FR2842105A1 - Localisation des genes impliques dans la canitie precoce - Google Patents

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Abstract

Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1768 et D3S1285, ou dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, ou dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs D11S898 et D11S925, utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à l'une de ces régions, utilisation des produits d'expression de l'une de ces régions et utilisation d'agents capables de modifier la fonction de ces produits d'expression, à des fins cosmétiques, thérapeutiques ou diagnostiques.

Description

i
LOCALISATION DES G NES IMPLIQU S DANS LA CANITIE
PR COCE
Annuler ou atténuer autant que faire se peut les effets du vieillissement est une préoccupation qui ne cesse de croître. Dans ce contexte, faire disparaître des cheveux blancs jugés disgracieux grâce à des shampoings traitants colorants est désormais une activité très répandue. Il est clair cependant que, même si cette technique permet effectivement d'annuler les effets du phénomène, elle n'en affecte nullement les causes. De
ce fait, cette solution est temporaire et doit être fréquemment renouvelée.
Dans ce contexte, les inventeurs ont choisi d'explorer l'apparition des cheveux
blancs, ou canitie, sous un angle totalement nouveau, celui de la génétique.
En effet, explorer la canitie de par son aspect génétique permet de mettre en évidence les mécanismes profonds de la dépigmentation. Cela permet aussi d'identifier les gènes qui sont impliqués dans la canitie. Cette identification ouvre la porte à de très nombreuses applications, dans le domaine de la cosmétique évidemment, mais aussi pour effectuer des tests diagnostics. De plus, lh dépigmentation des cheveux est parfois l'un des symptômes d'une maladie et dans un tel cas, il est envisageable que le diagnostic de la canitie permette le diagnostic de cette maladie, ou bien que le traitement de la canitie ait un
effet thérapeutique sur ladite maladie.
La présente invention décrit pour la première fois l'utilisation de la génétique dans un projet à visée cosmétique. Il est hautement novateur de chercher à connaître les régions génomiques de la canitie par analyse de liaison génétique alors que d'autres études visent
plutôt à décrypter la biochimie de la canitie.
Les inventeurs ont choisi de tirer partie de l'hypothèse proposée depuis bien longtemps du caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie. Le caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains est en effet aisément observable. Les gènes identifiés comme responsables de la canitie précoce sont très vraisemblablement aussi impliqués dans la canitie. due au vieillissement. Le deuxième obstacle de la mise en oeuvre des méthodes de génétique inverse concerne la définition exacte du phénotype. Une parfaite définition du phénotype étudié est en effet nécessaire. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette identification de gènes, le choix et la composition de l'échantillon utilisé dans la présente invention se sont déroulés selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype " canitie précoce " fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans. De plus, il est vraisemblable que d'une part la canitie précoce ait une origine multigénique et non monogénique, et que d'autre part, des facteurs environnementaux aient une influence sur le phénotype. Il s'agit de fait de définir un ensemble de causes
prédisposant à la canitie précoce plutôt qu'une mutation unique responsable du phénotype.
Dans ce contexte, la génétique inverse n'est pas, habituellement, une technique recommandée par les généticiens. Il est donc original de la part des inventeurs d'avoir
utilisé cette méthode.
Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs de définir des zones chromosiques et/ou génomiques impliquées avec une forte probabilité dans la canitie. Dans la présente demande, les régions des chromosomes ou les sous-parties de ces régions, identifiées par les inventeurs comme statistiquement impliquées dans la canitie, seront dénommées indifféremment "régions chromosomiques de l'invention" ou "régions génomiques de l'invention" ou "zones chromosomiques de l'invention" ou "zones
génomiques de l'invention".
L'objet de la présente invention concerne d'une part les régions chromosomiques identifiées et d'autre part l'utilisation de produits dérivés, tels que des produits de transcription ou de traduction, dans les domaines de la cosmétique, de la thérapeutique et
du diagnostic.
Pour les domaines de la thérapie et de la cosmétique, la présente invention concerne successivement l'utilisation de polynucléotides dérivant d'une région chromosomique de l'invention, l'utilisation d'agents capables de modifier la fonction attachée à une région de l'invention, l'utilisation des produits d'expression d'une région de l'invention et l'utilisation d'agents capables de modifier la fonction de ces produits d'expression. L'utilisation conjointe ou combinée d'au moins deux des produits précédents
peut s'avérer judicieuse, en particulier dans le domaine thérapeutique.
La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic d'une canitie précoce basé sur les variations alléliques au sein des régions chromosomiques de l'invention. En matière de diagnostic, il peut être, de plus, particulièrement pertinent de combiner les renseignements provenant de différentes zones chromosomiques de l'invention.
GLOSSAIRE
Dans le cadre de la présente invention, les termes énoncés revêtent la signification suivante: Par fragment polynucléotidique, on entend toute molécule résultant de l'enchaînement linéaire d'au moins deux nucléotides, cette molécule pouvant être monocaténaire, bicaténaire ou tricaténaire. Il peut donc s'agir d'une molécule d'ADN double-brin, d'un ADN simple brin, d'un ARN, d'un duplex ADN simple brin-ARN, d'un triplex ADN-ARN ou de toute autre combinaison. Le fragment polynucléotidique peut être naturel isolé, recombinant ou bien synthétique. Lorsque le fragment polynucléotidique comporte des brins complémentaires, la complémentarité n'est pas nécessairement parfaite, mais l'affinité entre les différents brins est suffisante pour permettre l'établissement de
liaison stable de type Watson Crick entre les deux brins.
Bien que l'appariement des bases soient de préférence de type WatsonCrick, d'autres types ne sont pas exclus, tels qu'un appariement de type Hoogsteen ou Hoogsteen inverse. On considère que la séquence S d'une molécule " correspond " à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire l'enchaînement des bases de S de celui de la molécule d'ADN donnée par l'un des processus suivants 1. par identité, ou bien 2. par identité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile, ou bien 3. par complémentarité, ou bien
4. par complémentarité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile.
De plus, on considère que deux séquences restent " correspondantes " s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans l'un des processus précédents (complémentarité ou bien identité, avec ou sans échange T,U), de préférence moins d'une erreur sur 100. Par conséquent, les deux molécules ont aussi nécessairement des longueurs voisines, la variation maximale de longueur étant de 10% d'après le taux d'erreur accepté,
elles ont de préférence une différence de longueur inférieure à 1 %.
Cette définition ne suppose pas que les deux molécules soient de même nature, en particulier pour ce qui est de leur squelette, il s'agit d'une correspondance entre leur
séquence uniquement.
Par exemple, deux séquences d'ADN identiques " correspondent " l'une à l'autre.
De même, si ces deux séquences sont substantiellement identiques, c'est-àdire identiques à plus de 90%, elles correspondent l'une à l'autre. Une séquence d'ARN, issue de la traduction d'une molécule d'ADN quelconque, "correspond " à la séquence de cette molécule d'ADN. De même, une séquence synthétique, par exemple hybride ADN-ARN, peut correspondre à une séquence d'ADN. Il en va de même entre une séquence d'ADN et
1 0 l'ARN anti-sens ayant pour cible cette séquence.
Sur le même schéma, on considère que la séquence S d'une molécule d'ADN " correspond " à la séquence d'une molécule d'ADN donnée si l'on peut déduire la séquence S de celle de la molécule d'ADN donnée par le processus l ou 3 uniquement. La même latitude est autorisée concernant la possibilité d'introduction d'erreurs dans ces 1 5 processus, c'est-à-dire que l'on considère que deux séquences d'ADN restent " correspondantes " s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans les
processus de complémentarité ou bien d'identité, de préférence moins d'une erreur sur 100.
Les produits d'expression d'un fragment d'ADN englobent toutes les molécules traduisant l'information génétique portée par ce fragment. Les ARN correspondant à la transcription du fragment d'ADN, à tous les stades de maturation, sont donc des produits d'expression; il en est de même pour les polypeptides, à tous les stades de maturation, résultant de la traduction des ARN. Si des clivages interviennent au sein du polypeptide, comme par exemple le clivage de signaux d'adressage, tous les polypeptides résultants sont
aussi considérés comme des produits d'expression du fragment d'ADN initial.
Dans le contexte de l'invention, la " fonction " primaire d'un fragment d'ADN est de préférence d'être transcrite puis traduite en protéine. La fonction secondaire de l'ADN peut être assimilée à la fonction de la protéine résultant de la traduction de cet ADN. La fonction d'un fragment d'ADN revêt aussi d'autres significations dans la présente invention. En particulier, un fragment d'ADN peut appartenir à une région régulatrice d'un gène, sa fonction est alors, ou bien d'être le site de fixation d'enhancers ou d'inhibiteurs, ou bien d'être le site de fixation de l'ARN polymérase, ou bien d'être un site de reconnaissance pour le positionnement de l'ARN polymérase, ou bien toute autre
fonction généralement assimilée à une séquence régulatrice.
D'autres fonctions sont envisageables pour les fragments d'ADN. En particulier, leur simple présence au sein d'un gène peut faciliter les recombinaisons. De même, une
fonction selon l'invention peut être celle des télomères et avoir trait à la dégénérescence.
D'autres fonctions particulières attribuées à des fragments d'ADN sont bien connues par les biologistes. Un marqueur génétique est une séquence d'ADN détectable. En génétique humaine, les marqueurs sont des séquences particulières de l'ADN pouvant prendre différentes formes selon les individus. Cette polymorphie des marqueurs permet de suivre
leur transmission dans le cadre des arbres généalogiques.
Parmi les marqueurs classiques, on peut citer les marqueurs qui présentent un polymorphisme de longueur de fragment de restriction. Ce type de polymorphisme est
nommé RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Un microsatellite est une séquence d'ADN répétée, constituée d'un motif relativement simple: un di, un tri ou un tétra nucléotide le plus souvent. Le nombre de 1 5 répétitions change pour un même motif selon les individus et peut varier de quelques unités (une douzaine au minimum pour un dinucléotide), jusqu'à plus d'une centaine. Ces séquences sont dispersées un peu partout dans le génome, de façon presque aléatoire, mais à des endroits identiques d'un individu à un autre. Elles sont très abondantes (environ une tous les 10000 nucléotides = 10 kb) et elles sont très polymorphes. C'est la variation de longueur de la répétition en tandem qui constitue le marqueur. Ces séquences
microsatellites sont donc très utilisées comme marqueurs génétiques.
Normalement, il n'y a pas de lien explicite entre un marqueur microsatellite et un gène, sinon une co-localisation. La longueur d'une répétition en tandem n'a pas, selon les connaissances actuelles, et en dehors de quelques rares cas de marqueurs intragéniques associés à certaines pathologies, de lien avec le rôle d'un gène. Dans le cadre de la présente invention, les marqueurs microsatellites sont des outils pour localiser les gènes impliqués dans la canitie précoce. Comme il existe beaucoup moins de polymorphisme dans les gènes que dans les marqueurs, un allèle génique sera représenté par plusieurs allèles d'un même
marqueur microsatellite.
Il existe différentes méthodes pour définir la localisation de séquences particulières d'ADN le long des chromosomes. L'unité de mesure physique est le nombre de paires de bases. Toutefois, le centimorgan est souvent utilisé, c'est une unité de recombinaison donc une unité de mesure génétique et non physique. Deux séquences particulières d'un même chromosome sont distantes d'un centimorgan si elles recombinent une fois sur cent lors de la méiose. Un centimorgan équivaut approximativement à 106
paires de bases.
Une autre méthode pour localiser des séquences particulières d'ADN le long des chromosomes consiste à définir leur position relativement à des marqueurs jalonnant les chromosomes et dont la position est parfaitement déterminée et connue. Des marqueurs très utilisés sont les marqueurs microsatellites dont il existe des cartographies très complètes. En particulier le GDB " Genome Database " est une banque de données, connue mondialement pour répertorier entre autres les STSs (Sequence tagged sites), bornes spécifiques et uniques de l'ADN dont font partie les microsatellites. Les codes DxSxxxx (par exemple D6S257), servant à identifier ces marqueurs, sont leur numéro d'accession dans GDB. Ces codes sont un moyen d'identification non ambigu et universel car seul GDB attribue ce type de code. Comme on peut trouver de tels marqueurs microsatellites environ tous les 10 kb, il est donc possible de définir la position de toute
séquence à lOkb près, en indiquant les marqueurs microsatellites l'encadrant.
Par région chromosomique entre deux marqueurs, on entend toute la séquence comprise entre ces deux marqueurs, les bornes étant comprises, donc la séquence des
marqueurs y compris.
En génétique inverse, les indices permettant de localiser un gène proviennent de la comparaison de la transmission d'un phénotype, supposé induit par un gène muté ou par
un allèle donné, avec la transmission de marqueurs connus, au sein d'une même famille.
Ces données de co-ségrégation d'un phénotype et d'un marqueur permettent d'établir une
analyse de liaison génétique.
La co-transmission d'un phénotype et d'un marqueur suggère que le gène responsable du phénotype et le marqueur sont physiquement proches l'un de l'autre sur le chromosome. La liaison est déterminée par l'analyse du schéma de transmission d'un gène
et d'un marqueur dans des familles qui s'y prêtent.
L'analyse de liaison repose sur la co-transmission de certaines formes de marqueurs avec la forme défectueuse, ou modifiée d'un gène. Mais c'est une analyse indirecte dans le sens o d'une part, lors d'une première étape, un phénotype est associé à la forme défectueuse ou modifiée du gène. Une erreur dans l'assignation de certains phénotypes fausse l'étude. D'autre part, cette étude est basée sur des statistiques, ces statistiques reposant sur l'analyse d'un échantillon de la population, il s'agit donc d'un sondage. Enfin, il faut noter que lorsqu'il est possible d'associer un allèle particulier du marqueur avec un allèle du gène (en fait un phénotype), cette association n'est a priori
valable que pour les échantillons inter-familiaux.
Le résultat des analyses de liaison dépend évidemment du degré de liaison entre le marqueur et le locus de la maladie. Cinq centimorgans (5 cM) est considéré comme un minimum de liaison pour un diagnostic. Une liaison à 5 cM signifie que l'on a 95% de chances d'arriver à une conclusion correcte et seulement 1 chance sur 20 qu'une
recombinaison soit survenue entre le marqueur et le locus de la maladie.
Les inventeurs ont identifié 3 régions chromosomiques distinctes, appartenant aux chromosomes 3, 5 et 11 et qui sont impliquées dans la canitie précoce. Ces 3 régions sont
chacune des régions ou zones chromosomiques de l'invention.
Selon un premier aspect, l'invention concerne la région du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de cette région, tels que des produits de transcription ou d'expression. Cette première zone chromosomique de l'invention est délimitée sur le chromosome 3 par les marqueurs microsatellites D3S1277 et D3S1285. Cette zone sera
plus particulièrement dénommée " première zone chromosomique de l'invention ".
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne la région du chromosome 5 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de cette région, tels que des produits de transcription ou d'expression. Cette deuxième zone chromosomique de l'invention est délimitée sur le chromosome 5 par les marqueurs microsatellites D5S2115 et D5S422. Cette zone sera plus
particulièrement dénommée " deuxième zone chromosomique de l'invention ".
Selon un troisième aspect, l'invention concerne la région du chromosome 11 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie précoce et les utilisations des produits dérivés de cette région, tels que des produits de transcription ou d'expression. Cette troisième zone chromosomique de l'invention est délimitée sur le chromosome 1I par les marqueurs microsatellites Dl S898 et Dl IS925. Cette zone sera
plus particulièrement dénommée " troisième zone chromosomique de l'invention ".
