CA2439731A1 - Bioreacteur pour tissu cultive en couche mince et utilisations - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un réacteur de culture cellulaire et tissulaire particulièrement adapté à la culture de cellules ou tissus de structure en couche mince, et comprend des moyens permettant d'assurer une stimulation physiologique et une alimentation en milieu de culture adaptée à l'épaisseur réduite de la culture. Le réacteur peut servir à la préparation d'un implant et comporte également des moyens permettant d'assurer une stimulation mécanique des tissus ou cellules et une alimentation en milieu de culture adaptée aux tissus de structure. Le réacteur comporte également, de manière avantageuse, des moyens ou une forme permettant de faciliter l'introduction du tissu ou de la partie solide d'un implant dans la chambre de culture, et par exemple une paroi ou un élément déformable élastiquement. Le réacteur peut e n outre comporter des moyens de régulation de la température. Le réacteur est utilisable pour la culture de différents types cellulaires et la préparation d'implants de formes, compositions et applications variées.

Description

Bioréacteur pour tissu cultivé en couche mince et utilisations La présente invention concerne un réacteur de culture cellulaire et tissulaire, éventuellement pour la préparation d'un implant, notamment par croissance et/ou différentiation cellulaire, éventuellement dans une matrice biocompatible et/ou sur un support d'adhésion.
Le bioréacteur est particulièrement adapté à la culture de tissu ou cellules en couches) mince(s), et comprend des moyens permettant d'assurer une stimulation physiologique des tissus ou cellules et une alimentation en milieu de culture, adaptées à la culture en couche mince. Le réacteur comporte également, de manière avantageuse, des moyens ou une forme permettant de faciliter l'introduction ou l'extraction du tissu ou de la partie solide d'un implant dans la chambre de culture, et par exemple une paroi ou un élément déformable élastiquement. Le réacteur peut en outre comporter des moyens de régulation de la température.
Le réacteur est utilisable pour la culture de différents types cellulaires et la préparation d'implants de formes, compositions et applications variées.
La présente invention concerne également des procédés de préparation d'implants à l'aide d'un bio-réacteur selon l'invention.
L'invention est donc utilisable notamment pour la préparation d'implants dentaires, osseux, cartilagineux, etc., comprenant un tissu ou une composition cellulaire, éventuellement associés à une matrice biocompatible et/ou à un support solide ou semi-solide d'adhésion des cellules ou tissus ou matrice.
Un réacteur pour la fabrication d'implants dentaires est connu notamment du document WO 00/21456. Ce réacteur permet de recevoir un noyau d'implant comportant une partie radiculaire et une partie coronaire. Le noyau est constitué d'un matériau inerte biocompatible selon une forme analogue à une dent extraite. La partie radiculaire de l'implant est immergée dans une culture de cellules mésenchymateuses, dans un milieu de culture dont la composition permet la différenciation en cémentoblastes et en fibroblastes. Cette immersion est maintenue un temps suffisant pour permettre l'adhésion des cémentoblastes sur la partie radiculaire, la

2 formation d'une première couche de cément et d'une ébauche de ligament alvéolo-dentaire attaché à ce cément.
Le réacteur est conçu pour permettre une sollicitation mécanique du tissu en formation autour de l'implant. Cette sollicitation reproduit les contraintes physiologiques auxquelles une dent est normalement soumise.
En effet, une stimulation physiologique est nécessaire pour permettre une prolifération et une différenciation in vitro des cémentoblastes et des fibroblastes.
Dans le réacteur décrit dans le document WO 00/21456, le noyau de l'implant est disposé dans une alvéole délimitée par une paroi poreuse rigide au travers de laquelle est diffusé un milieu de culture. Pour la sollicitation du tissu cultivé, des moyens mécaniques sont disposés entre le noyau de l'implant et la cuve du réacteur. Ces moyens assurent un déplacement en va et vient du noyau de l'implant par rapport à la cuve. Le déplacement s'effectue notamment suivant la longueur de l'implant. Les moyens d'excitation comportent par exemple un actionneur électrique.
Un tel réacteur est d'une fabrication délicate puisqu'il doit permettre un guidage en translation précis du noyau de l'implant par rapport à la cuve.
En effet, l'espace entre la paroi de l'alvéole et le noyau doit étre maintenu dans une plage de valeurs déterminée pour une croissance satisfaisante des cémentoblastes et des fibroblastes. En outre, ce réacteur ne permet pas le renouvellement ou le contrôle de la composition du milieu baignant les cellules. D'autre part, la stimulation mécanique offerte présente certaines limites. En outre, ce réacteur est décrit spécifiquement pour la préparation d'un implant dentaire.
L'invention a pour but de fournir des réacteurs dont la fabrication est plus aisée et qui permettent une croissance et/ou une différentiation satisfaisantes des cellules dans la chambre du réacteur, de préférence au sein d'une matrice (e.g., matrice extracellulaire produite par les cellules ou tissus cultivés) et à la surface d'un support (d'adhésion), plus particulièrement de cellule ou tissu cultivé en couche mince.
Les particularités de ce réacteur sont notamment de permettre le contrôle de plusieurs conditions de culture pour favoriser la prolifération et la

3 différenciation cellulaires, la production de matrice extracellulaire, l'organisation et la maturation tissulaire. Le bioréacteur est plus particulièrement adapté à la culture de tissus ou cellules en couche mince, notamment de tissu de structure, pour lesquels il existe de nombreuses contraintes et difficultés.
La première condition est un effet de surface qui permette une adhésion cellulaire ou un attachement tissulaire à une paroi biocompatible dans le réacteur ou à deux parois en vis-à-vis, séparées par l'espace de culture qui est alors soumis à un double effet de surface ou d'attachement.
La seconde condition est un effet mécanique généré au sein du tissu pour le rapprocher de ses conditions physiologiques naturelles. Les contraintes peuvent étre en pression, en étirement, en cisaillement, en frottement ou en une combinaison de ces effets.
Une autre contrainte réside dans l'alimentation en milieu de culture, permettant une bonne croissance homogène du tissu en couche mince, c'est-à-dire une alimentation homogène et contrôlée du milieu dans l'espace réduit de la culture.
Ces effets sont importants pour le développement in vivo et in vitro notamment des tissus de structure, par exemple ligament, os, cartilage, desmodonte, cément, aponévroses, insertions ligamentaires sur l'os, etc.
Ces tissus sont très sensibles à une stimulation physiologique et il existe un intérét majeur à les cultiver avec ces modes de sollicitation.
La présente invention fournit ainsi pour la première fois un réacteur de culture biologique, adapté à la culture de tissu en couche mince, assurant une stimulation mécanique des cellules et une alimentation et une diffusion adaptées du milieu nutritionnel. Avantageusement, le réacteur est également muni de moyens de contrôle de la température et de moyens permettant ou facilitant l'introduction ou l'extraction de la partie solide d'un implant (tel que le support d'adhésion) dans l'espace de culture sans altérer les cellules ou tissus présents.

