous phase (see patent applications EP 0641 557 and EP 0705 593).
  • the products of the invention can also be encapsulated in nanocapsules consisting of a lamellar coating obtained from a silicone surfactant (see patent application EP 0 780 115), the nanocapsules can also be prepared based on polyesters hydrodispersible sulfonic (see patent application FR 0113337).
  • the products of the invention may also be complexed on the surface of cationic oily globules, whatever their size (see patent applications EP 1 010 413, EP 1 010 414, EP 1 010 415, EP 1 010 416, EP 1 013 338 , EP 1 016453, EP 1 018 363, EP 1 020 219, EP 1 025 898, EP 1 120 101, EP 1 120 102, EP 1 129 684, EP 1 160005 and EP 1 172 077).
  • the products of the invention can finally be complexed on the surface of nanocapsules or nanoparticles provided with a lamellar coating (see EP 0447 318 and EP 0 557489) and containing a cationic surfactant on the surface (see the references cited above for cationic surfactants).
  • compositions such as the coating of the product or products of the invention will have a diameter less than or equal to 10 ⁇ m.
  • the composition can also contain adjuvants customary in the cosmetic field, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic additives, preservatives, antioxidants, solvents, perfumes, fillers, filters, odor absorbers and coloring matters.
  • adjuvants customary in the cosmetic field such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic additives, preservatives, antioxidants, solvents, perfumes, fillers, filters, odor absorbers and coloring matters.
  • the amounts of these various adjuvants are those conventionally used in the cosmetic field, and for example from 0.01% to 10% of the total weight of the composition.
  • These adjuvants depending on their nature, can be introduced into the fatty phase, into the aqueous phase and / or into the lipid spherules.
  • solvents which can be used, mention may be made of lower alcohols, in particular ethanol and isopropanol, propylene glycol.
  • hydrophilic gelling agents which can be used, mention may be made of carboxyvinyl polymers (carbomers), acrylic copolymers such as acrylate / alkyl acrylate copolymers, polyacrylamides, polysaccharides such as hydroxypropylcellulose, natural gums and clays, and, as gelling agents lipophilic- mention may be made of modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids such as aluminum stearates and hydrophobic silica, ethylcellulose, polyethylene.
  • the compositions can combine at least one product of the invention with other active agents.
  • active agents there may be mentioned by way of example:
  • agents modulating the differentiation and / or proliferation and / or pigmentation of skin cells such as retinol and its esters, vitamin D and its derivatives, estrogens such as Toestradiol, cAMP modulators such as POMC derivatives, adenosine, or forskolin and its derivatives, prostaglandins and their derivatives, triiodotrionine and its derivatives; ;
  • - extracts of microorganisms - anti-free radical agents such as -tocopherol or its esters, superoxide dismutases or its mimetics, certain metal chelators or ascorbic acid and its esters;
  • anti-seborrhoeics such as certain sulfur amino acids, 13-cis retinoic acid, cyproterone acetate; - other agents for combating scalp conditions such as zinc pyrithione, selenium disulfide, climbazole, undecylenic acid, Ketoconazole, lapiroctone olamine (octopirox) or ciclopiroctone (ciclopirox); in particular, it may be active stimulating regrowth and / or promoting the slowing down of hair loss, we can more particularly cite without limitation:
  • - nicotinic acid esters including in particular tocopherol nicotinate, benzyl nicotinate and C1-C6 alkyl nicotinates such as methyl or hexyl nicotinates; - pyrimidine derivatives, such as 2,4-diamino 6-piperidmopyrimidine 3-oxide or "Minoxidii” described in US patents 4,139,619 and US 4,596,812;
  • antibacterial agents such as macrolides, pyranosides and tetracyclines, and in particular l ⁇ rythromycin;
  • - calcium antagonist agents such as Cinnarizine, Nimodipine and Nifedipine
  • - hormones such as estriol or analogues, or thyroxine and its salts
  • - antiandrogenic agents such as oxendolone, spironolactone and flutamide
  • - ATP-dependent potassium channel agonists such as cromakalim and nicorandil.
  • the present invention relates to methods for diagnosing a predisposition to premature canities in an individual.
  • premature canities is a phenotype which has been defined by the inventors as being, inter alia, characterized by the appearance of the first white hairs early in life, and preferably around the age of 18 years. As this phenotype is passed on to the next generation, it may be important for individuals with a relative or loved one to determine before symptoms appear whether or not they will be affected.
  • the diagnostic method according to the invention is perfectly suited to individuals under the age of 18 years.
  • a method for determining a predisposition to premature canities includes a first step of selecting one or more markers which will be used in the following steps.
  • marker is meant a sequence DNA whose various allelic variations carry information.
  • Such a marker can be a short sequence of a gene whose mutation is the source of the phenotype. It can also be a marker physically located on the chromosome in a region very close to a gene involved in premature canities.
  • the marker is a SNP ('single nucleotide polymorphism').
  • the marker or markers selected belong to the region of human chromosome 3 comprising the genes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 and AL133097.
  • the markers are chosen as belonging to the sequence of one of these genes.
  • the marker or markers selected belong to the region of human chromosome 5 comprising the genes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI to PCDHAI 3, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, ALI 33039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO and FLJ11715.
  • the markers are chosen as belonging to the sequence of one of these genes.
  • the marker or markers selected belong to the region of human chromosome 11 comprising the genes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2 , ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 and ENS300650.
  • the markers are chosen as belonging to the sequence of one of these genes.
  • the next step in implementing a method according to the invention consists, for the marker or markers chosen, in determining the alleles present in a sample of genetic material originating from the individual who is undergoing the diagnostic test. Two different alleles, carried by the two versions of the chromosome, can be identified.
  • the sample containing the genetic material can be blood, a single drop being sufficient for the implementation of a method according to the invention.
  • Other samples of body fluids can be used in the context of the invention. It is also possible to use a few cells from the individual. Those skilled in the art will be able to determine which sample can be used in the context of this test, while minimizing the inconvenience for the individual undergoing it.
  • This diagnostic test could possibly be combined with other genetic tests. Current techniques, well known to the molecular biologist, can be used to determine the alleles of the marker or markers chosen; Hybridization tests are in particular very common in this kind of steps.
  • markers are potentially preferred in the context of the implementation of the method of the invention.
  • bi-allelic markers can prove to be particularly suitable if one allelic form reflects a predisposition to premature canities while the other allelic form reflects on the contrary the absence of such a predisposition.
  • Other more common markers are polymorphic and can be found in at least two allelic forms and generally more than two.
  • ar ⁇ arqueurs which can be selected at the first stage of the process of the invention, particularly well known markers are SNPs. When selecting the marker, it is very important to base yourself on the informative value of the marker polymorphism.
  • a particularly privileged situation consists in selecting a marker whose certain allelic variants reflect a predisposition to premature canities while all the other variants reflect on the contrary the absence of such a predisposition.
  • the marker does not entirely fulfill such a condition, that is to say that for example certain alleles are present preferentially but not exclusively in individuals predisposed to canities. In these situations, it may be very wise to select several markers, in order to establish a diagnostic test as reliable as possible.
  • the markers selected are SNPs
  • the different allelic variants correspond to the modification of a base.
  • a particularly advantageous situation to look for when selecting the marker corresponds to the situation where certain alleles (modification of a base) are characteristic of a predisposition to premature canities.
  • the marker or markers selected in the first step can be chosen from the SNPs of chromosome 3 mentioned in the summary table of Example 2.
  • the marker or markers selected in the first step can be chosen from the SNPs of chromosome 5 mentioned in the summary table of Example 2.
  • the marker or markers selected in the first step can be chosen from the SNPs of chromosome 11 mentioned in the summary table of Example 2.
  • the methods of the invention are not limited to the two stages described and may contain other stages before or after the two stages mentioned.
  • a method of the invention may comprise the additional step of comparing the allaque form of the selected marker or markers with the allaque form of this or these same markers in other individuals.
  • This additional comparison step may be necessary in order to establish the diagnosis.
  • it may be useful to make a comparison with the form of the marker (s) in individuals known to have premature canities and possibly also with the form of the marker (s) in individuals known to be free from such a predisposition. Since premature canities are a presumably multigenic disease, the causes of predisposition are numerous and can hardly be comprehensively considered.
  • some members of which were prematurely affected by canities it is very likely that the cause of the susceptibility is unique.
  • a comparison which is particularly rich in information is the comparison of the alleles of the marker of the individual undergoing the test with alleles of the same marker for people in his family whose phenotype is known. If several markers have been selected, it is preferable to repeat this operation for all the markers.
  • the present invention also relates to methods of screening for molecules having a particular effect.
  • the invention relates to a method of identifying molecules capable of modulating the function of a polynucleotide fragment.
  • the polynucleotide fragment whose function one seeks to modulate comprises at least 18 consecutive nucleotides whose sequence corresponds to all or part of a gene from human chromosome 3 chosen from. the KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 and AL133097 genes.
  • the polynucleotide fragment whose function is sought to modulate comprises at least 18 consecutive nucleotides whose sequence corresponds to all or part of a gene of human chromosome 5 chosen from the genes KLHL3, HNRPAO, CDC25C , EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI to PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO.
  • the polynucleotide fragment whose function one seeks to modulate comprises at least 18 consecutive nucleotides whose sequence corresponds to all or part of a gene from human chromosome 11 chosen from the genes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 and ENS300650.
  • the method of identifying molecules capable of modulating the function of one or other of these fragments comprises a step of bringing the test molecule and the polynucleotide fragment into the presence. Another step in the process is the detection of a variation in a parameter linked to the function of said fragment, for example the detection of a possible fixation of this molecule on the polynucleotide fragment demonstrated by a ligand detection technique.
  • the “second use according to the invention” is the use of an agent modulating the function of a DNA fragment corresponding at least in part to one of the genes of the invention.
  • the screening process identifies such agents.
  • Modulation of function may correspond to a decrease in the ability to be transcribed, or translated, or to a change in the ability to interact with other factors. Depending on the properties of said fragment used, a person skilled in the art is able to determine which parameter is the variation of which is easy to monitor.
  • the identification method of the invention is not limited to the steps previously described, other previous or later steps can be applied.
  • the present invention also covers the molecules identified by the method described above.
  • the present invention covers inhibitors of the functions of the polynucleotide fragments of the invention.
  • the present invention also relates to methods of screening molecules capable of modulating the function of the expression product of a polynucleotide fragment of the invention.
  • the expression product whose function one seeks to modulate is that of a DNA fragment belonging to and / or corresponding to all or part of one of the 5 genes of the invention of human chromosome 3.
  • the expression product whose function one seeks to modulate is that of a DNA fragment belonging and / or corresponding to all or part of one of the genes of the invention of human chromosome 5.
  • the expression product whose function is sought to modulate is that of a DNA fragment belonging to and / or corresponding to all or part of one of the 18 genes of human chromosome 11.
  • the DNA fragment comprises at least 18 nucleotides.
  • the method for identifying molecules capable of modulating the function of the expression product of a DNA fragment as described comprises a step of bringing the test molecule into contact with the expression product. Another step of the process is the detection of a variation of a parameter linked to the function of said expression product, for example the detection of a possible fixation of this molecule on the expression product demonstrated by a technique. ligand detection.
  • the expression product of a DNA fragment is understood to mean both the molecules, RNA resulting from the transcription of the fragment, at any stage of maturation, and the polypeptides resulting from translation, also at any stage of maturation.
  • RNA molecule different stages of maturation are represented by the presence or absence of the cap, of polyadenylated tail, for example.
  • stages of maturation of a polypeptide one includes inter alia the polypeptides before and after folding, before and after cleavage of the different addressing signals, with and without glycosylation, with and without disulfide bridges.
  • the functions fulfilled by the expression products of the DNA fragments they are very numerous and they depend on the nature of the expression product in question. Examples have already been given earlier in the present application.
  • the “third use according to the invention” is the use of an agent modulating the function of the expression product of a DNA fragment.
  • the screening process identifies such agents.
  • modulate the function of the expression product of a DNA fragment examples have already been given to define the third use according to the invention.
  • the identification method of the invention is not limited to the steps previously described, other previous or later steps can be applied.
  • the present invention also covers the molecules identified by the method described above. In particular, the present invention covers inhibitors of the functions of the expression products of the polynucleotide fragments of the invention.
  • the present invention also makes it possible to highlight the genes involved in the pigmentation of the skin, the hair and the integuments, within the three chromosomal zones of the invention.
  • a particular use envisaged by the present invention therefore consists in using SNPs markers within each of the chromosomal regions of interest with the aim of localizing more finely the genes involved in pigmentation, and more particularly those involved in the progressive interruption or sudden pigmentation of the skin or integuments.
  • the present invention is based on the identification by the inventors of genes, on chromosomes 3, 5 and 11 human, involved in the phenomenon of pigmentation or depigmentation. This genetic basis enabled them to envisage the uses in therapy and in cosmetics described; previously, as well as the diagnostic methods, illustrated above.
  • the particularly preferred uses are those which take advantage of the combination of the results obtained for the three chromosomal zones of the invention.
  • a first combination use in the field of cosmetics and therapy preferably makes use of at least two polynucleotide fragments, the sequence of each of which corresponds, at least in part, to that of one of the 5 genes of the invention of the human chromosome 3, or of that of one of the genes of the invention of the human chromosome 5, or of that of one of the 18 genes of the invention of the human chromosome 11.
  • use is therefore made of two or more fragments, the sequence of at least one corresponding, at least in part, to those previously mentioned on chromosomes 3, 5 and 11, the sequence of the other or others corresponding, at least in part, either to those previously mentioned on chromosomes 3, 5 and 11, or to that of a gene from human chromosome 6 chosen from the genes HLAG, NT_007592.445, NT_.007592.446, NT_007592.
  • Preferred genes are DDX31 and GTF3C4.
  • At least two have sequences corresponding to two distinct chromosomes, or to two distinct genes. It is also conceivable that for the same gene, the different fragments which are used have different chemical natures, for example DNA for the first fragment and RNA for the second. It is also conceivable that different fragments have a sequence corresponding to the same gene, but with the slight variations permitted by the definition of “correspondence sequences”, that is to say at most one different nucleotide in 10, preferably 1 in 100
  • the fragments contain at least 18 successive nucleotides, these 18 nucleotides forming the sequence which must correspond at least partially to one of the genes mentioned.
  • One of the fragments contains at least 18 successive nucleotides corresponding at least partially to one of the genes of the invention.
  • these two fragments are preferably carried by separate molecules. It is also conceivable that these two fragments are, for example, part of the same vector. According to a preferred case, the different fragments are of the same chemical nature, for example DNA for all the fragments.
  • the polynucleotide fragments are used in the manufacture of a medicament.
  • a second use of combination envisaged by the present invention, in the field of therapy and in that of cosmetics, is the use of a combination of at least two agents each modulating the function of a selected DNA fragment from the fragments belonging to and / or corresponding to all or part of one of the 5 genes of the invention of human chromosome 3, or of one of the genes of the invention of human chromosome 5, or of one of 18 genes for the invention of human chromosome 11.
  • a preferred use takes advantage of the results obtained on chromosomes 6 and 9. It is therefore advantageously made use of two or more agents, one at least modulating the function of a DNA fragment chosen from the fragments belonging and / or corresponding to all or part of the genes previously mentioned on chromosomes 3, 5 and 11, the other agent (s) each modulating the function of a DNA fragment chosen from the fragments belonging to and / or corresponding to all or part of a gene of the invention or a gene chosen from the genes HLAG, NT_007592.445, .NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB , HLA-DMAj BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_00759
  • Preferred genes are the DDX31 and GTF3C4 genes.
  • at least two modulate the function of DNA fragments corresponding to two distinct chromosomes, or two distinct genes. It is also conceivable that for the same chromosomal zone, the different agents which are used modulate different functions of the same DNA fragment.
  • the DNA fragments whose function is modulated according to the invention preferably contain at least 18 successive nucleotides, these 18 nucleotides forming the sequence which must correspond at least partially to one of the genes mentioned.
  • One of the fragments contains at least 18 successive nucleotides corresponding at least partially to one of the genes of the invention. All the preferred uses of such agents have already been explained in detail in the section describing the second use according to the invention.
  • a third combination use envisaged by the present invention is the use of a combination of at least two agents each modulating the function of the expression product of a DNA fragment chosen from the fragments belonging to and / or corresponding to all or part of one of the 5 genes of the invention of human chromosome 3, or of one of the genes of invention of human chromosome 5, or alternatively d one of the 18 genes of the invention of human chromosome 11.
  • a preferred use takes advantage of the results obtained on chromosomes 6 and 9. It is therefore advantageously made use of two or more agents, one at least modulating the function of the expression product of a DNA fragment chosen from fragments belonging to and / or corresponding to all or part of the genes; of the invention on chromosomes 3, 5 and 11, the other agent (s) each modulating the function of the expression product of a chosen DNA fragment among, the fragments belonging to and / or corresponding to all or part of the previously mentioned genes, or else to all or part of a gene chosen from the genes HLAG, NT_007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592 .508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638,
  • n592.459 007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 and Q96MA6.
  • Preferred genes are the DDX31 and GTF3C4 genes.
  • the different agents which are used modulate different functions of the same product of expression of a DNA fragment, or else modulate different products of expression of a DNA fragment, for example RNAs at different stages of maturation, or else RNAs from different splices.
  • the DNA fragments whose function of the expression product is modulated according to the invention preferably contain at least 18 successive nucleotides, these 18 nucleotides forming the sequence which must correspond at least partially to one of the genes mentioned.
  • One of the fragments contains at least 18 successive nucleotides corresponding at least partially to one of the genes of the invention. All the preferred uses of such agents have already been explained in detail in the section describing the third use according to the invention.
  • a fourth combination use envisaged by the present invention is the use of a combination of at least two expression products of DNA fragments chosen from the fragments belonging to and / or corresponding to all or part of one of the 5 genes of the invention of human chromosome 3, or of one of the genes of the invention of human chromosome 5, or of one of the 18 genes of l invention of human chromosome 11.
  • a preferred use takes advantage of the results obtained on chromosomes 6 and 9. It is therefore advantageously made use of two or more expression products, at least one of which is the expression product of a DNA fragment chosen from the fragments belonging to and / or corresponding to all or part of one of the genes of the invention, the others being each the product of expression of a DNA fragment chosen from the fragments belonging and / or corresponding to any or part of a gene of the invention or of a gene chosen from the genes HLAG, NT_007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8 , HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FR
  • the various expression products which are used are derived from DNA fragments corresponding to two distinct chromosomes, or to two distinct genes. It is also possible to envisage that for the same chromosomal area of the invention, the different expression products which are used are derived from the same DNA fragment, it may for example be RNA at different stages of maturation, or RNA from different splices. The same possibilities are offered for the polypeptides resulting from the translation of RNAs.
  • the DNA fragments whose expression products are used according to the invention preferably contain at least 18 successive nucleotides, these 18 nucleotides forming the sequence which must correspond at least partially to one of the genes mentioned.
  • One of the fragments contains at least 18 successive nucleotides corresponding at least partially to one of the genes of the invention.
  • the expression products are used in the manufacture of a medicament.
  • the cosmetic uses are preferably in the field of pigmentation.
  • a very interesting combination comprises at least one polynucleotide fragment or an expression product of a sequence corresponding to all or part of the DDX31 or GTF3C4 gene of the human chromosome 9. . ; ⁇ • ,
  • the present invention also relates to combination methods. These methods are used to determine a possible predisposition to premature canities.
  • a combination method for determining a predisposition to premature canities includes a first step of selecting at least two markers which will be used in the following steps.
  • the markers selected are chosen from markers belonging to the region of human chromosome 3 comprising the genes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 and AL133097, the markers belonging to the region of human chromosome 5 comprising the genes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI to PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO and FLJ1115 region markers 11 human including the genes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF
  • markers belong to one of these genes.
  • at least one of the markers selected is chosen from the markers belonging to one of the regions previously mentioned on chromosomes 3, 5 and 11, the other marker or markers selected belonging to the chromosomal regions previously mentioned, or that of chromosome 6 human between the markers D6S1629 and D6S257, or that of human chromosome 9 between the marker D9S290 and the telomeric region (telomer of the long arm).
  • the markers are preferably within a gene chosen from the genes HLAG, NT_ 007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22 , BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5 , CEL, CELL, FS, ABO, BARLHl, DDX31, GTF3C4 and Q96MA6.
  • Preferred genes are the DDX31 and GTF3C4 genes.