Pour les trois zones chromosomiques identifiées ci-dessus, la présente invention couvre des fragments polynucléotidiques ayant une longueur minimale de 18 nucléotides, correspondant au moins partiellement à l'une des zones chromosomiques de l'invention, ces fragments d'ADN ayant la caractéristique fonctionnelle d'être impliqués dans la
canitie, ou bien dans la canitie précoce, et éventuellement dans les deux phénomènes.
Selon une possibilité envisagée par la présente invention, un fragment impliqué dans la canitie ou la canitie précoce et possédant une séquence répondant aux exigences mentionnées plus haut peut être utilisé en thérapie. Plus particulièrement, le premier aspect de l'invention concerne la zone du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie de la zone du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie. Cette première zone chromosomique de l'invention est délimitée sur le chromosome 3 par les marqueurs microsatellites D3S1277 et D3S1285. De préférence, les fragments ainsi définis ont une séquence correspondant à tout ou partie de la séquence délimitée par les marqueurs D3S1768 et D3S1285, comprise dans la première zone chromosomique de l'invention. Selon d'autres cas particuliers préférés, la séquence des fragments correspond à tout ou partie de la première zone chromosomique de l'invention délimitée par les marqueurs D3S1277 et D3S1768, ou par les marqueurs D3S1768 et D3S2409, ou par les marqueurs D3S2409 et D3S1289, ou par les marqueurs D3S1289 et D3S1766, ou par les marqueurs D3S1766 et D3S1300, ou par
les marqueurs D3S1300 et D3S1285.
Le deuxième aspect de l'invention concerne la zone du chromosome 5 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie de cette zone. Cette deuxième zone chromosomique de l'invention est délimitée sur le chromosome 5 par les marqueurs microsatellites D5S2115 et D5S422. De préférence, les fragments ainsi définis ont une séquence correspondant à tout ou partie de la séquence délimitée par les marqueurs D5S2115 et D5S436, comprise dans la deuxième zone chromosomique de l'invention. Selon d'autres cas particuliers préférés, la séquence des fragments correspond à tout ou partie de la deuxième zone chromosomique de l'invention
délimitée par les marqueurs D5S436 et D5S410, ou par les marqueurs D5S410 et D5S422.
Le troisième aspect de l'invention concerne la zone du chromosome 11 humain identifiée par les inventeurs comme étant impliquée dans la canitie précoce. Selon cet aspect, un fragment tel que couvert par l'invention a une séquence correspondant à tout ou partie de cette zone. Cette troisième zone chromosomique de l'invention est délimitée sur le chromosome Il par les marqueurs microsatellites Dl IS898 et Dl IS925. De préférence, les fragments ainsi définis ont une séquence correspondant à tout ou partie de la séquence délimitée par les marqueurs DllS898 et DllS925, comprise dans la troisième zone chromosomique de l'invention. Selon d'autres cas particuliers préférés, la séquence des fragments correspond à tout ou partie de la troisième zone chromosomique de l'invention délimitée par les marqueurs Dl1S898 et Dl1S908, ou par les marqueurs DllS908 et
Dl1 S925.
Le fragment polynucléotidique dont il est fait référence dans le cadre de l'invention correspond à un fragment d'un chromosome. Ce fragment a une longueur minimale de 18 nucléotides, et une longueur maximale qui peut aller jusqu'à la longueur totale de la zone chromosomique en question. De préférence, le fragment a un nombre de nucléotides supérieur à 18. Une longueur particulièrement préférée est comprise entre 18 et
10000 nucléotides, de préférence entre 30 et 8000 nucléotides.
Selon des variantes préférées de l'invention, il est fait référence à des fragments dont la longueur est comprise entre 30 et 5000 nucléotides, de préférence entre 50 et 3000
nucléotides, par exemple entre 100 et 2000 nucléotides, ou entre 200 et 1000 nucléotides.
L'invention concerne également l'utilisation en cosmétique ou en thérapie d'un fragment polynucléotidique ou du produit d'expression d'un fragment ou d'un agent modulant la fonction d'un fragment, ou bien d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment, o le fragment en question correspond à tout ou partie de l'une des trois zones chromosomiques de l'invention. Selon un cas préféré, le fragment correspond plus particulièrement à une partie au moins d'un gène, compris dans l'une des trois zones chromosomiques de l'invention. Dans un cas particulier de cette situation, il s'agit de tout ou partie d'un exon d'un gène compris dans l'une des trois zones
chromosomiques de l'invention.
Dans ce qui suit, seront désignés "produits de l'invention ", le fragment, le produit d'expression d'un fragment, l'agent modulant la fonction d'un fragment, et l'agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique
correspondant à tout ou partie de l'une des trois zones chromosomiques de l'invention.
Pour ces trois zones chromosomiques, la présente invention concerne tout d'abord des utilisations dans le domaine de la cosmétique. On entend par cosmétique toute
application qui ne tend à modifier que l'esthétique et n'a aucune visée thérapeutique.
Pour toutes les utilisations selon l'invention dans le domaine de la cosmétique, le produit de l'invention peut être conditionné sous différentes formes appropriées, seul ou en combinaison avec d'autres agents. En particulier, des formes préférées sont destinées à des applications locales et elles concernent les crèmes, les lotions, les gels, les émulsions, les pommades et les shampoings. D'autres formes sont aussi envisageables pour des utilisations selon l'invention, en particulier sous forme de pilules pour une administration orale. Parmi les différentes visées cosmétiques dans le cadre de la présente invention, un domaine particulièrement préféré est celui de la pigmentation. La pigmentation peut être celle de la peau ou bien des phanères. Il peut s'agir de la couleur de la pigmentation comme de l'absence de pigmentation; les problèmes touchant à la qualité et à l'intensité
de la pigmentation sont aussi concernés par la présente invention.
En particulier, l'objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un produit de l'invention pour prévenir et/ou limiter et/ou arrêter le développement de la
1 5 canitie.
L'objet de l'invention se rapporte aussi à l'utilisation d'au moins un produit de
l'invention pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique de la canitie caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une
composition comprenant au moins un produit de l'invention.
L'invention se rapporte aussi à un procédé traitement cosmétique destiné à favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs caractérisé en ce qu'on applique sur la zone à traiter une composition comprenant au moins un produit de l'invention. Les zones à traiter peuvent être, par exemple et sans aucune limitation, le cuir
chevelu, les sourcils, la moustache et/ou la barbe.
Plus particulièrement, les procédés de traitement de la canitie et de pigmentation naturelle des cheveux et/ou poils gris ou blancs consistent à appliquer une composition
comprenant au moins un produit de l'invention.
Les procédés de traitement pour lutter contre la canitie et/ou pour stimuler la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs peuvent par exemple consister à appliquer la composition sur les cheveux et le cuir chevelu, le soir, garder la composition toute la nuit au contact et éventuellement effectuer un shampooing le matin ou il laver les cheveux à l'aide de cette composition et à laisser à nouveau en contact quelques minutes avant de rincer. La composition conforme à l'invention s'est révélée particulièrement intéressante lorsqu'elle est appliquée sous forme de lotion capillaire,
éventuellement rincée ou même sous forme d'un shampooing.
Pour les trois zones chromosomiques identifiées dites " zones chromosomiques de l'invention ", la présente invention concerne ensuite des utilisations thérapeutiques dans
le domaine de la pigmentation.
Les affections touchant le système de pigmentation, que ce soit celui de la peau ou celui des phanères, peuvent avoir de graves conséquences sur la santé des personnes atteintes. En effet, la pigmentation de la peau joue le rôle de barrière protectrice face aux agressions lumineuses en particulier, les personnes souffrant d'albinisme sont dépourvues
de protection faces aux rayons du soleil qui constituent pour eux un danger important.
D'autres affections mettant en jeu la pigmentation sont aussi concernées par la présente invention. Dans le cadre des utilisations thérapeutiques et cosmétiques tendant à modifier une caractéristique de la pigmentation, il s'agit de préférence de la pigmentation de la peau. Selon d'autres cas envisagés par la présente invention, le type de pigmentation qui doit être modifiée concerne la pigmentation des phanères, en particulier les ongles ou les poils. Selon un cas particulier préféré de la présente invention, la pigmentation dont on cherche à modifier les caractéristiques est celle du système pileux en général et de la chevelure, moustache et sourcils en particulier. La présente invention permet de modifier le phénomène d'arrêt de la pigmentation des cheveux, c'est-à-dire la canitie, en particulier lorsque celle-ci survient de manière prématurée chez une personne et quel'on parle de
canitie précoce.
Pour toutes les utilisations en thérapeutique, les produits actifs entrant dans la composition d'un médicament sont de préférence associés à des excipients pharmaceutiquement acceptables. Toutes les voies d'administration considérées comme acceptables peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention, en particulier voie intradermique, intraveineuse, musculaire, orale, otique, nasale, optique. La formulation est
de préférence adaptée à la voie d'administration choisie.
Les utilisations pour la fabrication d'un médicament selon l'invention peuvent faire entrer dans leur formulation d'autres principes actifs. De même, l'administration d'un médicament comme défini dans l'invention peut être combinée avec l'administration d'un
autre médicament, que cette administration soit simultanée, séquentielle ou séparée.
De même, les différents produits dont il est fait usage dans le cadre des utilisations en thérapie, peuvent être combinés et entrer dans la composition d'un unique médicament ou bien peuvent servir à la fabrication de différents médicaments. En particulier, s'ils entrent dans la composition de médicaments distincts, ils peuvent être
administrés à des fréquences différentes.
Les caractéristiques et les variantes préférées des produits dont il est fait usage dans les utilisations selon l'invention peuvent être identiques dans le cadre des utilisations en cosmétologie et pour des utilisations du même produit dans la fabrication d'un médicament. Dans les deux cas, l'utilisation de produits selon l'invention peut nécessiter que le
produit soit introduit dans un fluide corporel, ou bien dans des tissus, ou dans des cellules.
Pour l'introduction dans des cellules, l'utilisation peut prévoir que le produit soit actif dans
le cytoplasme des cellules, ou bien dans le noyau cellulaire.
La première utilisation, cosmétique ou thérapeutique, envisagée dans le cadre de l'invention est l'utilisation d'un fragment polynucléotidique dont la séquence correspond, au moins en partie, à une des trois zones chromosomiques de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, le fragment polynucléotidique entre dans la fabrication d'un
médicament.
Concernant la nature chimique de ce fragment polynucléotidique, il peut s'agir d'une molécule d'ADN, simple ou double brin, circulaire ou linéaire, d'une molécule d'ARN ou de toute autre molécule envisagée dans la définition de fragment
polynucléotidique donnée plus haut.
Concernant son environnement, ce fragment peut être ou faire partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Il peut, dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour
comporter ce fragment dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant ce fragment, il est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si le fragment est inséré dans un vecteur, le dit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement la traduction du fragment. Ce fragment peut aussi être entouré par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique, conduisant éventuellement à l'insertion du fragment de
l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
Le fragment polynucléotidique tel que décrit peut se trouver sous forme naturelle ou bien être de nature synthétique, ou bien être en partie l'un et en partie l'autre, en particulier s'il s'agit d'une molécule " duplex " constitué de deux brins aux origines différentes. Selon différents cas envisagés par la présente invention, le fragment polynucléotidique peut être isolé, il peut avoir subi une étape de purification. Il peut s'agir aussi d'un fragment recombinant, par exemple synthétisé dans un autre organisme. Selon un exemple préféré, il s'agit d'un fragment d'ADN ayant été amplifié par PCR
(Polymerisation Chain Reaction) puis purifié.
Selon d'autres constructions envisagées par la présente invention, la première utilisation fait usage d'une fragment polynucléotidique associé à une sonde. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation du fragment, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. La sonde peut aussi permettre de suivre la dégradation du fragment. La nature de la sonde est de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. L'homme du métier saura quelle sonde est la mieux adaptée
en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Le fragment polynucléotidique, dont il est fait usage dans le cadre de cette première utilisation selon l'invention, peut être utilisé dans un test d'hybridation, un
séquençage, un microséquençage ou bien un test de détection de mésappariement.
Ce fragment selon l'invention contient au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides constituant une séquence qui correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, ou à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, ou à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs DllS898 et Dl1S925. En particulier, un fragment selon l'invention peut ne contenir que 18 bases complémentaires de 18 bases successives de l'une des trois régions
chromosomiques précédemment décrites.
Selon un autre cas particulier, le fragment décrit peut être l'ADNc ou l'ARN de l'une des trois régions chromosomiques précédemment décrites. Il peut correspondre à un ou plusieurs exons de l'une des régions de l'invention, il peut correspondre à une séquence
de régulation comprise dans l'une des régions identifiées sur les chromosomes 3, 5 et 11.
Dans le cadre de cette première utilisation, le nombre de fragments polynucléotidiques tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se restreint pas nécessairement à un seul. En particulier, il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à la première zone chromosomique de l'invention. De préférence, les séquences des différents fragments correspondent à des régions distinctes de la première zone chromosomique de l'invention, par exemple des
exons distincts.
Alternativement, il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à la deuxième zone chromosomique de l'invention, ou bien plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond,
au moins en partie, à la troisième zone chromosomique de l'invention.
Cependant, dans le cadre de cette première utilisation, les différents fragments polynucléotidiques dont il est fait usage ont tous une partie de leur séquence au moins
correspondant à une même région chromosomique de l'invention.
Cette première utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de
la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une
action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la première utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un fragment nucléotidique tel que décrit ou non. Dans le cas o un gène responsable de la pigmentation est défectueux car muté, cette première utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un fragment polynucléotidique qui représente une nouvelle copie sauvage du
gène endogène défectueux.
Dans le cas o l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette première utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant
un ARN antisense qui va bloquer la traduction dudit gène.
Une deuxième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à une des zones chromosomiques de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au moins 18 nucléotides. Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'une des trois zones chromosomiques de l'invention identifiées par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction d'une séquence endogène comprise dans l'une des ces trois zones chromosomiques de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette deuxième utilisation selon l'invention module non seulement la fonction d'un fragment d'ADN
exogène tel que défini, mais aussi du fragment d'ADN endogène correspondant.
Le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à la première région chromosomique de l'invention. Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction est modulée peut correspondre partiellement à la deuxième région chromosomique de l'invention, ou bien à la troisième région chromosomique de l'invention. En particulier, il peut s'agir d'un plasmide ayant uniquement une courte séquence correspondante à l'une des régions chromosomiques mentionnées. De préférence,
la correspondance des séquences est établie sur au moins 18 nucléotides successifs.
Toutes les remarques qui précèdent, dans la partie définition, sur ce qu'il faut entendre par " fonction d'un fragment d'ADN " sont valables pour envisager toutes les
utilisations correspondant à une deuxième utilisation selon l'invention.
Etant donné la pluralité de fonctions des fragments d'ADN, la modulation de ces fonctions comprend des aspects très différents. Dans le cas particulier o la fonction dudit fragment est d'être transcrite, moduler une telle fonction consiste à favoriser ou inhiber la capacité dudit fragment à être transcrit. Cela peut aussi consister à modifier le site d'initiation et de terminaison de la transcription, ou bien à modifier le taux d'initiation de la transcription. Selon un autre cas, moduler la fonction peut aussi consister à modifier l'épissage de l'ARN, par exemple en modifiant des signaux de reconnaissance de l'ADN
responsables la répartition entre introns et exons.
Quand le fragment d'ADN appartient à une séquence régulatrice, modifier sa fonction peut consister à inhiber la fixation des enhancers ou des inhibiteurs. Elle peut consister au contraire à favoriser leur fixation, ou bien à favoriser la fixation d'autres facteurs de transcription. Il en est de même lorsqu'il s'agit de séquences utilisées par
l'ARN polymérase.
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, comme dans le cadre de toutes les autres utilisations selon l'invention, le nombre de produits, en l'occurrence d'agents modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'une des
trois régions chromosomiques de l'invention, n'est pas limité et peut être supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette deuxième utilisation, les différents agents dont il est fait usage ont en commun de tous moduler la fonction de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle
identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 1 1 respectivement.