4 Un objet de l'invention réside donc, plus précisément, dans un réacteur pour la culture cellulaire ou tissulaire en couches) mince(s). Le réacteur est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il comprend (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture compris entre 1 et 1000 microns, de préférence entre 10 et 1000 microns, plus préférentiellement entre 50 et 800 microns, (ü) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture.
Le bio-réacteur selon l'invention peut permettre d'obtenir dans un but thérapeutique ou scientifique ou industriel des tissus biologiques en tant que tels. Ce bio-réacteur permet également de cultiver et développer des tissus à la surface d'un support d'adhésion ou d'une prothèse qui garderont à leur surface ou sur une partie de leur surface le tissu cultivé, par exemple pour améliorer ou accélérer la cicatrisation tissulaire et la réparation organique après la mise en place chirurgicale de l'implant mixte ou de ladite prothèse ainsi produits.
L'invention peut être mise en oeuvre avec différents types d'implants, de forme, structure et composition variées et pour des applications différentes. Au sens de l'invention, le terme implant désigne en effet toute composition comprenant des cellules ou un tissu reconstitué, éventuellement associé à un support solide. II s'agit de préférence d'un implant comportant un noyau (ou une composante) solide et une composante cellulaire ou biologique. Le noyau de l'implant est également désigné dans la présente par le terme « support d'adhésion » ou coeur de l'implant. Le noyau de l'implant peut être réalisé en tout matériau biocompatible, par exemple métal, plastique, polymère, verre, matériau biologique, céramique, os, corail, etc. Typiquement, il s'agit de bioverre, céramique (par exemple zircone), d'alliages, de titane ou d'os. L'implant selon un exemple spécifique de l'invention est un implant dentaire, comportant un noyau (partie radiculaire) couvert en partie de cellules au moyen d'un réacteur selon l'invention. Un implant dentaire, par exemple, peut étre réalisé en tout matériau biocompatible, par exemple métal (titane par exemple), polymère, verre biologique, céramique, etc. II peut également s'agir d'autres types d'implants, comme par exemple d'un implant osseux ou articulaire.

5 Comme indiqué ci-avant, le bioréacteur selon l'invention comporte avantageusement une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture adapté à la production de tissu en couches) mince(s). II
s'agit avantageusement d'un espace de culture d'une épaisseur inférieure ou égale à environ 1000 microns, généralement comprise entre environ 10 et environ 1000 microns, plus préférentiellement entre 50 et 800 microns. De manière préférentielle, l'espace de culture présente au moins une zone d'épaisseur inférieure ou égale à 900 microns, plus préférentiellement à
environ 800 microns, de préférence entre 50 et 800 microns. Le réacteur est adapté à la formation de tissus biologiques d'épaisseur contrôlée et faible, par exemple de tissus de structure, par exemple de type feuillets.
L'espace de culture est avantageusement homogène au sein de tout ou partie de la chambre de culture, de manière à assurer la production d'un tissu cultivé essentiellement homogène. Ainsi, l'épaisseur de l'espace de culture est avantageusement constante dans une zone importante de la chambre.
Les parois délimitant l'espace de culture peuvent être composée ou comprendre différents types de matériaux, rigides ou non.
Préférentiellement, les parois délimitant l'espace de culture sont en matériau biocompatible, par exemple en polymère, verre, plastique, métal, etc. Plus préférentiellement, l'une au moins des parois est dans un matériau favorisant la prolifération cellulaire, ou l'adhésion cellulaire, ou reproduisant une situation physiologique. A cet égard, des matériaux particulièrement préférés sont le bioverre, l'os, le corail, l'hydroxyapatite, l'oxyde de titane etc.
(voir également les exemples). Ainsi, dans un premier mode de réalisation, le réacteur comporte un espace de culture délimité par deux parois en matériau biocompatible, l'une au moins d'entre elles étant composée ou à

6 base d'un matériau favorisant la culture des cellules, de préférence en bioverre, os, corail. Le matériau favorisant la culture des cellules peut étre en recouvrement partiel ou total d'autres matériaux biocompatibles, tels que céramiques, métaux ou polymères.
Selon la forme du bioréacteur, les deux parois peuvent être fixes ou mobiles, comme il sera décrit plus loin. De manière préférée, l'une au moins des deux parois est mobile. En outre, l'une des parois peut étre formée par le noyau de l'implant lui-même. Dans ce cas, la chambre du réacteur est délimitée par une paroi de forme adaptée à celle du noyau de l'implant, dont l'introduction dans la chambre crée l'espace réduit de culture. Dans des modes particuliers de réalisation, la chambre du réacteur est délimitée par une paroi de forme conique ou cylindrique et le noyau de l'implant est respectivement de forme conique ou de forme cylindrique. Dans ce cas, le réacteur comporte en outre des moyens de support du noyau de l'implant, disposés ou réglables de sorte que l'introduction du noyau de l'implant forme, avec la paroi de la chambre de culture, un espace de culture réduit comme défini ci-avant.
Selon une variante de réalisation particulière, la chambre de culture du réacteur est délimitée par une paroi non rigide, déformable élastiquement, permettant de faciliter l'introduction ou le retrait du noyau de l'implant de la chambre, sans altérer le tissu. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le bioréacteur comporte en outre des moyens d'introduction ou de retrait du noyau d'un implant dans la chambre de culture. L'invention a également pour but de fournir un réacteur permettant d'améliorer les conditions d'introduction ou d'extraction du support d'adhésion (ou noyau) d'un implant dans la chambre ou alvéole de culture, notamment sans endommager les tissus adhérents à la surface du noyau.
Selon un mode particulier, le réacteur est caractérisé notamment par la présence d'une membrane délimitant ou bordant une alvéole (ou une chambre) pour la culture, la différentiation et/ou la croissance cellulaire, ladite membrane étant déformable élastiquement pour faciliter l'introduction

7 des cellules ou celle du support d'adhésion dans ladite chambre. Comme il sera décrit dans la suite du texte, la membrane déformable peut également permettre une stimulation mécanique des cellules dans ladite chambre.
S A cet effet, la présente invention propose et a pour objet un réacteur pour la préparation d'un implant, notamment par croissance et/ou différentiation cellulaire, éventuellement au sein d'une matrice biocompatible, comprenant une alvéole pour la culture, la différentiation et/ou la croissance cellulaires, caractérisé en ce que l'alvéole est délimitée par une membrane déformable élastiquement. Ainsi, l'invention repose en partie sur la mise au point d'une chambre à paroi déformable, destinée à
recevoir les cellules et, le cas échéant, le support d'adhésion (ou noyau) d'un implant. L'utilisation d'une telle alvéole procure de multiples avantages, et notamment celui de faciliter l'introduction des cellules ou du support de l'implant dans ladite chambre, et/ou de permettre une stimulation mécanique des cellules dans ladite chambre.
Ainsi, pour la préparation par exemple d'un implant comprenant des cellules associées à un support d'adhésion (partie solide composée par exemple d'os, de polymère, de matériau biocompatible, de bioverre, de teflon, de métal, etc., également désignée noyau de l'implant), et comprenant éventuellement une matrice extracellulaire, le réacteur permet de réaliser, dans des conditions stériles et reproductibles, la culture, la différentiation et/ou la croissance des cellules à la surface du noyau de l'implant. En effet, en opérant une déformation de la paroi de l'alvéole, il est possible d'introduire le noyau de l'implant dans celle-ci sans risque de frottements importants entre le noyau et la paroi, et donc sans endommager les cellules disposées à la surface du noyau. Dans ce mode de réalisation, il est également possible de placer les cellules en gel ou en suspension ou en matrice biologique exogène ou en matrice auto-sécrétée, à la fois dans la cuve et sur le noyau l'implant ou la prothèse. Dans ce cas, les cellules peuvent être identiques ou bien différentes dans la cuve et sur le noyau de l'implant ou de la prothèse.