  • at least two do not belong to the same
  • the next step in implementing a method according to the invention consists, for the markers chosen, in determining the alleles present> in a sample of genetic material derived from; the individual undergoing the diagnostic test? Of them. different alleles, carried by the two versions of the chromosome, can be identified.
  • the combinations of the invention can be incorporated into a cosmetic or pharmaceutical composition as described above.
  • a method of combining the invention may include the additional step of comparing the allaque form of the selected markers with the allaque form of these same markers in other individuals.
  • This additional comparison step may be necessary in order to establish the diagnosis.
  • it may be useful to make a comparison with the shape of the markers in individuals known to have premature canities and possibly also with the shape of the markers in individuals known to be free from such a predisposition.
  • a particularly interesting situation consists in comparing the alleles of markers selected for alleles of these same markers in other individuals of the same family as the individual to be diagnosed.
  • the present invention finally makes it possible to highlight the genes involved in the pigmentation of the skin, hair and integuments, within the five chromosomal zones mentioned.
  • a particular use envisaged by the present invention therefore consists in using a combination of the SNPs markers within each of the chromosomal regions of interest with the aim of localizing more finely the genes involved in pigmentation, and more particularly those involved in the interruption. progressive or sudden pigmentation of the skin or integuments.
  • the present invention relates to a kit comprising a combination of at least two polynucleotide fragments chosen from those comprising at least 18 consecutive nucleotides whose sequence corresponds to all or part of one of the 5 genes of the invention of human chromosome 3, or one of the genes of the invention of human chromosome 5,. or one of the 18 genes of the invention of human chromosome 11.
  • the kit comprises two or more fragments, the sequence of at least one corresponding, at least in part, to those previously mentioned on chromosomes 3, 5 and 11, the sequence of the other or of each of the others corresponding, at least in part, or to those previously mentioned, or else to that of a gene chosen from the genes HLAG, NT_007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.
  • NT_030046.17 GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLHl, DDX31, GTF3C4 and Q96MA6.
  • Preferred genes are the DDX31 and GTF3C4 genes.
  • Figure 1 Composition of families analyzed for linkage with the candidate region
  • Figure 2 Candidate region for PC on chromosome 3: Chromosomal location and distribution of markers
  • Figure 3 Graphical representation of the NPL scores obtained for the non-parametric multi-point global genome linkage analysis on the CP families for the chromosomes selected.
  • FIG.A Chromosomes 3 and 5;
  • Figure 3B Chromosomes 6 and 9
  • FIG. 3C Chromosomel 1
  • Figure 4 Schematic representation of the CP loci identified on chromosomes 11,
  • FIG. 4A Chromosome 11, locus 11 ql4-q22
  • Figure 4B Chromosome 5, locus 5q31-q32 - ”.
  • FIG. 4C Chromosome 3, locus 3pl4.1-pl2.3
  • FIG. 4D Chromosome 6, locus6p21 -p 12
  • Figure 4E Chromosome 9, locus 9q34
  • the columns display the average Lod score, the standard deviation, the minimum Lod score, the maximum Lod score and the group (A-E) in which the family places themselves according to their score.
  • Figure 6 Potential Lod scores by family as a function of the rate of genetic heterogeneity in PC.
  • Figure 7 Lod scores detailed by family as a function of the rate of genetic heterogeneity of the PC: new simulation after collection of the new families.
  • Figure 8 New simulation on the finalized families for the search for candidate chromosomal regions. Lod potential scores depending on the rate of heterogeneity.
  • Figure 10 Comparison of the composition of families between the candidate-region analysis and the Genome-global analysis.
  • Figure 11 Potential Lod scores as a function of the rate of heterogeneity of the PC. The results are expressed by family.
  • Figure 12 Probability (in%) of reaching or exceeding a Lod score of 1, 2 or 3 for each rate of heterogeneity. The results are expressed by family.
  • Figure 13 Composition of the 4 pools.
  • the AI and Ail pools are made up of individuals with premature canities.
  • the two control pools BI and BH are composed of “crossed” individuals for origin and age with individuals suffering from premature canities.
  • PC premature canities
  • A- Epoch 1 Determination of the potential of the study. A first selection of the most informative families is carried out by a simulation of link analysis.
  • B- Epoch 2 Medical confirmation of phenotypes and collection of blood samples from preselected families. This verification campaign results in a new list of families applying for the study. A new simulation of connection makes it possible to estimate the potential of F corrected sample.
  • C- Epoch 3 Analysis of genetic link with the candidate chromosomal region for PC. First phase of DNA analysis for the chromosomal region which could contain the CP genes.
  • D- Epoch 4 Analysis of global genetic linkage of PC on the whole human genome. Analysis of family segregations on the DNA of the 22 autosomal chromosomes and the X chromosome in order to detect the regions that bind to the CP trait.
  • A- Epoch 1 Choice of families with the help of link analysis simulation
  • Twenty-nine families among the 65 were selected, based on structural criteria (total number of individuals, affected, available), to be analyzed in simulation.
  • a) software generates a series of replicates of the code file by assigning simulated genotypes. The file obtained for each family explores several allelic combinations (genotypes) in each of the individuals, b) software then analyzes each of the replicates to estimate the possible Lod scores (Z) for genetic link analysis in each family.
  • the results, in the form of minimum, average and maximum Lod scores thus make it possible to assess the potential of each family in this type of study. Obviously, these estimates only remain valid in the case where each individual has been assigned a correct phenotype.
  • the phenotype In case of uncertainty, the phenotype should be reported as unknown; it is therefore not taken into account in the study and therefore does not need to be sampled.
  • the Lod score decreases (in variable proportions) each time an individual is removed for an uncertain phenotype.
  • the family trees have been redesigned using pedigree management software, which also builds coded files (prephnk files) for genetic linkage analysis.
  • coded files prephnk files
  • an availability code (cd) (table 1) is assigned. It therefore weighs, by a code of 0 to 3, the informative nature of each individual in the study.
  • the following criteria have been defined for assigning the phenotype according to age in individuals under 30 years of age. However, during the final clinical examination, it is desirable that the definition of the phenotype be more quantitative.
  • the number of replications was finally fixed at 200. • •, The frequency of the trait a was set at 1%. The number of possible alleles for the genotype is fixed at 6 with an equivalent frequency for each.
  • Table 3 gives an indication of the potential of the GENORMAX families as a function of the maximum Lod score (Zmax) achieved (group A-E).
  • Figure 5 reports the simulated Lod score for each family.
  • Table 3 Family statistics / maximum Lod scores. The detailed results are shown in the table in Figure 5.
  • the maximum Lod score can only be reached when a DNA marker is 100% informative in a family. Most often, even with the type of markers used (the most informative markers in the chromosomal regions to be visited), the Lod score will not reach its maximum value.
  • Table 4 Lod score obtained for a series of distances from the marker to the trait locus (Lod score maximum in bold).
  • the families of group A will be informative in a genetic linkage analysis for the localization of the genes of premature canities. For this, no uncertainty should remain regarding the phenotype. When in doubt, it is advisable to exclude individuals or even families from the study. However, in some of these families, the high proportion of affected / unaffected individuals (sometimes all affected children) should encourage extreme distrust of the genetic trait at 100% of the trait. Of course, it is not excluded that in certain families, the CP gene was transmitted simultaneously by the paternal and maternal branches of the first generation. In this case, the small children would all be affected (Can28, 43, 53 ). In order to be able to positively consider these few families, it is highly desirable to verify this hypothesis.
  • group B The families in group B are themselves very interesting because they allow the sample to be enlarged, even if individually they will not be able to access a significant Lod score in most cases. In groups, they can however consolidate the Lod score, especially if it turns out that the trait was genetically heterogeneous (slightly).
  • the families of group C can also be used in studies of replication of the results of genetic linkage.
  • the families of groups D and E (Zmax ⁇ 2) are not very informative for a genetic hedge analysis.
  • B- Period 2 Collection of samples, confirmation of phenotypes and new estimates of the study's potential
  • This phenotype medical verification campaign helped to confirm many of the PC diagnoses, but not all as expected.
  • Table 5 presents the results obtained for all 8 families in 3 situations of genetic heterogeneity (0%, i.e. all families linked to the same locus, 50% or only half of the families linked to the locus, 70% or only about a third of families linked).
  • Table 7 New simulation after collection of new families. The potential Lod scores are expressed as a function of the rate of genetic heterogeneity.
  • Heterogeneity rate 0% 50% 70% Lod score 1. 000 99,500 57,000 27,000 2. 000 95,500 31,000 8,500 3. 000 84,500 14,000 3,500
  • the region 3pl4.1-pl2.3 is called the “candidate region” (CR) because it is associated with premature canities through Klein Waardenburg disease (type IIA) with which the trait is associated.
  • Table 9 New simulation on families finalized for research on the candidate chromosomal region. Lod potential scores based on the rate of genetic heterogeneity. The detailed results are shown in the table in Figure 8.
  • Table 10 Probabilities (in%) of reaching or exceeding Lod score of 1, 2 or 3 for each rate of heterogeneity. The detailed results are shown in the table in Figure 9.
  • NPL non-parametric
  • CAN53 shows a relatively high hedge for this chromosomal region.
  • D- Epoch 4 Analysis of the global genetic link between PC and the genome.
  • Table 12 Comparison of the number of individuals studied in each family between the candidate-region analysis and the genome-global analysis, (detailed composition of families, table in Figure 10)
  • the probability of finding a significant link (Table 14 and Figure 12) with 4/5 of families living at the same locus is 50%. This result is based on an average lod score which is conservative.
  • Table 14 Probabilities (in%) of reaching or exceeding Lod score of 1, 2 or 3 for each rate of heterogeneity
  • Analyzes can therefore indicate significant links if the heterogeneity of the sample does not exceed 20% (i.e. only 1/5 of families not binding to a single major locus), but it is still possible to identify a link in the case where half of the families are not linked to this locus.
  • the DNA of 96 individuals belonging to the 12 families selected was genotype for 400 polymorphic markers distributed on the 22 autosomes and the X chromosome (Table 15) according to an average inter-archer interval of 9.2 cM (density). These are DNA microsatellites, which are composed of tandem repeats of the dinucleotide type (CA) facedfrom the Généthon collection (Evry, France).
  • CA dinucleotide type
  • Table 15 Number of markers analyzed for each chromosome during the wide scan genome
  • the average heterozygosity rate observed is 0.70, and the average size of the inter-marker interval is 9.2 cM.
  • the inventors have carried out several types of analysis in order to optimize their performance in order to find a link between a region of the genome and the CP.
  • Parametric analysis more efficient in terms of power, takes into account the mode of transmission of the trait and is most suitable in the case of monogenic traits.
  • the non-parametric analysis which makes it possible to identify a link even if the mode of transmission supposed is erroneous, is also more robust in the case of multigem traits.
  • the inventors used the methods already mentioned, the 2-point method (iterative analysis between the line and each marker) and the multipoint method (global analysis on each chromosome according to a map of markers).
  • NPL non-parametric
  • Figure 3 reports the NPL scores obtained for the analysis of non-parametric hedge on chromosomes 3, 5, 11, 6 and 9.
  • Tables 16 (best 2-point analysis results) and 17 (best multipoint analysis results) report the best results obtained for the chromosomes selected.
  • the NPL score is moreover in the range of suggestivity in a case of monogenism or in a case of multigenism (suggestivity: monogenism 2 ⁇ Z-all ⁇ 3; multigenism 2.2 ⁇ Z-all ⁇ 3.6).
  • the inventors identify a region between positions 100 and 115 (between Dl 1S898 and Dl 1S925) ( Figure 4A).
  • This region collects the best PL and bipoint result of these analyzes which is located at a recombination distance (theta) 0.14 (approximately 14 cM) from the marker D5S422.
  • a recombination distance 0.14 (approximately 14 cM) from the marker D5S422.
  • Example 1 Following the work presented in Example 1, the inventors continued the analysis of the regions of chromosomes 3, 5 and 11 using SNP-based technology, in order to highlight the genes involved in canities. early.
  • GG global genome MP: multipoint
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • the number of SNPs is estimated to be around 0.8 SNPs per 1000 nucleotides (coding and non-coding sequences combined), which makes it possible to establish a true mapping of the human genome using SNPs.
  • SNPs are often classified into different categories, in particular according to whether they are in a coding region or not, in a regulatory region or in another non-coding region of the genome, whether the polymorphism modifies the coded amino acid or not, etc. .
  • SNPs are now better known and referenced, as well as their position in the genome (GDB).
  • GDB Human Genome Project program
  • Different methods have been developed to demonstrate these polymo ⁇ hisms between different individuals, often based on the methods used to detect point mutations (RFLP-PCR, hybridization with allele specific oligomers, mini-sequencing, direct sequencing ).
  • RFLP-PCR point mutations
  • mini-sequencing mini-sequencing
  • direct sequencing a point mutations
  • MALDI-TOF technology matrix-assisted laser deso ⁇ tion / ionization time-of-flight mass spectiometry
  • the inventors defined very precisely the regions of chromosomes 3, 5 and 11 to be analyzed with SNPs.
  • 3848 SNPs belonging to the previous regions were pre-selected on certain criteria (SNPs candidates in silico) and 3227 were selected following an experimental validation step.
  • the inventors assembled the DNAs of the different individuals with premature canities and of the 'control' individuals into different groups, then genotyped these different groups using 1264 SNPs chosen from among 3227. The different steps are described more fully in the following sections.
  • the inventors defined more precisely the regions of interest on chromosomes 3, 5 and 11, from the results obtained thanks to the analysis with microsatellite markers (see the work described in Example 1) of the 12 families selected (see Table 6).
  • region C The region on chromosome 3, called region C, is defined by its chromosomal position as well as by three other types of coordinates for optimal precision and security in the definition of this region for the subsequent steps. The same is true for the region of chromosome 5, called region D, and for the region of chromosome 11, called region E.
  • the following table lists the different cartographic characteristics of regions C, D and E (code and size of the region in Mb and Kb, number of microsatellite markers that bound the regions, position in the genome sequence, number of an SNP).
  • the two columns for the positions on the genome differ in the different version of database (NCBI UCSC freeze April 2002 and June 2002).
  • the cumulative size of the three C + D + E regions is 77,351 Kb, or 77,106 bp.
  • the position of the sequence is expressed as a function of the version number of the human genome database according to a UCSC update (http: //genome.cse.ucsc. edu /) and / or a human genome sequence assembly version number, in April 2002 (either NCBI Build29) or June 2002 (either NCBI Build30).
  • 3332 SNPs were preselected in particular by removing the SNPs distant by less than 14kb.
  • the 3332 SNPs selected were analyzed on 92 control individuals (individuals from the Center for the Study of Human Polymohism) in order to validate the presence of at least two alleles for each of the SNPs (validation of polymohismism).
  • the DNAs of the different individuals with the trait 'early canities' (CP) and that of the control individuals were assembled. This assembly was carried out so that each of the DNAs is represented in an equimolar manner, in order to guarantee that no individual has a preponderant influence on the result compared to another. To this end, the exact concentration of each of the DNAs was measured by the “Picogreen” method in the various samples of the individuals.
  • Groups were formed taking into account a “phenotypic intensity of canity score” which was assigned for each individual as follows.
  • AI group this group is made up of the DNA of 72 PC individuals whose phenotypic score is 4 or 5.
  • AU group this group is made up of DNA from 132 PC individuals, whose phenotypic score is 2, 3, 4 or 5.
  • BI and BII groups are made up of the DNA of control individuals whose geographic origin is close to that of CP individuals. For these control individuals, the selection criteria were: (i) an age greater than 40 years, (ii) the absence of sign of canities in the control individual, (iii) the absence of a family concept of canities.
  • the criteria for matching with an individual from the AI or AU group are identical geographic origin, same sex and identical hair color at 18 years of age.
  • each CP individual in the AI group is represented by a control individual in the BI group whose place of geographic origin is close or identical. The same is true for each individual in the AH group.
  • the rigor of matching according to the rules set by the inventors is the guarantee of the relevance of statistical analyzes comparing genomic data from these individuals whether they are grouped in pools or compared individually.
  • a battery of 2142 SNPs from groups 1 and 2 were thus validated for a minimum frequency of the rarest Pallele of 0%.
  • Some SNPs of groups 3 and 4 (frequency of the rare allele ⁇ 10%) were also selected in order to be able to complete certain zones where there would not be enough SNPs from groups 1 and 2.
  • 3227 SNPs were thus validated.
  • 1,264 were chosen during a new selection stage. This new selection is based on the following criteria:
  • the next step was to determine their allelotype, that is to say the frequency of each of the alleles, for the 4 groups of DNA assembled (pooled) depending on the severity and precocity of the phenotype (see the definition of the 4 groups in step 3 and Figure 13).
  • the Alabank frequency of the two alleles was determined for each SNP in the 4 groups.
  • allelotype is determined by this method, and not the genotype.
  • the statistical significance of the allelic frequency differences between the groups AI and BI or AU and BII is estimated by the value "p" representing the significance. The lower the p-value, the more statistically significant the difference.
  • -CHROM chromosome number
  • -AI_A2 is the frequency of allele 2 (the higher mass allele in MALDI-TOF in the AI pool)
  • -BI_A2 is the frequency of allele 2 (the higher mass allele in MALDI-TOF in the pool BI)
  • -DAI-BI is the difference in frequency of allele 2 between pool AI and pool BI
  • -P-value_I is the p-value calculated for the comparison of the frequencies of the AI and BI pools.
  • -P ⁇ 0.05: value 0 when the p-value is> 0.05; value 1 when the p-value is ⁇ 0.05 -Code: code (ind, dbs, 2, 3), depending on the nature of the result (see table of codes), indicating whether it is an individual positive SNP, or distributed in double spot or cluster of 2, 3 or more.
  • this criterion indicates whether the frequencies of 2 or 3 positive cluster SNPs (contiguous positive SNPs) are compatible with the existence of a haplotype. To do this, the frequencies of the 2 alleles (positive SNPs in the cluster), frequent allele and rare allele (lower and upper allele), are statistically analyzed to determine if there is a linkage disequilibrium (LD Linkage desequilibrium) resulting in significant p-value.
  • LD Linkage desequilibrium linkage disequilibrium
  • Linkage disequilibrium is a situation where 2 genes (alleles) segregate together at a higher frequency than the frequency predicted by the product of their frequencies individual. This means that the two genes are not independent since they segregate together more frequently than expected by the statistics, so there is a lack of independence between alleles located close to each other on the same chromosome. In addition, this takes into account the distance, and therefore SNPs distant from more than 100-110 Kbs are eliminated.
  • i- region C Region C is characterized by a relatively large number of isolated positive SNPs. On the other hand, the number of double spots or clusters is relatively low. LD analysis
  • -CCK gas ⁇ rin / cholecystokinintypeb receptor (cck-b receptor)
  • C2 f52846896-5291394n: -CACNA1D: voltage-dependent 1-type calcium channel alpha-ld subunit
  • Region D is characterized by a relative density in clusters and the LD and freq analysis also shows several regions of interest. Seven zones (D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7) are noted for their cluster arrangement, their LD potential and the arrangement of the allelic frequencies. Among these 7 zones, 5 (in bold; D2, D3, D5, D6, D7) seem to be more promising due to the significance of the comparison of at least one SNP.
  • -HNRPAO heterogeneous nuclear ribonucleoprotein aO (hnrnp aO).
  • -CDC25C map / microtubule affinity-regulating kinase 3 (ec 2.7.1.27)
  • EGR1 early gro th response protein 1 (egr-1) (krox-24 protein)
  • -ETFl eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 (erfl)
  • HSPA9B stress-70 protein, mitochondrial precursor
  • -PDGFRB beta platelet-derived growth factor receptor precursor (ec 2.7.1.112)
  • -TCOFl Treacle Protein (Treacher Collins Syndrome Protein).
  • -ALI 33039 predicted
  • -CD74 hla class ii histocompatibility antigen, gamma chain
  • -G3BP ras-gtpase-activating protein binding protein 2
  • GLRAl glycine receptor alpha-1 chain precursor D7 (153463449-153854650)
  • C5orf3 predicted
  • -GALNTIO putative udp-galnac: n-acetylgalactosaminyltransferase polypeptide
  • Region E is also characterized by a relative density in clusters and the LD and freq analysis shows 6 regions of interest (E1, E2, E3, E4, E5, E6). Three zones (in bold, E2,
  • -GUCY1A2 soluble guanylate cyclase, alpha-2 chain (ec 4.6.1.2) E2 (110056711-110546142)
  • vasopressin-activated calcium-mobilizing receptor (vacm-1) (cullin homolog 5)
  • -ACAT1 acetyl-coa acetyltransferase, mitochondrial precursor (ec 2.3.1.9)
  • -NPAT muclear protein ataxia-telangiectasia locus; el4 gene;
  • IGSF4 immunoglobulin superfamily, member 4; nectin-like protein 2 E5 (118532530-118685957)
  • transgelin smooth muscle protein 22-al ⁇ ha
  • sm22-al ⁇ ha ws3-10
  • 22 kda actin-binding protein 22 kda actin-binding protein
  • This lotion is applied daily to the areas to be treated and preferably to the entire scalp for at least 10 days and preferably 1 to 2 months.