Des agents selon l'invention sont par exemple des molécules d'ADN simple brin capable de se fixer à des sous-régions définies de l'une des trois régions chromosomiques de l'invention, pour former des triples hélices. Dans ces conditions, des agents selon
l'invention abolissent la fonction de la sous-région à laquelle ils s'hybrident.
D'autres agents selon l'invention sont de préférence des polypeptides capables d'interagir avec des sous-régions définies de l'une des trois régions chromosomiques de l'invention. De préférence, des agents selon l'invention sont des enhancers ou des inhibiteurs se fixant sur des régions régulatrices de la région du chromosome 3 humain
comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285.
Alternativement, des agents selon l'invention sont des enhancers ou des inhibiteurs se fixant sur des régions régulatrices de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, ou de la région du chromosome 1 1
humain comprise entre les marqueurs Dl IS898 et Dl 1S925.
Une autre catégorie d'agents selon l'invention concerne des molécules capables d'interagir avec des régions précises de l'ADN pour en changer sa conformation. Une autre catégorie concerne des molécules interagissant avec des inhibiteurs ou des enhancers pour en modifier leur fonction, les inhibiteurs ou enhancers ayant la fonction initiale de modifier l'expression de fragments d'ADN appartenant à l'une des trois régions chromosomiques de l'invention. Un agent dont il est fait usage selon cette deuxième utilisation de l'invention peut en particulier moduler la fonction d'un fragment d'ADN correspondant à 18 bases
successives de l'une des trois régions chromosomiques précédemment décrites.
Cette deuxième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de la cosmétique. Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une
action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la seconde utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction d'un
fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas o l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, par exemple, à sa région promotrice. Dans le cas o l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette seconde utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant un agent qui va activer la transcription dudit gène, par exemple en se fixant à sa région promotrice, ou bien en se fixant à un éventuel inhibiteur qui cessera de ce fait
d'inactiver ledit gène.
Une troisième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'une des trois régions chromosomiques de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment
d'ADN possède au moins 18 nucléotides.
En particulier, un tel agent selon l'invention module la fonction d'un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à la première région chromosomique de l'invention. Selon un autre cas, un agent selon l'invention module la
fonction d'un polypeptide issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés.
Alternativement, le fragment d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée, peut correspondre au moins en partie à la deuxième région chromosomique de l'invention,
ou bien à la troisième région chromosomique de l'invention.
Un tel agent selon l'invention peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène dont une partie de la séquence correspond à l'une des trois zones chromosomiques de l'invention identifiées par les inventeurs, ou bien il peut être capable de moduler la fonction du produit d'expression d'une séquence endogène comprise dans l'une des ces trois zones chromosomiques de l'invention. De préférence, un agent servant pour cette troisième utilisation selon l'invention module non seulement la fonction d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène tel que
défini, mais aussi du fragment d'ADN endogène correspondant.
Moduler la fonction d'un polypeptide peut être réalisé de différentes manières. En particulier, il est possible de croître ou décroître son activité, son rendement, sa spécificité, son avidité pour un anticorps, il est possible de modifier son substrat pour une enzyme, son
taux de conversion.
Des agents selon l'invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à la première région chromosomique de l'invention, ou bien la deuxième ou la troisième région chromosomique de l'invention. D'autres agents remplissant les mêmes rôles peuvent être des molécules d'ADN simple brin, ou bien des molécules hybrides ADN-ARN. Le rôle de ces agents selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit
transcrit.
D'autres agents préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables de se fixer sur ledit transcrit et ainsi d'en moduler sa traduction. De tels agents de la classe des polypeptides peuvent être d'origine naturelle ou synthétique (synthétisés chimiquement ou par voie biotechnologique). Notamment il peut s'agir d'anticorps. Comme mentionné plus haut, cette modulation peut se traduire par l'action de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction dudit transcrit. En particulier, l'interaction entre le polypeptide et ledit transcrit peut constituer un obstacle à la fixation
normale des ribosomes.
Des agents tels que définis dans la présente invention peuvent moduler la fonction de la protéine codée par un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à la première région chromosomique de l'invention. Ces agents sont ou non de nature protéique. Un agent selon l'invention peut intervenir à un stade précoce en empêchant le repliement correct de la protéine. Un agent selon l'invention peut aussi modifier la fonction de ladite protéine en modifiant sa structure tridimentionnelle après le repliement. Il est aussi envisageable que cet agent soit un inhibiteur de la protéine, en particulier un
inhibiteur compétitif.
Selon les autres aspects de l'invention, des agents tels que définis dans la présente demande peuvent moduler la fonction de la protéine codée par un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à la deuxième région chromosomique de l'invention, ou
bien à la troisième région chromosomique de l'invention identifiées par les inventeurs.
Les agents qui peuvent convenir dans le cadre de la présente invention ne sont pas
limités à ceux cités précédemment.
Dans le cadre de cette troisième utilisation, le nombre d'agents modifiant la fonction d'un produit d'expression tels que définis précédemment n'est pas limité et ne se
restreint pas nécessairement à un seul.
Cependant, dans le cadre de cette troisième utilisation, les différents agents dont il est fait usage ont en commun de tous moduler la fonction de produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est
celle identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 1 1 respectivement.
Cette troisième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de
la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une
action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la troisième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un agent modulant la fonction du produit
d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas o l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette troisième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN antisens qui va bloquer la traduction dudit gène en empêchant le passage ARN-protéine. Une autre situation préférée consiste à choisir pour agent un
anticorps capable de se fixer sur la protéine résultant de la traduction dudit gène.
Une quatrième utilisation envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'un produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à l'une des trois régions chromosomiques de l'invention. Pour les utilisations en thérapeutique, l'agent ainsi défini entre dans la fabrication d'un médicament. De préférence, le fragment d'ADN possède au
moins 18 nucléotides.
En particulier, un tel produit d'expression est le transcrit ARN issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à la première région chromosomique de l'invention, ou bien la deuxième ou la troisième région chromosomique de l'invention, quelque soit le stade de maturation dudit transcrit. En cas d'épissage, le transcrit peut donc être de taille inférieure au fragment d'ADN dont il est issu. De préférence, si le produit
d'expression est une molécule d'ARN, elle comporte au moins 18 nucléotides.
Selon un autre cas préféré, un produit d'expression selon l'invention est issu de la traduction d'un des transcrits mentionnés. Un tel produit d'expression peut donc comporter moins de 6 acides aminés si le transcrit dont il est issu a subi des étapes d'épissage. De
préférence, un produit d'expression peptidique contient au moins 6 acides aminés.
Le produit d'expression selon l'invention ne provient pas nécessairement des étapes de transcription ou de traduction d'ADN génomique. En particulier, un produit d'expression utilisé selon l'invention peut être un produit d'expression issu d'ADN exogène dont une partie de la séquence au moins correspond à une partie de l'une des trois
régions chromosomiques de l'invention.
Est aussi envisagée par la présente invention l'utilisation d'un agent parfaitement synthétique mais semblable au produit d'expression d'un fragment d'ADN exogène ou endogène correspondant au moins en partie à l'une des trois régions chromosomiques de
l'invention.
Des produits d'expression tels qu'utilisés par la présente invention sont de préférence des molécules d'ARN, dites ARN antisense, qui s'hybrident avec au moins un transcrit issu d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à la première région chromosomique de l'invention, ou bien la deuxième ou la troisième région chromosomique de l'invention. En particulier, pour former des ARN anti-sens ayant pour cible un ARN spécifique, il est envisageable d'utiliser des ARN issus de la transcription de la même séquence d'ADN que la cible mais non pas du brin leader, mais de sa séquence complémentaire portée par l'autre brin. On obtient ainsi des fragments d'ARN complémentaires des fragments cibles normalement synthétisés par la cellule. Le rôle attendu de ces produits d'expression selon l'invention est de préférence de favoriser, empêcher, retarder, accélérer ou introduire des erreurs dans la traduction des transcrits
normalement synthétisés par la cellule.
D'autres produits d'expression préférés selon l'invention appartiennent à la classe des polypeptides. En particulier, l'invention concerne des protéines capables d'introduire
un changement dans le fonctionnement de la cellule dans laquelle elles agissent.
Dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, le nombre de produits d'expression d'un fragment d'ADN dont la séquence appartient ou correspond au moins en partie à l'une des trois régions chromosomiques de l'invention, n'est pas limité et peut être
supérieur à un.
Cependant, dans le cadre de cette quatrième utilisation, les différents produits dont il est fait usage ont en commun d'être tous des produits d'expression de fragments d'ADN dont la séquence appartient ou correspond à au moins une partie d'une même région chromosomique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, cette région est celle du chromosome 3 humain identifiée par les inventeurs. Selon les deuxième et troisième aspects de la présente invention, la région chromosomique en question est celle
identifiée par les inventeurs sur les chromosomes 5 et 11 respectivement.
Cette quatrième utilisation selon l'invention est de préférence dans le domaine de
la cosmétique.
Cette utilisation peut aussi permettre la fabrication d'un médicament pour une
action thérapeutique, dans le domaine de la pigmentation.
Selon un cas particulier envisagé, la quatrième utilisation décrite implique une modification génétique, qu'elle soit induite par un produit d'expression d'un fragment
d'ADN tel que décrit ou non.
Dans le cas o l'activation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet d'abolir la fonction de ce gène en introduisant un ARN anti-sens qui va bloquer la traduction dudit gène en se fixant, au
* transcrit synthétisé par la cellule.
Dans le cas o l'inactivation d'un gène est responsable de la dépigmentation, cette quatrième utilisation selon l'invention permet de restaurer la fonction de ce gène en introduisant dans la cellule ou bien une molécule d'ARN permettant la synthèse de la
protéine codée par le gène ou bien la protéine codée par le gène.
Pour les quatre types d'utilisations décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de la pigmentation. Pour les quatre types d'utilisation décrits précédemment, le produit de l'invention pourra être incorporé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique. Une telle composition comprend, dans un milieu pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable, une quantité de produits de l'invention comprise entre 0,001 et
1 0 % en poids par volume.
La composition peut être administrée par voie orale ou appliquée sur la peau (sur
1 0 toute zone cutanée du corps) et/ou le cuir chevelu ou les cheveux.
Par voie orale, la composition peut contenir le ou les produits de l'invention en solution dans un liquide alimentaire tel qu'une solution aqueuse ou hydroalcoolique, éventuellement aromatisée. Ils peuvent également être incorporés dans un excipient solide ingérable et se présenter par exemple sous forme de granulés, de pilules, de comprimés ou
de dragées. Ils peuvent également être placés en solution dans un liquide alimentaire luimême éventuellement conditionné dans des capsules ingérables.
Selon le mode d'administration, la composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées, particulièrement en cosmétologie.
Une composition préférée de l'invention est une composition cosmétique adaptée
à une application topique sur le cuir chevelu et/ou la peau.
Pour une application topique, la composition utilisable peut être notamment sous la forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/K), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle du type crème ou gel aqueux ou anhydres, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elle peut ainsi se présenter sous forme d'onguent, de teinture, de crème, de pommade, de poudre, de timbre, de tampon imbibé, de solution, d'émulsion ou de dispersion vésiculaire, de lotion, de gel, de spray, de suspension, de shampooing, d'aérosol ou de mousse. Elles peuvent être anhydres ou aqueuses. Elle peut également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition peut en particulier être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous fonne de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les cheveux, de masque. Lorsque l'invention consiste en une utilisation à des fins cosmétiques, la composition sera préférentiellement une crème, une lotion capillaire, un shampoing ou un après-shampoing. Les quantités des différents constituants des compositions utilisables sont celles
classiquement utilisées dans les domaines considérés.
Lorsque la composition est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5% à 80% en poids, et de préférence de 5% à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les émulsionnants et les co-émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. L'émulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% à 30% en poids, et de préférence de 0,5 à 20% en poids par rapport au poids total de la composition. L'émulsion peut, en outre,
contenir des vésicules lipidiques.
Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus d Dans une variante, la composition sera telle que le ou les produits de l'invention sont encapsulés dans un enrobage tel que des microsphères, des nanosphères, des oléosomes ou des nanocapsules, l'enrobage sera choisi selon la nature chimique du produit
de l'invention.
A titre d'exemple, les microsphères pourront être préparées selon la méthode
décrite dans la demande de brevet EP 0 375 520.
Les nanosphères pourront se présenter sous forme de suspension aqueuse et être préparées selon les méthodes décrites dans les demandes de brevet FR 0015686 et
FR 0101438.
Les oléosomes consistent en une émulsion huile dans eau formée par des globules huileux pourvus d'un enrobage cristal liquide lamellaire dispersé dans une phase aqueuse
(voir les demandes de brevet EP 0 641 557 et EP 0 705 593).
Les produits de l'invention pourront aussi être encapsulés dans des nanocapsules consistant en un enrobage lamellaire obtenu à partir d'un tensio-actif siliconé (voir la demande de brevet EP 0 780 115), les nanocapsules pourront également être préparées à
base de polyesters sulfonique hydrodispersibles (voir la demande de brevet FR 0113337).
Les produits de l'invention pourront également être complexés à la surface de globules huileux cationiques, quelque soit leur taille (voir les demandes de brevet
EP 1 010 413, EP 1 010 414, EP 1 010 415, EP 1 010 416, EP 1 013 338, EP 1 016 453,
EP 1 018 363, EP 1 020 219, EP 1 025 898, EP 1 120 101, EP 1 120 102, EP 1 129 684,
EP 1 160 005 et EP 1 172 077).
Les produits de l'invention peuvent enfin être complexés à la surface de nanocapsules ou nanoparticules pourvues d'un enrobage lamellaire (Voir EP 0 447 318 et EP 0 557 489) et contenant un tensio-actif cationique à la surface (voir les références citées
précédemment pour les tensio-actifs cationiques).
En particulier, on préférera une composition telle que l'enrobage du ou des
produits de l'invention a un diamètre inférieur ou égal à 10 gim.
De façon connue, la composition peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique, et par exemple de 0,01% à 10% du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les
sphérules lipidiques.
Comme huiles ou cires utilisables, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffine. On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des
acides gras (acide stéarique).
Comme émulsionnants utilisables, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la
dénomination de Tefose 63 par la société Gattefosse.