De plus, les propriétés de déformabilité de la paroi, notamment ses caractéristiques élastiques, permettent d'exercer, au cours de la culture, une stimulation mécanique sur les cellules, et d'en favoriser la prolifération et/ou la différentiation.
La présente invention a donc également pour objet tout bioréacteur comportant une chambre de culture délimitée par une paroi déformable élastiquement. La cuve du bio-réacteur comporte ainsi, dans une chambre intermédiaire, une paroi élastique déformable par dépression. Dans un mode de réalisation préféré, le réacteur selon l'invention comporte des moyens de déformation mécanique de la paroi, notamment des moyens pneumatiques ou hydrauliques.
Comme indiqué ci-avant, le réacteur selon l'invention comprend avantageusement des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus cultivés. Pour cela, l'espace de culture peut étre soumis à des contraintes par mouvements relatifs des deux parois, l'attachement tissulaire biologique ou micro-mécanique à l'une ou aux deux parois en vis-à-vis produisant la stimulation mécanique.
L'effet mécanique est préférentiellement exercé en pression, en étirement, en cisaillement, en frottement ou en une combinaisons) de ces effets. II est généralement obtenu par mouvement de l'une ou des deux parois de la chambre, produisant essentiellement une modification de l'épaisseur de l'espace de culture. Avantageusement, la modification de l'épaisseur est produite par mouvement d'une seule des deux parois, et est contrôlée pour ne pas excéder + ou - 20% environ de l'épaisseur initiale de l'espace de culture, de préférence + ou - 10%.
II peut être obtenu au moyen de parois déformables, de joints souples (notamment de joints toriques) introduits dans la structure de la chambre de culture ou entre celle-ci et des moyens de support des parois, par une stimulation mécanique (pression, rotation, écrasement, etc.) etc., comme décrit ci-après et dans les exemples.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le réacteur comporte des moyens de stimulation mécanique des cellules, par exemple au moyen d'un piston, par déplacement du noyau de l'implant, le cas échéant, ou par déformation de la chambre de culture ou d'une partie de celle-ci (par exemple au moyen d'un joint déformable). Dans le cas d'un déplacement, celui-ci peut être par exemple exercé suivant l'axe de l'implant, par un mouvement de va et vient, ou par une légère rotation partielle. De manière avantageuse, la stimulation est réalisée au moyen d'un élément déformable (par exemple, souple), introduit dans le réacteur (membrane de l'alvéole, joint, etc.) et par application d'une pression/dépression ou d'une force d'écrasement.
Par ailleurs, pour augmenter la transmission des contraintes au sein du tissu cultivé, il est possible d'ajouter dans l'espace de culture des éléments tels que des éponges résorbables ou non, par exemple éponge de collagène, de chitosan ou de collagène-chitosan, ou bien des irrégularités de surface de l'une des parois, par exemple des rainures, ou bien des fibres par exemple en polymère biocompatible, ou des billes d'un diamètre de 50 à
1000 microns, de préférence de 50 à 500 microns, un peu inférieur à
l'épaisseur de l'espace de culture, et qui peuvent être en polymère, en verre, en céramique, etc., ou bien une combinaison de ces éléments.
Un mode de réalisation préféré de l'invention concerne un bioréacteur tel que défini ci-avant comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture d'une épaisseur inférieure à environ 1000 microns, (ü) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture, l'espace de culture comprenant en outre des éléments permettant d'augmenter la stimulation mécanique (éponge, fibre, bille, particule, etc.) ou ayant au moins une paroi présentant des irrégularités (rainures, bombages, fibres, etc.).

Un autre objet particulier de l'invention réside dans un bioréacteur tel que défini ci-avant, comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture d'une épaisseur inférieure à environ 1000 microns, (ü) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus 5 dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture, l'une au moins des deux parois étant en matériau favorisant la culture cellulaire, préférentiellement en bioverre ou en os. L'invention réside, plus généralement, dans un bioréacteur comprenant une chambre de culture, ladite chambre étant 10 délimitée par une paroi interne réalisée en ou comprenant du bioverre ou de l'os.
Selon un mode de réalisation préféré, les réacteurs de l'invention comportent en outre des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture. Une autre caractéristique avantageuse des bio-réacteurs de l'invention est de favoriser la diffusion du milieu nutritionnel dans un espace de culture réduit en épaisseur, nécessaire pour obtenir un effet de surface et d'interface dans le tissu cultivé. La diffusion du milieu est obtenue par perfusion mais sa répartition est obtenue par une expansion contraction périodique de cet espace et/ou un mouvement d'amplitude la plus régulière possible sur toutes les surfaces.
L'effet se rapproche alors du pouls sanguin, et peut être réglé en amplitude et en fréquence pour une nutrition et une stimulation fonctionnelle suffisantes et adaptées, sans risquer de détruire le tissu. La fréquence de la stimulation (notamment des cycles expansion-contraction est avantageusement comprise entre 1 et 80 cycles par minute.
L'angle entre l'axe du mouvement des pièces rigides constituant l'interface et la surface de culture est un élément important pour obtenir un bon réglage. Pour une alvéole élastique, les variations de pression appliquée dans la chambre intermédiaire permettent de communiquer l'effet de dilatation-contraction qui va favoriser la diffusion du milieu nutritif et la stimulation fonctionnelle, ou une partie de cette stimulation, au tissu cultivé.