  • This shampoo is used for each wash with an exposure time of approximately one minute. Prolonged use, of the order of two months, leads to the gradual repigmentation of gray hair. This shampoo can also be used as a preventive measure to delay bleaching of the hair.
  • This gel is applied to the areas to be treated twice a day (morning and evening) with a terminal massage. After three months of application, a repigmentation of the hairs or hair of the treated area is observed.

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Abstract

Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNAID, ARHGEF3 et AL133097, ou dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, ou dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCYIA2, CULS, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à l'une de ces régions, utilisation des produits d'expression de l'une de ces régions et utilisation d'agents capables de modifier la fonction de ces produits d'expression, à des fins cosmétiques, thérapeutiques ou diagnostiques.

Description

GÈNES DES CHROMOSOMES 3, 5 et 11 IMPLIQUÉS DANS LA
CANITIE PRÉCOCE
Annuler ou atténuer autant que faire se peut les effets du vieillissement est une préoccupation qui ne cesse de croître. Dans ce contexte, faire disparaître des cheveux blancs jugés disgracieux grâce à des shampoings traitants colorants est désormais une activité très répandue. Il est clair cependant que, même si cette technique permet effectivement d'annuler les effets du phénomène, elle n'en affecte nullement les causes. De ce fait, cette solution est temporaire et doit être fréquemment renouvelée. Dans ce contexte, les inventeurs ont choisi d'explorer l'apparition des cheveux blancs, ou canitie, sous un angle totalement nouveau, celui de la génétique.
En effet, explorer la canitie de par son aspect génétique permet de mettre en évidence les mécanismes profonds de la dépigmentation. Cela, permet aussi d'identifier les gènes qui sont impliqués dans la canitie. Cette identification ouvre la porte à de très nombreuses applications, dans le domaine du soin des cheveux, tant cosmétiques que thérapeutiques ou dignostiques.
Il est hautement novateur de chercher à connaître les régions génomiques de la canitie par analyse de liaison génétique alors que d'autres études visent plutôt à décrypter la bioctiimie de la canitie. Les inventeurs ont choisi de tirer partie de l'hypothèse proposée depuis bien longtemps du caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie. Le caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains est en effet aisément observable.
Le deuxième obstacle de la mise en œuvre des méthodes de génétique inverse concerne la définition exacte du phénotype. Une parfaite définition du phénotype étudié est en effet nécessaire. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette identification de gènes, le choix et la composition de l'échantillon utilisé dans la présente invention se sont déroulés selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype « canitie précoce » fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans. De plus, il est vraisemblable que d'une part la canitie précoce ait une origine multigénique et non monogénique, et que d'autre part, des facteurs environnementaux aient une influence sur le phénotype. Il s'agit de fait de définir un ensemble de causes prédisposant à la canitie précoce plutôt qu'une mutation unique responsable du phénotype. Dans ce contexte, la génétique inverse n'est pas, habituellement, une technique recommandée par les généticiens. Il est donc original de la part des inventeurs d'avoir utilisé cette méthode.
Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs de définir des zones chromosiques et/ou génomiques comprenant des gènes impliquées avec une forte probabilité dans la canitie. Dans la présente demande, les régions des chromosomes ou les sous-parties de ces régions,, identifiées par les inventeurs comme comprenant des gènes statistiquement impliqués dans la canitie, seront dénommées indifféremment "régions chromosomiques de l'invention" ou "régions génomiques de l'invention" ou "zones chromosomiques de l'invention" ou "zones génomiques de l'invention". Quant aux gènes identifiés dans le cadre de la présente invention au sein desdites régions, ils seront dénommés « gènes de l'invention ».
L'objet de la présente invention concerne d'une part les gènes des régions chromosomiques identifiés et d'autre part l'utilisation de produits dérivés, tels que des produits de transcription ou de traduction, dans les domaines de la cosmétique, de la thérapeutique et du diagnostic.
Pour les domaines de la thérapie et de la cosmétique, la présente invention concerne successivement l'utilisation de polynucléotides dérivant gène compris dans une région chromosomique de l'invention, l'utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à ce gène, l'utilisation des produits d'expression de ce gène et l'utilisation d'agents capables de modifier la fonction de ces produits d'expression. L'utilisation conjointe ou combinée d'au moins deux des produits précédents peut s'avérer judicieuse, en particulier dans le domaine thérapeutique.
La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic d'une canitie précoce basé sur les variations alléliques au sein des gènes compris dans les régions chromosomiques de l'invention. En matière de diagnostic, il peut être, de plus, particulièrement pertinent de combiner les renseignements provenant de différents gènes au sein des zones chromosomiques de l'invention. GLOSSAIRE
Dans le cadre de la présente invention, les termes énoncés revêtent la signification suivante :
Par fragment polynucléotidique, on entend toute molécule résultant de l'enchaînement linéaire d'au moins deux nucleotides, cette molécule pouvant être monocaténaire, bicaténaire ou tricaténaire. Il peut donc s'agir d'une molécule d'ADN double-brin, d'un ADN simple brin, d'un ARN, d'un duplex ADN simple brin-ARN, d'un triplex ADN- ARN ou de toute autre combinaison. Le fragment polynucléotidique peut être naturel isolé, recombinant ou bien synthétique. Lorsque le fragment polynucléotidique comporte des brins complémentaires, la complémentarité n'est pas nécessairement parfaite, mais l'affinité entre les différents brins est suffisante pour permettre l'établissement de liaison stable de type Watson Crick entre les deux brins.
Bien que l'appariement des bases soient de préférence de type Watson-Crick, d'autres types ne sont pas exclus, tels qu'un appariement de type Hoogsteen ou Hdogsteen inverse.
On considère que la séquence S d'une molécule « correspond » à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire l'enchaînement des bases de S de celui de la molécule d'ADN donnée par l'un des processus suivants 1. par identité, ou bien 2. par identité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile, ou bien
3. par complémentarité, ou bien
4. par complémentarité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile.
De plus, on considère que deux séquences restent « correspondantes » s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans l'un des processus précédents (complémentarité ou bien identité, avec ou sans échange T,U), de préférence moins d'une erreur sur 100. Par conséquent, les deux molécules ont aussi nécessairement des longueurs voisines, la variation maximale de longueur étant de 10% d'après le taux d'erreur accepté, elles ont de préférence une différence de longueur inférieure à 1%.
Cette définition ne suppose pas que les deux molécules soient de même nature, en particulier pour ce qui est de leur squelette, il s'agit d'une correspondance entre leur séquence uniquement.
Par exemple, deux séquences d'ADN identiques « correspondent » l'une à l'autre. De même, si ces deux séquences sont substantiellement identiques, c'est-à-dire identiques à plus de 90%, elles correspondent l'une à l'autre. Une séquence d'ARN, issue de la traduction d'une molécule d'ADN quelconque, « correspond » à la séquence de cette molécule d'ADN. De même, une séquence synthétique, par exemple hybride ADN-ARN, peut correspondre à une séquence d'ADN. Il en va de même entre une séquence d'ADN et l'ARN anti-sens ayant pour cible cette séquence.
Sur le même schéma, on considère que la séquence S d'une molécule d'ADN « correspond » à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire la séquence S de celle de la molécule d'ADN donnée par le processus 1 ou 3 uniquement. La même latitude est autorisée concernant la possibilité d'introduction d'erreurs dans ces processus, c'est-à-dire que l'on considère que deux séquences d'ADN restent
« correspondantes » s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans les processus de complémentarité ou bien d'identité, de préférence moins d'une erreur sur 100.
Les produits d'expression d'un fragment d'ADN englobent toutes les molécules traduisant l'information génétique portée par ce fragment. Les ARN correspondant à la transcription du fragment d'ADN, à tous les stades de maturation, sont donc des produits d'expression ; il en est de même pour les polypeptides, à tous les stades de maturation, résultant de la traduction des ARN. Si des clivages interviennent au sein du polypeptide, comme par exemple le clivage de signaux d'adressage, tous les polypeptides résultants sont aussi considérés comme des produits d'expression du f agment d'ADN initial. Dans le contexte de l'invention, la « fonction » primaire d'un fragment d'ADN est de préférence d'être transcrite puis traduite en protéine. La fonction secondaire de l'ADN peut être assimilée à la fonction de la protéine résultant de la traduction de cet ADN. La fonction d'un fragment d'ADN revêt aussi d'autres significations dans la présente invention. En particulier, un fragment d'ADN peut appartenir à une région régulatrice d'un gène, sa fonction est alors, ou bien d'être le site de fixation d'enhancers ou d'inhibiteurs, ou bien d'être le site de fixation de l'ARN polymérase, ou bien d'être un site de reconnaissance pour le positionnement de l'ARN polymérase, ou bien toute autre fonction généralement assimilée à une séquence régulatrice.
D'autres fonctions sont envisageables pour les fragments d'ADN. En particulier, leur simple présence au sein d'un gène peut faciliter les recombinaisons. De même, une fonction selon l'invention peut être celle des télomères et avoir trait à la dégénérescence. D'autres fonctions particulières attribuées à des fragments d'ADN sont bien connues par les biologistes. Un marqueur génétique est une séquence d'ADN détectable. En génétique humaine, les marqueurs sont des séquences particulières de l'ADN pouvant prendre différentes formes selon les individus. Cette polymorphie des marqueurs permet de suivre leur transmission dans le cadre des arbres généalogiques. Parmi les marqueurs classiques, on peut citer deux grandes catégories qui sont les marqueurs microsatellites et les SNP (Single nucleotide polymorphism).
Un microsatellite est une séquence d'ADN répétée, constituée d'un motif relativement simple : un di, un tri ou un tétra nucleotide le plus souvent. Le nombre de répétitions change pour un même motif selon les individus et peut varier de quelques unités (une douzaine au minimum pour un dinucléotide), jusqu'à plus d'une centaine. Ces séquences sont dispersées un peu partout dans le génome, de façon presque aléatoire, mais à des endroits identiques d'un individu à un autre. Elles sont très abondantes (environ une tous les 10000 nucleotides = 10 kb) et elles sont très polymorphes. C'est la variation de longueur de la répétition en tandem qui constitue le marqueur- Ces séquences microsateUites sont donc très utilisées comme marqueurs génétiques.
Normalement, il n'y a pas de lien explicite entre un marqueur microsatelhte et un gène, sinon une co-localisation. La longueur d'une répétition en tandem n'a pas, selon les connaissances actuelles, et en dehors de quelques rares cas de marqueurs intragéniques associés à certaines pathologies, de lien avec le rôle d'un gène. Dans le cadre de la présente invention, les marqueurs microsatellites sont des outils pour localiser les gènes impliqués dans la canitie précoce. Comme il existe beaucoup moins de polymorphisme dans les gènes que dans les marqueurs, un allèle génique sera représenté par plusieurs allèles d'un même marqueur microsatellite.
Il existe différentes méthodes pour définir la localisation de séquences particulières d'ADN le long des chromosomes. L'unité de mesure physique est le nombre de paires de bases. Toutefois, le centimorgan est souvent utilisé, c'est une unité de recombinaison donc une unité de mesure génétique et non physique. Deux séquences particulières d'un même chromosome sont distantes d'un centimorgan si elles recombinent une fois sur cent lors de la méiose. Un centimorgan équivaut approximativement à 106 paires de bases.
Une autre méthode pour localiser des séquences particulières d'ADN le long des chromosomes consiste à définir leur position relativement à des marqueurs jalonnant les chromosomes et dont la position est parfaitement déterminée et connue. Des marqueurs très utilisés sont les marqueurs microsatellites dont il existe des cartographies très, complètes. En particulier le GDB « Génome Database » est une banque de données, connue mondialement pour répertorier entre autres les STSs (Séquence tagged sites), bornes spécifiques et uniques de l'ADN dont font partie les microsatellites. Les codes DxSxxxx (par exemple D6S257), servant à identifier ces marqueurs, sont leur numéro d'accession dans GDB. Ces codes sont un moyen d'identification non ambigu et universel car seul GDB attribue ce type de code. Comme on peut trouver de tels marqueurs microsatellites environ tous les 10 kb, il est donc possible de définir la position de toute séquence à lOkb près, en indiquant les marqueurs microsatellites l'encadrant. Un SNP (Single Nucleotide Pholymorphism) est un polymorphisme qui touche une unique base de l'ADN. C'est la forme de polymorphisme la plus répandue dans le génome humain, et elle se caractérise également par; une grande stabilité lors de la transmission. La plupart de ces polymorphismes n'ont pas d'implications fonctionnelles. On compte environ 1 SNP sur 100 paires de bases. La connaissance de ces SNPs permet d'étabhr une cartographie du génome humain et les SNPs servent alors de véritables marqueurs du génome, d'autant plus qu'ils mutent lentement et ont peu de chance de réapparaître de façon récurrente.
Par région chromosomique entre deux marqueurs, on entend toute la séquence comprise entre ces deux marqueurs, les bornes étant comprises, donc la séquence des marqueurs y compris.
En génétique inverse, les indices permettant de localiser un gène proviennent de la comparaison de la transmission d'un phénotype, supposé induit par un gène muté ou par un allèle donné, avec la transmission de marqueurs connus, au sein d'une même famille. Ces données de co-ségrégation d'un phénotype et d'un marqueur permettent d'établir une analyse de liaison génétique.
La co-transmission d'un phénotype et d'un marqueur suggère que le gène responsable du phénotype et le marqueur sont physiquement proches l'un de l'autre sur le chromosome. La liaison est déterminée par l'analyse du schéma de transmission d'un gène et d'un marqueur dans des familles qui s'y prêtent. L'analyse de liaison repose sur la co-transmission de certaines formes de marqueurs avec la forme défectueuse, ou modifiée d'un gène. Mais c'est une analyse indirecte dans le sens où d'une part, lors d'une première étape, un phénotype est associé à la forme défectueuse ou modifiée du gène. Une erreur dans l'assignation de certains phénotypes fausse l'étude. D'autre part, cette étude est basée sur des statistiques, ces statistiques reposant sur l'analyse d'un échantillon de la population, il s'agit donc d'un sondage. Enfin, il faut noter que lorsqu'il est possible d'associer un allèle particulier du marqueur avec un allèle du gène (en fait un phénotype), cette association n'est a priori valable que pour les échantillons inter-familiaux.
Le résultat des analyses de liaison dépend évidemment du degré de liaison entre le marqueur et le locus de la maladie. Cinq centimorgans (5 cM) est considéré comme un minimum de liaison pour un diagnostic. Une liaison à 5 cM signifie que l'on a 95% de chances d'arriver à une conclusion correcte et seulement 1 chance sur 20 qu'une recombinaison soit survenue entre le marqueur et le locus de la maladie.
Par le terme gène, dans le. cadre de la présente invention, on entend non seulement la partie strictement codante, mais également les parties non codantes telles que les introns, et les parties régulatrices, en 5' et 3', les UTR (UnTranslated Région), notamment le ou les promoteurs, « enhancers » etc...associés. , ;
Les inventeurs ont identifié 3 régions chromosomiques distinctes, appartenant aux chromosomes 3, 5 et 11 et qui sont impliquées dans la canitie précoce. Ces 3 régions sont chacune des régions ou zones chromosomiques de l'invention. Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence l'implication de certains gènes appartenant à ces régions chromosomiques, appelés gènes de l'invention.
Selon un premier aspect, l'invention concerne les gènes KIAA1042, CCK-, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097 du chromosome 3 humain, identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de ces gènes, tels que les produits de transcription ou d'expression. Ces gènes appartiennent à la première zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 3 par les marqueurs microsatellites D3S1277 et D3S1285. Cette zone sera plus particulièrement dénommée « première zone chromosomique de l'invention ». Les 5 gènes mentionnés seront plus particulièrement dénommés les 5 gènes de l'invention du chromosome 3. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les gènes KLHL3, HNRPAO,
CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSF1R, RPL7, PDGFRB, TCOF1, AL133039, CD74, RPS14, NDST1, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ117151 du chromosome 5 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de ces gènes, tels que des produits de transcription ou d'expression. Ces gènes appartiennent à la deuxième zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 5 par les marqueurs microsatelhtes D5S2115 et D5S422. Cette zone sera plus particulièrement dénommée « deuxième zone chromosomique de l'invention ». Les gènes mentionnés seront plus particulièrement dénommés les gènes de l'invention du chromosome 5.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650 du chromosome 11 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce et , les utilisations des produits dérivés de ces gènes, tels que des produits de transcription ou d'expression. Ces gènes appartiennent à la troisième zone chromosomique de l'invention qui est déhmitée sur le chromosome 11 par les marqueurs microsatellites D11S898 et D11S925. Cette zone sera plus particuherement dénommée « troisième zone chromosomique de l'invention ». Les 18 gènes mentionnés seront plus particulièrement dénommés les 28 gènes de l'invention du chromosome 11.
Les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3, ALI 33097, KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNTIO, FLJ11715, GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650 seront dénommés gènes de l'invention. Pour les trois zones chromosomiques identifiées ci-dessus, la présente invention couvre des fragments polynucléotidiques ayant une longueur minimale de 18 nucleotides, correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention, ces fragments d'ADN ayant la caractéristique fonctionnelle d'être impliqués dans la canitie, ou bien dans la canitie précoce, et éventuellement dans les deux phénomènes. Selon une possibilité envisagée par la présente invention, un fragment impliqué dans la canitie ou la canitie précoce et possédant une séquence répondant aux exigences mentionnées plus haut peut être utilisé en thérapie. Plus particuherement, le premier aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 3 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097. Ces gènes sont compris dans la première zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 3 par les marqueurs microsatelhtes D3S1277 et D3S1285.
Le deuxième aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 5 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRA1, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715. Ces gènes sont compris dans la deuxième zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 5 par les marqueurs microsatellites D5S2115 et D5S422.
Le troisième aspect de l'invention concerne les gènes du chromosome 11 humain identifiés par les inventeurs comme étant impliqués dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. Ces gènes sont compris dans la troisième zone chromosomique de l'invention qui est délimitée sur le chromosome 11 par les marqueurs microsatellites Dl 1S898 et Dl 1S925. Le fragment polynucléotidique dont il est fait référence dans le cadre de l'invention correspond à un fragment d'un chromosome. Ce fragment a une longueur minimale de 18 nucleotides, et une longueur maximale qui peut aller jusqu'à la longueur totale du gène en question, ou de plusieurs gènes de l'invention. De préférence, le fragment a un nombre de nucleotides supérieur à 18. Une longueur particulièrement préférée est comprise entre 18 et 10000 nucleotides, de préférence entre 30 et 8000 nucleotides.
Selon des variantes préférées de l'invention, il est fait référence à des fragments dont la longueur est comprise entre 30 et 5000 nucleotides, de préférence entre 50 et 3000 nucleotides, par exemple entre 100 et 2000 nucleotides, ou entre 200 et 1000 nucleotides. L'invention concerne également l'utilisation en cosmétique ou en thérapie d'un fragment polynucléotidique ou du produit d'expression d'un fragment ou d'un agent modulant la fonction d'un fragment, ou bien d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment, où le fragment en question correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, ou tout ou partie d'un gène du chromosome 5 choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, ou tout ou partie d'un gène du chromosome 3 choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097: Selon un cas préféré, le fragment correspond plus particulièrement à tout ou partie d'un exon de l'un de ces gènes.
Dans ce qui suit, seront désignés « produits de l'invention », le fragment, le produit d'expression d'un fragment, l'agent modulant la fonction d'un fragment, et l'agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique correspondant à tout ou partie de l'un des gènes de l'invention.
Pour les gènes identifiés par les inventeurs, la présente invention concerne tout d'abord des utilisations dans le domaine de la cosmétique. On entend par cosmétique toute application qui ne tend à modifier que l'esthétique et n'a aucune visée thérapeutique.