Comme solvants utilisables, on peut citer les alcools inférieurs, notamment
l'éthanol et l'isopropanol, le propylène glycol.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et la silice hydrophobe, éthylcellulose, polyéthylène. Les compositions peuvent associer au moins un produit de l'invention à d'autres agents actifs. Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple: - les agents modulant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation des cellules de la peau tels que le rétinol et ses esters, la vitamine D et ses dérivés, les oestrogènes tels que l'oestradiol, les modulateurs de l'AMPc tels que les dérivés de POMC, l'adénosine, ou la forskoline et ses dérivés, les prostaglandines et leurs dérivés, la triiodotrionine et ses dérivés; - des extraits de végétaux tels que ceux d'Iridacées ou de soja, extraits pouvant alors contenir ou non des isoflavones; - des extraits de micro-organismes; - les agents anti-radicaux libres tels que l'cc-tocophérol ou ses esters, les superoxyde dismutases ou ses mimétiques, certains chélatants de métaux ou l'acide ascorbique et ses esters; - les anti-séborrhéiques tels que certains acides aminés soufrés, l'acide 13-cis rétinoique, l'acétate de cyprotérone; - les autres agents de lutte contre les états desquamatifs du cuir chevelu comme le zinc pyrithione, le disulfure de sélénium, le climbazole, l'acide undécylénique, le Kétoconazole, la piroctone olamine (octopirox) ou la ciclopiroctone (ciclopirox); en particulier, il pourra s'agir d'actifs stimulant la repousse et/ou favorisant le ralentissement de la chute des cheveux, on peut plus particulièrement citer à titre non limitatif: - les esters d'acide nicotinique, dont notamment le nicotinate de tocophérol, le nicotinate de benzyle et les nicotinates d'alkyles en Cl-C6 comme les nicotinates de méthyle ou d'hexyle; - les dérivés de pyrimidine, comme le 2,4-diamino 6- piperidinopyrimidine 3oxyde ou "Minoxidil" décrit dans les brevets US 4, 139,619 et US 4,596,812; - les agents inhibiteurs de lipoxygenase ou inducteur de cyclo-oxydase favorisant la repousse des cheveux comme ceux décrits par la Demanderesse dans la demande de brevet européen EP 0 648 488; - les agents antibactériens tels que les macrolides, les pyranosides et les tétracyclines, et notamment l'Erythromycine; - les agents antagonistes de calcium, comme la Cinnarizine, la Nimodipine et la Nifedipine; - des hormones, telles que l'estriol ou des analogues, ou la thyroxine et ses sels; - des agents antiandrogènes, tels que l'oxendolone, la spironolactone et la flutamide; - des inhibiteurs stéroidiens ou non stéroidiens des 5-a-réductases tels que ceux décrits par la Demanderesse dans les demandes de brevet européen EP 0 964 852 et EP 1 068 858 ou encore le finastéride; - des agonistes des canaux potassiques dépendant de l'ATP tels que la cromakalim
et le nicorandil.
Dans une autre possibilité de mise en oeuvre, la présente invention concerne des
procédés pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu.
En effet, la canitie précoce est un phénotype qui a été défini par les inventeurs comme étant, entre autres, caractérisé par l'apparition des premiers cheveux blancs tôt dans la vie, et de préférence vers l'âge de 18 ans. Comme ce phénotype est transmis à la génération suivante, il peut s'avérer important, pour les individus dont un parent ou un proche est atteint, de déterminer, avant l'apparition des symptômes, s'ils seront ou non sujets à cette atteinte. Le procédé de diagnostic selon l'invention est parfaitement adapté
aux individus âgés de moins de 18 ans.
Comme il est très probable que des facteurs environnementaux jouent un rôle dans le phénotype " canitie " comme dans celui " canitie précoce ", il s'agit, grâce aux procédés de l'invention, d'évaluer les risques de développer un tel phénotype, c'est-à-dire une
prédisposition à la canitie précoce.
Un procédé selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'un ou de plusieurs marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Par marqueur, on entend une séquence d'ADN dont les différentes variations alléliques sont porteuses d'informations. Un tel marqueur peut être une courte séquence d'un gène dont la mutation est source du phénotype. Il peut s'agir aussi d'un marqueur situé physiquement sur le chromosome dans
une région très proche d'un gène impliqué dans la canitie précoce.
Selon un premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs microsatellites D3S1277 et D3S1285, c'est-à-dire à la première zone chromosomique de l'invention, de préférence à la région délimitée par les marqueurs
D3S1768 et D3S1285.
Selon un deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs microsatellites D5S2115 et D5S422, c'est-à-dire à la deuxième zone chromosomique de l'invention, de préférence à la région délimitée par les marqueurs
D5S2115 et D5S436.
Selon un troisième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés appartiennent à la région du chromosome 1 1 humain comprise entre les marqueurs microsatellites DlIS898 et DllS925, c'est-à- dire à la troisième zone chromosomique de l'invention, de préférence à la région délimitée par les marqueurs
DI IS898 et DllS925.
L'étape suivante de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour le ou les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents dans un échantillon de matériel génétique issu de l'individu qui subit le test diagnostique. Deux allèles différents,
portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
L'échantillon contenant le matériel génétique peut être le sang, une unique goutte étant suffisante pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. D'autres échantillons de fluides corporels peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Il est aussi envisageable d'utiliser quelques cellules issues de l'individu. L'homme de l'art saura déterminer quel échantillon pourra être utilisé dans le cadre de ce test, tout en minimisant le désagrément pour l'individu le subissant. Ce test diagnostic pourra éventuellement être
couplé avec d'autres tests génétiques.
Les techniques courantes, bien connues du biologiste moléculaire, peuvent être utilisées pour effectuer la détermination des allèles du ou des marqueurs choisis; des tests
d'hybridation sont en particulier très courants dans ce genre d'étapes.
Divers marqueurs sont potentiellement préférés dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de l'invention. En particulier, des marqueurs bialléliques peuvent s'avérer particulièrement adéquats si une forme allélique traduit une prédisposition à la canitie précoce alors que l'autre forme allélique reflète au contraire l'absence d'une telle prédisposition. D'autres marqueurs plus courants sont polymorphiques et peuvent être
trouvés sous au moins deux formes alléliques et généralement plus de deux.
Parmi les marqueurs qui peuvent être sélectionnés à la première étape du procédé de l'invention, des marqueurs particulièrement bien connus sont les marqueurs microsatellites. Les propriétés de ces marqueurs ont déjà été amplement décrites dans le cadre de la présente invention. Lors de la sélection du marqueur, il est très important de se baser sur la valeur informative du polymorphisme du marqueur. Une situation particulièrement privilégiée consiste à sélectionner un marqueur dont certains variants alléliques traduisent une prédisposition à la canitie précoce alors que tous les autres variants reflètent au contraire l'absence d'une telle prédisposition. Dans de nombreuses situations, le marqueur ne remplit pas entièrement une telle condition, c'est-à-dire que par exemple certains allèles sont présents préférentiellement mais non exclusivement chez les individus prédisposés à la canitie. Dans ces situations, il peut être très judicieux de
sélectionner plusieurs marqueurs, afin d'établir un test diagnostic aussi fiable que possible.
Lorsque les marqueurs sélectionnés sont des marqueurs microsatellites, les différents variants alléliques correspondent aux nombres de répétitions en tandem du motif caractérisant le marqueur. Une situation particulièrement avantageuse à rechercher lors de la sélection du marqueur, correspond à la situation o certains nombres de répétitions en
tandem sont caractéristiques d'une prédisposition à la canitie précoce.
Selon le premier aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les marqueurs suivants: D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300 et D3S1285. Ces marqueurs sont des marqueurs microsatellites appartenant à la première zone
chromosomique de l'invention.
Selon le deuxième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les marqueurs suivants: D5S2115, D5S436, D5S410 et D5S422. Ces marqueurs sont des marqueurs microsatellites
appartenant à la deuxième zone chromosomique de l'invention.
Selon le troisième aspect d'un procédé de l'invention, le ou les marqueurs sélectionnés à la première étape peuvent être choisis parmi les marqueurs suivants: Dl1S898, DllS908 et DI1IS925. Ces marqueurs sont des marqueurs microsatellites
appartenant à la troisième zone chromosomique de l'invention.
Les procédés de l'invention ne sont pas limités aux deux étapes décrites et
peuvent contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique du ou des marqueurs sélectionnés à la forme allélique de ce ou de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'établir le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme du ou des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme du ou des
marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
Etant donné que la canitie précoce est une atteinte vraisemblablement multigénique, les causes de prédisposition sont nombreuses et peuvent difficilement être toutes envisagées de manière exhaustive. Par contre, au sein d'une même famille dont certains membres ont été précocement atteints de canitie, il est très probable que la cause de la susceptibilité est unique. De ce fait, lors de l'étape de comparaison, mentionnée comme éventuelle troisième étape des procédés de l'invention, une comparaison particulièrement riche en information est la comparaison des allèles du marqueur de l'individu subissant le test aux allèles du même marqueur pour les personnes de sa famille dont le phénotype est connu. Si plusieurs marqueurs ont été sélectionnés, il faut de
préférence répéter cette opération pour tous les marqueurs.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules ayant un effet particulier. En particulier, l'invention concerne un procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique. Selon le premier aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285. Selon le deuxième aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422. Enfin, selon le troisième aspect de l'invention, le fragment polynucléotidique dont on cherche à moduler la fonction comprend au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du
chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs D 1IS898 et Dl lS925.
Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction de l'un ou l'autre de ces fragments comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du fragment polynucléotidique. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le fragment polynucléotidique mise en évidence
par une technique de détection de ligands.
La " deuxième utilisation selon l'invention " est l'utilisation d'un agent modulant la fonction d'un fragment d'ADN correspondant au moins en partie à une des trois zones
chromosomiques de l'invention. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents.
Les différentes fonctions que peuvent revêtir un fragment polynucléotidique ont déjà été explicitées dans la présente demande. En particulier, ces fonctions dépendent de la
nature du fragment polynucléotidique, selon s'il s'agit d'ADN ou d'ARN par exemple.
Une modulation de la fonction peut correspondre a une diminution de la capacité à être transcrit, ou traduit, ou bien à un changement dans la capacité à interagir avec d'autres facteurs. En fonction des propriétés dudit fragment utilisé, l'homme de l'art est capable de
déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à monitorer.
Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées. La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des
fonctions des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention concerne aussi des procédés de criblage de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment polynucléotidique de l'invention. Selon le premier aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285. Selon le deuxième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422. Selon le troisième aspect de l'invention, le produit d'expression dont on cherche à moduler la fonction est celui d'un fragment d'ADN appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs D 1S898 et D 1S925. De préférence, le fragment d'ADN comprend au moins 18 nucléotides. Le procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN tel que décrit comprend une étape de mise en présence de la molécule à tester et du produit d'expression. Une autre étape du procédé est la détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit produit d'expression, par exemple la détection d'une éventuelle fixation de cette molécule sur le produit
d'expression mise en évidence par une technique de détection de ligands.
Comme mentionné précédemment dans la demande, on entend par produit d'expression d'un fragment d'ADN aussi bien les molécules d'ARN issues de la transcription du fragment, à tout stade de maturation, que les polypeptides issus de la traduction, aussi à tout stade de maturation. Pour une molécule d'ARN, différents stades de maturation sont représentés par la présence ou l'absence de coiffe, de queue polyadénylée, par exemple. Par différents stades de maturation d'un polypeptide, on inclut entre autres les polypeptides avant et après le repliement, avant et après clivage des différents signaux
d'adressage, avec et sans glycosylation, avec et sans ponts disulfure.
Quant aux fonctions remplies par les produits d'expression des fragment d'ADN, elles sont très nombreuses et elles dépendent de la nature du produit d'expression en
question. Des exemples ont déjà été donnés plus haut dans la présente demande.
La " troisième utilisation selon l'invention " est l'utilisation d'un agent modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN. Le procédé de criblage permet d'identifier de tels agents. Pour ce qui doit être compris par la locution " moduler la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN ", des exemples ont déjà été
donnés pour définir la troisième utilisation selon l'invention.
En fonction des propriétés dudit produit d'expression utilisé, l'homme de l'art est capable de déterminer quel est le paramètre dont la variation est facile à monitorer: Le procédé d'identification de l'invention n'est pas limité aux étapes précédemment décrites, d'autres étapes antérieures ou postérieures peuvent être appliquées. La présente invention couvre aussi les molécules identifiées par le procédé précédemment décrit. En particulier, la présente invention couvre les inhibiteurs des
fonctions des produits d'expression des fragments polynucléotidiques de l'invention.
La présente invention permet aussi de mettre en évidence les gènes impliqués dans la pigmentation de la peau, des cheveux et des phanères, au sein des trois zones chromosomiques de l'invention. Une utilisation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser les marqueurs microsatellites décrits précédemment au sein de chacune des régions chromosomiques d'intérêt dans le but de localiser plus finement les gènes impliqués dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux impliqués
dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
Dans le cadre de ces utilisations, selon le premier aspect de l'invention, les marqueurs microsatellites dont il est fait usage pour la détermination des gènes d'intérêt sont choisis parmi les marqueurs D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766,
D3S1300 et D3S1285.
Selon le deuxième aspect de l'invention, les marqueurs microsatellites dont il est fait usage pour la détermination des gènes d'intérêt sont choisis parmi les marqueurs
D5S2115, D5S436, D5S410 et D5S422.
Selon le troisième aspect de l'invention, les marqueurs microsatellites dont il est fait usage pour la détermination des gènes d'intérêt sont choisis parmi les marqueurs
DI 1S898, Dl 1S908 et DI 1S925.
La présente invention repose sur l'identification par les inventeurs de trois zones chromosomiques, sur les chromosomes 3, 5 et 1 1 humains, impliquées dans le phénomène de pigmentation ou de dépigmentation. Cette base génétique leur a permis d'envisager les utilisations en thérapie et en cosmétique décrites précédemment, ainsi que les procédés de
diagnostic illustrés précédemment.
Mais comme déjà mentionné, les inventeurs soupçonnent que de nombreux gènes sont impliqués dans les phénomènes de pigmentation, et dans ceux liés à la régulation et la
cessation de cette pigmentation.
De ce fait, les utilisations particulièrement préférées sont celles qui tirent partie de
la combinaison des résultats obtenus pour les trois zones chromosomiques de l'invention.
En particulier, une première utilisation de combinaison dans le domaine de la cosmétique et de la thérapie, fait de préférence usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques dont la séquence de chacun correspond, au moins en partie, à celle de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, ou bien à celle de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, ou bien à celle de la région du chromosome 11 humain comprise entre les
marqueurs DlIS898 et DIIS925.
De plus, dans une autre demande de brevet, déposée le même jour par le même demandeur, les inventeurs ont aussi mis en évidence, par une méthode similaire, d'autres zones chromosomiques, sur les chromosomes 6 et 9 humains, impliquées aussi dans le phénomène de pigmentation ou de dépigmentation. Cette base génétique leur a permis d'envisager des utilisations en thérapie et en cosmétique similaires à celles décrites précédemment, ainsi que des procédés de diagnostic similaires à ceux illustrés précédemment. De préférence, il est donc fait usage de deux fragments ou plus, la séquence d'au moins un correspondant, au moins enpartie, à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, la séquence de l'autre ou des autres correspondant, au moins en partie, ou bien à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, ou bien à celle de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, ou bien à celle de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur
D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long).
De préférence, parmi les différents fragments polynucléotidiques dont il est fait usage, au moins deux ont des séquences correspondant à deux chromosomes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique, les différents fragments dont il est fait usage aient des natures chimiques différentes, par exemple de l'ADN pour le premier fragment et de l'ARN pour le second. Il est aussi envisageable que différents fragments aient une séquence correspondant à la même zone chromosomique, mais avec
les faibles variations permises par la définition de " séquences correspondances ", c'est-àdire au plus un nucléotide différent sur 10, de préférence 1 sur 100.
Les fragments contiennent au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'une des cinq zones chromosomiques mentionnées. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à l'une des trois zones chromosomiques
de l'invention.
Toutes les utilisations préférées, la nature chimique des fragments, leur environnement, ont déjà été explicités en détails dans la partie décrivant la première
utilisation selon l'invention.
Lorsqu'il est fait usage d'au moins deux fragments polynucléotidiques, ces deux fragments sont de préférence portés par des molécules distinctes. Il est aussi envisageable que ces deux fragments fassent partie par exemple d'un même vecteur. Selon un cas préféré, les différents fragments sont de même nature chimique, par exemple de l'ADN
pour tous les fragments.
Pour les utilisations en thérapeutique, les fragments polynucléotidiques entrent
dans la fabrication d'un médicament.
Une deuxième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, et à ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les
marqueurs DI1 S898 et DI 1 S925.
Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux agents ou plus, l'un au moins modulant la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des régions précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres agents modulant chacun la fonction d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des régions chromosomiques précédemment mentionnées, ou bien à celle de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, ou bien à celle de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et la région
télomérique (télomère du bras long).
De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique, les différents agents dont
il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même fragment d'ADN.