Par exemple, l'espace de culture peut varier de 10% autour d'une valeur moyenne de 50 à 1000 microns selon les cultures.
Le nombre d'entrées et de sorties du milieu de culture peut être adapté au tissu à cultiver et à la matière de l'alvéole. Pour une alvéole élastique, une entrée par le fond de la cuve et une sortie à la partie supérieure est la modalité la plus simple. L'entrée peut également provenir du noyau de l'implant, par exemple. Pour une alvéole rigide, en plus de ou en remplacement de la solution précédente, des entrées et sorties multiples sont possibles pour optimiser la répartition du milieu dans l'espace de culture (Figures n° 5 et 6). Avantageusement, les entrées et sorties sont disposées en plan, à 90° les unes des autres, les sorties et entrées étant alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu. Des canaux creusés en surface dans la paroi de l'alvéole peuvent aussi aider à la diffusion du milieu.
Dans un mode de réalisation préféré, le réacteur comporte donc en outre un système de perfusion, permettant d'alimenter et/ou de renouveler le milieu de culture présent dans l'alvéole. Le débit de perfusion peut être réglé
par l'homme du métier en fonction du type cellulaire et du type de culture, milieu, etc. Comme indiqué, la diffusion du milieu au sein de l'espace réduit de culture est avantageusement favorisée par le mouvement d'une ou des parois de la chambre de culture (pression, déformation élastique, mouvement de va-et-vient, etc.).
Selon un mode particulier, les réacteurs de l'invention comprennent en outre des moyens de régulation de la température du milieu de culture.
Lesdits moyens sont par exemple un circuit d'eau ou de liquide ou de gaz, de température contrôlée, la présence d'une résistance électrique, ou d'un transistor, par exemple d'un transistor à effet Peltier.
A cet égard, selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne également tout réacteur de culture cellulaire ou tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre de culture et des moyens de régulation de la température de la chambre de culture. II s'agit avantageusement d'un réacteur tel que défini ci-avant, comprenant des moyens de stimulation mécanique des cellules, et/ou des moyens de perfusion du milieu.
Les réacteurs selon l'invention sont utilisables pour la culture de différents types cellulaires et la préparation d'implants de formes, compositions et applications variées. Préférentiellement, il est utilisé pour la préparation de produits cellulaires comprenant des cellules dont la croissance, la culture, la différentiation et/ou l'adhésion est favorisée par une stimulation mécanique. On peut citer notamment les fibroblastes, cémentoblastes, chondrocytes, etc. Des exemples particuliers de cellules sont des fibroblastes du derme, de la muqueuse buccale, de la gencive, de ligaments alvéolo-dentaires (desmodontaux), des chondrocytes, ou des précurseurs de ces cellules. En outre, les populations cellulaires utilisées peuvent être des populations mixtes, comprenant différents types cellulaires.
Les cellules utilisées dans l'invention peuvent étre autologues, allogéniques ou xénogéniques. II peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies.
II s'agit préférentiellement de cellules humaines ou d'origine humaine. Elle peuvent être utilisées sous forme de suspension, agrégats, amas, tapis, éventuellement dans une matrice extracellulaire naturelle ou synthétique permettant de faciliter l'adhésion sur le noyau de l'implant. En outre, les cellules peuvent être des cellules modifiées génétiquement, c'est-à-dire contenant un acide nucléique recombinant permettant de leur conférer des propriétés d'intérêt.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un bioréacteur tel que défini ci-avant pour la préparation d'un tissu ou d'une culture cellulaire ou d'un implant. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un implant, tissu cultivé ou culture cellulaire, au moyen d'un réacteur tel que défini ci-avant.
La composition ou le tissu cellulaire (qui peut comprendre plusieurs types de cellules) peut être placée dans la cuve du bio-réacteur avant qu'elle soit refermée. Elle peut encore étre placée en adhésion à la surface du support d'adhésion de l'implant ou de la prothèse avant que ceux-ci ne soient placés dans la cuve du bio-réacteur. Ces deux techniques peuvent étre utilisées simultanément, en plaçant des cellules en gel ou en suspension ou en matrice biologique exogène ou en matrice auto-sécrétée, à la fois dans la cuve et sur le support d'adhésion de l'implant ou la prothèse. Dans ce cas, les cellules peuvent être identiques ou bien différentes dans la cuve et sur l'implant ou la prothèse.
Le bio-réacteur est adapté pour ménager un espace de culture d'épaisseur relativement faible autour de l'implant. Deux situations peuvent se produire selon la forme de l'implant ou de la prothèse.
- La pièce peut étre placée ou retirée du bio-réacteur, sans arracher ou gratter par frottement les tissus adhérents à sa surface, du fait d'une forme dite « de dépouille » par rapport à un axe d'insertion et de mise en place ou de retrait. Les surfaces destinées à la culture peuvent par exemple avoir une forme conique.
- Si le noyau d'implant ou la prothèse présente une forme susceptible d'engendrer des frottements sur les surfaces cultivées, lors de la mise en place dans le bio-réacteur ou du retrait de la pièce du bio-réacteur, il est avantageux d'utiliser une alvéole déformable telle que décrite ci-avant, qui peut s'espacer de l'implant à ces moments-là.
Dans un mode particulier, l'invention a pour objet un réacteur tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un implant comprenant un noyau recouvert d'une matrice composée en tout ou en partie de cellules, ledit réacteur comportant - une membrane délimitant ou bordant une alvéole (ou chambre de culture) destinée à recevoir tout ou partie du noyau de l'implant ;
- des moyens de support dudit noyau d'implant dans l'alvéole ; et - des moyens de stimulation mécanique des cellules autour de l'implant ;
caractérisé en ce que la membrane est déformable élastiquement et en ce que les moyens de stimulation mécanique comportent des moyens de déformation répétée de ladite membrane.

Un exemple spécifique de mise en oeuvre de l'invention est constitué
d'un réacteur pour la préparation d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur une partie radiculaire de l'implant, comportant - une membrane délimitant une alvéole de réception de la partie radiculaire de l'implant ;
- des moyens de support dudit implant avec sa partie radiculaire dans l'alvéole; et - des moyens de stimulation mécanique des cellules sur la partie radiculaire de l'implant ;
caractérisé en ce que la membrane est déformable élastiquement et les moyens de stimulation mécanique comportent des moyens de déformation de ladite membrane.
Dans un autre mode particulier, l'invention a pour objet un réacteur tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un implant comprenant un noyau recouvert d'une matrice composée en tout ou en partie de cellules, ledit réacteur comportant - une paroi souple ou rigide délimitant ou bordant une alvéole (ou chambre de culture) destiné à recevoir tout ou partie du noyau de l'implant ;
- des moyens de support dudit noyau d'implant dans l'alvéole ;
- des moyens de stimulation mécanique des cellules autour de l'implant ; et - des moyens de perfusion du milieu de culture dans l'alvéole.
Dans un mode particulier, les moyens de support du noyau comportent en outre un élément déformable élastiquement (par exemple un joint), permettant d'assurer un mouvement à l'implant dans l'alvéole.
Dans un autre mode particulier, l'alvéole est délimitée par une paroi rigide composée ou à base de bioverre, d'os ou d'autres matériaux biocompatibles (polymère, verre, plastique, métal, ou corail).
Dans un autre mode particulier, le bioréacteur comporte en outre des moyens de régulation de sa température.