Pour toutes les utilisations selon l'invention dans le domaine de la cosmétique, le produit de l'invention peut être conditionné sous différentes formes appropriées, seul ou en combinaison avec d'autres agents. En particulier, des formes préférées sont destinées à des applications locales et elles concernent les crèmes, les lotions, les gels, les émulsions, les pommades et les shampoings. D'autres formes sont aussi envisageables pour des utilisations selon l'invention, en particulier sous forme de pilules pour une administration orale.
Parmi les différentes visées cosmétiques dans le cadre de la présente invention, un domaine particulièrement préféré est celui de la pigmentation. La pigmentation peut être celle de la peau ou bien des phanères. Il peut s'agir de la couleur de la pigmentation comme de l'absence de pigmentation ; les problèmes touchant à la qualité et à l'intensité de la pigmentation sont aussi concernés par la présente invention. En particulier, l'objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un produit de l'invention pour prévenir et/ou limiter et/ou arrêter le développement de la canitie.
L'objet de l'invention se rapporte aussi à l'utilisation d'au moins un produit de l'invention pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique de la canitie caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une composition comprenant au moins un produit de l'invention.
L'invention se rapporte aussi à un procédé traitement cosmétique destiné à favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une composition comprenant au moins un produit de l'invention. . - ;-- •
Les zones à traiter peuvent être, par exemple et sans aucune limitation, le cuir chevelu, les sourcils, la moustache et/ou la barbe. .;<--.• • Plus particulièrement, les procédés de traitement de la canitie et de pigmentation naturelle des cheveux et ou poils gris ou blancs consistent à appliquer une composition comprenant au moins un produit de l'invention.
Les procédés de traitement pour lutter contre la canitie et/ou pour stimuler la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs peuvent par exemple consister à appliquer la composition sur les cheveux et le cuir chevelu, le soir, garder la composition toute la nuit au contact et éventuellement effectuer un shampooing le matin ou laver les cheveux à l'aide de cette composition et à laisser à nouveau en contact quelques minutes avant de rincer. La composition conforme à l'invention s'est révélée particulièrement intéressante lorsqu'elle est appliquée sous forme de lotion capillaire, éventuellement rincée ou même sous forme d'un shampooing.
Pour les gènes identifiés dits « gènes de l'invention », la présente invention concerne ensuite des utilisations thérapeutiques dans le domaine de la pigmentation.
Les affections touchant le système de pigmentation, que ce soit celui de la peau ou celui des phanères, peuvent avoir de graves conséquences sur la santé des personnes atteintes. En effet, la pigmentation de la peau joue le rôle de barrière protectrice face aux agressions lumineuses en particulier, les personnes souffrant d'albinisme sont dépourvues de protection faces aux rayons du soleil qui constituent pour eux un danger important. D'autres affections mettant en jeu la pigmentation sont aussi concernées par la présente invention.
Dans le cadre des utilisations thérapeutiques et cosmétiques tendant à modifier une caractéristique de la pigmentation, il s'agit de préférence de la pigmentation de la peau. Selon d'autres cas envisagés par la présente invention, le type de pigmentation qui doit être modifiée concerne la pigmentation des phanères, en particulier les ongles ou les poils.
Selon un cas particulier préféré de la présente invention, la pigmentation dont on cherche à modifier les caractéristiques est celle du système pileux en général et de la chevelure, moustache et sourcils en particulier. La présente invention permet de modifier le phénomène d'arrêt de la pigmentation des cheveux, c'est-à-dire la canitie, en particulier lorsque celle-ci survient de manière prématurée chez une personne et que l'on parle de canitie précoce.
Pour. toutes les, utilisations en thérapeutique, les produits actifs entrant dans la composition d'un médicament sont de préférence associés à des excipients pharmaceutiquement acceptables. Toutes les voies d'administration considérées comme acceptables peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention, en particulier voie intradermique, intraveineuse, musculaire, orale, otique, nasale, optique. La formulation est de préférence adaptée à la voie d'administration choisie. Les utilisations pour la fabrication d'un médicament selon l'invention peuvent faire entrer dans leur formulation d'autres principes actifs. De même, administration d'un médicament comme défini dans l'invention peut être combinée avec l'administration d'un autre médicament, que cette administration soit simultanée, séquentielle ou séparée.
De même, les différents produits dont il est fait usage dans le cadre des utilisations en thérapie, peuvent être combinés et entrer dans la composition d'un unique médicament ou bien peuvent servir à la fabrication de différents médicaments. En particulier, s'ils entrent dans la composition de médicaments distincts, ils peuvent être administrés à des fréquences différentes.
Les caractéristiques et les variantes préférées des produits dont il est fait usage dans les utilisations selon l'invention peuvent être identiques dans le cadre des utilisations en cosmétologie et pour des utilisations du même produit dans la fabrication d'un médicament. Dans les deux cas, l'utilisation de produits selon l'invention peut nécessiter que le produit soit introduit dans un fluide corporel, ou bien dans des tissus, ou dans des cellules. Pour l'introduction dans des cellules, l'utilisation peut prévoir que le produit soit actif dans le cytoplasme des cellules, ou bien dans le noyau cellulaire. La première utilisation, cosmétique ou thérapeutique, envisagée dans le cadre de l'invention est l'utilisation d'un fragment polynucléotidique dont la séquence correspond, au moins en partie, à l'un des gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, le fragment polynucléotidique entre dans la fabrication d'un médicament.
Concernant la nature chimique de ce fragment polynucléotidique, il peut s'agir d'une molécule d'ADN, simple ou double brin, circulaire ou linéaire, d'une molécule d'ARN bu de toute autre molécule envisagée dans la définition de fragment polynucléotidique donnée plus haut.
Concernant son environnement, ce fragment peut être ou faire partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Il peut, dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour comporter ce fragment dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant ce fragment, il est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si le fragment est inséré dans un vecteur, le dit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement la traduction du fragment. Ce fragment peut aussi être entouré par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique, conduisant éventuellement à l'insertion du fragment de l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
Le fragment polynucléotidique tel que décrit peut se trouver sous forme naturelle ou bien être de nature synthétique, ou bien être en partie l'un et en partie l'autre, en particulier s'il s'agit d'une molécule « duplex » constitué de deux brins aux origines différentes. Selon différents cas envisagés par la présente invention, le fragment polynucléotidique peut être isolé, il peut avoir subi une étape de purification. Il peut s'agir aussi d'un fragment recombinant, par exemple synthétisé dans un autre organisme. Selon un exemple préféré, il s'agit d'un fragment d'ADN ayant été amplifié par PCR (Polymérisation Chain Reaction) puis purifié.
Selon d'autres constructions envisagées par la présente invention, la première utilisation fait usage d'un fragment polynucléotidique associé à une sonde. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la locahsation du fragment, du miheu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. La sonde peut aussi permettre de suivre la dégradation du fragment. La nature de la sonde est de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. L'homme du métier saura quelle sonde est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Le fragment polynucléotidique, dont il est fait usage dans le cadre de cette première utilisation selon l'invention, peut être utilisé dans un test d'hybridation, un séquençage, un microséquençage ou bien un test de détection de mésappariement. Ce fragment selon l'invention contient au moins 18 nucleotides successifs, ces
18 nucleotides constituant une séquence qui correspond à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou à tout ou partie de l'un des gènes de l'invention du chromosome 5 ou tout ou partie de l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11. En particulier, un fragment selon l'invention peut ne contenir que 18 bases complémentaires de 18 bases successives de l'un des gènes de l'invention.
Selon un autre cas particulier, le fragment décrit peut être l'ADNc ou l'ARN de l'un des gènes précédemment décrits. Il peut correspondre à un ou plusieurs exons de l'un des gènes de l'invention, il peut correspondre à une séquence de régulation de l'un de ces gènes identifiés sur les chromosomes 3, 5 et 11. Dans le cadre de cette première utilisation, le nombre de fragments polynucléotidiques tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul.
En particulier, il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à l'un des gènes de l'invention au sein des régions chromosomiques de l'invention. De préférence, les séquences des différents fragments correspondent à des gènes de l'invention distincts ou à des exons distincts.
Cette première utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation. Selon un cas particulier envisagé, la première utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un fragment nucléotidique tel que décrit ou non.
Dans le cas où un gène responsable de la pigmentation est défectueux car muté, cette première utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un fragment polynucléotidique qui représente une nouvelle copie sauvage du gène endogène défectueux.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette première utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN antisense qui va bloquer la traduction dudit gène.
Une deuxième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à un gène choisi parmi les gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucleotides.
Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'un des gènes de l'invention identifiés par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction d'une séquence endogène comprise dans l'un de ces gènes de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette deuxième utilisation selon l'invention module non seulement la fonction d'un fragment d'ADN exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN endogène correspondant.
Le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à l'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3. Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à l'un des gène de l'invention du chromosome 5, ou bien à l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11. En particulier, il peut s'agir d'un plasmide ayant uniquement une courte séquence correspondante à l'un des gènes mentionnés. De préférence, la correspondance des séquences est établie sur au moins 18 nucleotides successifs.
Toutes les remarques qui précèdent, dans la partie définition, sur ce qu'il faut entendre par « fonction d'un fragment d'ADN » sont valables pour envisager toutes les utilisations correspondant à une deuxième utilisation selon l'invention. Etant donné la pluralité de fonctions des fragments d'ADN, la modulation de ces fonctions comprend des aspects très différents. Dans le cas particulier où la fonction dudit fragment est d'être transcrite, moduler une telle fonction consiste à favoriser ou inhiber la capacité dudit fragment à être transcrit. Cela peut aussi consister à modifier le site d'initiation et de terminaison de la transcription, ou bien à modifier le taux d'initiation de la transcription. Selon un autre cas, moduler la fonction peut aussi consister à modifier l'épissage de l'ARN, par exemple en modifiant des signaux de reconnaissance de l'ADN responsables la répartition entre introns et exons.
Quand le fragment d'ADN appartient à une séquence régulatrice, modifier sa fonction peut consister à inhiber la fixation des enhancers ou des inhibiteurs. Elle peut consister au contraire à favoriser leur fixation, ou bien à favoriser la fixation d'autres facteurs de transcription. Il en est de même lorsqu'il s'agit de séquences utilisées par l'ARN polymérase.
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, comme dans le cadre de toutes les autres utilisations selon l'invention, le nombre de produits, en l'occurrence d'agents modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention, n'est pas limité et peut être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette deuxième utilisation, les différents agents dont il est fait usage ont en commun de tous moduler la fonction de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 11 respectivement. Les différents agents peuvent moduler le même gène d'une des régions, ou bien différents gènes au sein d'une région de l'invention.
Des agents selon l'invention sont par exemple des molécules d'ADN simple brin capable de se fixer à des sous-régions définies de l'un des gènes de l'invention, pour former des triples hélices. Dans ces conditions, des agents selon l'invention abolissent la fonction de la sous-région à laquelle ils s'hybrident.
D'autres agents selon l'invention sont de préférence des polypeptides capables d'interagir avec des sous-régions définies de l'un des gènes de l'invention. De préférence, des agents selon l'invention sont des enhancers ou des inhibiteurs se fixant sur des régions régulatrices de l'un des gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou de l'un de ceux du chromosome 5 humain, ou de l'un de ceux du chromosome 11.
Une autre catégorie d'agents selon l'invention concerne des molécules capables d'interagir avec des régions précises de l'ADN pour en changer sa conformation. Une autre catégorie concerne des molécules interagissant avec des inhibiteurs ou des enhancers pour en modifier leur fonction, les inhibiteurs ou enhancers ayant la fonction initiale de modifier l'expression de fragments d'ADN appartenant à l'un des gènes de l'invention.
Un agent dont il est fait usage selon cette deuxième utilisation de l'invention peut en particulier moduler la fonction d'un fragment d'ADN correspondant à 18 bases successives de l'un des gènes précédemment décrits.
Cette deuxième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique. Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation. « ,
Selon un cas particulier envisagé, la seconde utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, par exemple, à sa région promotrice.
Dans le cas où l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va activer la transcription dudit gène, par exemple en se fixant à sa région promotrice, ou bien en se fixant à un éventuel inhibiteur qui cessera de ce fait d'inactiver ledit gène.
Une troisième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucleotides.
En particulier, un tel agent selon l'invention module la fonction d'un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3. Selon un autre cas, un agent selon l'invention module la fonction d'un polypeptide issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés. Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée, peut correspondre au moins en partie à un gène de l'invention du chromosome 5, ou bien à un gène de l'invention du chromosome 11.
Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'un des gènes de l'invention identifiés par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'une séquence endogène de l'un de ces gènes de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette troisième utihsation selon l'invention module non seulement la fonction d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN endogène correspondant.
Moduler la fonction d'un polypeptide peut être réalisé de différentes manières. En particulier, il est possible de croître ou décroître son activité, son rendement, sa spécificité, son avidité pour un anticorps, il est possible de modifier son substrat pour une enzyme, son taux de conversion.
Des agents selon l'invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention. D'autres agents remplissant les mêmes rôles peuvent être des molécules d'ADN simple brin, ou bien des molécules hybrides ADN-ARN. Le rôle de ces agents selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit.
D'autres agents préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables de se fixer sur ledit transcrit et ainsi d'en moduler sa traduction. De tels agents de la classe des polypeptides peuvent être d'origine naturelle ou synthétique (synthétisés chimiquement ou par voie biotechnologique). Notamment il peut s'agir d'anticorps. Comme mentionné plus haut, cette modulation peut se traduire par l'action de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit. En particulier, l'interaction entre le polypeptide et ledit transcrit peut constituer un obstacle à la fixation normale des ribosomes. Des agents tels que définis dans la présente invention peuvent moduler la fonction de la protéine codée par un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 ou l'un des gènes de l'invention du chromosome 5 ou l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11. Ces agents sont ou non de nature proteique. Un agent selon l'invention peut mtervenir à un stade précoce en empêchant le repliement correct de la protéine. Un agent selon l'invention peut aussi modifier la fonction de ladite protéine en modifiant sa structure tridimentionnelle après le repliement. Il est aussi envisageable que cet agent soit un inhibiteur de la protéine, en particulier un inhibiteur compétitif. Les agents qui peuvent convenir dans le cadre de la présente invention ne sont pas limités à ceux cités précédemment. *
Dans le cadre de cette troisième utihsation, le nombre d'agents modifiant la fonction d'un produit d'expression tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul. - Cependant, dans le cadre de cette troisième utilisation, les différents agents dont il est fait usage ont en commun de tous moduler la fonction de produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un gène d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 11 respectivement.
Cette troisième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique. Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la troisième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non. Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette troisième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN antisens qui va bloquer la traduction dudit gène en empêchant le passage ARN-protéine. Une autre situation préférée consiste à choisir pour agent un anticorps capable de se fixer sur la protéine résultant de la traduction dudit gène.
Une quatrième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. Dé préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucleotides.
En particulier, un tel produit d'expression est le transcrit ARN issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3, ou bien l'un des gènes de l'invention u chromosome 5, ou bien l'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11, quelque soit le stade de maturation dudit transcrit. En cas d'épissage, le transcrit peut donc être de taille inférieure au fragment d'ADN dont il est issu. De préférence, si le produit d'expression est une molécule d'ARN, elle comporte au moins 18 nucleotides. Selon un autre cas préféré, un produit d'expression selon l'invention est issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés. Un tel produit d'expression peut donc comporter moins de 6 acides aminés si le transcrit dont il est issu a subi des étapes d'épissage. De préférence, un produit d'expression peptidique contient au moins 6 acides aminés.
Le produit d'expression selon l'invention ne provient pas nécessairement des étapes de transcription ou de traduction d'ADN genomique. En particuher, un produit d'expression utilisé selon l'invention peut être un produit d'expression issu d'ADN exogène dont une partie de la séquence au moins correspond à une partie de l'un des gènes de l'invention.
Est aussi envisagée par la présente invention l'utilisation d'un agent parfaitement synthétique mais semblable au produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène ou endogène correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention.
Des produits d'expression tels qu'utilisés par la présente invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'un des gènes de l'invention. En particulier, pour former des ARN anti-sens ayant pour cible un ARN spécifique, il est envisageable d'utiliser des ARN issus de la transcription de la même séquence d'ADN que la cible mais non pas du brin leader, mais de sa séquence complémentaire portée par l'autre brin. On obtient ainsi des fragments d'ARN complémentaires des fragments cibles normalement synthétisés par la cellule. Le rôle attendu de ces produits d'expression selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction des transcrits normalement synthétisés par la cellule. D'autres produits d'expression préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables d'introduire un changement dans le fonctionnement de la cellule dans laquelle elles agissent.
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, le nombre de produits d'expression d'un fragment d'ADN dont la séquence appartient ou correspond au moins en partie à l'un des gènes de l'invention, n'est pas limité et peut être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette quatrième utilisation, les différents produits dont il est fait usage ont en commun d'être tous des produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'un gène d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 11 respectivement.
Cette quatrième utihsation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique. Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la quatrième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non. Dans le cas où l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utihsation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN anti-sens qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, au transcrit synthétisé par la cellule.
Dans le cas où l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant dans la cellule ou bien une molécule d'ARN permettant la synthèse de la protéine codée par le gène ou bien la protéine codée par le gène. Pour les quatre types d'utilisations décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation.
Pour les quatre types d'utilisation décrits précédemment, le produit de l'invention pourra être incorporé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique.
Une telle composition comprend, dans un miheu pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable, une quantité de produits de l'invention comprise entre 0,001 et 10 % en poids par volume.
La composition peut être administrée par voie orale ou appliquée sur la peau (sur toute zone cutanée du corps) et/ou le cuir chevelu ou les cheveux.
Par voie orale, la composition peut contenir le ou les produits de l'invention en solution dans un liquide alimentaire tel qu'une solution aqueuse ou hydroalcoolique, éventuellement aromatisée. Ils peuvent également être incorporés dans un excipient solide ingérable et se présenter par exemple sous forme de granulés, de pilules, de comprimés ou de dragées. Ils peuvent également être placés en solution dans un liquide alimentaire lui- même éventuellement conditionné dans des capsules ingérables.
Selon le mode d'administration, la composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées, particulièrement en cosmétologie.
Une composition préférée de l'invention est une composition cosmétique adaptée à une application topique sur le cuir chevelu et/ou la peau.
Pour une application topique, la composition utilisable peut être notamment sous la forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou sérum, d' émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle du type crème ou gel aqueux ou anhydres, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elle peut ainsi se présenter sous forme d'onguent, de teinture, de crème, de pommade, de poudre, de timbre, de tampon imbibé, de solution, d'émulsion ou de dispersion vésiculaire, de lotion, de gel, de spray, de suspension, de shampooing, d'aérosol ou de mousse. Elles peuvent être anhydres ou aqueuses. Elle peut également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. La composition peut en particuher être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les cheveux, de masque.
Lorsque l'invention consiste en une utihsation à des fins cosmétiques, la composition sera préférentiellement une crème, une lotion capillaire, un shampoîng ou un après-shampoing.
Les quantités des différents constituants des compositions utilisables sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés.
Lorsque la composition est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5% à 80% en poids, et de préférence de 5% à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les émulsionnants et les co-émulsionnants utihsés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. L'emulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% à 30% en poids, et de préférence de 0,5 à 20% en poids par rapport au poids total de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques.
Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus d
Dans une variante, la composition sera telle que le ou les produits de l'invention sont encapsulés dans un enrobage tel que des microsphères, des nanosphères, des oléosomes ou des nanocapsules, l'enrobage sera choisi selon la nature chimique du produit de l'invention. A titre d'exemple, les microsphères pourront être préparées selon la méthode décrite dans la demande de brevet EP 0 375 520.