Les fragments d'ADN dont la fonction est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'une des cinq zones chromosomiques mentionnées. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à l'une des trois zones chromosomiques de l'invention. Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails
dans la partie décrivant la deuxième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un
médicament.
Une troisième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux agents modulant chacun la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, et à ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain
comprise entre les marqueurs D 1IS898 et Dl S925.
Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux agents ou plus, l'un au moins modulant la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des régions précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres agents modulant chacun la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des régions chromosomiques précédemment mentionnées, ou bien à celle de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, ou bien à celle de la région du chromosome 9 humain comprise entre
le marqueur D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long).
De préférence, parmi les différents agents dont il est fait usage, au moins deux modulent la fonction du produit d'expression de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts. Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique de l'invention, les différents agents dont il est fait usage modulent des fonctions différentes d'un même produit d'expression d'un fragment d'ADN, ou bien modulent différents produits d'expression d'un fragment d'ADN, par exemple les ARN à différents stades de
maturation, ou bien les ARN issus de différents épissages.
Les fragments d'ADN dont la fonction du produit d'expression est modulée selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'une des cinq zones chromosomiques mentionnées. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à l'une des trois zones
chromosomiques de l'invention.
Toutes les utilisations préférées de tels agents ont déjà été explicitées en détails
dans la partie décrivant la troisième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les agents entrent dans la fabrication d'un médicament. Une quatrième utilisation de combinaison envisagée par la présente invention, dans le domaine de la thérapie et dans celui de la cosmétique, est l'utilisation d'une combinaison d'au moins deux produits d'expression de fragments d'ADN choisis parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, et à ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et ceux appartenant et/ou correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs DlIS898 et
DI1IS925.
Une utilisation préférée tire partie des résultats obtenus sur les chromosomes 6 et 9. Il est donc avantageusement fait usage de deux produits d'expression ou plus, l'un au moins est le produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des régions précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres étant chacun le produit d'expression d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments appartenant et/ou correspondant à tout ou partie des régions chromosomiques précédemment mentionnées, ou bien à celle de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, ou bien à celle de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et
la région télomérique (télomère du bras long).
De préférence, parmi les différents produits d'expression dont il est fait usage, au
moins deux sont issus de fragments d'ADN correspondant à deux chromosomes distincts.
Il est aussi envisageable que pour une même zone chromosomique de l'invention, les différents produits d'expression dont il est fait usage soient issus d'un même fragment d'ADN, il peut s'agir par exemple des ARN à différents stades de maturation, ou bien des ARN issus de différents épissages. Les mêmes possibilités sont offertes pour les
polypeptides issus de la traduction des ARN.
Les fragments d'ADN dont les produits d'expression sont utilisés selon l'invention contiennent de préférence au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides formant la séquence qui doit correspondre au moins partiellement à l'une des cinq zones chromosomiques mentionnées. L'un des fragments contient au moins 18 nucléotides successifs correspondant au moins partiellement à l'une des trois zones
chromosomiques de l'invention.
Toutes les utilisations préférées de tels produits d'expression ont déjà été
explicitées en détails dans la partie décrivant la quatrième utilisation selon l'invention.
Pour les utilisations en thérapeutique, les produits d'expression entrent dans la
fabrication d'un médicament.
Pour les quatre types d'utilisations de combinaison décrits précédemment dans le cadre de l'invention, les utilisations en cosmétique sont de préférence dans le domaine de
la pigmentation.
Parmi les nombreuses combinaisons envisagées par la présente invention, une combinaison très intéressante comprend au moins un fragment polynucléotidique correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 6 humain comprise entre les
marqueurs D6S1610 et D6S1280 pour la première utilisation de combinaison.
Pou la deuxième utilisation de combinaison, parmi les agents dont il est fait usage, de préférence un au moins de ces agents module la fonction d'un fragment d'ADN correspondant ou bien appartenant à la région du chromosome 6 humain comprise entre les
marqueurs D6S1610 et D6S1280.
Pour la troisième utilisation de combinaison, parmi les agents dont il est fait usage, de préférence un au moins de ces agents module la fonction du produit d'expression d'un fragment d'ADN correspondant ou bien appartenant à la région du chromosome 6
humain comprise entre les marqueurs D6S1610 et D6S1280.
Pour la quatrième utilisation de combinaison, parmi les produits d'expression dont il est fait usage, de préférence, un au moins de ces produits d'expression est issu d'un fragment d'ADN correspondant ou bien appartenant à la région du chromosome 6 humain
comprise entre les marqueurs D6S1610 et D6S1280.
Dans toutes les utilisations de combinaison précédemment décrites, en cosmétique ou en thérapie, il est fait usage de plusieurs fragments ou de plusieurs produits d'expression de fragment ou de plusieurs agents modulant la fonction de fragments, ou bien de plusieurs agents modulant la fonction du produit d'expression de fragments, o le fragment en question correspond à tout ou partie de l'une des cinq zones chromosomiques mentionnées. De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question correspond à la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S 1629 et D6S 1610, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1610 et D6S1019, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1019 et D6S1017, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1017 et D6S1280, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1280 et D6S1960, ou à celle
comprise entre les marqueurs D6S1960 et D6S257.
De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question dans les utilisations de combinaison correspond à la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1768, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1768 et D3S2409, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S2409 et D3S1289, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1289 et D3S1766, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1766 et D3S1300, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1300 et
D3S1285.
De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question dans les utilisations de combinaison correspond à la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S436, ou à celle comprise entre les marqueurs D5S436
et D5S410, ou à celle comprise entre les marqueurs D5S410 et D5S422.
De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question dans les utilisations de combinaison correspond à la région du chromosome 9 humain comprise entre les marqueurs D9S290 et D9S158, ou à celle comprise entre les marqueurs D9S290 et D9S164, ou à celle comprise entre les marqueurs D9S164 et D9S158, ou à celle
comprise entre le marqueur D9S158 et la région télomérique.
De préférence, l'un au moins des fragments dont il est question dans les utilisations de combinaison correspond à la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl1S898 et Dl1S908, ou à celle comprise entre les marqueurs
D11S908 etDllS925.
Afin de tirer profit de la combinaison de ces zones chromosomiques, la présente invention concerne aussi des procédés de combinaison. Ces procédés sont mis en oeuvre pour la détermination d'une éventuelle prédisposition à la canitie précoce. Un procédé de combinaison selon l'invention pour la détermination d'une prédisposition à la canitie précoce comprend une première étape de sélection d'au moins deux marqueurs dont il va être fait usage dans les étapes suivantes. Les marqueurs sélectionnés sont choisis parmi les marqueurs appartenant à la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, les marqueurs appartenant à la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, les marqueurs appartenant à la région du chromosome 1 1 humain comprise entre les marqueurs DI IS898 et D11 S925 Selon une variante du procédé, l'un au moins des marqueurs sélectionnés est choisi parmi les marqueurs appartenant à l'une des régions précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, le ou les autres marqueurs sélectionnés appartenant aux régions chromosomiques précédemment mentionnées, ou bien à celle du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S 1629 et D6S257, ou bien à celle du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et la région télomérique
(télomère du bras long).
De préférence, parmi les marqueurs sélectionnés, deux au moins n'appartiennent pas à la même région chromosomique de l'invention. Selon un cas particulier de la présente invention, les marqueurs, au nombre de deux au minimum, sont choisis parmi la liste suivante de marqueurs: D6S1629, D6S1610, D6S1019, D6S1017, D6S1280,
D6S1960, D6S257, D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300,
D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, D9S290, D9S164, D9S158, DllS898, DllS908 et DllS925, l'un au moins étant D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, D1lS898, D1lS908
ou Dl S925.
L'étape suivante de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention consiste, pour les marqueurs choisis, à déterminer les allèles présents dans un échantillon de matériel génétique issu de l'individu qui subit le test diagnostique. Deux allèles différents,
portés par les deux versions du chromosome, peuvent être identifiés.
Les modalités de mise en oeuvre de ces procédés ont déjà été explicitées dans la
partie consacrée aux procédés de diagnostic.
Pour les quatre types d'utilisation de combinaison décrits précédemment, les combinaisons de l'invention pourront être incorporées dans une composition cosmétique ou pharmaceutique telle que décrite plus haut. Les procédés de combinaison de l'invention ne sont pas limités à l'utilisation de deux marqueurs, ils ne sont pas limités non plus aux deux étapes décrites et peuvent
contenir d'autres étapes antérieures ou postérieures aux deux étapes mentionnées.
En particulier, un procédé de combinaison de l'invention peut comporter l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique des marqueurs sélectionnés à la forme allélique de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus. Cette étape de comparaison supplémentaire peut s'avérer nécessaire afin d'établir le diagnostic. Dans ce cas, il peut être utile de faire la comparaison avec la forme des marqueurs chez des individus notoirement atteints de canitie précoce et éventuellement aussi avec la forme des
marqueurs chez des individus notoirement exempts d'une telle prédisposition.
Comme pour les procédés de diagnostic déjà mentionnés dans la présente demande, une situation particulièrement intéressante consiste à comparer les allèles des marqueurs sélectionnés aux allèles de ces mêmes marqueurs chez d'autres individus de la
même famille que l'individu à diagnostiquer.
La présente invention permet enfin de mettre en évidence les gènes impliqués dans la pigmentation de la peau, des cheveux et des phanères, au sein des cinq zones chromosomiques mentionnées. Une utilisation particulière envisagée par la présente invention consiste donc à utiliser une combinaison des marqueurs microsatellites décrits précédemment au sein de chacune des régions chromosomiques d'intérêt dans le but de localiser plus finement les gènes impliqués dans la pigmentation, et plus particulièrement ceux impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou
des phanères.
Dans le cadre de ces utilisations, selon l'invention, les marqueurs microsatellites dont il est fait usage pour la détermination des gènes d'intérêt sont choisis parmi les marqueurs D6S1629, D6S1610, D6S1019, D6S1017, D6S1280, D6S1960, D6S257,
D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115,
D5S436, D5S410, D5S422, D9S290, D9S164, D9S158, DlS898, D1 S908 et D1lS925, l'un au moins. étant D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, DllS898, DllS908 ou DlIS925. La combinaison utilisée comprend au moins deux marqueurs et parmi les marqueurs utilisés,
au moins deux marqueurs correspondent à des chromosomes distincts.
Enfin, la présente invention concerne un kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les
marqueurs DI 1S898 et DI IS925.
Selon une variante du kit, celui-ci comprend deux fragments ou plus, la séquence d'au moins un correspondant, au moins en partie, à celles précédemment mentionnées sur les chromosomes 3, 5 et 11, la séquence de l'autre ou de chacun des autres correspondant, au moins en partie, ou à celles précédemment mentionnées, ou bien à celle de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, ou bien à celle de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et la région
télomérique (télomère du bras long).
Légende des figures Figure 1 Composition des familles analysées pour liaison avec la région-candidate Figure 2 Région candidate pour la CP sur le chromosome 3: Localisation chromosomique et distribution des marqueurs Figure 3 Représentation graphique des scores NPL obtenus pour l'analyse de liaison non-paramétrique multipoints génome global sur les familles CP pour les
chromosomes retenus.
Abscisse = position sur la carte génétique (0 = pter) Ordonnée = score NPL Figure 3A: Chromosomes 3 et 5 Figure 3B: Chromosomes 6 et 9 Figure 3C: Chromosomel 1 Figure 4: Représentation schématique des loci CP identifiés sur les chromosomes 11, et 3 par l'étude génome global.
La distance entre marqueurs est indiquée en cM.
Figure 4A: Chromosome 11, locus 1 1q14-q22 Figure 4B: Chromosome 5, locus 5q3 1 -q32 Figure 4C: Chromosome 3, locus 3p14.1-pl2.3 Figure 4D: Chromosome 6, locus6p2l-pl2 Figure 4E: Chromosome 9, locus 9q34
Figure 5: Lod scores simulés pour les 29 familles sélectionnées.
Dans l'ordre, les colonnes affichent le Lod score moyen, la déviation standard, le Lod score minimum, le Lod score maximum et le groupe (A-E)
dans lequel la famille se place selon son score.
Figure 6: Lod scores potentiels par famille en fonction du taux d'hétérogénéité
génétique de la CP.
Figure 7: Lod scores détaillé par famille en fonction du taux d'hétérogénéité génétique
de la CP: nouvelle simulation après collection des nouvelles familles.
Figure 8: Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche des régions chromosomiques candidates. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 9: Probabilité (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour
chaque taux d'hétérogénéité.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 10: Comparaison de la composition des familles entre l'analyse régionscandidates et l'analyse Génome-global.
Figure 11: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité de la CP.
Les résultats sont exprimés par famille.
Figure 12: Probabilité (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour
chaque taux d'hétérogénéité.
* Les résultats sont exprimés par famille.
EXEMPLES
EXEMPLE 1
Résumé des travaux effectués Afin de localiser le ou les gènes de la canitie précoce (CP), il a été réalisé un programme d'analyse de ségrégations (liaison génétique) chez des familles o ce trait se transmet à travers les générations. Au terme d'une série de présélections sur la base de la puissance statistique de l'échantillon et de la confirmation des phénotypes, douze familles sont retenues pour participer à une étude de liaison et l'ADN fut préparé à partir d'un échantillon de sang périphérique de chacun des individus informatifs (présentant et ne présentant pas le trait). L'étude a été réalisée selon deux approches principales, analyse ciblée sur une région-candidate et étude génomeglobal sur les vingt-deux chromosomes autosomiques et le chromosome X. De l'ensemble des analyses réalisées en fixant ou ne fixant pas des paramètres pour la transmission du trait de CP, 3 loci potentiels se dégagent sur les chromosomes 11, 5 et 3 en plus de ceux identifiés sur les chromosomes 6 et 9. Les trois loci (chromosomes
1 1q14-q22, 5q31-q32, 3p14.1-pl2.3) montrent des signes suggestifs de liaison à la CP.
Cette étude, et en particulier la discordance entre les scores obtenus pour les analyses paramétrique/non-paramétrique, suggère que la canitie précoce ne serait pas provoquée par un petit nombre de gènes à effet majeur, mais serait plutôt gouvernée par un
système multifactoriel incluant l'action de plusieurs gènes de prédisposition.
INTRODUCTION
Le caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie, est une hypothèse proposée depuis bien longtemps, du fait du
caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains.
Pour explorer la canitie de par son aspect génétique, il a été réalisé une étude de ségrégation de l'ADN chez des familles dont la canitie apparaît très tôt dans la vie. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette chasse aux gènes, la composition de l'échantillon pour l'étude s'est déroulée selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype CP fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à ans. Les familles furent retenues pour l'étude sur la base de leurs performances
statistiques dans l'analyse de ségrégation.
La partie de l'étude réalisée est décrite selon quatre époques principales: A- Epoque 1: Détermination du potentiel de l'étude. Un première sélection des familles les
plus informatives est réalisée par une simulation d'analyse de liaison.
B- Epoque 2: Confirmation médicale des phénotypes et collection des échantillons sanguins chez les familles présélectionnées. Cette campagne de vérification aboutit à une nouvelle liste de familles candidates pour l'étude. Une nouvelle
simulation de liaison permet d'estimer le potentiel de l'échantillon corrigé.
C- Epoque 3: Analyse de liaison génétique avec la région chromosomique candidate pour la CP. Première phase d'analyse des ADNs pour la région chromosomique
qui pourrait contenir les gènes de la CP.
D- Epoque 4: Analyse de liaison génétique globale de la CP sur tout le génome humain.
Analyse de ségrégations familiales sur l'ADN des 22 chromosomes autosomiques et le chromosome X afin de détecter les régions qui se lient au
trait CP.
Les résultats obtenus à chaque époque sont présentés sous forme de tableaux et de figures de manière synthétique dans les tableaux récapitulatifs ou de manière profonde
dans les tableaux détaillés.