En outre, l'invention a pour objet un procédé de fabrication d'un implant par croissance et/ou culture et/ou différentiation cellulaire sur un support d'adhésion solide (e.g., noyau de l'implant) au sein d'un milieu de culture, ledit procédé comportant 5 - la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans l'alvéole ou l'espace de culture d'un 10 bioréacteur tel que défini ci-avant, préalablement ou concomitamment empli d'un milieu de culture; et - la sollicitation mécanique des cellules.
Selon un mode particulier, le procédé comprend 15 - la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans une alvéole emplie d'un milieu de culture, l'alvéole étant délimitée ou bordée par une membrane élastiquement déformable ; et - la sollicitation mécanique de la membrane pour sa déformation au cours du temps.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de fabrication d'un implant par croissance et/ou culture et/ou différentiation cellulaire sur un support d'adhésion solide (e.g., noyau de l'implant) au sein d'un milieu de culture, ledit procédé comportant - la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans une alvéole emplie d'un milieu de culture, l'alvéole étant délimitée par une membrane élastiquement déformable et l'alvéole étant préalablement déformée par expansion radiale ;
- l'arrêt de la déformation de l'alvéole ; et - le maintien du noyau de l'implant dans l'alvéole pendant une période suffisante pour permettre la croissance et/ou la culture et/ou la différentiation cellulaire sur ledit noyau de l'implant.
Au sens de l'invention, le terme « adhésion » désigne le fait que les cellules (éventuellement dans une matrice) peuvent être maintenues au contact du noyau de l'implant, au moins partiellement et temporairement, le temps d'introduire le noyau dans l'alvéole ou le réacteur de l'invention.
Cette adhésion peut étre réalisée en utilisant des surfaces assurant naturellement une telle adhésion ou pré-traitée dans ce but. II est également possible d'inclure les cellules dans un gel, pâte, éponge, matrice auto-sécrétée, de nature à faciliter cette adhésion. II est également possible de recouvrir les cellules, après leur dépôt sur le noyau de l'implant, d'un film assurant leur maintien, de préférence d'un film poreux biodégradable.
Comme indiqué ci-avant, un exemple particulier d'application de l'invention réside dans la préparation d'un implant dentaire, par culture de cellules sur la partie radiculaire dudit implant, introduite dans une alvéole déformable selon l'invention.
L'invention a également pour objet un procédé de culture, différentiation et/ou prolifération cellulaire, ledit procédé, comportant - l'introduction d'une composition cellulaire dans une alvéole emplie d'un milieu de culture, l'alvéole étant délimitée par une membrane élastiquement déformable ; et - la sollicitation mécanique de la membrane pour sa déformation au cours du temps.
Comme indiqué avant, dans le procédé de l'invention, le tissu est préférentiellement perfusé, de manière à renouveler le milieu de culture. La perfusion est préférentiellement assurée par la présence d'une ouverture dans la partie inférieure de l'alvéole, assurant l'alimentation en milieu frais.
Cette alimentation peut également étre effectuée par une conduite ménagée dans le noyau (ou corps) de l'implant, ou dans un piston utilisé pour la stimulation mécanique, le cas échéant. La sortie du milieu est généralement assurée par une ouverture située dans la partie supérieure de l'alvéole.
Le milieu utilisé pour la culture cellulaire peut être tout milieu connu de l'homme du métier, notamment tout milieu adapté à la culture, croissance ou différentiation de cellules de mammifères. II peut s'agir en particulier de milieu DMEM, RPMI, HAF, etc., éventuellement supplémentés d'antibiotiques, acides aminés, sérum, etc.
L'invention concerne également l'utilisation d'un réacteur tel que décrit ci-avant, ou d'une alvéole tel que décrite ci-avant, pour la préparation de compositions cellulaires, notamment d'implants, typiquement pour une utilisation chez l'homme.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaitront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs, ainsi que dessins sur lesquels la figure 1 est une vue en coupe longitudinale d'un réacteur selon l'invention comprenant une paroi déformable ;
la figure 2 est une vue de dessus du corps du réacteur selon l'invention ;
la figure 3 est une vue en coupe longitudinale du corps du réacteur selon l'invention ;
la figure 4 est une vue en coupe longitudinale d'un conteneur de transport d'un implant dentaire ;
la figure 5 est une vue en coupe longitudinale d'un réacteur selon l'invention, perfusé pour la culture de chondroblastes, comportant une paroi rigide, avec stimulation fonctionnelle ; et la figure 6 est une vue en coupe longitudinale d'un réacteur selon l'invention, perfusé pour la culture de fibroblastes du ligament alvéolo-dentaire, avec stimulation fonctionnelle.
Le réacteur 2 représenté sur la figure 1 est destiné notamment à la fabrication d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur un noyau d'implant 4 réalisé dans un matériau bio-compatible. Ce noyau est constitué
par exemple de céramique, de titane, de bio-verre ou d'une composition de ces matériaux.
Le réacteur 2 est généralement de révolution d'axe x-x'. II comporte une cuve 6 délimitant une enceinte 8. La cuve 6 comporte un corps cylindrique 10 et un couvercle 12 solidarisé au corps. Le corps et le couvercle sont tous les deux réalisés avantageusement en PTFE. II est entendu que d'autres matériaux peuvent être utilisés pour la réalisation du réacteur.
Le couvercle 12 est solidarisé au corps 10 par trois vis non représentées. Les vis sont engagées dans des passages 14 ménagés au travers du couvercle 12. L'extrémité filetée des vis est reçue dans des trous taraudés 16 ménagés dans le corps 10. En outre, des trous borgnes 18, visibles sur la figure 2 sont ménagés dans les faces en regard du couvercle et du corps pour recevoir des pions de centrage non représentés.
L'enceinte 8 comporte un puits axial 22 ménagé dans le corps 16. Ce puits débouche au centre du fond généralement plat 23 d'une cuvette coaxiale 24 creusée dans le corps 10. Cette cuvette s'ouvre sur une première face d'extrémité plane 10A du corps cylindrique 10.
Une membrane élastique 26 en forme de cloche est disposée dans l'enceinte 8. Cette membrane délimite une alvéole généralement cylindrique 28 de réception de la partie radiculaire, notée 30, de l'implant. La membrane 26 présente un tronçon cylindrique 32 obturé par un fond 34 percé
axialement d'un passage 36. A son extrémité opposée au fond, la membrane présente une collerette extérieur 38 de solidarisation de la membrane 26 au corps 10. Cette collerette est venue de matière avec le tronçon cylindrique 32. Elle présente sur sa face tournée vers le fond 34, un bourrelet périphérique 40 reçu dans une gorge périphérique ménagée dans le fond 23 de la cuvette.
La membrane 26 est imperméable aux liquides et aux gaz et est déformable. Elle est formée par exemple en silicone biocompatible.
Le diamètre intérieur du tronçon cylindrique 32, c'est-à-dire le diamètre de l'alvéole 28 est très légèrement supérieur au diamètre de la partie radiculaire 30 de l'implant. En particulier, la différence de diamètres est telle que lorsque la membrane 26 est au repos et qu'elle n'est pas déformée, la distance entre le noyau d'implant 4 reçu dans l'alvéole et la membrane 26 est compris entre 0,1 et 5 mm. L'espace annulaire formé entre le noyau et la membrane correspond à la région de culture tissulaire.
Par ailleurs, les diamètres extérieur et intérieur respectivement du tronçon cylindrique 32 et du puits 22 sont tels qu'une chambre annulaire 42 d'épaisseur non nulle est formée entre le corps 10 et la membrane 26.
L'épaisseur de la chambre annulaire 42 est d'au moins 1 mm. Elle est par exemple de 3 mm.
Un alésage axial 44 prolonge le puits 22. Cet alésage débouche sur la seconde face plane d'extrémité, notée 10B, du corps. L'alésage 44 est normalement obturé par un pion 46 monté serré dans cet alésage afin de l'obturer de manière étanche.
Une extrémité du pion 46 fait saillie à l'intérieur du puits 22. Cette extrémité comporte une protubérance 47 adaptée pour s'enclencher élastiquement à l'intérieur d'un évidement 48 de forme complémentaire ménagé dans l'épaisseur du fond 34 de la membrane. En outre, le pion 46 comporte un conduit interne 49 débouchant axialement au sommet de la protubérance 47 en regard du passage 36 ménagé dans le fond 34 de la membrane. Le conduit 49 débouche, à l'autre extrémité, du pion 46, à
l'extérieur du réacteur. Ainsi, le conduit 49 permet l'alimentation en milieu de culture dans l'alvéole, au moyen de tout dispositif adapté (pompe, seringue, etc.). Le conduit 49 peut également présenter un coude, de manière à
déboucher sur la paroi latérale du réacteur.
Un conduit 50 connecté à la chambre annulaire 42 est ménagé au travers du corps 10. Ce conduit est adapté pour relier la chambre 42 à une source de dépression variable, notée 52. Cette source de dépression variable est par exemple constituée d'une pompe à vide.
Le conduit 50 s'étend radialement et débouche dans la paroi latérale du corps cylindrique 10 où il présente un profil de connexion à la source de dépression 52.