Les nanosphères pourront se présenter sous forme de suspension aqueuse et être préparées selon les méthodes décrites dans les demandes de brevet FR 0015686 et FR 0101438. Les oléosomes consistent en une émulsion huile dans eau formée par des globules huileux pourvus d'un enrobage cristal liquide lamellaire dispersé dans une phase aqueuse (voir les demandes de brevet EP 0641 557 et EP 0705 593). Les produits de l'invention pourront aussi être encapsulés dans des nanocapsules consistant en un enrobage lamellaire obtenu à partir d'un tensio-actif siliconé (voir la demande de brevet EP 0 780 115), les nanocapsules pourront également être préparées à base de polyesters sulfonique hydrodispersibles (voir la demande de brevet FR 0113337). Les produits de l'invention pourront également être complexés à la surface de globules huileux cationiques, quelque soit leur taille (voir les demandes de brevet EP 1 010413, EP 1 010 414, EP 1 010415, EP 1 010 416, EP 1 013 338, EP 1 016453, EP 1 018 363, EP 1 020 219, EP 1 025 898, EP 1 120 101, EP 1 120 102, EP 1 129 684, EP 1 160005 et EP 1 172 077). Les produits de l'invention peuvent enfin être complexés à la surface de nanocapsules ou nanoparticules pourvues d'un enrobage lamellaire (Voir EP 0447 318 et EP 0 557489) et contenant un tensio-actif cationique à la surface (voir les références citées précédemment pour les tensio-actifs cationiques).
En particulier, on préférera une composition telle que l'enrobage du ou des produits de l'invention a un diamètre inférieur ou égal à 10 μm.
De façon connue, la composition peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique, et par exemple de 0,01% à 10% du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques.
Comme huiles ou cires utilisables, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffine. On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique). Comme émulsionnants utilisables, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de Tefose® 63 par la société Gattefosse. Comme solvants utilisables, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol, le propylène glycol.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles- on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et la silice hydrophobe, éthylcellulose, polyéthylène. Les compositions peuvent associer au moins un produit de l'invention à d'autres agents actifs. Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple :
- les agents modulant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation des cellules de la peau tels que le rétinol et ses esters, la vitamine D et ses dérivés, les oestrogènes tels que Toestradiol, les modulateurs de l'AMPc tels que les dérivés de POMC, l'adénosine, ou la forskoline et ses dérivés, les prostaglandines et leurs dérivés, la triiodotrionine et ses dérivés ; ;
- des extraits de végétaux tels que ceux d'Iridacées ou de soja, extraits pouvant alors contenir ou non des isoflavones ;
- des extraits de micro-organismes ; - les agents anti-radicaux libres tels que l' -tocophérol ou ses esters, les superoxyde dismutases ou ses mimétiques, certains chélatants de métaux ou l'acide ascorbique et ses esters ;
- les anti-séborrhéiques tels que certains acides aminés soufrés, l'acide 13-cis rétinoïque, l'acétate de cyprotérone ; - les autres agents de lutte contre les états desquamatifs du cuir chevelu comme le zinc pyrithione, le disulfure de sélénium, le climbazole, l'acide undécylénique, le Kétoconazole, lapiroctone olamine (octopirox) ou la ciclopiroctone (ciclopirox) ; en particulier, il pourra s'agir d'actifs stimulant la repousse et/ou favorisant le ralentissement de la chute des cheveux, on peut plus particulièrement citer à titre non limitatif :
- les esters d'acide nicotinique, dont notamment le nicotinate de tocophérol, le nicotinate de benzyle et les nicotinates d'alkyles en C1-C6 comme les nicotinates de méthyle ou d'hexyle ; - les dérivés de pyrimidine, comme le 2,4-diamino 6-piperidmopyrimidine 3- oxyde ou "Minoxidii" décrit dans les brevets US 4,139,619 et US 4,596,812 ;
- les agents inhibiteurs de hpoxygenase ou inducteur de cyclo-oxydase favorisant la repousse des cheveux comme ceux décrits par la Demanderesse dans la demande de brevet européen EP 0648 488 ;
- les agents antibactériens tels que les macrolides, les pyranosides et les tétracyclines, et notamment lΕrythromycine ;
- les agents antagonistes de calcium, comme la Cinnarizine, la Nimodipine et la Nifedipine ; - des hormones, telles que l'estriol ou des analogues, ou la thyroxine et ses sels ;
- des agents antiandrogènes, tels que l'oxendolone, la spironolactone et la flutamide ;
- des inhibiteurs stéroïdiens ou non stéroïdiens des, 5- -réductases tels que ceux décrits par là Demanderesse dans les demandes de brevet européen ËP 0964 852 et EP 1 068 858 ou encore le finastéride ;
- des agonistes des canaux potassiques dépendant de l'ATP tels que la cromakalim et le nicorandil.
Dans une autre possibilité de mise en œuvre, la présente invention concerne des procédés pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu. En effet, la canitie précoce est un phénotype qui a été défini par les inventeurs comme étant, entre autres, caractérisé par l'apparition des premiers cheveux blancs tôt dans la vie, et de préférence vers l'âge de 18 ans. Comme ce phénotype est transmis à la génération suivante, il peut s'avérer important, pour les individus dont un parent ou un proche est atteint, de déterminer, avant l'apparition des symptômes, s'ils seront ou non sujets à cette atteinte. Le procédé de diagnostic selon l'invention est parfaitement adapté aux individus âgés de moins de 18 ans.
Comme il est très probable que des facteurs environnementaux jouent un rôle dans le phénotype « canitie » comme dans celui « canitie précoce », il s'agit, grâce aux procédés de l'invention, d'évaluer les risques de développer un tel phénotype, c'est-à-dire une prédisposition à la canitie précoce.
Un procédé selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'un ou de plusieurs marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Par marqueur, on entend une séquence d'ADN dont les différentes variations alléliques sont porteuses d'informations. Un tel marqueur peut être une courte séquence d'un gène dont la mutation est source du phénotype. Il peut s'agir aussi d'un marqueur situé physiquement sur le chromosome dans une région très proche d'un gène impliqué dans la canitie précoce. De préférence, le marqueur est un SNP ('single nucleotide polymorphism').
Selon un premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 3 humain comprenant les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de l'un de ces gènes. Selon un deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 5 humain comprenant les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETF1, HSPA9B, PCDHAI à PCDHAI 3, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, ALI 33039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de l'un de ces gènes.
Selon un troisième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 11 humain comprenant les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. De préférence, les marqueurs sont choisis comme appartenant à la séquence de l'un de ces gènes.
L'étape suivante de la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour le ou les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents dans un échantillon de matériel génétique issu de l'individu qui subit le test diagnostique. Deux allèles différents, portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
L'échantillon contenant le matériel génétique peut être le sang, une unique goutte étant suffisante pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. D'autres échantillons de fluides corporels peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Il est aussi envisageable d'utiliser quelques cellules issues de l'individu. L'homme de l'art saura détern iner quel échantillon pourra être utilisé dans le cadre de ce test, tout en rninimisant le désagrément pour l'individu le subissant. Ce test diagnostic pourra éventuellement être couplé avec d'autres tests génétiques. Les techniques courantes, bien connues du biologiste moléculaire, peuvent être utilisées pour effectuer la détermination des allèles du ou des marqueurs choisis ; des tests d'hybridation sont en particulier très courants dans ce genre d'étapes.
Divers marqueurs sont potentiellement préférés dans le cadre de la mise en œuvre du procédé de l'invention. En particulier, des marqueurs bi-alléliques peuvent s'avérer particuherement adéquats si une forme alléhque traduit une prédisposition à la canitie précoce alors que l'autre forme »allélique reflète au contraire l'absence d'une telle prédisposition. D'autres marqueurs plus courants sont polymorphiques et peuvent être trouvés sous au moins deux formes alléliques et généralement plus de deux. Parmi les ήαarqueurs qui peuvent être sélectionnés à la première étape du procédé de l'invention, des marqueurs particuherement bien connus sont les SNPs. Lors de la sélection du marqueur, il est très important de se baser sur la valeur informative du polymorphisme du marqueur. Une situation particulièrement privilégiée consiste à sélectionner un marqueur dont certains variants alléliques traduisent une prédisposition à la canitie précoce alors que tous les autres variants reflètent au contraire l'absence d'une telle prédisposition. Dans de nombreuses situations, le marqueur ne remplit pas entièrement une telle condition, c'est-à-dire que par exemple certains allèles sont présents préférentiellement mais non exclusivement chez les individus prédisposés à la canitie. Dans ces situations, il peut être très judicieux de sélectionner plusieurs marqueurs, afin d'établir un test diagnostic aussi fiable que possible.
Lorsque les marqueurs sélectionnés sont des SNP, les différents variants alléliques correspondent à la modification d'une base. Une situation particulièrement avantageuse à rechercher lors de la sélection du marqueur, correspond à la situation où certains allèles (modification d'une base) sont caractéristiques d'une prédisposition à la canitie précoce. Selon le premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les SNPs du chromosome 3 mentionnés dans le tableau récapitulatif de l'exemple 2.
Selon le deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les SNPs du chromosome 5 mentionnés dans le tableau récapitulatif de l'exemple 2.
Selon le troisième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les SNPs du chromosome 11 mentionnés dans le tableau récapitulatif de l'exemple 2. Les procédés de l'invention ne sont pas limités aux deux étapes décrites et peuvent contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme alléhque du ou des marqueurs sélectionnés à la forme alléhque de ce ou de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'étabhr le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition. Etant donné que la canitie - précoce est une atteinte vraisemblablement multigénique, les causes de prédisposition sont nombreuses et peuvent difficilement être toutes envisagées de manière exhaustive. Par contre, au sein d'une même famille dont certains membres ont été précocement atteints de canitie, il est très probable que la cause de la susceptibilité est unique. De ce fait, lors de l'étape de comparaison, mentionnée comme éventuelle troisième étape des procédés de l'invention, une comparaison particulièrement riche en information est la comparaison des allèles du marqueur de l'individu subissant le test aux allèles du même marqueur pour les personnes de sa famille dont le phénotype est connu. Si plusieurs marqueurs ont été sélectionnés, il faut de préférence répéter cette opération pour tous les marqueurs. La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules ayant un effet particulier. En particulier, l'invention concerne un procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique. Selon le premier aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi. les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097. Selon le deuxième aspect de l'mvention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715. Enfin, selon le troisième aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction de l'un ou l'autre de ces fragments comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du fragment polynucléotidique. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le fragment polynucléotidique mise en évidence par une technique de détection de ligands.
La « deuxième utilisation selon l'invention » est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à un des gènes de l'invention. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents.,
Les différentes fonctions que peuvent revêtir un fragment polynucléotidique ont déjà été explicitées dans la présente demande. En particulier, ces fonctions dépendent de la nature du fragment polynucléotidique, selon s'il s'agit d'ADN ou d'ARN par exemple.
Une modulation de la fonction peut correspondre a une diminution de la capacité à être transcrit, ou traduit, ou bien à un changement dans la capacité à interagir avec d'autres facteurs. En fonction des propriétés dudit fragment utilisé, l'homme de l'art est capable de déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à monitorer.
Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées.
La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des fonctions des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain. Selon le deuxième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain. Selon le troisième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des 18 gènes du chromosome 11 humain. De préférence, le fragment d'ADN comprend au moins 18 nucleotides.
Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du produit d'expression. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit produit d'expression, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le produit d'expression mise en évidence par une technique de détection de ligands.
Comme mentionné précédemment dans la demande, on entend par produit d'expression d'un fragment d'ADN aussi bien les molécules , d'ARN issues de la transcription du fragment, à tout stade de maturation, que les polypeptides issus de la traduction, aussi à tout stade de maturation. Pour une molécule d'ARN, différents stades de maturation sont représentés par la présence ou l'absence de coiffe, de queue polyadénylée, par exemple. Par différents stades de maturation d'un polypeptide, on inclut entre autres les polypeptides avant et après le repliement, avant et après clivage des différents signaux d'adressage, avec et sans glycosylation, avec et sans ponts disulfure. Quant aux fonctions remplies par les produits d'expression des fragments d'ADN, elles sont très nombreuses et elles dépendent de la nature du produit d'expression en question. Des exemples ont déjà été donnés plus haut dans la présente demande.
La « troisième utihsation selon l'invention » est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents. Pour ce qui doit être compris par la locution « moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN », des exemples ont déjà été donnés pour définir la troisième utilisation selon l'invention.
En fonction des propriétés dudit produit d'expression utilisé, l'homme de l'art est capable de déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à suivre. Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées. La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé précédemment décrit. En particuher, la présente invention couvre les inhibiteurs des fonctions des produits d'expression des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention permet aussi de mettre en évidence les gènes imphqués dans la pigmentation de la peau, des cheveux et des phanères, au sein des trois zones chromosomiques de l'invention. Une utihsation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser des marqueurs SNPs au sein de chacune des régions chromosomiques d'intérêt dans le but de localiser plus finement les gènes impliqués dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux imphqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
La présente invention repose sur l'identification par les inventeurs de gènes, sur les chromosomes 3, '5 et 11 humains, impliquées dans le phénomène de pigmentation ou de dépigmentation. Cette base génétique leur a permis d'envisager lés utilisations en thérapie et en cosmétique décrites; précédemment, ainsi que les procédés de diagnostic, illustrés précédemment.
Mais comme déjà mentionné, les inventeurs soupçonnent que de nombreux gènes sont imphqués dans les phénomènes de pigmentation, et dans ceux liés à la régulation et la cessation de cette pigmentation.
De ce fait, les utilisations particulièrement préférées sont celles qui tirent partie de la combinaison des résultats obtenus pour les trois zones chromosomiques de l'invention.
En particulier, une première utilisation de combinaison dans le domaine de la cosmétique et de la thérapie, fait de préférence usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques dont la séquence de chacun correspond, au moins en partie, à celle d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien à celle d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien à celle d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
De plus, dans une autre demande de brevet, déposée le même jour par le même demandeur, les inventeurs ont aussi mis en évidence par une méthode similaire, d'autres gènes impliqués aussi dans le phénomène de pigmentation ou dépigmentation, sur les chromosomes 6 (entre les marqueurs D6S1629 et D6S257) et 9 (entie le marqueur D9S290 et la région télomérique),. Cette base génétique leur a permis d'envisager des utilisations en thérapie et en cosmétique similaires à celles décrites précédemment, ainsi que des procédés de diagnostic similaires à ceux illustrés précédemment. De préférence, il est donc fait usage de deux fragments ou plus, la séquence d'au moins un correspondant, au moins en partie, à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, la séquence de l'autre ou des autres correspondant, au moins en partie, ou bien à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, ou bien à celle d'un gène du chromosome 6 humain choisi parmi les gènes HLAG, NT_007592.445, NT_.007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPA1B, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA- DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459 et NT_007592.457, ou bien à celle d'un gène du chromosome 9 humain choisi parmi les gènes FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les différents fragments polynucléotidiques dont il est fait usage, au moins deux ont des séquences correspondant à deux chromosomes distincts, ou à deux gènes distincts. IL est aussi envisageable que pour un même gène, les différents fragments dont il est fait usage aient des natures chimiques différentes, par exemple de l'ADN pour le premier fragment et de l'ARN pour le second. Il est aussi envisageable que différents fragments aient une séquence correspondant au même gène, mais avec les faibles variations permises par la définition de « séquences correspondances », c'est-à-dire au plus un nucleotide différent sur 10, de préférence 1 sur 100. Les fragments contiennent au moins 18 nucleotides successifs, ces 18 nucleotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucleotides successifs correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.
Toutes les utilisations préférées, la nature chimique des fragments, leur environnement, ont déjà été explicités en détails dans la partie décrivant la première utilisation selon l'invention.
Lorsqu'il est fait usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques, ces deux fragments sont de préférence portés par des molécules distinctes. Il est aussi envisageable que ces deux fragments fassent partie par exemple d'un même vecteur. Selon un cas préféré, les différents fragments sont de même nature chimique, par exemple de l'ADN pour tous les fragments.
Pour les utilisations en thérapeutique, les fragments polynucléotidiques entrent dans la fabrication d'un médicament. Une deuxième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux agents ou plus, l'un au moins modulant la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des gènes précédemment mentionnés sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres agents modulant chacun la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène de l'invention ou d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT_007592.445,.NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMAj BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4. De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts, ou deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique, les différents agents dont il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même fragment d'ADN. Les fragments d'ADN dont la fonction est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucleotides successifs, ces 18 nucleotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucleotides successifs correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention. Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la deuxième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament. Une troisième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux agents ou plus, l'un au moins modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des gènes ;de l'invention sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres agents modulant chacun la fonction du produit d'expression d'un -'fragment d'ADN choisi parmi, les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des gènes précédemment mentionnés, ou bien à tout ou partie d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT_ 007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT .007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction du produit d'expression de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts, ou deux gènes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique de l'invention, les différents agents dont il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même produit d'expression d'un fragment d'ADN, ou bien modulent différents produits d'expression d'un fragment d'ADN, par exemple les ARN à différents stades de maturation, ou bien les ARN issus de différents épissages.
Les fragments d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucleotides successifs, ces 18 nucleotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'une des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucleotides successifs correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention. Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la troisième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament. Une quatrième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux produits d'expression de fragments d'ADN choisis parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien d'un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux produits d'expression ou plus, l'un au moins est le produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un des gènes de l'invention, le ou les autres étant chacun le produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie d'un gène de l'invention ou d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT_007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLH1, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
De préférence, parmi les différents produits d'expression dont il est fait usage, au moins deux sont issus de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts, ou à deux gènes distincts II est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique de l'invention, les différents produits d'expression dont il est fait usage soient issus d'un même fragment d'ADN, il peut s'agir par exemple des ARN à différents stades de maturation, ou bien des ARN issus de différents épissages. Les mêmes possibilités sont offertes pour les polypeptides issus de la traduction des ARN. Les fragments d'ADN dont les produits d'expression sont utilisés selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucleotides successifs, ces 18 nucleotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'un des gènes mentionnés. L'un des fragments contient au moins 18 nucleotides successifs correspondant au moins partiellement à l'un des gènes de l'invention.
Toutes les utilisations préférées de tels produits d'expression ont déjà été explicitées en détails dans la partie décrivant la quatrième utilisation selon l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, les produits d'expression entrent dans la fabrication d'un médicament.
Pour les quatre types d'utilisations de combinaison décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation. Parmi les nombreuses combinaisons envisagées par la présente invention, une combinaison très intéressante comprend au moins un fragment polynucléotidique ou un produit d'expression d'une séquence correspondant à tout ou partie du gène DDX31 ou GTF3C4 du chromosome 9 humain. . ;< •,
Afin de tirer profit de la combinaison de ces zones chromosomiques, la présente invention concerne aussi des procédés de combinaison. Ces procédés sont mis en œuvre pour la détermination d'une éventuelle prédisposition à la canitie précoce.
Un procédé de combinaison selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'au moins deux marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Les marqueurs sélectionnés sont choisis parmi les marqueurs appartenant à la région du chromosome 3 humain comprenant les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, les marqueurs appartenant à la région du chromosome 5 humain comprenant les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715 et les marqueurs appartenant à la région du chromosome 11 humain comprenant les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650. Des marqueurs préférés appartiennent à l'un de ces gènes. Selon une variante du procédé, l'un au moins des marqueurs sélectionnés est choisi parmi les marqueurs appartenant à l'une des régions précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres marqueurs sélectionnés appartenant aux régions chromosomiques précédemment mentionnées, ou bien à celle du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, ou bien à celle du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long). Sur les chromosomes 6 et 9, les marqueurs sont de préférence au sein d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT_ 007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLHl, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4. De préférence, parmi les marqueurs sélectionnés, deux au moins n'appartiennent pas à la même région chromosomique de l'invention, au même gène de l'invention.
L'étape suivante de la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents >dans un échantillon de matériel génétique issu de; l'individu qui subit le test diagnostique? Deux. allèles différents, portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
Les modalités de mise en oeuvre de ces procédés ont déjà été explicitées dans la partie consacrée aux procédés de diagnostic.
Pour les quatre types d'utilisation de combinaison décrits précédemment, les combinaisons de l'invention pourront être incorporées dans une composition cosmétique ou pharmaceutique telle que décrite plus haut.
Les procédés de combinaison de l'invention ne sont pas hmités à l'utilisation de deux marqueurs, ils ne sont pas limités non plus aux deux étapes décrites et peuvent contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de combinaison de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme alléhque des marqueurs sélectionnés à la forme alléhque de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'établir le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
Comme pour les procédés de diagnostic déjà mentionnés dans la présente demande, une situation particulièrement intéressante consiste à comparer les allèles des marqueurs sélectionnés aux allèles de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus de la même famille que l'individu à diagnostiquer.