RESULTA TS
A- Epoque 1: Choix des familles avec l'aide de la simulation d'analyse de liaison Au terme d'une tentative de sélection des familles avec une canitie précoce selon des critères d'informativité pour une localisation génique, 29 familles ont été soumises à une simulation d'analyse de liaison génétique. Sur la base de la disponibilité de tous les individus, il s'avérait que ce projet possédait un potentiel de succès très encourageant car dix-neuf pedigrees (soit 255 individus) furent alors retenus. Cette conclusion n'étant valable que si les phénotypes sont confirmés et si la majorité des sujets acceptent de participer à l'étude. Parmi cette sélection se trouvent sept familles très informatives qui individuellement pourraient atteindre ou dépasser un Lod score Z=4.00 (soit plus que la limite inférieure de significativité du Lod score quiest de Z=3.00). Afin de rassembler un maximum de chance de succès, il était très important que le diagnostic de CP soit attribué
avec rigueur.
Le résultat de cette étude permet, selon la robustesse de l'évaluation clinique, de
qualifier les familles qui sont ensuite collectées pour l'étude génétique.
1. Critères pour l'attribution du phénotype CP Vingt-neuf familles parmi les 65, ont été retenues, sur des critères de structure (nombre d'individus total, atteints, disponibles), pour être analysées en simulation. Lors du processus de simulation: a) un logiciel génère une série de réplicats du fichier code en assignant des génotypes simulés. Le fichier obtenu pour chaque famille explore plusieurs combinaisons
alléliques (génotypes) chez chacun des individus.
b) un logiciel vient ensuite analyser chacun des réplicats pour estimer les Lod scores (Z) possibles de analyse de liaison génétique chez chaque famille. Les résultats, sous forme de Lod scores minimum, moyen et maximum permettent ainsi d'évaluer
le potentiel de chaque famille dans ce type d'étude.
Evidemment, ces estimations ne restent valables que dans le cas o chaque individu s'est vu attribuer un phénotype correct. En cas d'incertitude, le phénotype doit être indiqué comme inconnu; il n'est alôrs pas pris en compte dans l'étude et donc ne nécessite pas d'être prélevé. Le Lod score diminue (dans des proportions variables) chaque
fois qu'un individu est enlevé pour phénotype incertain.
Les arbres généalogiques ont été redessinés à l'aide d'un logiciel de gestion de pedigrees, qui construit également les fichiers codés (fichiers preplink) pour l'analyse de liaison génétique. En plus des codes indiquant pour chaque individu, les liens de parenté, le sexe, le phénotype ainsi que le génotype qui sera incrémenté par le logiciel de simulation SLINK, un code de disponibilité (cd) (tableau 1) est attribué. Il pondère ainsi, par un code
de 0 à 3, le caractère informatif de chaque individu dans l'étude.
Le phénotype de chaque individu fut assigné d'après les informations figurant
dans les pedigrees et les tableaux de description du rapport Genormax. Toutefois, pour
certains individus, le phénotype a été modifié d'après les critères indiqués dans le tableau 2. Les individus, non-présents sur les pedigrees initiaux (identifiés par un numéro seulement) ont été portés phénotypiquement inconnu, et sont été considérés indisponibles
(cd=3).
a. Codes de disponibilité Lors de la simulation, n'ont été pris en compte que les individus pour lesquels
(tableau 1):
- il sera possible, d'après l'étude Genormax, de prélever du sang en vue de préparer l'ADN pour les étude de génétique (âge, domicile en France métropolitaine/outremer/étranger, consentement à priori);
- le phénotype de canitie précoce aura été clairement défini (tableau 2).
Tableau 1: Définition des codes de disponibilité code de disponibilité (cd) ADN phénotype O indisponible connu 1 disponible inconnu 2 disponible connu 3 indisponible inconnu Tableau 2: Définition des phénotypes < 25ans 25 ans >25ans pas de cheveux blancs 0 0 1 quelques cheveux blancs (qb) (de 50%) 2 O 0 b. Assignation du phénotype selon l 'âge Afin d'écarter les risques d'erreurs, les critères suivants ont été définis pour
l'assignation du phénotype en fonction de l'âge chez les individus de moins de 30 ans.
Toutefois, lors de l'examen clinique final, il est souhaitable que la définition du phénotype
soit plus quantitative.
c. Autres paramètres Après examen de la variation du Lod score maximum chez la famille Can65 (test , 200, 300, 500 réplications), le nombre de réplications (générations des combinaisons
alléliques) a finalement été fixé à 200.
La fréquence du trait a été fixée à 1%. Le nombre d'allèles possibles pour le
génotype est fixé à 6 avec une fréquence équivalente pour chacun.
2. Résultats a- Classification des familles selon leurs scores Le tableau 3 donne une indication du potentiel des familles GENORMAX en fonction du Lod score maximum (Zmax) atteint (groupe A-E). La figure 5 rapporte le Lod score
simulé pour chaque famille.
Tableau 3: Statistiques familles/Lod scores maximum. Les résultats détaillés figurent dans
le tableau de la figure 5.
Lod Score Maximum (LMx) nombre de familles groupe Zmax > ou = 4 7 A 3<Zmax<4 6 B 2<Zmax<3 6 C 1<Zmax<2 7 D Zmax<l 3 E Le Lod score maximum ne peut être atteint que lorsqu'un marqueur de l'ADN est informatif à 100% dans une famille. Le plus souvent, même avec le type de marqueurs utilisés (les marqueurs les plus informatifs dans les régions chromosomiques à visiter), le
Lod score n'atteindra pas sa valeur maximum.
En analyse de liaison génétique, pour être significatif, le Lod score doit atteindre
ou excéder la valeur de 3 (résultat à 1000/1).
b- Effet d'un diagnostic incorrect sur les résultats d'analyse de liaison L'effet de l'attribution d'un diagnostic incorrect a été testé sur les résultats d'analyse (en cas de liaison à un locus) par une simulation sur la famille Can46 en variant
le phénotype de 1,2 ou 3 individus (tableau 4).
Tableau 4: Lod score obtenus pour une série de distances du marqueur au locus du trait
(Lod score maximum en gras).
1- selon le diagnostic actuel(lod score maximum) distance 0.0 0.01 0.05 0. 1 0.2 0.3 0.4 Lod score 2.28 2.24 2.08 1.88 1.44 0.95 0.43 a 2- 3 individus incorrectement diagnostiqués (A2, R10, R19) distance 0.0 0.01 0. 05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score -3.89 -1.75 -0.90 -0.50 -0.14 -0.01 0.01 a 32 individus incorrectement diagnostiqués(A2, R19) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score -2.85 -0.75 -0.05 0.22 0.36 0.30 0.17 a 4- 1 individu incorrectement diagnostiqué(R19) distance 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Lod score 1.24 1.24 1.23 1.16 0.94 0.63 0.27 a 3. Discussion, conclusion et décisions Cette étude de simulation permèt de placer les 29 familles présélectionnées en groupes selon le Lod score maximum potentiel. Bien qu'une liaison soit significative dès que la valeur de Lod score de Z=3.00 est atteinte, les inventeurs ont préféré distinguer 2 groupes lorsque ce critère est vérifié car le Lod score simulé maximum est très rarement atteint. Ainsi la probabilité que le Lod score réel pour des familles se plaçant dans le
groupe B (3<Zmax<4) est assez faible.
Les familles du groupe A seront informatives dans une analyse de liaison génétique pour la localisation du/des gènes de la canitie précoce. Pour cela, aucune incertitude ne doit subsister quant au phénotype. Dans le doute, il est conseillé d'exclure
des individus, voire des familles de l'étude.
Toutefois, chez certaines de ces familles, la proportion élevée d'individus atteints/non-atteints (parfois tous les enfants atteints) doit inciter à une extrême méfiance sur le caractère génétique à 100% du trait. Bien entendu, il n'est pas exclu que dans certaines familles, le gène CP ait été transmis simultanément par les branches paternelle et maternelle de la première génération. Dans ce cas, les petits enfants seraient tous atteints (Can28, 43, 53...). Afin de pouvoir considérer positivement ces quelques familles, il est
hautement souhaitable de vérifier cette hypothèse.
Les familles du groupe B sont elles-mêmes très intéressantes car elles permettent d'étoffer l'échantillon, même si individuellement elles ne pourront accéder à un Lod score significatif dans la plupart des cas. En groupe, elles peuvent cependant permettre de consolider le Lod score, spécialement s'il s'avère que le trait était génétiquement hétérogène (légèrement). Les familles du groupe C, peuvent être également utilisées dans des études de
réplications des résultats de liaison génétique.
Les familles des groupes D et E (Zmax<2) sont peu informatives pour une analyse
de liaison génétique.
Il semble, sous réserve d'une caractérisation clinique robuste, que les familles des groupes A,B et C sont appropriées pour une étude d'analyse de liaison génétique et qu'elles doivent être collectées (individus avec cd=2). En effet, les analyses de liaison génétique réalisées sur des échantillons insuffisamment caractérisés sont vouées à l'échec ou à un "pâle" résultat (locus imprécis). Etant donné, que dans de telles analyses, certains paramètres ne peuvent être sous total contrôle (en particulier l'informativité des génotypes), et que l'hétérogénéité génétique toujours possible rend la tâche plus délicate (car elle réduit la puissance de l'analyse sur l'ensemble des familles), il semble donc indispensable de rassembler dès le départ tous les atouts qui peuvent être gérés. Dans cette première étape, les inventeurs ont donc fortement recommandé que le phénotype de chaque individu avec un code de disponibilité approprié (cd=2) soit soigneusement vérifié avant
collection (phénotype confirmé, ou exclusion de l'échantillon/de la famille).
B- Epoque 2: Collection des échantillons, confirmation des phénotypes et nouvelles estimations du potentiel de l'étude Sur la base des résultats de l'époque 1, les 19 familles (groupes A, B, et C) retenues pour former une banque dans laquelle seront prélevés les pedigrees pour les analyses de liaison génétique, furent contactées pour confirmation du diagnostic CP et
collection d'une série d'individus atteints et non atteints.
Cette campagne de vérification médicale des phénotypes a permis de confirmer un grand nombre des diagnostiques CP, mais pas tous comme prévu. Le refus de quelques individus clés (atteints de CP) de participer au projet, le décès de certains ainsi que réajustement d'une partie des phénotypes a conduit à ne pas retenir un certain nombre de
familles et réduit le potentiel d'informativité de plusieurs autres familles.
1- Ré-estimation du potentiel de l'étude après confirmation des phénotypes Afin de ré-estimer le potentiel de l'étude après la vérification des phénotypes, les inventeurs ont simulé une analyse de liaison sur les 8 familles qui pouvaient encore être informatives. Le tableau 5 présente les résultats obtenus pour l'ensemble des 8 familles dans 3 situations d'hétérogénéité génétique (0%, soit toutes les familles liées au même locus, 50% ou seulement la moitié des familles liées au locus, 70% ou seulement environ
un tiers des familles liées).
Tableau 5: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP
Les résultats détaillés par familles figurent dans le tableau de la figure 6.
Taux d' Hétérogénéité Moyen StdDev Minimun Maximum Max époquel
0% 5.094620 1.679698 1.221207 8.835722 38.823
% 1.619190 1.553049 0.000000 7.409957
% 0.835383 1.022004 0.000000 5.517145 -
2- Conclusion Dans un effort continuel pour l'optimisation de l'échantillon pour les analyses de liaison, 4 familles supplémentaires ont été identifiées (tableau 6; 2 familles -can65B et can46B- sont des branches collatérales des familles can65 et can46) et les phénotypes de
nouveau vérifiés.
Tableau 6: Liste finale des familles 1 c103974
2 F104512
3 CAN33
4 CAN35
5 CAN43
6 CAN46
7 CAN46B
8 Can53
9 CAN55
10 CAN62
11 CAN65
12 CAN65B
Après une nouvelle simulation (tableau 7), il s'avère que le Lod score maximum général de liaison est à peine supérieur (Z=8.91) si les 12 familles retenues (phénotypes strictement définis) sont liées au même locus. L'augmentation attendue du Lod score par l'apport de nouvelles familles est cependant réduite par la correction et le durcissement des phénotypes.
Tableau 7: Nouvelle simulation après collection des nouvelles familles.
Les Lod scores potentiels sont exprimés en fonction du taux d'hétérogénéité génétique.
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 7.
Taux d' Hétérogénéité Moyen StdDev Minimun Maximum
0% 4.752321 1.748924 0.356854 8.914062
% 1.535356 1.418022 0.000000 6.078132
% 0.719737 0.978920 0.000000 5.282466
La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z=1. 0, Z=2.0, Z=3.0 respectivement et qui donne une approximation de la chance de trouver une liaison
significative (tableau 8).
Tableau 8: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser un Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité Taux d' hétérogénéité 0% 50% 70% Lod score 1.000 99.500 57.000 27.000
2.000 95.500 31.000 8.500
3.000 84.500 14.000 3.500
C- Epoque 3: Analyse de liaison génétique de la CP avec la région candidate 1- Hypothèse La région 3pi4.1-pi2.3 est dite " région-candidate " (RC) car elle est associée à la canitie précoce par le biais de la maladie de Klein Waardenburg (type IIA) à laquelle le trait est associé. 2- Composition finale des familles Dans un souci d'optimisation technique, un échantillon de 92 individus atteints et non-atteints parmi les 12 familles est retenu (voir figure 1). Cette sélection est formée en fonction de l'informativité potentielle de chaque individu et confirmée par une nouvelle simulation de liaison. L'ajout de quelques individus conduit à une légère augmentation du Lod score potentiel (de 8.91 à 9.04, selon homogénéité complète, tableau 9) et donc de la
puissance de l'échantillon (tableau 10).
Tableau 9: Nouvelle simulation sur les familles finalisées pour la recherche sur la région chromosomique candidate. Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité
génétique. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 8.
Taux d' hétérogénéité 0% % % % Moyen
4.367608
1.354325
0.666549
0.222622
StdDev
1.649267
1.359845
0.891330
0.378039
Minimun
0.564761
0.000000
0.000000
0.000000
Maximum
9.042465
6.610168
4.988076
2.528617
Tableau 10: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1, 2 ou 3 pour
chaque taux d'hétérogénéité. Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 9.
Taux d' hétérogénéité Lod score 1.000 2.000
3. 000
0% 50%
% %
98.000
94. 500
79.000
48.500
23.500
12. 000
21.500
9.500 3.000 4.000 0.500 0.000 3- Marqueurs microsatellites utilisés La distribution des marqueurs sur la région candidate du chromosome 3 est
présentée dans la figure 2.
4- Analyses de liaison Plusieurs types d'analyses de liaison ont été réalisés afin d'augmenter la
probabilité d'observer une liaison existante entre cette région chromosomique et la CP.
Pour cette analyse, les deux approches suivantes ont été réalisées: - 2points (analyse itérative entre le trait et les marqueurs.pris un-à-un); multipoints (analyse pour chaque chromosome selon une carte de
marqueurs placés en fonction de leurs distances respectives).
1. Analyses avec paramètres définis, paramétriques (PL): Mode de transmission (dominant), fréquence du trait (1%), équifréquence des allèles de marqueurs testés et
pénétrance (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants). Méthode 2points et multipoints.
2. Analyse indépendante du mode de transmission du trait, nonparamétrique (NPL): Analyse de déviation de la proportion d'allèles partagés pour chaque paire d'individus atteints (dans chaque famille par identité par descendance) par rapport à une transmission au hasard. Dans l'analyse multipoints, toutes les paires d'atteints (all-pairs,
score Z-all=loglo de p-values, et p-values) ont été considérées. Dans la méthode 220 points, ce sont les paires de germains qui ont été étudiées (affected sib-pair, p-values).