En outre, un conduit d'évacuation 54, visible sur les figures 2 et 3, est ménagé au travers du corps 10 pour la circulation d'un milieu de culture dans lequel baigne la partie radiculaire 30 de l'implant. Ce conduit débouche, à une première extrémité, dans la cuvette 24 et, à son autre 5 extrémité, au travers de la paroi cylindrique du corps 10. Ce conduit est adapté pour être relié à un collecteur 56 de milieu de culture.
Par ailleurs, le réacteur 2 comporte des moyens 58 de support du noyau 4 de l'implant dans une position fixe par rapport à la cuve 6 et à
l'enceinte 8.
10 Ces moyens de support sont engagés au travers d'un orifice central 60 traversant le couvercle 12.
Les moyens de support 58 comportent un pion de support 62 représenté seul sur la figure 3. Ce pion 62 est généralement de révolution. II
comporte un passage axial épaulé 64 dans lequel est reçue une tige, notée 15 66, prolongeant axialement le noyau 4 de l'implant.
Un trou taraudé traversant 68 est ménagé radialement au travers de la paroi du pion 62. Ce trou reçoit une vis sans tête 70 de retenue de l'implant par rapport au pion. L'extrémité de la vis 70 s'appuie contre un méplat de la tige 66, assurant ainsi son immobilisation axiale et en rotation.
20 La tige 66 se prolonge au-delà du pion 62 à son extrémité opposée au noyau d'implant 4. Cette extrémité de la tige est liée au goujon axial 72.
Ce goujon comporte, axialement à une extrémité, un logement dans lequel l'extrémité de la tige 66 est reçue. Cette dernière y est maintenue par collage. A son autre extrémité, le goujon 72 comporte un filetage extérieur 76 sur lequel est rapporté un écrou 78.
Le pion 62 est reçu dans une chambre 80 délimitée par une virole cylindrique 82. La virole délimite un passage cylindrique débouchant à ses deux extrémités et dans la longueur duquel la chambre 80 est définie.
A une première extrémité, le diamètre du passage est réduit par une lèvre rentrante périphérique 84 formant un diaphragme. Cette lèvre rentrante définit une surface annulaire d'appui pour le pion 62.
A l'autre extrémité du passage, la virole 82 présente un taraudage adapté pour recevoir un tampon d'obturation fileté 90 maintenant le pion 62 plaqué contre la lèvre 84. Le tampon 90 est traversé axialement d'un alésage 92 pour le passage du goujon 72. II comporte un filetage extérieur apte à coopérer avec le taraudage. Au-delà du filetage, le tampon 90 présente une couronne moletée 94.
La virole 82 présente à son extrémité présentant la lèvre 84 une collerette extérieure 96 adaptée pour être enserrée entre le corps 10 et le couvercle 12. Cette collerette a un diamètre supérieur au diamètre de la cuvette 24. Son bord périphérique extérieur est reçu partiellement dans une empreinte annulaire 100 ménagée dans la première face principale 10A du corps autour de la cuvette 24. Cette empreinte 100 présente un fond plat dans lequel est ménagé un canal annulaire 102 recevant un joint torique d'étanchéité 104.
La profondeur de l'empreinte 100 est inférieure à l'épaisseur de la collerette 96 afin que la collerette 96 et la virole 82 soient maintenues serrées entre le fond de l'empreinte 100 et le couvercle 12.
Pour la fabrication d'un implant, par exemple dentaire, le réacteur est d'abord assemblé comme illustré sur la figure 1 alors que le noyau de l'implant n'est pas encore installé.
En particulier, la membrane 26 est mise en place dans le puits 22, et la virole 82 est engagée dans l'orifice 60 du couvercle. Le couvercle étant immobilisé sur le corps 10, la virole 82 est retenue par la collerette 96 enserrée entre le corps et le couvercle.
Par ailleurs, le noyau 4 de l'implant est solidarisé au pion de support 62 par la vis 70 retenant la tige 66 prolongeant le noyau.
Après fixation du noyau au pion de support, la partie radiculaire du noyau est incubée en présence d'une composition cellulaire dans des conditions assurant l'adhésion de cellules sur ladite partie radiculaire. Pour la préparation d'un implant dentaire, la composition cellulaire comprend typiquement des fibroblastes du ligament alvéolo-dentaire et/ou des précurseurs de ces fibroblastes et des cémentoblastes. Dans un mode particulier, la partie radiculaire du noyau est recouverte d'un tissu cellulaire.
Ce tissu cellulaire est préalablement cultivé à plat puis est enroulé autour de la partie radiculaire du noyau d'implant. Dans un autre mode de réalisation, la partie radiculaire du noyau est recouverte d'une matrice imprégnée de cellules, par exemple de type éponge, gel, pâte, etc.
Afin de permettre la mise en place du noyau 4 ainsi recouvert dans le réacteur, sans risque d'endommager le tissu cellulaire, une dépression est établie dans la chambre annulaire 42. Cette dépression est créée par la pompe 52. Sous l'action de cette dépression, la membrane 26 se déforme notamment par expansion radiale de son tronçon cylindrique 32.
L'alvéole 28 se trouve ainsi dilatée augmentant sa section intérieure.
Le noyau de l'implant est alors introduit dans le réacteur 2 au travers du passage du couvercle. La partie radiculaire du noyau est reçue dans l'alvéole 28. Pour maintenir le noyau d'implant en place, le tampon 90 est engagé autour du goujon 72 et est vissé dans la virole 82. Le vissage est effectué jusqu'à ce que le pion de support 62 soit serré et immobilisé
axialement entre la lèvre 84 et le tampon 90.
Après mise en place initiale du noyau d'implant, l'alvéole 28 est relâchée par arrêt de la dépression créée dans la chambre 42. II est entendu que l'invention n'est pas limitée à ce mode d'utilisation, et qu'il est possible de mettre en contact l'implant et la composition cellulaire directement dans l'alvéole du réacteur.
Pour la culture du tissu cellulaire, l'alvéole 28 est en permanence perfusée d'un milieu de culture introduit au travers du fond 34 de la membrane par le conduit 49. Le milieu de culture circule alors dans l'alvéole 28 le long du noyau 4 et ressort dans la partie supérieure de l'alvéole pour déboucher dans la cuvette 24. Le liquide de culture est évacué de la cuvette 24 par le conduit d'évacuation 54.
Pendant la phase de culture ou croissance cellulaire, la membrane 26 subit des cycles répétés de déformations élastiques. Chaque cycle comporte une première phase tendant à augmenter le volume de l'alvéole 28 par établissement d'une dépression dans la chambre étanche 42 et une seconde phase au cours de laquelle la chambre étanche 42 est mise à l'air faisant cesser la dépression et tendant à réduire ce volume lors du relâchement de la membrane par élasticité.