La présente invention permet enfin de mettre en évidence les gènes imphqués dans la pigmentation de la peau, des cheveux et des phanères, au sein des cinq zones chromosomiques mentionnées. Une utilisation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser une combinaison des marqueurs SNPs au sein de chacune des régions chromosomiques d'intérêt dans le but de localiser plus finement les gènes impliqués dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères. Enfin, la présente invention concerne un kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un des 5 gènes de l'invention du chromosome 3 humain, ou bien d?un des gènes de l'invention du chromosome 5 humain, . ou bien d'un des 18 gènes de l'invention du chromosome 11 humain.
Selon une variante du kit, celui-ci comprend deux fragments ou plus, la séquence d'au moins un correspondant, au moins en partie, à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, la séquence de l'autre ou de chacun des autres correspondant, au moins en partie, ou à celles précédemment mentionnées, ou bien à celle d'un gène choisi parmi les gènes HLAG, NT_007592.445, NT_007592.446, NT_007592.506, NT_007592.507, NT_007592.508, HSPAIB, G8, NEUl, NG22, BAT8, HLA-DMB, HLA-DMA, BRD2, HLA-DQA1, HLA-DQA2, NT_007592.588, GRM4, RNF23, FLJ22638, NT_007592.459, NT_007592.457, FREQ, NT_030046.18, NT_030046.17, GTF3C5, CEL, CELL, FS, ABO, BARLHl, DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Des gènes préférés sont les gènes DDX31 et GTF3C4.
Légende des figures
Figure 1 : Composition des familles analysées pour liaison avec la région-candidate Figure 2 : Région candidate pour la CP sur le chromosome 3 : Localisation chromosomique et distribution des marqueurs Figure 3 : Représentation graphique des scores NPL obtenus pour l'analyse de liaison non-paramétrique multipoints génome global sur les familles CP pour les chromosomes retenus.
Abscisse = position sur la carte génétique (0 = pter) Ordonnée = score NPL
Figure 3A : Chromosomes 3 et 5 ; Figure 3B : Chromosomes 6 et 9
Figure 3C : Chromosomel 1 Figure 4 : Représentation schématique des loci CP identifiés sur les chromosomes 11,
5 et 3 par l'étude génome global. La distance entre marqueurs est indiquée en cM.
Figure 4A : Chromosome 11, locus 11 ql4-q22
Figure 4B : Chromosome 5, locus 5q31-q32 - ».
Figure 4C : Chromosome 3, locus 3pl4.1-pl2.3
Figure 4D : Chromosome 6, locus6p21 -p 12 Figure 4E : Chromosome 9, locus 9q34
Figure 5 : Lod scores simulés pour les 29 familles sélectionnées. *
Dans l'ordre, les colonnes affichent le Lod score moyen, la déviation standard, le Lod score minimum, le Lod score maximum et le groupe (A-E) dans lequel la famille se place selon son score. Figure 6 : Lod scores potentiels par famille en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP. Figure 7 : Lod scores détaillé par famille en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP : nouvelle simulation après collection des nouvelles familles.
Figure 8 : Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche des régions chromosomiques candidates. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille. Figure 9 : Probabilité (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité. Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 10 : Comparaison de la composition des familles entre l'analyse régions- candidates et l'analyse Génome-global. Figure 11 : Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité de la CP. Les résultats sont exprimés par famille. Figure 12 : Probabilité (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité. Les résultats sont exprimés par famille. Figure 13 : Composition des 4 pools. Les pools AI et Ail sont composés d'individus atteints de canitie précoce. Les deux pools contrôles BI et BH sont composés d'individus « croisés » pour origine et âge avec les individus atteints de canitie précoce.
EXEMPLES
EXEMPLE 1
Résumé des travauk effectués
Afin de localiser le ou les gènes de la canitie précoce (CP), il a été réalisé un programme d'analyse de ségrégations (liaison génétique) chez des familles où ce trait se transmet à travers les générations. Au terme d'une série de présélections sur la base de la puissance statistique de l'échantillon et de la confirmation des phénotypes, douze familles sont retenues pour participer à une étude de liaison et l'ADN fut préparé à partir d'un échantillon de sang périphérique de chacun des individus infoπnatifs (présentant et ne présentant pas le trait). L'étude a été réalisée selon deux approches principales, analyse ciblée sur une région-candidate et étude génome-global sur les vingt-deux chromosomes autosomiques et le chromosome X.
De l'ensemble des analyses réalisées en fixant ou ne fixant pas des paramètres pour la transmission du trait de CP, 3 loci potentiels se dégagent sur les chromosomes 11, 5 et 3 en plus de ceux identifiés sur les chromosomes 6 et 9. Les trois loci (chromosomes Ilql4-q22, 5q31-q32, 3ρl4.1-pl2.3) montrent des signes suggestifs de liaison à la CP.
Cette étude, et en particulier la discordance entre les scores obtenus pour les analyses paramétrique/non-paramétrique, suggère que la canitie précoce ne serait pas provoquée par un petit nombre de gènes à effet majeur, mais serait plutôt gouvernée par un système multifactoriel incluant l'action de plusieurs gènes de prédisposition. INTRODUCTION
Le caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie, est une hypothèse proposée depuis bien longtemps, du fait du caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains.
Pour explorer la canitie de par son aspect génétique, il a été réahsé une étude de ségrégation de l' ADN chez des familles dont la canitie apparaît très tôt dans la vie. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette chasse aux gènes, la composition de l'échantillon pour l'étude s'est déroulée selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype CP fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans. Les familles furent retenues pour l'étude sur. la base; de leurs performances statistiques dans l'analyse de ségrégation.
La partie de l'étude réahsée est décrite selon quatre époques principales:
A- Epoque 1: Détermination du potentiel de l'étude. Un première sélection des familles les plus informatives est réalisée par une simulation d'analyse de liaison. B- Epoque 2: Confirmation médicale des phénotypes et collection des échantillons sanguins chez les familles présélectionnées. Cette campagne de vérification aboutit à une nouvelle liste de familles candidates pour l'étude. Une nouvelle simulation de liaison permet d'estimer le potentiel de F échantillon corrigé. C- Epoque 3: Analyse de liaison génétique avec la région chromosomique candidate pour la CP. Première phase d'analyse des ADNs pour la région chromosomique qui pourrait contenir les gènes de la CP. D- Epoque 4: Analyse de liaison génétique globale de la CP sur tout le génome humain. Analyse de ségrégations familiales sur l'ADN des 22 chromosomes autosomiques et le chromosome X afin de détecter les régions qui se lient au trait CP.
Les résultats obtenus à chaque époque sont présentés sous forme de tableaux et de figures de manière synthétique dans les tableaux récapitulatifs ou de manière profonde dans les tableaux détaillés. RESULTATS
A- Epoque 1: Choix des familles avec l'aide de la simulation d'analyse de liaison
Au terme d'une tentative de sélection des familles avec une canitie précoce selon des critères d'informativité pour une localisation génique, 29 familles ont été soumises à une simulation d'analyse de haison génétique. Sur la base de la disponibilité de tous les individus, il s'avérait que ce projet possédait un potentiel de succès très encourageant car dix-neuf pedigrees (soit 255 individus) furent alors retenus. Cette conclusion n'étant valable que si les phénotypes sont confirmés et si la majorité des sujets acceptent de participer à l'étude. Parmi cette sélection se trouvent sept familles très informatives qui individuellement pourraient atteindre ou dépasser un Lod score Z≈4.00 (soit plus que la limite inférieure de significativité du Lod score qui est de Z=3.0Q). Afin de rassembler un maximum de chance de succès, il était très important que le diagnostic de CP soit attribué avec rigueur.
Le résultat de cette étude permet, selon la robustesse de l'évaluation clinique, de qualifier les familles qui sont ensuite collectées pour l'étude génétique.
1. Critères pour l'attribution du phénotype CP
Vingt-neuf familles parmi les 65, ont été retenues, sur des critères de structure (nombre d'individus total, atteints, disponibles), pour être analysées en simulation. Lors du processus de simulation: a) un logiciel génère une série de réplicats du fichier code en assignant des génotypes simulés. Le fichier obtenu pour chaque famille explore plusieurs combinaisons alléliques (génotypes) chez chacun des individus, b) un logiciel vient ensuite analyser chacun des réplicats pour estimer les Lod scores (Z) possibles de analyse de liaison génétique chez chaque famille. Les résultats, sous forme de Lod scores minimum, moyen et maximum permettent ainsi d'évaluer le potentiel de chaque famille dans ce type d'étude. Evidemment, ces estimations ne restent valables que dans le cas où chaque individu s'est vu attribuer un phénotype correct. En cas d'incertitude, le phénotype doit être indiqué comme inconnu; il n'est alors pas pris en compte dans l'étude et donc ne nécessite pas d'être prélevé. Le Lod score diminue (dans des proportions variables) chaque fois qu'un individu est enlevé pour phénotype incertain. Les arbres généalogiques ont été redessinés à l'aide d'un logiciel de gestion de pedigrees, qui construit également les fichiers codés (fichiers prephnk) pour l'analyse de liaison génétique. En plus des codes indiquant pour chaque individu, les liens de parenté, le sexe, le phénotype ainsi que le génotype qui sera incréments par le logiciel de simulation SLENK, un code de disponibilité (cd) (tableau 1) est attribué. Il pondère ainsi, par un code de 0 à 3, le caractère informatif de chaque individu dans l'étude.
Le phénotype de chaque individu fut assigné d'après les informations figurant dans les pedigrees et les tableaux de description du rapport Genormax. Toutefois, pour certains individus, le phénotype a été modifié d'après les critères indiqués dans le tableau 2. Les individus, non-présents sur les pedigrees initiaux (identifiés par un numéro seulement) ont été portés phénotypiquement inconnu, et sont été considérés indisponibles (cd=3).
a. Codes de disponibilité
Lors de la simulation, n'ont été pris en compte que les individus pour lesquels (tableau 1):
- il sera possible, d'après l'étude Genormax, de prélever du sang en vue de préparer l'ADN pour les étude de génétique (âge, domicile en France métropohtaine/outre- mer/étranger, consentement à priori);
- le phénotype de canitie précoce aura été clairement défini (tableau 2).
Tableau 1: Définition des codes de disponibihté
Tableau 2: Définition des phénotypes
b. Assignation du phénotype selon l'âge
Afin d'écarter les risques d'erreurs, les critères suivants ont été définis pour l'assignation du phénotype en fonction de l'âge chez les individus de moins de 30 ans. Toutefois, lors de l'examen clinique final, il est souhaitable que la définition du phénotype soit plus quantitative.
c. Autres paramètres
Après examen de la variation du Lod score maximum chez la famille Can65 (test 100, 200, 300, 500 réplications), le nombre de réplications (générations des combinaisons alléliques) a finalement été fixé à 200. • • , La fréquence du trait a été fixée à 1%. Le nombre d' allèles possibles pour le génotype est fixé à 6 avec une fréquence équivalente pour chacun.
2. Résultats
a- Classification des familles selon leurs scores
Le tableau 3 donne une indication du potentiel des familles GENORMAX en fonction du Lod score maximum (Zmax) atteint (groupe A-E). La figure 5 rapporte le Lod score simulé pour chaque famille.
Tableau 3: Statistiques familles/Lod scores maximum. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 5.
Le Lod score maximum ne peut être atteint que lorsqu'un marqueur de l'ADN est informatif à 100% dans une famille. Le plus souvent, même avec le type de marqueurs utilisés (les marqueurs les plus informatifs dans les régions chromosomiques à visiter), le Lod score n'atteindra pas sa valeur maximum.
En analyse de liaison génétique, pour être significatif, le Lod score doit atteindre ou excéder la valeur de 3 (résultat à 1000/1). b- Effet d'un diagnostic incorrect sur les résultats d'analyse de liaison
L'effet de l'attribution d'un diagnostic incorrect a été testé sur les résultats d'analyse (en cas de liaison à un locus) par une simulation sur la famille Can46 en variant le phénotype de 1,2 ou 3 individus (tableau 4).
Tableau 4: Lod score obtenus pour une série de distances du marqueur au locus du trait (Lod score maximum en gras).
1- selon le diagnostic actuel (lod score maximum) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score \2.28 2.24 2.08 1.88 1-44 0.95 0.43 a
2- 3 individus incorrectement diagnostiqués (A2, RIO, R19) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score -3.89 -1.75 -0.90 -0.50 -0.14 -0.01 0.01 a 3- 2 individus incorrectement diagnostiqués (A2 , R19) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
Lod score -2 . 85 -0 . 75 -0 . 05 0 .22 0.36 0 .30 0 . 17 a
4- 1 individu incorrectement diagnostiqué (R19) distance 0 . 0 0 . 01 0 . 05 0 . 1 0 . 2 0 .3 0 .4
Lod score 1.24 1.24 1 .23 1. 16 0 . 94 0 . 63 0 . 27 a
3. Discussion, conclusion et décisions
Cette étude de simulation permet de placer les 29 familles présélectionnées en 5 groupes selon le Lod score maximum potentiel. Bien qu'une liaison soit significative dès que la valeur de Lod score de Z=3.00 est atteinte, les inventeurs ont préféré distinguer 2 groupes lorsque ce critère est vérifié car le Lod score simulé maximum est très rarement atteint. Ainsi la probabilité que le Lod score réel pour des familles se plaçant dans le groupe B (3<Zmax<4) est assez faible.
Les familles du groupe A seront informatives dans une analyse de liaison génétique pour la localisation du/des gènes de la canitie précoce. Pour cela, aucune incertitude ne doit subsister quant au phénotype. Dans le doute, il est conseillé d'exclure des individus, voire des familles de l'étude. Toutefois, chez certaines de ces familles, la proportion élevée d'individus atteints/non-atteints (parfois tous les enfants atteints) doit inciter à une extrême méfiance sur le caractère génétique à 100% du trait. Bien entendu, il n'est pas exclu que dans certaines familles, le gène CP ait été transmis simultanément par les branches paternelle et maternelle de la première génération. Dans ce cas, les petits enfants seraient tous atteints (Can28, 43, 53...). Afin de pouvoir considérer positivement ces quelques familles, il est hautement souhaitable de vérifier cette hypothèse.
Les familles du groupe B sont elles-mêmes très intéressantes car elles permettent d'étoffer l'échantillon, même si individuellement elles ne pourront accéder à un Lod score significatif dans la plupart des cas. En groupe, elles peuvent cependant permettre de consolider le Lod score, spécialement s'il s'avère que le trait était génétiquement hétérogène (légèrement).
Les familles du groupe C, peuvent être également utilisées dans des études de réplications des résultats de liaison génétique. Les familles des groupes D et E (Zmax<2) sont peu informatives pour une analyse de haison génétique.
Il semble, sous réserve d'une caractérisation clinique robuste, que les familles des groupes A,B et C sont appropriées pour une étude d'analyse de haison génétique et qu'elles doivent être collectées (individus avec cd=2). En effet, les analyses de liaison génétique réalisées sur des échantillons insuffisamment caractérisés sont vouées à l'échec ou à un "pâle" résultat (locus imprécis). Etant donné, que dans de telles analyses, certains paramètres ne peuvent être sous total contrôle (en particulier l'informativité des génotypes), et que l'hétérogénéité génétique toujours possible rend la tâche plus délicate (car elle réduit la puissance de l'analyse sur l'ensemble des familles), il semble donc indispensable de rassembler dès le départ tous les atouts qui peuvent être gérés. Dans cette première étape, les inventeurs ont donc fortement recommandé que le phénotype de chaque individu avec un code de disponibilité approprié (cd=2) soit soigneusement vérifié avant collection (phénotype confirmé, ou exclusion de l' échantillon/de la famille).
B- Epoque 2: Collection des échantillons, confirmation des phénotypes et nouvelles estimations du potentiel de l'étude
Sur la base des résultats de l'époque 1, les 19 familles (groupes A, B, et C) retenues pour former une banque dans laquelle seront prélevés les pedigrees pour les analyses de liaison génétique, furent contactées pour confirmation du diagnostic CP et collection d'une série d'individus atteints et non atteints.
Cette campagne de vérification médicale des phénotypes a permis de corifirmer un grand nombre des diagnostiques CP, mais pas tous comme prévu. Le refus de quelques individus clés (atteints de CP) de participer au projet, le décès de certains ainsi que réajustement d'une partie des phénotypes a conduit à ne pas retenir un certain nombre de familles et réduit le potentiel d'informativité de plusieurs autres familles.
1- Ré-estimation du potentiel de l'étude après confirmation des phénotypes
Afin de ré-estimer le potentiel de l'étude après la vérification des phénotypes, les inventeurs ont simulé une analyse de haison sur les 8 familles; qui pouvaient encore être informatives. Le tableau 5 présente les résultats obtenus pour l'ensemble des 8 familles dans 3 situations d'hétérogénéité génétique (0%, soit toutes les familles liées au même locus, 50% ou seulement la moitié des familles liées au locus, ,70% ou seulement environ un tiers des familles liées).
Tableau 5: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP
Les résultats détaillés par familles figurent dans le tableau de la figure 6.
Taux d'
Hétérogénéité Moyen Si ;dDev Minimun Maximum Max époque1
0% 5.094620 1. .679698 1.221207 8.835722 38.823
50% 1.619190 1. .553049 0.000000 7.409957 -
70% 0.835383 1. .022004 0.000000 5.517145 _
2- Conclusion
Dans un effort continuel pour l'optimisation de l'échantillon pour les analyses de liaison, 4 familles supplémentaires ont été identifiées (tableau 6; 2 familles -can65B et can46B- sont des branches collatérales des familles can65 et can46) et les phénotypes de nouveau vérifiés. Tableau 6: Liste finale des familles
1 C103974
2 F104512
3 CAN33
4 CAN35
5 CAN43
6 CAN46
7 CAN46B
8 Çan53,.
9 CAN55
10 CAN62
11 CAN65
12 CAN65B
Après une nouvelle simulation (tableau 7), il s'avère que le Lod score maximum général de liaison est à peine supérieur (Z=8.91) si les 12 familles retenues (phénotypes strictement définis) sont liées au même locus. L'augmentation attendue du Lod score par l'apport de nouvelles familles est cependant réduite par la correction et le durcissement des phénotypes.
Tableau 7: Nouvelle simulation après collection des nouvelles familles. Les Lod scores potentiels sont exprimés en fonction du taux d'hétérogénéité génétique.
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 7.
Taux d'
Hé érogénéité Moyen StdDev Minimun Maximum
0% 4.752321 1.748924 0.356854 8.914062
50% 1.535356 1.418022 0.000000 6.078132
70% 0.719737 0.978920 0.000000 5.282466
La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z=1.0, Z=2.0, Z=3.0 respectivement et qui donne une approximation de la chance de trouver une liaison significative (tableau 8). Tableau 8: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité
Taux d' hétérogénéité 0% 50% 70% Lod score 1 . 000 99.500 57.000 27.000 2 . 000 95.500 31.000 8.500 3 . 000 84.500 14.000 3.500
C- Epoque 3: Analyse de liaison génétique de la CP avec la région candidate
1- Hypothèse La région 3pl4.1-pl2.3 est dite « région-candidate » (RC) car elle est associée à la canitie précoce par le biais de la maladie de Klein Waardenburg (type IIA) à laquelle le trait est associé.
2- Composition finale des familles
Dans un souci d'optimisation technique, un échantillon de 92 individus atteints et non-atteints parmi les 12 familles est retenu (voir figure 1). Cette sélection est formée en fonction de l'informativité potentielle de chaque individu et confirmée par une nouvelle simulation de liaison. L'ajout de quelques individus conduit à une légère augmentation du Lod score potentiel (de 8.91 à 9.04, selon homogénéité complète, tableau 9) et donc de la puissance de l'échantillon (tableau 10).
Tableau 9: Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche sur la région chromosomique candidate. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 8.
Taux d' hétérogène:. .té Moyen StdDev Minimun Maximum
0% 4.367608 1.649267 0.564761 9.042465
50% 1.354325 1.359845 0.000000 6.610168
70% 0.666549 0.891330 0.000000 4.988076
90% 0.222622 0.378039 0.000000 2.528617 Tableau 10: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 9.
Taux d' hétêrogénéi .té 0% 50% 70% 90%
Lod score
1.000 98, .000 48.500 21.500 4.000
2.000 94, .500 23.500 9.500 0.500
3.000 79, .000 12.000 3.000 0.000
3- Marqueurs microsatellites utilisés •. La distribution des marqueurs sur la région candidate du chromosome 3 est présentée dans la figure 2.
4- Analyses de liaison
Plusieurs types d'analyses de liaison ont été réalisés afin d'augmenter la probabihté d'observer une haison existante entre cette région chromosomique et la CP. Pour cette analyse, les deux approches suivantes ont été réalisées:
- 2-points (analyse itérative entre le trait et les marqueurs pris un-à-un);
- multipoints (analyse pour chaque chromosome selon une carte de marqueurs placés en fonction de leurs distances respectives).