- Résultats
Les résultats sont exposés dans le tableau 11.
Tableau 11: Résultat de l'analyse de liaison sur la région-candidate Quand seule une position est indiquée, et non pas un nom de marqueur, cela signifie que la
position est intermédiaire entre 2 marqueurs.
Global 2-points multipoint Chromo, Marqueur/ Marqueur/ Marqueur/ some Region Lod p M position cM p NPL position cM 3p14.1-p12.3 1.03 @ 0.2 D3S1285/90 1,55 82 2,58 D3S2409/70 Chromo- Réin1o nM P1pstQle f some I. t airu-ué gio tu t d.r 3 3p14.1-p12.3 53 1,54 . D3S1285ô i 8 D3S1285 6Discussion et conclusion Cette étude distingue un locus fortement suggéré de prédisposition à la canitie précoce sur le chromosome 3pl4-pl2 (vers les marqueurs D3S2409 et D3S1766;
multipoints NPL= 2.58 à la position 12 et HLod:=1.55 à la position 24).
Ce résultat documente positivement les présomptions d'association qui portent sur
la région chromosomique 3p14-P12 vis-à-vis de la canitie précoce.
Il est à noter qu'une famille (CAN53) montre une liaison relativement élevée pour
cette région chromosomique.
D- Epoque 4: Analyse de liaison génétique globale de la CP avec le génome.
L'analyse globale du génome permet de faire une visite de tous les chromosomes (un sondage global) afin de trouver des régions impliquées et éventuellement un locus majeur qui gouvernerait la canitie précoce. Cette grande analyse permet également
d'estimer le taux d'hétérogénéité génétique de la CP.
1- Contenu des familles Ce sont les mêmes familles que celles qui ont été étudiées dans la phase régionscandidates (époque 3), mais avec cependant un ajustement de certaines dans leur contenu (voir tableau 12). Certains membres peu informatifs ont été remplacés par d'autres, plus
récemment recrutés, ou dont le diagnostic a été précisé plus tardivement.
Afin de confirmer le bénéfice de l'évolution de l'échantillon, une nouvelle simulation d'analyse de liaison a été réalisée pour différentes situations d'hétérogénéité génétique (tableau 13 et tableaux des figures liA, liB, liC et llD). Les Lods scores exprimés montrent une évolution favorable. Ainsi, considérant le Lod score moyen possible, il serait possible d'obtenir un résultat significatif (ZÄ3.0) pour une hétérogénéité atteignant 20% (soit 1/5 des familles non liées au locus). En fait, ce résultat est très conservateur et il serait possible d'atteindre la significativité avec un échantillon nettement plus hétérogène (soit 50-70% avec l'utilisation de marqueurs microsatellites montrant une
hétérozygosité moyenne de 0.7).
Tableau 12: Comparaison du nombre d'individus étudiés dans chaque familles entre l'analyse régions-candidates et l'analyse génome-global. (détail composition des familles, tableau de la figure 10) familles Région Candidate Génome Global
A35 11 11
A46 12 12
A65 5 9
A53 8 9
B43 7 7
B55 7 7
C33 6 6
C62 6 6
A46B 6 7
A65B 6 6
103974 12 10
104512 6 6
| Total individus 92 96 Tableau 13: Lod scores potentiels en fonction du taux d'hétérogénéité génétique de la CP
Les résultats détaillés figurent dans les tableaux de la figure 11.
Taux d' hétérogénéité 0% % % % % Moyen
4.751841
3.115806
1.378378
0.672997
0.242418
StdDev
1.749689
1. 866821
1.467071
0.904472
0.402384
Minimun
0.334792
0. 024841
0.000000
0.000000
0.000000
Maximum
9.338889
8.780452
7.508479
5.226281
2.722478
La puissance de l'échantillon peut être également observée sous l'angle du nombre de réplications (de génotypes) qui atteignent ou dépassent les Lod scores Z=l.0, Z=2.0, Z=3.0 respectifs. La probabilité de trouver une liaison significative (tableau 14 et figure 12) avec 4/5 des familles liées au même locus est de 50%. Ce résultat est basé sur
un lod score moyen qui est conservateur.
Tableau 14: Probabilités (en %) d'atteindre ou de dépasser Lod score de 1, 2 ou 3 pour chaque taux d'hétérogénéité
Les résultats détaillés figurent dans le tableau de la figure 12.
Taux d' hétérogénéité 1.000 2.000 3.000 0%
99.000
93.500
84.000
%
87.500
69.500
48.500
%
47.000
25.500
15.000
%
23.000
il.500 3.500 % 5.500 0.500 0.000 Les analyses peuvent donc indiquer des liaisons significatives si l'hétérogénéité de l'échantillon ne dépasse pas 20 % (soit seulement 1/5 des familles ne se liant pas à un locus majeur unique), mais il est encore possible d'identifier une liaison dans le cas o la
moitié des familles ne sont pas liées à ce locus.
2- Marqueurs de l'ADN L'ADN de 96 individus appartenant aux 12 familles sélectionnées a été génotypé pour 400 marqueurs polymorphes distribués sur les 22 autosomes et le chromosome X (tableau 15) selon un intervalle inter-marqueurs moyen de 9.2 cM (densité). Ce sont des microsatellites de l'ADN, qui sont composés de répétitions en tandem de type
dinucléotidique (CA), de la collection du Généthon (Evry, France).
Tableau 15: Nombre de marqueurs analysés pour chaque chromosome durant le genome wide scan Chromosome Nb de marqueurs
1 31
*2 30
3 23
4 22
22
6 20
7 22
8. 14
9 20
20
11 18
12 19
13 14
14 14
14
16 13
17 15
18 14
19 12
13
21 5
22 7
X 18
1 total 400 Le taux d'hétérozygosité moyen observé
inter-marqueurs se situe à 9.2 cM.
est de 0.70, et la taille moyenne de l'intervalle 3- Analyses de liaison Pour cette approche globale, les inventeurs ont réalisé plusieurs types d'analyses afin d'optimiser leurs performances pour trouver une liaison entre une région du génome et la CP. L'analyse paramétrique, plus performante sur le plan de la puissance, tient compte
du mode de transmission du trait et est la plus adaptée dans le cas des traits monogéniques.
L'analyse non-paramétrique qui permet d'identifier une liaison même si le mode de
transmission supposé est erroné, est aussi plus robuste dans le cas des traits multigéniques.
Pour chacune de ces analyses, les inventeurs ont utilisé les méthodes déjà évoquées, la méthode 2-points (analyse itérative entre le trait et chaque marqueur) et la méthode multipoints (analyse globale sur chaque chromosome selon une carte de marqueurs). a- Analyses avec paramètres définis, paramétriques (PL) Mode de transmission (dominant), * Fréquence du trait (1 %), * Equi-fréquences alléliques de tous les marqueurs, * Pénétrances définies (90 % hétérozygotes mutants- 100% homozygotes mutants),
* Méthodes 2-points et multipoints.
* Les Scores de probabilité de liaison sont exprimés en: - Lod score Z (échantillon homogène); - Lod score ZH (échantillon hétérogène) et taux d'hétérogénéité ac (proportion de
familles qui ne sont pas liées à ce locus).
b- Analyse indépendante du mode de transmission du trait, nonparamétrique
(NPL),
Il s'agit d'une analyse de la déviation de la proportion d'allèles partagés par paires d'individus atteints par rapport à une transmission des allèles au hasard (identité par descendance). Les inventeurs ont considéré toutes les paires d'individus atteints pour
l'analyse multipoints, et les paires de germains pour l'analyse 2-points.
Les scores de probabilité de liaison sont exprimés en - NPL ou Z-all (LoglO de valeur p) pour la méthode multipoints sur toutes les paires d'individus atteints;
- valeur "p" pour la méthode 2-points sur les paires de germains atteints.
4- Résultats
La figure 3 rapporte les scores NPL obtenus pour l'analyse de liaison nonparamétrique sur les chromosomes 3, 5, 11, 6 et 9.
a- résultats détaillés Les tableaux 16 (meilleurs résultats analyses 2points) et 17 (meilleurs résultats analyses multipoints) rapportent les meilleurs résultats obtenus pour les chromosomes retenus. Tableau 16: Meilleurs résultats analyses 2-points pour les chromosome retenus PL NPL rome Locus* 1 Marqueur | (distance-pter) Z(t) Theta Z(a,t) Theta Alpha Sibpail Hom ogénéité Heterogénéité
3 4 D3S1285 91,2 0,688 0,2 0,819 0,12 0,59
D3S1601 214,4 0,006153
6 D5S422 164,2 2,007 0,14 2,007 0,14 1
23 D5S647 74,07 0,021524
11 19 D11S908 108,6 0,777 0,2 0,846 0,06 0,6
4 21,5 0,203028
Tableau 17: Meilleurs résultats de l'analyse multi-points pour les chromosomes retenus PL NPL Chromo Localisation cM Z (a, ZH).al PValinformatio some (distance-pter) e eterogénee
3 72 -9,34 (0.1411, 0.4780 2,62 0,0070 0,78
146 -7,84 (0.0959, 0.0787 1,70 0,0503 0,75
168 -3,97 (0.4022, 1.1118 0,71 0,2334 0,62
il 106 -6,31 (0.3441, 1.5288 2,61 0,0072 0,72 b- résultats retenus Le tableau 18 rapporte les meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) discutés ci-dessous: Tableau 18: Meilleurs résultats retenus pour chaque type d'analyse (PL, NPL) Chromosome Positionipter Score 2-point MPJ or) | Mulfipoint (MP) Non-paramétrique npl >3.0 Z-alf
6 57 MP
9 151 37MP
npl >2.5 Z-al|
3 72 MP
11 106 MP
npl >2.0 Z-ail
3 72 2,12 A MP
101 $ MP
2-point (2P) or Chromosome Positionipter Score 2-point (MP) Multipofint (MP) Paramétrique Lod >2.0 Lod
164,2. 2,00P 2P
Lod >1.5 Lod il1 106 V1'"11 lr -, Mp I Lod >1.0 Lod
168 M1,118P
s t 6 61 i.42 MP
6 89,7,48 2P
i En terme de PL: a- Un Lod score (2P) ZH=2.007 a été relevé sur le bras long du chromosome 5 (position 164.2 cM à partir du télomère supérieur) soit en position 3/4 sur la
bande 5q31-q32.
b- Lod scores intermédiaires (1.5<ZH<2.0) - chromosome 1 lql4-q22, position 106 (MP-ZH=1.53) c- Lod score intéressants (1.0<ZH<1.5) chromosome 5q31-q32, position 168 (MP-ZH=1.11) - chromosome 6p2l-pl2, position 61 (MP-ZH=1.43) - chromosome 6ql3-ql4, position 90 (2P-ZH=1.46) ii En terme de NPL: Il a été distingué ici les scores logwo pour l'étude de déviation du partage allélique, identité par descendance (IBD), pour toutes les paires d'atteints (scores étude multipoints Z-all) ainsi que les valeurs p pour les paires de germains atteints (affected sib-pairs, scores
étude 2-points, p-values).
Les meilleurs scores sont abordés selon leur rang par rapport à la limite de significativité: - Z-all>3, 2.5<Z-all<3, 2.0<Z-all<2.5 - p<10-5 et 105<p<I04 a- Scores Z-all>3. 0 Sur le chromosome 6p2l-pl2, le score atteint en utilisant les marqueurs génome25 global maximise à un Z-all=3.52 à la position 71 (entre les marqueurs D6S1610 et D6S257). Toutefois, la précision du locus est probablement affectée par la grande distance entre ces 2 marqueurs de la batterie génome-global qui est plus nettement plus importante
que l'intervalle moyen observé (26.11 cM).
Le second meilleur score est atteint sur le chromosome 9q31-q32, position 151 (Z-all=3.37) b- Scores 2.5<Z-all<3.0 - chromosome 3pl4-pl3, position 72 (Z-all=2.62) - chromosome 1 1q21 -q22, position 106 (Z-all=2.61) cScores 2. O<Z-all<2.5 - chromosome 9q31-q32, position 131 (Z-all=2.13) chromosome 3q21, position 101 (Z-all=2.15) ainsi que les p-values <10-5 et 104 d. p<Ix10-4 - chromosome 6q31.3-q33, position 154 (p=0.000012) iii Les loci qui sont identifiés simultanément par PL et NPL:
PL NPL
6p21-pl2, position 57-61 1.42 3.59 11q14-q22, position 106 1.52 2.6 Discussion et conclusion Les 2 scores significatifs ou à la bordure de la significativité selon que l'on considère le trait comme étant monogéni4ue ou multifactoriel (Lander et Kruglyak 1995) ont été observés pour leschromosomes 6p21-p12 (NPL MP Z-all=3.59) et 9q3 1-q32 (NPL
MP Z-all=3.37).
Parmi ces 2 loci, le plus robuste est celui du 6p21-pl2 qui est renforcé par un MPPL Lod score, qui bien que moyen, maximise à ZH=1.42.
Un autre locus apparaît également assez intéressant, il est situé sur le chromosome 1 q14-q22 car les scores PL et NPL maximisent à la même position 106 (Z-all 2.61, PL 1.52). Le score NPL est d'ailleurs dans la fourchette de suggestivité dans un cas de monogénisme ou dans un cas de multigénisme (suggestivité: monogénisme 2<Z-all<3;
multigénisme 2.2<Z-all<3.6).
Enfin le locus 5q31-q32 avec le meilleur PL lod score (2P) (ZH=2.00) se situe
également dans des valeurs de suggestivité (en monogénisme).
Il faut ajouter une série de valeur p pour les analyses de germains atteints qui sont également dans la fourchette de suggestivité (chromosomes 6q31.3-q33). Ce sont des loci à
considérer aussi.
D- Discussion et conclusion générales Au terme des différentes époques d'analyses, plusieurs régions chromosomiques
sont identifiées ou suggérées.
Validité des loci llql4-q22, Sq3l-q32, 3pJ4.1-pl2.3 a Chromosome lql4-q22 Les inventeurs identifient une région entre les positions 100 et 115 (entre
DllS898 etDIlS925) (figure 4A).
b Chromosome 5q31-q32 Cette région recueille le meilleur résultat PL et bipoint de ces analyses qui se situe à une distance de recombinaison (theta) 0.14 (environ 14 cM) du marqueur D5S422. En se plaçant à cette distance de D5S422 vers le haut de la carte (position 149), on arrive dans le voisinage du locus qui rassemble le meilleur score NPL multipoints du chromosome 5 (Zall=1.70, vers marqueur D5S436). Un certain consensus apparaît pour ce locus également
(figure 4B).
c Chromosome 3pl4.1-pl2.3 Il s'agit d'une région de presque 30 cM entre les positions 60 et 87 (entre
D3S1277 et D3S1285 (figure 4C).
EXEMPLE 2
Exemple de Compositions - lotion capillaire fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285 0,5 g Propylène glycol 20 g Ethanol 950 30g Eau qsp 100 g Cette lotion est appliquée quotidiennement sur les zones à traiter et de préférence
sur l'ensemble du cuir chevelu pendant au moins 10 jours et préférentiellement 1 à 2 mois.
On constate alors une diminution de l'apparition des cheveux blancs ou gris et une
repigmentation des cheveux gris.
- shampooing traitant fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422 1,5 g Polyglycéryl 3hydroxylarylether 26 g Hydroxy propyl cellulose vendue sous la dénomination de Klucell G par la société Hercules 2 g Conservateurs qps Ethanol 950 50g Eau qsp 100 g Ce shampooing est utilisé à chaque lavage avec un temps de pose d'environ d'une minute. Un usage prolongé, de l'ordre de deux mois, conduit à la repigmentation
progressive des cheveux gris.
Ce shampooing peut également être utilisé à titre préventif afin de retardé le
blanchissement des cheveux.