Cette dépression cyclique est provoquée par la source de dépression 52 connectée à la chambre 42 par le conduit 50.
La déformation de la membrane provoque une action mécanique sur les cellules en culture. De plus, les pulsations créées par la membrane dans le milieu de culture favorisent la diffusion de celui-ci dans l'alvéole 28.
La dépression créée par la source est périodique et sa fréquence peut se rapprocher du pouls naturel, sans que cette référence puisse étre considérée comme nécessaire pour le résultat. Pour un étre humain, cette fréquence est telle que 40 à 80 pulsations ont lieu chaque minute. Dans le bioréacteur, une pulsation toute les trois à dix secondes peut étre suffisante.
Les dépressions périodiques créées dans la chambre 42 sont avantageusement répétées tout au long de la durée de la culture cellulaire.
Elles provoquent une stimulation physiologique des cellules, propre à
favoriser le développement tissulaire.
En variante et afin d'accentuer encore l'effet de diffusion du milieu de culture sous l'action de la déformation de la membrane, la chambre 42 délimitée entre la membrane 26 et le corps 10 est compartimentée par des parois de séparation. Chaque compartiment clos ainsi créé est relié à une source de dépression propre. Les sources de dépression sont commandées successivement pour assurer des déformations successives de la membrane et ainsi créer une onde se propageant le long de la membrane 26. Cette onde engendre un phénomène pulsatile dans l'espace de culture formé entre la membrane et le noyau d'implant.
Suivant encore une autre variante, le milieu de culture est perfusé en plusieurs points répartis horizontalement à la circonférence de la cuve. Les entrées et les sorties du milieu de culture sont situées de part et d'autre du noyau d'implant en des points multiples sur un plan vertical mais diamétralement opposés par rapport au noyau d'implant.
Les entrées et sorties sont avantageusement disposées suivant des lignes verticales, mais à 90° les unes des autres en plan et alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu. Les entrées et sorties peuvent être inversées périodiquement pour que toutes les cellules soient irriguées de façon équivalente.

Comme précisé précédemment, l'angle entre l'axe du mouvement des pièces rigides constituant l'interface et la surface de culture est un élément important pour obtenir un bon réglage. Pour une alvéole élastique, les variations de pression appliquée dans la chambre intermédiaire permettent de communiquer l'effet de dilatation-contraction qui va favoriser la diffusion du milieu nutritif et la stimulation fonctionnelle, ou une partie de cette stimulation, au tissu cultivé. Par exemple, l'espace de culture peut varier de 10% autour d'une valeur moyenne de 50 à 1000 microns selon les cultures.
Le nombre d'entrées et de sorties du milieu de culture peut également être adapté au tissu à cultiver et à la matière de l'alvéole. Pour une alvéole élastique, une entrée par le fond de la cuve et une sortie à la partie supérieure est la modalité la plus simple. Pour une alvéole rigide, en plus de la solution précédente, des entrées et sorties multiples sont possibles pour optimiser la répartition du milieu dans l'espace de culture. Des canaux creusés en surface dans la paroi de l'alvéole peuvent aussi aider à la diffusion du milieu.
A l'issue de la culture cellulaire, le noyau 4 recouvert des cellules cultivées est extrait du réacteur au travers du couvercle 12. Pendant l'extraction, l'alvéole 28 est maintenue dilatée par une dépression créée dans la chambre 42.
Pour sa conservation et son transport jusqu'au lieu où l'intervention chirurgicale doit avoir lieu, l'implant est maintenu dans un conteneur cylindrique 130 illustré sur la figure 4. Ce conteneur présente une cavité
cylindrique 132 propre à recevoir la partie radiculaire de l'implant recouvert des cellules.
A son extrémité ouverte, la cavité cylindrique 132 présente un taraudage 134 permettant le vissage du tampon fileté 90.
Entre le fond de la cavité et le taraudage 134, la cavité présente un épaulement 136 formant une surface d'appui pour le pion de support 62.
Après vissage du tampon 90, le pion de support est immobilisé
axialement en étant serré entre l'épaulement 136 et le tampon 90.