1. Analyses avec paramètres définis, paramétriques (PL): Mode de transmission (dominant), fréquence du trait (1%), équifréquence des allèles de marqueurs testés et pénétrance (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants). Méthode 2- points et multipoints.
2. Analyse indépendante du mode de transmission du trait, non-paramétrique (NPL): Analyse de déviation de la proportion d' allèles partagés pour chaque paire d'individus atteints (dans chaque famille par identité par descendance) par rapport à une transmission au hasard. Dans l'analyse multipoints, toutes les paires d'atteints (ail-pairs, score Z-all≈logio de p-values, et p-values) ont été considérées. Dans la méthode 2- points, ce sont les paires de germains qui ont été étudiées (affected sib-pair, p-values).
5- Résultats Les résultats sont exposés dans le tableau 11. Tableau 11 : Résultat de l'analyse de liaison sur la région-candidate
Quand seule une position est indiquée, et non pas un nom de marqueur, cela signifie que la position est intermédiaire entre 2 marqueurs.
6- Discussion et conclusion
Cette étude distingue un locus fortement suggéré de prédisposition à la canitie précoce sur le chromosome 3pl4-pl2 (vers les marqueurs D3S2409 et D3S1766; multipoints NPL= 2.58 à la position 12 et HLod:=1.55 à la position 24).
Ce résultat documente positivement les présomptions d'association qui portent sur la région chromosomique 3pl4-P12 vis-à-vis de la canitie précoce.
Il est à noter qu'une famille (CAN53) montre une haison relativement élevée pour cette région chromosomique.
D- Epoque 4: Analyse de liaison génétique globale de la CP avec le génome.
L'analyse globale du génome permet de faire une visite de tous les chromosomes (un sondage global) afin de trouver des régions impliquées et éventuellement un locus majeur qui gouvernerait la canitie précoce. Cette grande analyse permet également d'estimer le taux d'hétérogénéité génétique de la CP.
1- Contenu des familles
Ce sont les mêmes familles que celles qui ont été étudiées dans la phase régions- candidates (époque 3), mais avec cependant un ajustement de certaines dans leur contenu (voir tableau 12). Certains membres peu informatifs ont été remplacés par d'autres, plus récemment recrutés, ou dont le diagnostic a été précisé plus tardivement.
Afin de confirmer le bénéfice de l'évolution de l'échantillon, une nouvelle simulation d'analyse de haison a été réalisée pour différentes situations d'hétérogénéité génétique (tableau 13 et tableaux des figures 11A, 11B, 11C et 11D). Les Lods scores exprimés montrent une évolution favorable. Ainsi, considérant le Lod score moyen possible, il serait possible d'obtenir un résultat significatif (Z>3.0) pour une hétérogénéité atteignant 20% (soit 1/5 des familles non liées au locus). En fait, ce résultat est très conservateur et il serait possible d'atteindre la significativité avec un échantillon nettement plus hétérogène (soit 50-70% avec l'utilisation de marqueurs microsatellites montrant une hétérozygosité moyenne dé 0.7).
Tableau 12 : Comparaison du nombre d'individus étudiés dans chaque familles entre l'analyse régions-candidates et l'analyse génome-global, (détail composition des familles, tableau de la figure 10)
familles Région Candidate Génome Global
A35 11 11
A46 12 12
A65 5 9
A53 8 9
B43 7 7
B55 7 7
C33 6 6
C62 6 6
A46B 6 7
A65B 6 6
103974 12 10
104512 6 6
Total individus 92 96 Tableau 13: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP
Les résultats détaillés figurent dans les tableaux de la figure 11.
Taux d' hétérogénéité Moyen StdDev Minimun Maximum
0% 4.751841 1.749689 0.334792 9.338889
20% 3.115806 1.866821 0.024841 8.780452
50% 1.378378 1.467071 0.000000 7.508479
70% ,0.672997 0.904472 . 0.000000 5.226281
* 90% 0.242418 0.402384 0.000000 2.722478
La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications (de, génotypes) qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z≈l.0, Z=2.0, Z=3.0 respectifs. La probabihte de trouver une liaison significative (tableau 14 et figure 12) avec 4/5 des familles hées au même locus est de 50%. Ce résultat est basé sur un lod score moyen qui est conservateur.
Tableau 14: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 12.
Taux d' hétérogène:ité 0% 20% 50% 70% 90%
1.000 99.000 87.500 47.000 23.000 5.500
2.000 93.500 69.500 25.500 11.500 0.500
3.000 84.000 48.500 15.000 3.500 0.000
Les analyses peuvent donc indiquer des liaisons significatives si l'hétérogénéité de l'échantillon ne dépasse pas 20 % (soit seulement 1/5 des familles ne se liant pas à un locus majeur unique), mais il est encore possible d'identifier une liaison dans le cas où la moitié des familles ne sont pas liées à ce locus. 2- Marqueurs de l'ADN
L'ADN de 96 individus appartenant aux 12 familles sélectionnées a été génotype pour 400 marqueurs polymorphes distribués sur les 22 autosomes et le chromosome X (tableau 15) selon un intervalle inter- arqueurs moyen de 9.2 cM (densité). Ce sont des microsatellites de l'ADN, qui sont composés de répétitions en tandem de type dinucléotidique (CA)„ de la collection du Généthon (Evry, France).
Tableau 15: Nombre de marqueurs analysés pour chaque chromosome durant le génome wide scan
Le taux d'hétérozygosité moyen observé est de 0.70, et la taille moyenne de l'intervalle inter-marqueurs se situe à 9.2 cM.
3- Analyses de liaison
Pour cette approche globale, les inventeurs ont réalisé plusieurs types d'analyses afin d'optimiser leurs performances pour trouver une liaison entre une région du génome et la CP. L'analyse paramétrique, plus performante sur le plan de la puissance, tient compte du mode de transmission du trait et est la plus adaptée dans le cas des traits monogéniques. L'analyse non-paramétrique qui permet d'identifier une liaison même si le mode de transmission supposé est erroné, est aussi plus robuste dans le cas des traits multigémques. Pour chacune de ces analyses, les inventeurs ont utilisé les méthodes déjà évoquées, la méthode 2-points (analyse itérative entre le trait et chaque marqueur) et la méthode multipoints (analyse globale sur chaque chromosome selon une carte de marqueurs). a- Analyses avec paramètres définis, paramétriques (PL) • Mode de transmission (dominant),
• Fréquence du trait (1%),
• Equi-fréquences alléliques de tous les marqueurs, .
• Pénétrances définies (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants), • Méthodes 2-points et multipoints.
• Les Scores de probabilité de liaison sont exprimés en:
- Lod score Z (échantillon homogène); - Lod score ZH (échantillon hétérogène) et taux d'hétérogénéité α (proportion de familles qui ne sont pas liées à ce locus).
b- Analyse indépendante du mode de transmission du trait, non-paramétrique (NPL),
Il s'agit d'une analyse de la déviation de la proportion d'allèles partagés par paires d'individus atteints par rapport à une transmission des allèles au hasard (identité par descendance). Les inventeurs ont considéré toutes les paires d'individus atteints pour l'analyse multipoints, et les paires de germains pour l'analyse 2-points. Les scores de probabilité de liaison sont exprimés en
- NPL ou Z-all (LoglO de valeur p) pour la méthode multipoints sur toutes les paires d'individus atteints; - valeur "p" pour la méthode 2-points sur les paires de germains atteints. 4- Résultats
La figure 3 rapporte les scores NPL obtenus pour l'analyse de haison non- paramétrique sur les chromosomes 3, 5, 11, 6 et 9.
a- résultats détaillés
Les tableaux 16 (meilleurs résultats analyses 2-points) et 17 (meilleurs résultats analyses multipoints) rapportent les meilleurs résultats obtenus pour les chromosomes retenus.
Tableau 16: Meilleurs résultats analyses 2-points pour les chromosome retenus
PL NPL
Chromo Localisation cM
Locus* Marqueur Z(t) Thêta Z(a,t) Thêta Alpha Sibpair some (distance -pter)
Homogénéité Hétérogénéité
3 4 D3S1285 91,2 0,688 0,2 0,819 0,12 0,59 15 D3S1601 214,4 0,006153
5 6 D5S422 164,2 2,007 0,14 2,007 0,14 1 23 D5S647 74,07 0,021524
11 19 D11S908 108,6 0,777 0,2 0,846 0,06 0,6 4 21 ,5 0,203028
Tableau 17 : Meilleurs résultats de l'analyse multi-points pour les chromosomes retenus
b- résultats retenus
Le tableau 18 rapporte les meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) discutés ci-dessous:
Tableau 18 : Meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL)
2-point(2P) or
Chromosome Posîtion/pter Score Multi oint(MP)
Non-paramétrique
2-poini (2P) or
Chromosome Position/pter Score Multipoint(MP)
Paramétrique
i En terme de PL: a- Un Lod score (2P) ZH=2.007 a été relevé sur le bras long du chromosome 5 (position 164.2 cM à partir du télomère supérieur) soit en position 3/4 sur la bande 5q31-q32. b- Lod scores intermédiaires (1.5<ZH<2.0)
- chromosome Ilql4-q22, position 106 (MP-ZH=1.53) c- Lod score intéressants (1.0<ZH<1.5)
- chromosome 5q31-q32, position 168 (MP-ZH=1.11)
- chromosome 6p21-pl2, position 61 (MP-ZH 1.43) - chromosome 6ql3-ql4, position 90 (2P-ZH=1.46) .- -
ii En terme de NPL:
Il a été distingué ici les scores log10 pour l'étude de déviation du partage alléhque, identité par descendance (IBD), pour toutes les paires d'atteints (scores étude multipoints Z-all) ainsi que les valeurs p pour les paires de germains atteints (affected sib-pairs, scores étude 2-points, p-values).
Les meilleurs scores sont abordés selon leur rang par rapport à la limite de significativité: - Z-all>3, 2.5<Z-all<3, 2.0<Z-all<2.5
- p<10"5 et 10"5<p<10"4
a- Scores Z-all>3.0
Sur le chromosome 6p21-pl2, le score atteint en utilisant les marqueurs génome- global maximise à un Z-all=3.52 à la position 71 (entre les marqueurs D6S1610 et
D6S257). Toutefois, la précision du locus est probablement affectée par la grande distance entie ces 2 marqueurs de la batterie génome-global qui est plus nettement plus importante que l'intervalle moyen observé (26.11 cM).
Le second meilleur score est atteint sur le chromosome 9q31-q32, position 151 (Z-all=3.37) b- Scores 2.5<Z-all<3.0
- chromosome 3pl4-pl3, position 72 (Z-all=2.62)
- chromosome Ilq21-q22, position 106 (Z-alb=2.61) c- Scores 2.0<Z-all<2.5
- chromosome 9q31-q32, position 131 (Z-all=2.13)
- chromosome 3q21, position 101 (Z-all=2.15 ) ainsi que les p-values <10"5 et 10"4
d. p<lxl0'4
- chromosome 6q31.3-q33, position 154 (p=0.000012) iii Les loci qui sont identifiés simultanément par PL et NPL:
5- Discussion et conclusion i .
Les 2 scores significatifs ou à la bordure de la significativité selon que l'on considère le trait comme étant monogénique ou multifactoriel (Lander et Kruglyak 1995) ont été observés pour les chromosomes 6ρ21-pl2 (NPL MP Z-all=3.59) et 9q31-q32 (NPL MP Z-aU=3.37). Parmi ces 2 loci, le plus robuste est celui du 6p21-pl2 qui est renfprcé par un MP-
PL Lod score, qui bien que moyen, maximise à ZH=1.42.
Un autre locus apparaît également assez intéressant, il est situé sur le chromosome
Ilql4-q22 car les scores PL et NPL maximisent à la même position 106 (Z-all 2.61, PL
1.52). Le score NPL est d'ailleurs dans la fourchette de suggestivité dans un cas de monogénisme ou dans un cas de multigénisme (suggestivité: monogénisme 2<Z-all<3; multigénisme 2.2<Z-all<3.6).
Enfin le locus 5q31-q32 avec le meilleur PL lod score (2P) (ZH=2.00) se situe également dans des valeurs de suggestivité (en monogénisme).
Il faut ajouter une série de valeur p pour les analyses de germains atteints qui sont également dans la fourchette de suggestivité (chromosomes 6q31.3-q33). Ce sont des loci à considérer aussi. D- Discussion et conclusion générales
Au terme des différentes époques d'analyses, plusieurs régions chromosomiques sont identifiées ou suggérées. Validité des loci Uql4-q22, 5q31-q32, 3pl4.1-pl2.3
a Chromosome Ilql4-q22
Les inventeurs identifient une région entre les positions 100 et 115 (entre Dl 1S898 et Dl 1S925) (figure 4A).
b Chromosome 5q31-p32
Cette région recueille le meilleur résultat PL et bipoint de ces analyses qui se situe à une distance de recombinaison (thêta) 0.14 (environ 14 cM) du marqueur D5S422. En se plaçant à cette distance de D5S422 vers le haut de la carte (position 149), on arrive dans le voisinage du locus qui rassemble le meilleur score NPL multipoints du chromosome 5 (Z- all=1.70, vers marqueur D5S436). Un certain consensus apparaît pour ce locus également (figure 4B).
c Chromosome 3pl4.1-yl2.3
Il s'agit d'une région de presque 30 cM entre les positions 60 et 87 (entre D3S1277 et D3S1285 (figure 4C).
EXEMPLE 2 : Analyse des régions d'intérêt avec des SNP 'Single Nucleotide Polymorphism'
A la suite des travaux présentés dans l'exemple 1, les inventeurs ont poursuivi l'analyse des régions des chromosomes 3, 5 et 11 à l'aide la technologie basée sur les SNP, afin de mettre en évidence les gènes impliqués dans la canitie précoce.
L'analyse de la totalité du génome des familles où ségrègent le trait canitie précoce a en effet mis en évidence 5 régions chromosomiques qui se hent avec le phénotype. Au delà des loci 6p21-pl2 (A) et 9q31-q32 (B) distingués par des Lod scores significatifs (Lod score non-paramétrique NPL=3,59 et NPL=3,36 respectivement) d'autres régions présentent un intérêt en raison des scores de liaison d'ordre suggestif dans plus d'une analyse.
La région sur le chromosome 3 (3pl4.1-pl2.3) présente en effet des résultats d'amplitude équivalente obtenus simultanément dans l'étude des gènes candidats et génome global (régions candidates multipoint Lod score non-paramétrique RC-MP- NPL=2.58, régions candidates analyse 2-points Lod score paramétrique RC-2P-PL=1.55, génome global multipoint Lod score non-paramétrique GG-MP-NPL=2.62).
La région sur le chromosome 5 (5q31-q32 ) est retenue en raison du seul locus en analyse PL-2 point qui atteigne un Lod score significatif (GG-2P-PL=2.00). La région sur le chromosome 11 (1 Iql4-q22) est retenue en raison de son score parmi les 5 les plus élevés en NPL et en PL (GG-MP-NPL=2.61, et GG-2P-PL 1.52).
Abbréviations utilisées
RC : régions candidates
GG :génome global MP : multipoint
2P : analyse 2-points
NPL : Lod score non-paramétrique
PL : Lod score paramétrique
Les SNP (single nucleotide polymorphism) représentent une forme de polymoφhisme particulièrement répandue dans le génome humain et tiès stable. On évalue le nombre de SNP à environ 0,8 SNP tous les 1000 nucleotides (séquences codantes et non codantes confondues), ce qui permet d'établir une véritable cartographie du génome humain à l'aide des SNP. Les SNP sont souvent classés en différentes catégories, notamment selon qu'ils sont dans une région codante ou non, dans une région régulatrice ou dans une autre région non codante du génome, que le polymoφhisme modifie l'acide aminé codé ou non, etc..
A l'issue du programme « Human Génome Project », les SNP sont désormais mieux connus et référencés, ainsi que leur position dans le génome (GDB). Différentes méthodes ont été mises au point pour mettre en évidence ces polymoφhismes entie différents individus, souvent basées sur les méthodes utilisées pour détecter des mutations ponctuelles (RFLP-PCR, hybridation avec des oligomères spécifiques des allèles, mini-séquençage, séquençage direct...). Dans le cadre de la présente demande, les inventeurs ont utihsé la technologie MALDI- TOF (matrix-assisted laser desoφtion/ionization time-of-flight mass spectiometry) pour détecter les différents allèles des SNPs candidats. De plus amples détails sur cette technologie sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans diverses publications (Stoerker J, et al, Nat Biotechnol 2000 Nov;18(ll):1213-6 et Tang K et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 Aug, 96, 10016-20).
Dans un premier temps, les inventeurs ont défini très précisément les régions des chromosomes 3, 5 et 11 à analyser avec les SNPs. Dans une seconde étape, 3848 SNPs appartenant aux régions précédentes ont été pré-sélectionnés sur certains critères (SNPs candidats in silico) et 3227 ont été retenus suite à une étape de validation expérimentale. Dans une étape suivante, les inventeurs ont assemblé les ADN des différents individus atteints de canitie précoce et des individus 'contrôles' en différents groupes, puis effectué le génotypage de ces différents groupes grâce à 1264 SNPs choisis parmi les 3227. Les différentes étapes sont décrites plus amplement dans les sections suivantes.
1- Définition des régions à analyser par les SNP
Dans un premier temps, les inventeurs ont défini plus précisément les régions d'intérêt sur les chromosomes 3, 5 et 11, à partir des résultats obtenus grâce à l'analyse avec les marqueurs microsatellites (voir les travaux décrits dans l'exemple 1) sur les 12 familles sélectionnées (voir tableau 6).
La région sur le chromosome 3, dénommée région C, est définie par sa position chromosomique ainsi que par trois autres types de coordonnées pour une précision et une sécurité optimale dans la définition de cette région pour les étapes ultérieures. Il en est de même pour la région du chromosome 5, dénommée région D et pour la région du chromosome 11, dénommée région E.
Le tableau suivant répertorie les différentes caractéristiques cartographiques des régions C,D et E (code et taille de la région en Mb et Kb, numéro des marqueurs microsatellites qui bornent les régions, position dans la séquence du génome, numéro d'un SNP). Les deux colonnes pour les positions sur le génome diffèrent par la version différent de database (NCBI UCSC freeze avril 2002 et juin 2002).
La taille cumulée des trois régions C+D+E est de 77'351 Kb soit 77.106 bp.
* La position de la séquence (en terme de paires de bases bp) est exprimée en fonction du numéro de la version de la banque de données sur le génome humain selon une mise à jour UCSC (http://genome.cse.ucsc.edu/ ) et/ou un numéro de version d'assemblage de séquence du génome humain, en avril 2002 (soit NCBI Build29) ou en juin 2002 (soit NCBI Build30).
UCSC Freeze (correspondance avec la version NCBI Assembled Génome Séquence, build)
Novembre 2002 (NCBI Build31) Juin 2002 (NCBI Build30)
Avril 2002 (NCBI Build29) Décembre 2001 (NCBI Build28)
2- Recherche des SNP candidats (in silico) et validation (expérimental). A parth des régions C, D et E telles que définies plus haut, une seconde étape a consisté à déterminer une collection de SNPs appartenant à ces régions, de façon à obtenir une carte de marqueurs des trois régions. Ces marqueurs ont également été définis de telle façon qu'ils couvrent les 77Mbp (longueur totale des trois régions) d'une façon homogène et équidistante. La distance entie les différents SNPs a été fixée en moyenne à 50 kb. Cette opération a été réalisée par la sélection de 3848 SNPs répondant à ces critères (SNPs candidats in silico). Parmi les 3848 ainsi envisagés lors de la première étape, 3332 SNPs ont été présélectionnés notamment en enlevant les SNPs distants de moins de 14kb. Les 3332 SNPs sélectionnés ont été analysés sur 92 individus contrôles (individus du Centre d'Etude du Polymoφhisme Humain) afin de valider la présence d'au moins deux allèles pour chacun des SNP (validation du polymoφhisme).
3- Assemblage des ADN (Pooling)
Afin d'augmenter la capacité de génotypage, une stratégie de pooling a été effectuée sur les différents ADN. La puissance de cette méthode est rapportée dans différentes publications (notamment Werner et al, Hum Mutât 2002 Jul;20(l):57-64, Bansal et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2002 Dec 24;99(26):16871-4). .