- Gel traitant fragment d'ADN issu de la zone chromosomique comprise entre les marqueurs D 11 S898 et D 11 S925 0,75 g Huiles essentielles d'Eucalyptus 1 g Econozole 0,2 g Lauryl polyglyceryl 6 cetearyl glycoether 1,9 g Conservateurs qs Carbopol 934P vendu par la société BF Goodrich Corporation 0,3 g Agent de neutralisation qs pH 7 Eau qsp 100 g Ce gel est appliqué sur les zones à traiter deux fois par jour (matin et soir) avec un massage tenninal. Après trois mois d'application, on observe une repigmentation des poils
ou cheveux de la zone traitée.
Références bibliographiques * E. Lander and L. Kruglyak. Genetic dissection of complex traits: guidelines for
interpreting and reporting linkage results [see comments]. Nat.Genet. Il (3):241247, 1995.

Claims (74)

Revendications
1. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, à des fins cosmétiques dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides. 2. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit
fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S1768 et D3S1285.
1 5 4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S1277 et D3S1768.
5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S1768 et D3S2409.
6. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S2409 et D3S1289.
7. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S1289 et D3S1766.
8. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S1766 et D3S1300.
Demande n0 02 09697 L'Oréal 9. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs
D3S1300 et D3S1285.
10. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'au moins une portion dudit fragment correspond à tout ou partie d'un gène. Il. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit fragment a une
longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.
12. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite pigmentation est
celle des phanères.
13. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que lesdits phanères sont les poils et
système pileux.
14. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que lesdits phanères sont les cheveux. 15. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle concerne la prévention
ou le traitement de la canitie.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie précoce. 17. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en
ce que ledit fragment est isolé, purifié ou recombinant.
18. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en
ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.
19. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes i) sélection d'un marqueur appartenant à la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de
matériel génétique dudit individu.
20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur
micro satellite.
Demande nO 02 09697 L'Oréal 21. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que ledit marqueur est choisi parmi les marqueurs suivants: D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300 et
D3S1285.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que le
polymorphisme dudit marqueur indique la présence ou l'absence d'une prédisposition à la
canitie précoce.
23. Procédé selon la revendication 19 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour
établir le diagnostic.
I0 24. Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que les autres individus sont des
membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
25. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les marqueurs D3 S1277, D3 S 1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300 et D3S1285 pour la détermination des gènes
impliqués dans la pigmentation de la peau ou des phanères.
1 5 26. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les marqueurs D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300 et D3S1285 pour la détermination des gènes impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères. 27. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, à des fins cosmétiques dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides. 28. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit
fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
29. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les
marqueurs D5S2115 et D5S436.
Demande n0 02 09697 L'Oréal 30. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les
marqueurs D5S436 et D5S410.
31. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les
marqueurs D5S410 et D5S422.
32. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce qu'au moins une portion
dudit fragment correspond à tout ou partie d'un gène.
33. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce que ledit fragment a une
longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.
34. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce que ladite pigmentation est
celle des phanères.
35. Utilisation selon la revendication 34 caractérisée en ce que lesdits phanères sont les poils et
système pileux.
36. Utilisation selon la revendication 34 caractérisée en ce que lesdits phanères sont les cheveux. 37. Utilisation selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce qu'elle concerne la
prévention ou le traitement de la canitie.
38. Utilisation selon la revendication 37, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie
précoce.
39. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 27 ou 28, caractérisée
en ce que ledit fragment est isolé, purifié ou recombinant.
40. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 27 ou 28, caractérisée
en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.
41. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes: i) sélection d'un marqueur appartenant à la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de
matériel génétique dudit individu.
Demande nO 02 09697 L'Oréal 42. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur microsatellite. 43. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que ledit marqueur est choisi parmi les
marqueurs suivants: D5S2115, D5S436, D5S410 et D5S422.
44. Procédé selon l'une quelconque des revendications 41 à 43, caractérisé en ce que le
polymorphisme dudit marqueur indique la présence ou l'absence d'une prédisposition à la
canitie précoce.
45. Procédé selon la revendication 41 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour
établir le diagnostic.
46. Procédé selon la revendication 45 caractérisé en ce que les autres individus sont des
membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
47. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les marqueurs D5S2115, D5S436, D5S410 et D5S422 pour la détermination des gènes impliqués dans la pigmentation de la
peau ou des phanères.
48. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les marqueurs D5S2115, D5S436, D5S410 et D5S422 pour la détermination des gènes impliqués dans l'interruption
progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
49. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs D 1IS898 et Dl lS925, à des fins cosmétiques dans le domaine de la pigmentation, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides. 50. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome Il humain comprise entre les marqueurs DlIS898 et DlIS925, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, ledit
fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
51. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les
marqueursDlS898 etDllS925.
Demande no 02 09697 L'Oréal 52. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 1I humain comprise entre les
marqueurs D 1 1 S898 et D 1 1 S908.
53. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce que ledit fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 1 1 humain comprise entre les
marqueurs Dl 1S908 et Dl 1S925.
54. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce qu'au moins une portion
dudit fragment correspond à tout ou partie d'un gène.
55. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce que ledit fragment a une
longueur comprise entre 50 et 3000 nucléotides.
56. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce que ladite pigmentation est
celle des phanères.
57. Utilisation selon la revendication 56 caractérisée en ce que lesdits phanères sont les poils et
système pileux.
58. Utilisation selon la revendication 56 caractérisée en ce que lesdits phanères sont les cheveux. 59. Utilisation selon la revendication 49 ou 50, caractérisée en ce qu'elle concerne la
prévention ou le traitement de la canitie.
60. Utilisation selon la revendication 59, caractérisée en ce que ladite canitie est une canitie
précoce.
61. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 49 ou 50, caractérisée
en ce que ledit fragment est isolé, purifié ou recombinant.
62. Utilisation d'un fragment polynucléotidique selon la revendication 49 ou 50, caractérisée
en ce que ledit fragment est associé à une sonde fluorescente, radioactive ou enzymatique.
63. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes: i) sélection d'un marqueur appartenant à la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl 1 S898 et Dl 1 S925, ii) détermination des allèles du marqueur choisi présents dans un échantillon de
matériel génétique dudit individu.
Demande no 02 09697 L'Oréal 64. Procédé selon la revendication 63 caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur
micro satellite.
65. Procédé selon la revendication 63 caractérisé en ce que ledit marqueur est choisi parmi les
marqueurs suivants: D11S898, D11S908 etDllS925.
66. Procédé selon l'une quelconque des revendications 63 à 65, caractérisé en ce que le
polymorphisme dudit marqueur indique la présence ou l'absence d'une prédisposition à la
canitie précoce.
67. Procédé selon la revendication 63 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour
établir le diagnostic.
68. Procédé selon la revendication 67 caractérisé en ce que les autres individus sont des
membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
69. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les marqueurs Dl 1S898, Dl 1S908 et Dl 1S925 pour la détermination des gènes impliqués dans la pigmentation de la peau ou
des phanères.
70. Utilisation d'au moins un des marqueurs choisis parmi les marqueurs Dl 1S898, Dl 1S908 et Dl 1 S925 pour la détermination des gènes impliqués dans l'interruption progressive ou
subite de la pigmentation de la peau ou des phanères.
71. Utilisation à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques comprenant chacun au moins 18 nucléotides successifs dont la séquence est choisie parmi: * une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, * une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et * une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl 1 S898 et Dl 1 S925,
lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
72. Utilisation d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi: Demande n0 02 09697 L'Oréal un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, * un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs DI 1 S898 et Dll S925, pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides. 73. Utilisation selon la revendication 71 ou 72, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les 1 5 marqueurs D3S 1277 et D3S 1768, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S 1768 et D3S2409, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S2409 et D3S1289, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1289 et D3S1766, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1766 et D3S1300, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1300 et
D3S1285.
74. Utilisation selon la revendication71 ou 72, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S436, ou à celle comprise entre les marqueurs D5S436 et
D5S410, ou à celle comprise entre les marqueurs D5S410 et D5S422.
75. Utilisation selon la revendication 71 ou 72, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs DllS898 et DIIS908, ou à celle comprise entre les marqueurs DIIS908 et Dl1IS925. 76. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes: i) sélection d'une combinaison d'au moins deux marqueurs choisis parmi les marqueurs appartenant à la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, Demande no 02 09697 L'Oréal * les marqueurs appartenant à la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, * les marqueurs appartenant à la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl 1 S898 et Dl 1 S925, ii) détermination des allèles des marqueurs choisis présents dans un échantillon de
matériel génétique dudit individu.
77. Procédé selon la revendication 76 caractérisé en ce que lesdits marqueurs sont choisis parmi les marqueurs suivants: D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, D11S898, D1IS908 et
Dl 11S925.
78. Procédé selon la revendication 76 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour
établir le diagnostic.
79. Procédé selon la revendication 78 caractérisé en ce que les autres individus sont des
1 5 membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
80. Utilisation d'une combinaison de marqueurs choisis parmi les marqueurs D3S1277,
D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436,
D5S410, D5S422, DllS898, DllS908 et DllS925, la combinaison comprenant au moins deux marqueurs correspondant à des chromosomes distincts, pour la détermination des
gènes impliqués dans la pigmentation de la peau ou des phanères.
81. Utilisation d'une combinaison de marqueurs choisis parmi les marqueurs D3S1277,
D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436,
D5S410, D5S422, DllS898, DIIS908 et DIIS925 pour la détermination des gènes impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la pigmentation de la peau ou des
phanères.
82. Kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 Demande n 02 09697 L'Oréal humain comprise entre les marqueurs Dli S898 et Dli S925, lesdits fragments ayant une
longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
83. Utilisation à des fins cosmétiques, dans le domaine de la pigmentation, d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques comprenant chacun au moins 18 nucléotides successifs dont la séquence est choisie parmi: (a) une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, (b) une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, (c) une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et (d) une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et le télomère du bras long, (e) une séquence correspondant à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl 1S898 et Dl 1S925, l'une au moins des séquences étant choisie parmi (b), (c) ou (e) , lesdits fragments ayant une
longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
84. Utilisation d'une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi: (a) un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, (b) un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, (c) un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, (d) un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et le télomère du bras long, (e) un fragment comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl 1S898 et Dl 1S925, Demande nl 02 09697 L'Oréal l'un au moins des fragments étant choisi parmi (b), (c) ou (e), pour la fabrication d'un médicament pour une utilisation thérapeutique dans le domaine de la pigmentation, lesdits
fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
85. Utilisation selon la revendication 83 ou 84, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S1610, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1610 et D6S1019, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1019 et D6S1017, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1017 et D6S1280, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1280 et D6S1960, ou à celle comprise entre les marqueurs D6S1960 et
D6S257.
86. Utilisation selon la revendication 83 ou 84, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1768, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1768 et D3S2409, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S2409 et D3S1289, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1289 et D3S1766, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1766 et D3S1300, ou à celle comprise entre les marqueurs D3S1300 et
D3S1285.
87. Utilisation selon la revendication 83 ou 84, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S436, ou à celle comprise entre les marqueurs D5S436 et
D5S410, ou à celle comprise entre les marqueurs D5S410 et D5S422.
88. Utilisation selon la revendication 83 ou 84, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 9 humain comprise entre les marqueurs D9S290 et D9S164, ou à celle comprise entre les marqueurs D9S164 et D9S158
ou à celle comprise entre le marqueur D9S 158 et le télomère du bras long.
89. Utilisation selon la revendication 83 ou 84, caractérisée en ce qu'au moins un fragment correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs DIIS898 et D1lS908, ou à celle comprise entre les marqueurs DIIS908 et D1lS925. 90. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant les étapes suivantes: i) sélection d'une combinaison d'au moins deux marqueurs choisis parmi Demande n0 02 09697 L'Oréal (a) les marqueurs appartenant à la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S 1629 et D6S257, (b) les marqueurs appartenant à la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, (c) les marqueurs appartenant à la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, (d) les marqueurs appartenant à la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et le télomère du bras long, (e) les marqueurs appartenant à la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs DI lS898 et DI 1 S925, ii) détermination des allèles des marqueurs choisis présents dans un échantillon de matériel génétique dudit individu,
l'un au moins des marqueurs choisis à l'étape i) est choisi parmi (b), (c) ou (e).
91. Procédé selon la revendication 90 caractérisé en ce que lesdits marqueurs sont choisis parmi les marqueurs suivants: D6S1629, D6S1610, D6S1019, D6S1017, D6S1280,
D6S1960, D6S257, D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300,
D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, D9S290, D9S164, D9S158, DllS898, DllS908 et DllS925, l'un au moins étant choisi parmi D3S1277, D3S1768, D3S2409,
D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422,
DlIS898, DllS908 etDllS925.
92. Procédé selon la revendication 90 comprenant l'étape supplémentaire iii) comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour
établir le diagnostic.
93. Procédé selon la revendication 92 caractérisé en ce que les autres individus sont des
membres de la même famille que celle de l'individu à diagnostiquer.
94. Utilisation d'une combinaison de marqueurs choisis parmi les marqueurs D6S1629,
D6S1610, D6S1019, D6S1017, D6S1280, D6S1960, D6S257, D3S1277, D3S1768,
D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410,
D5S422, D9S290, D9S164, D9S158, DllS898, DIIS908 et DllS925, la combinaison comprenant au moins deux marqueurs correspondant à des chromosomes distincts, et l'un au moins étant choisi parmi D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, D11S898, D11S908 etDllS925, pour la
détermination des gènes impliqués dans la pigmentation de la peau ou des phanères.
Demande n 02 09697 L'Oréal 95. Utilisation d'une combinaison de marqueurs choisis parmi les marqueurs D6S 1629,
D6S1610, D6S1019, D6S1017, D6S1280, D6S1960, D6S257, D3S1277, D3S1768,
D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410,
D5S422, D9S290, D9S164, D9S158, D11S898, D11S908 etDllS925, l'un au moins étant choisi parmi D3S1277, D3S1768, D3S2409, D3S1289, D3S1766, D3S1300, D3S1285, D5S2115, D5S436, D5S410, D5S422, DllS898, D1IS908 et D1lS925, pour la détermination des gènes impliqués dans l'interruption progressive ou subite de la
pigmentation de la peau ou des phanères.
96. Kit comprenant une combinaison d'au moins deux fragments polynucléotidiques choisis parmi ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 6 humain comprise entre les marqueurs D6S1629 et D6S257, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain compriseentre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 9 humain comprise entre le marqueur D9S290 et le télomère du bras long, et ceux comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 1 1 humain comprise entre les marqueurs DI 1S898 et Dl S925, l'un au moins des fragments polynucléotidiques ayant 18 nucléotides consécutifs ayant une séquence correspondant à tout ou partie de l'une des régions décrites sur les chromosomes 3, 5 et 11, lesdits fragments ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides. 97. Procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 3 humain comprise entre les marqueurs D3S1277 et D3S1285, comprenant les étapes de: i) Mise en présence de la molécule à tester et dudit fragment et ii) Détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment,
ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
98. Procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence Demande n 02 09697 L'Oréal correspond à tout ou partie de la région du chromosome 5 humain comprise entre les marqueurs D5S2115 et D5S422, comprenant les étapes de: i) Mise en présence de la molécule à tester et dudit fragment et ii) Détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment, ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides. 99. Procédé d'identification de molécules capables de moduler la fonction d'un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région du chromosome 11 humain comprise entre les marqueurs Dl 1 S898 et Dl1 S925, comprenant les étapes de: i) Mise en présence de la molécule à tester et dudit fragment et ii) Détection d'une variation d'un paramètre lié à la fonction dudit fragment,
ledit fragment ayant une longueur comprise entre 30 et 5000 nucléotides.
Demande n0 02 09697 L'Oréal
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