Pour effectuer ce pooling, les ADN des différents individus avec le trait 'canitie précoce' (CP) et celui des individus contrôles ont été assemblés. Cet assemblage a été réalisé de façon à ce que chacun des ADN soit représenté de manière équimolaire, afin de garantir qu'aucun individu n'ait d'influence prépondérante sur le résultat par rapport à un autre. A cette fin, la concentration exacte de chacun des ADN a été mesurée par la méthode « Picogreen » dans les différents échantillons des individus.
Des groupes ont été constitués en tenant compte d'un « score phénotypique d'intensité de canitie » qui a été attribué pour chaque individu de la façon suivante.
Dans un premier temps, deux sortes de critères ont été définis, les critères primaires auxquels sont affectés des valeurs de score de 2, et les critères secondaires auxquels sont affectés des valeurs de score de 1.
Il y a 2 critères primaires (valeur de score=2 pour chacun d'eux) qui sont : (i) premiers cheveux blancs avant 18 ans ; (ii) chevelure poivre et sel claire à 30 ans.
Il y a 3 critères secondaires (valeur de score≈l pour chacun d'eux) qui sont : (i) premiers cheveux blancs avant 25 ans ; (ii) Chevelure poivre et sel foncée à 30 ans, (iii) notion familiale de canitie précoce.
En additionnant pour chaque individu les scores obtenus avec chacun des critères diagnostics, on peut définir pour chaque individu un score d'intensité du phénotype de canitie précoce. H a ainsi été possible de définir plusieurs groupes différents selon le score phénotypique.
Parmi les individus atteints, 72 individus dont le score est supérieur ou égal à 4 ou 5 et 132 individus dont le score phénotypique est supérieur ou égal à 2.
Groupe AI : ce groupe est constitué par l'ADN des 72 individus CP dont le score phénotypique est de 4 ou 5.
Groupe AU : ce groupe est constitué par PADN des 132 individus CP, dont le score phénotypique est de 2, 3, 4 ou 5.
Groupes BI et BII : ces groupes sont constitués par l'ADN des individus contrôles dont l'origine géographique est proche de celle des individus CP. Pour ces individus contrôles, les critères de sélection ont été : (i) un âge supérieur à 40 ans, (ii) l'absence de signe de canitie chez l'individu contrôle, (iii) l'absence de notion familiale de canitie. Les critères d'appariement avec un individu du groupe AI ou AU sont une origine géographique identique, un même sexe et une couleur des cheveux identique à 18 ans.
Ainsi de cette façon outre l'appariement atteint versus non atteint par le trait phénotypique (CP), chaque individu CP du groupe AI est représenté par un individu contrôle dans le groupe BI dont le lieu d'origine géographique est proche ou identique. H en va de même pour chaque individu du groupe AH.
La constitution des différents groupes est représentée schématiquement sur la figure 13.
L'utihsation de ces méthodes rigoureuses de diagnostic clinique des sujets atteints et des sujets contiôles donnent une garantie de fiabihté sur la qualité des données phénotypiques.
Par ailleurs, la rigueur de l'appariement selon les règles fixées par les inventeurs est la garantie de la pertinence des analyses statistiques comparant les données génomiques issues de ces individus qu'ils soient regroupés en pools ou comparés individuellement.
4- Sélection des SNPs validés pour le génotypage sur les ADN groupés.
Différents groupes de SNPs ont été constitués selon la définition suivante : Définition des groupes 1, 2, 3 et 4
- groupe 1 : allèle inférieur >10%, déviation standard <0.025
- groupe 2 : allèle inférieur >10%, déviation standard >0.025 - groupe 3 : allèle inférieur <10%, déviation standard O.025
- groupe 4 : allèle inférieur <10%, déviation standard >0.025
Une batterie de 2142 SNPs des groupes 1 et 2 furent ainsi validés pour une fréquence minimum de Pallèle le plus rare del0%. Quelques SNPs des groupes 3 et 4 (fréquence de l'allèle rare <10%) ont également été retenus afin de pouvoir compléter certaines zones où il n'y aurait pas assez de SNPs des groupes 1 et 2. Par cette méthode, 3227 SNPs ont ainsi été validés.
Parmi les 3227 SNPs validés, 1264 ont été choisis lors d'une nouvelle étape de sélection. Cette nouvelle sélection est basée sur les critères suivants :
- intragéniques ou proches des régions géniques
- intervalles moyens inter-SNPs intta génique compris entre 30 et 50 Kb.
La très grande majorité des SNPs a été choisie dans le groupe 1 qui représente la plus grande fiabihté. Afin de mieux couvrir les régions à analyser dont la taille globale est de 77 Mb, l'analyse a été concentrée sur les régions géniques et les régions voisines des gènes susceptibles de contenir des séquences régulatrice, en délaissant les régions sans gènes. Cela permet d'augmenter la densité de la couverture (diminuer les intervalles inter-SNPs) dans les régions codantes et donc d'augmenter la probabilité d'avoir plusieurs SNPs positifs dans des zones qui seraient associées au tiait CP (canitie précoce). Par régions géniques, on entend aussi bien les régions contenant des gènes connus, que celle susceptibles d'en contenir (gènes prédits).
5- Allélotypage sur les ADN assemblés. Pour les 1264 SNPs retenus lors de l'étape 4, l'étape suivante a été de déterminer leur allélotype, c'est-à-dire la fréquence de chacun des allèles, et ce pour les 4 groupes d'ADN assemblés (poolés) selon la sévérité et la précocité du phénotype (voir la définition des 4 groupes à l'étape 3 et figure 13). La fréquence alléhque des deux allèles a été déterminée pour chacun des SNP dans les 4 groupes.
Toutefois, du fait que l'expérience est réalisée sur des «pools » et non sur un ADN individuel, seul l' allélotype est déterminé par cette méthode, et non le génotype. La signification statistique des écarts de fréquences alléliques entie les groupes AI et BI ou AU et BII est estimée par la valeur « p » représentant la significativité. Plus la valeur p est faible, plus l'écart est statistiquement significatif.
Les expériences ont été reproduites 3 fois (3 PCR), chacune des trois PCR étant ensuite testée 5 fois sur le MALDI-TOF afin d'obtenir une valeur moyenne fiable. Seuls les résultats pour les groupes de 72 CP et leurs contrôles ont été considéré, ceux-ci semblent en effet plus homogènes (les comparaisons des groupes AU-BII ne fournissant que peu de résultat positifs, faisant craindre la présence de faux-négatifs). La fréquence des deux allèles pour chacun des SNP sont calculées dans les différents ADNs groupés. Toutefois les génotypes ne sont pas déterminés dans ce type par cette étude et par conséquent leurs fréquences parmi les différents groupes ne seront pas disponibles. La signification statistique des écarts de fréquences alléliques entre les groupes est estimée par une valeur « p ». Seuls les SNPs dont les pvalue sont inférieures à 0.05 (5%) ont été retenus.
a- Tableau des comparaisons allélotypiques entres les groupes.
Les tableaux suivants illustrent sous forme de tableaux les résultats obtenus.
Définition des colonnes:
-CHROM : numéro du chromosome
-CHROMPOS : position sur le chromosome (NCBI build 30)
-SNP m : Nom du SNP utilisé
-AI_A2 est la fréquence de l'allèle 2 (l'allèle de masse supérieur en MALDÏ-TOF dans le pool AI) -BI_A2 est la fréquence de l'allèle 2 (l'allèle de masse supérieur en MALDI-TOF dans le pool BI)
-DAI-BI est la différence de fréquence de l'allèle 2 entre pool AI et pool BI
-P-value_I est la p-value calculée pour la comparaison des fréquences des pools AI et BI.
-P<0.05: valeur 0 quand la p-value est >0.05 ; valeur 1 quand la p-value est <0.05 -Code: code (ind, dbs, 2, 3), selon la nature du résultat (voir tableau des codes), indiquant s'il s'agit d'un SNP positif individuel, ou réparti en double spot ou cluster de 2, 3 ou plus.
-LD/freq: ce critère indique si les fréquences de 2 ou 3 SNPs positifs en cluster (SNP positifs contigus) sont compatibles avec l'existence d'un haplotype. Pour ce faire, les fréquences des 2 allèles (des SNPs positifs du cluster), allèle fréquent et allèle rare (lower and upper allèle), sont analysées statistiquement pour déterminer s'il existe un déséquihbre de liaison (LD Linkage desequilibrium) se traduisant par une p-value significative.
Le déséquilibre de liaison est une situation où 2 gènes (allèles) ségrègent ensemble à une fréquence plus haute que la fréquence prédite par le produit de leurs fréquences individuelles. Cela signifie que les deux gènes ne sont pas indépendants puisqu'ils ségrègent ensemble plus fréquemment que prévu par les statistiques, il y a donc un déficit d'indépendance entre des allèles situés proche l'un de l'autre sur un même chromosome. De plus, cela prend en considération la distance, et donc les SNPs distants de plus de 100- 110 Kbs sont éliminés.
Cette analyse de déséquilibre de liaison a permis de définir des blocs d'ADN qui sont matérialisés par plusieurs marqueurs dont la co-ségrégation des allèles dévie d'une co- ségrégation régie par le seul hasard. Cette situation est produite par une absence ou un déficit de recombinaison au sein de ce bloc. La taille des régions présentant un déséquihbre de liaison est variable selon les régions chromosomiques, elle semble s'étendre sur 10 à 200kb.
Lorsque que la zone est en noir dans cette colonne, l'association est significative. En grisé, les valeurs d'association sont marginalement bonnes (acceptables). - p-val-eval: Ce critère est basé sur la seule p-value. Si la p-value d'un SNP ou de plusieurs groupés en clusters est inférieure à 1%, alors le cluster est marqué comme important : case noire.
Seuls les SNPs ayant une p-value inférieure à 5% ont été indiqués dans le tableau, à l'exception des SNPs négatifs situés entre deux SNPs positifs, ce qui détermine un double spot et ceux encadrant un cluster d'intérêt.
REGION C
?
REGION E
Le tableau ci-dessous récapitule le nombre de SNPs positifs au sein de chaque région, selon qu'il s'agit de : -Spots :
-SNPs positifs isolés -SNPs positifs en double spots (exemple : 2 SNPs positifs séparés par 1 SNP négatif) -Clusters :
-2 SNPs positifs contigus
-Plus de 3 SNPs positifs contigus -Déséquilibre de liaison / fréquences
* LD : Linkage desequilibrium Résultats
i- région C La région C se caractérise par un relativement grand nombre de SNPs positifs isolés. Par contre le nombre de double spots ou de clusters est relativement faible. L'analyse de LD
(désquilibre de liaison) et des fréquences alléliques combinés ne révèle que 3 zones d'intérêt. De ces 3 zones 2 loci (positions 41527287-41677819 et 55638663-56042041) se caractérisent par une p-value <1%. Le contenu génique de ces 3 zones (Cl, C2, C3) est développé ci-dessous :
Cl (41527287-41677819V.
-Protéine hypothétique KIAA1042
-CCK: gasτrin/cholecystokinintypeb receptor (cck-b receptor) C2: f52846896-5291394n : -CACNA1D: voltage-dependent 1-type calcium channel alpha-ld subunit
C3 : (55638663-56042041) :
-ARHGEF3 rho guanine nucleotide exchange factor 3; rhogef protein; 59.8 kda protein; exchange factor found in platelets and leukemic and neuronal tissues, xpln. -Protéine hypothétique ALI 33097
ii~ région D La région D se caractérise par une relative densité en clusters et l'analyse LD et freq montre également plusieurs régions d'intérêt. Sept zones (D1,D2,D3,D4,D5,D6,D7) sont relevées pour leur arrangement en cluster, leur potentiel LD et l'arrangement des fréquences alléliques. Parmi ces 7 zones, 5 (en gras ; D2,D3,D5,D6,D7) semblent être plus prometteuses en raison de la significativité de la comparaison de un SNP au moins.
Le contenu génique de ces 7 zones est développé ci-dessous : Dl (136479801-137007868):
-KLHL3 : kelch-like protein 3
-HNRPAO : heterogeneous nuclear ribonucleoprotein aO (hnrnp aO).
D2 (137542040-137771805)
-CDC25C: map/microtubule affinity-regulating kinase 3 (ec 2.7.1.27) -EGR1 : early gro th response protein 1 (egr-1) (krox-24 protein)
-C5orf6 : prédit
-C5orf7 : prédit
-LOC51308 : prédit
-ETFl : eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 (erfl) -HSPA9B : stress-70 protein, mitochondrial precursor
D3 (139931847-140118601)
-PCDHAI à PCDHAI 3 :protocadherin alpha 1 precursor à protocadherin alpha 1 precursor
D4 (149518721-149586774) -CSF 1R : Macrophage Colony Stimulating Factor I Receptor Precursor
-RPL7: 60s ribosomal protein 17
-PDGFRB : beta platelet-derived growth factor receptor precursor (ec 2.7.1.112)
D5 (149793126-149995886)
-TCOFl : Treacle Protein (Treacher Collins Syndrome Protein). -ALI 33039 : prédit
-CD74 : hla class ii histocompatibility antigen, gamma chain
-RPS14 : 40s ribosomal protein s 14
-NDSTl : Heparan Sulfate N-Deacetylase N-Sulfotransferase (Ec 2.8.2.8) D6 (151235618-151373121)
-G3BP : ras-gtpase-activating protein binding protein 2 -GLRAl : glycine receptor alpha-1 chain precursor D7 (153463449-153854650) -C5orf3: prédit
-MFAP3 : microfibril-associated glycoprotein 3 precursor
-GALNTIO : putative udp-galnac:polypeptide n-acetylgalactosaminyltransferase
-FLJ11715 : prédit
iii- région E • • -
La région E se caractérisé également par une relative densité en clusters et l'analyse LD et freq montre 6 zones régions d'intérêt (E1,E2,E3,E4,E5,E6). Trois zones (en gras, E2,
E5,E6) sont plus prometteuses en raison de la significativité de la comparaison entre les échantillons. Le contenu génique de ces 6 zones est développé ci-dessous :
El (108893187-108944206)
-GUCY1A2 : guanylate cyclase soluble, alpha-2 chain (ec 4.6.1.2) E2 (110056711-110546142)
-CUL5 : vasopressin-activated calcium-mobilizing receptor (vacm-1) (cullin homolog 5)
-ACAT1 : acetyl-coa acetyltransferase, mitochondrial precursor (ec 2.3.1.9)
-NPAT muclear protein, ataxia-telangiectasia locus; el4 gène;
-ATM : serine-protein kinase atm (ec 2.7.1.37) (ataxia telangiectasia mutated
-AF035326 : prédit -AF035327 : prédit
-AF035328 : prédit
-BC029536 :prédit E3 (115527211-115745012)
-FLJ20535 -DRD2 : d(2) dopamine receptor
-ENS303941 : prédit E4 (117397672-117752160) :
IGSF4 : immunoglobulin superfamily, member 4; nectin-like protein 2 E5 (118532530-118685957)
Pas de gène connu
E6 (119417270-119469358)
-LOC51092 : prédit -BC010946 : prédit
-TAGLN : transgelin (smooth muscle protein 22-alρha) (sm22-alρha) (ws3-10) (22 kda actin-binding protein).
-PCSK7 : proprotein convertase subtilisin kexin type 7 precursor (ec 3.4.21.-) -ENS300650 : prédit
EXEMPLE 3
Exemple de Compositions
- lotion capillaire fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285 0,5 g
Propylène glycol 20 g
Ethanol 95° 30 g
Eau qsp 100 g
Cette lotion est appliquée quotidiennement sur les zones à traiter et de préférence sur l'ensemble du cuir chevelu pendant au moins 10 jours et préférentiellement 1 à 2 mois.
On constate alors une diminution de rapparition des cheveux blancs ou gris et une repigmentation des cheveux gris.
- shampooing traitant fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422 1,5 g
Polyglycéryl 3-hydroxylarylether 26 g Hydroxy propyl cellulose vendue sous la dénomination de Klucell G par la société Hercules 2 g
Conservateurs qps
Ethanol 95° 50 g
Eau qsp 100 g Ce shampooing est utilisé à chaque lavage avec un temps de pose d'environ d'une minute. Un usage prolongé, de l'ordre de deux mois, conduit à la repigmentation progressive des cheveux gris. Ce shampooing peut également être utilisé à titre préventif afin de retardé le blanchissement des cheveux.
- Gel traitant fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D11S898 et D11S925 0,75 g
Huiles essentielles d'Eucalyptus 1 g
Econozole 0,2 g
Lauryl polyglycéryl 6 cetearyl glycoether 1,9 g
Conservateurs qs Carbopol 934P vendu par la société BF Goodrich Corporation 0,3 g
Agent de neutralisation qs pH 7
Eau qsp 100 g
Ce gel est appliqué sur les zones à traiter deux fois par jour (matin et soir) avec un massage terminal. Après trois mois d'application, on observe une repigmentation des poils ou cheveux de la zone traitée.
Références bibliographiques
• E. Lander and L. Kruglyak. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results [see comments]. Nat.Genet. 11 (3):241- 247, 1995.

Claims

Revendications
1. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D,
5 ARHGEF3 et AL133097, à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
2. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène
10 du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D,
ARHGEF3 et ALI 33097, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une
*"'" longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides. *
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment a une 15 longueur comprise entre 50 et 3000 nucleotides.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des cheveux.
5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.
20 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.
7. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique. 25
8. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, 30 ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.
9. Procédé selon la revendication 8 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme alléhque du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.
10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
11. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP,
GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
12. Utihsation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
13. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit fragment a une longueur comprise entre 50 et 3000 nucleotides.
14. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des cheveux.
15. Utihsation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.
17. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.
18. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6,
5 C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR,
RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu. *10 19. Procédé selon la revendication 18 comprenant l'étape supplémentaire . >< r iii) comparaison de la forme alléhque du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic. 20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer. 15 21. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins
18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, à 20 des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
22. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, 25 NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2,
ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides. 30
23. Utilisation selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que ledit fragment a une longueur comprise entre 50 et 3000 nucleotides.
24. Utihsation selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que ladite pigmentation est celle des cheveux.
25. Utihsation selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention ou le traitement de la canitie.
26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce.
27. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.
28. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) sélection d'un marqueur appartenant à un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.
29. Procédé selon la revendication 28 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme alléhque du marqueur à celle d'autres individus ^ pour établir le diagnostic.
30. Procédé selon la revendication 29 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
31. Utilisation à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques comprenant chacun au moins 18 nucleotides successifs dont la séquence est choisie parmi : • une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et ALI 33097, et • une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7,
PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, et • une séquence correspondant à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BCO 10946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
32. Utilisation d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi:
• un fragment comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNAlD, ARHGEF3 et AL133097, et
• un fragment comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5όrf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHAI 3, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3,
GALNTIO et FLJ11715, et
• un fragment comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092,
BCO 10946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
33. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) sélection d'une combinaison d'au moins deux marqueurs choisis parmi
. les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, et
. les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, ALI 33039, CD74,
RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et
FLJ11715, et
. les marqueurs appartenant à un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1 A2, CUL5, ACAT1 , NPAT, ATM,
AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, ii) détermination des allèles des marqueurs choisis présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu.
34. Procédé selon la revendication 33 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme alléhque du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic.
35. Procédé selon la revendication 34 caractérisé en ce que les autres individus sont des membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
36. Kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 3 humain choisi parmi les gènes KIAA1042, CCK, CACNA1D, ARHGEF3 et AL133097, ceux comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 5 humain choisi parmi les gènes KLHL3, HNRPAO, CDC25C, EGR1, C5orf6, C5orf7, LOC51308, ETFl, HSPA9B, PCDHAI à PCDHA13, CSFIR, RPL7, PDGFRB, TCOFl, AL133039, CD74, RPS14, NDSTl, G3BP, GLRAl, C5orf3, MFAP3, GALNTIO et FLJ11715, et ceux comprenant au moins 18 nucleotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie d'un gène du chromosome 11 humain choisi parmi les gènes GUCY1A2, CUL5, ACAT1, NPAT, ATM, AF035326, AF035327, AF035328, BC029536, FLJ20535, DRD2, ENS303941, IGSF4, LOC51092, BC010946, TAGLN, PCSK7 et ENS300650, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucleotides.
EP03748204A 2002-07-10 2003-07-09 Genes des chromosomes 3,5 et 11 impliques dans la canitie precoce Withdrawn EP1520042A2 (fr)

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