La distance entre le fond de la cavité et l'épaulement 136 est telle que lorsque le pion de support 62 est en appui contre l'épaulement 136, la partie radiculaire de l'implant est en tout point espacée de la paroi de la cavité.
Pour la conservation de l'implant, la cavité est emplie d'un liquide de 5 conservation dans lequel baigne la partie radiculaire de l'implant.
Le réacteur représenté sur la figure 5 comprend une cuve 202 qui de façon préférentielle est en bio-verre avec une concavité tronc-conique pour 10 assurer l'interface avec le cône interne 203 et ainsi obtenir une stimulation mécanique de la culture en gel avec un effet de pression et de cisaillement-frottement qui se rapproche des conditions physiologiques auxquelles sont soumis les cartilages. La taille du dispositif peut être adaptée à la surface de culture souhaitée (tronc-conique), et donc à la quantité de cellules. Le tronc 15 de cône interne 203 peut également être, de façon préférentielle, en bio-verre ou en tout autre matériau qui mime le plus possible l'os support. Plus le cône est plat, plus les variations de pression et la diffusion du milieu seront importantes, et les contraintes en cisaillement réduites, et inversement.
20 La cuve 202 peut être insérée dans une cuve 201 muni d'un couvercle 204 et possédant un fond plat de façon à permettre l'utilisation éventuelle du réacteur sur une table chauffante et d'assurer ainsi une répartition homogène de la température. Le système de régulation de la température peut également étre directement inclus dans la paroi de la cuve 25 201 du bio-réacteur. II peut, par exemple, s'agir d'un circuit d'eau ou encore d'une résistance électrique ou d'un transistor à effet Peltier, etc.
Deux axes de centrage 213 sont insérés dans le couvercle 204 et le corps 201.
Dans le couvercle 204 est également ménagée une entrée 212 destinée à permettre la pénétration de l'air comprimé responsable du mouvement et qui permet ainsi la stimulation mécanique. Un joint torique inférieur 210 autorise l'amplitude du mouvement vertical appliqué au milieu.
II est également possible d'ajouter au dispositif un joint torique supérieur qui facilite quant à lui l'amplitude du mouvement vertical appliqué à l'air sous pression.
Le dispositif comprend en outre une partie mobile cylindrique 205 munie d'un diaphragme inférieur et portant le cône interne. Dans cette partie mobile, une entrée 208 permet la perfusion du milieu de culture et une sortie 209 assure son évacuation. Une rondelle 207 associée à une lame-ressort ou une rondelle en silicone de rappel, permet, par son épaisseur, le réglage de la hauteur du mouvement imprimé par la partie mobile 205. Une tige ou étrier de blocage 206 limite le mouvement vertical en butant contre la rondelle 207.
Le réacteur représenté sur la figure 6 comprend une cuve 302 alvéolée » qui de façon préférentielle est en bio-verre, avec une alvéole tronc-conique qui permet d'assurer l'interface avec le cône interne 313 (partie solide de l'implant, par exemple du ligaplant) et ainsi d'obtenir une stimulation mécanique de la culture avec un effet de cisaillement qui se rapproche des conditions physiologiques auxquelles est soumis le ligament parodontal et avec un effet de dilatation-compression permettant une diffusion homogène du milieu de culture entre les parois rigides. La taille du dispositif peut étre adaptée à la surface de culture souhaitée (tronc-conique), et donc à la quantité de cellules. D'une manière préférée, l'espace compris entre le cône interne 313 et l'alvéole est de 0,2 ~ 0,1 mm.
La cuve 302 peut être insérée dans une cuve 301, de préférence en polymère et par exemple en PTFE, laquelle est munie d'un couvercle 303 qui est lui aussi de façon avantageuse en polymère. La cuve 301 possède un fond plat de façon à permettre l'utilisation éventuelle du réacteur sur une table chauffante et d'assurer ainsi une répartition homogène de la température. Le système de régulation de la température peut également être directement inclus dans la paroi de la cuve 301 du bio-réacteur. II peut, là encore, s'agir d'un circuit d'eau ou encore d'une résistance électrique ou d'un transistor à effet Peltier, etc.
Deux axes de centrage 308 sont insérés dans le couvercle 303 et le corps 301.

Dans la masse de l'alvéole 302 sont préférentiellement ménagées des entrées-sorties 309 destinées à permettre la circulation du milieu. Ces entrées-sorties, dont le nombre est dépendant de la longueur de la partie solide (e.g., radiculaire) de l'implant 313, sont disposées en lignes verticales, à 90° les unes des autres en plan et alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu. Ces entrées-sorties sont le plus souvent de deux ou trois. L'aménagement de fentes verticales peut également être réalisé de même que celui d'une alvéole en quatre quart. Des ouvertures 310 sont également ménagées dans la cuve 302 pour permettre le passage des tuyaux et embouts de connexion ou celui des filetages permettant éventuellement un verrouillage. Un joint torique inférieur 312, souple et épais, autorise l'amplitude du mouvement vertical appliqué au milieu. Ce dernier est appliqué de façon préférentielle avec une amplitude de 0,1 ~ 0,05 mm pour une période de 10 secondes.
Le dispositif comprend en outre, dans un écrou 307, un porte-implant 304 dans lequel vient s'insérer le cône interne 313 et l'axe de désinsertion 305 dudit cône. Une clavette de sécurité 306 prévue sur l'axe de désinsertion 305, permet de bloquer la rotation de l'ensemble mobile portant l'implant et qui comprend les pièces 305, 306, 307, 304 et 313. Un diaphragme 311, associé au cylindre, permet d'éviter la rotation de l'ensemble mobile.
Un tel dispositif permet d'optimiser et d'égaliser le flux de milieu nutritif grâce aux multiples entrées-sorties prévues.
L'invention peut être mise en oeuvre avec différents types d'implants, de forme, structure et composition variées et pour des applications différentes. II s'agit avantageusement d'un implant dentaire, dont la partie radiculaire est couverte de cellules au moyen d'un réacteur selon l'invention.

Claims (34)

REVENDICATIONS

1. - Réacteur pour la culture cellulaire ou tissulaire, comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture compris entre 1 et 1000 microns, de préférence entre 10 et 1000 microns, plus préférentiellement entre 50 et 800 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture.

2. - Réacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les parois délimitant l'espace de culture sont en matériau biocompatible, par exemple à base de polymère, verre, plastique, métal, bioverre, os ou corail.

3. - Réacteur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte un espace de culture délimité par deux parois en matériau biocompatible, l'une au moins d'entre elles étant composée ou à base d'un matériau favorisant la culture des cellules, de préférence en bioverre, os ou corail.

4. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'une au moins des deux parois est mobile.

5. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un implant comprenant un noyau recouvert en tout ou partie de cellules.

6. - Réacteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'une des parois est formée par le noyau de l'implant lui-même.

7. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un implant, caractérisé en ce qu'il comporte une chambre de culture délimitée par une paroi rigide en matériau biocompatible, ladite chambre ayant une forme cylindrique ou conique, et des moyens de support du noyau de l'implant, l'implant ayant une forme adaptée à celle de la chambre et les moyens de support étant disposés ou réglés pour que l'introduction du noyau d'implant forme, entre la paroi de la chambre et celle du noyau, un espace de culture réduit.

8. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chambre de culture du réacteur est délimitée par une paroi non rigide, déformable élastiquement.

9. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus comportent des moyens de déplacement de l'une au moins des parois de l'espace de culture.

10. - Réacteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que les moyens de déplacement génèrent dans l'espace de culture une force de pression, étirement, cisaillement et/ou frottement.

11. - Réacteur selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les moyens de déplacement induisent une modification de l'épaisseur de l'espace de culture, de préférence inférieure ou égale à environ 20% de l'épaisseur initiale de l'espace de culture, plus préférentiellement à environ 10%.

12. - Réacteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que la stimulation mécanique est obtenue par des moyens de déplacement du noyau de l'implant, par un mouvement de va et vient et/ou par une rotation partielle, de préférence par un mouvement de va et vient dans l'axe du noyau de l'implant.

13. - Réacteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que la stimulation mécanique est obtenue par déformation de la chambre de culture ou d'une partie de celle-ci, par exemple au moyen d'un joint déformable ou d'une paroi élastique, et en ce que le réacteur comporte de moyens de déformation de ladite chambre.

14. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture d'une épaisseur inférieure à environ 1000 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture, l'espace de culture comprenant en outre des éléments permettant d'augmenter la stimulation mécanique (éponge, fibre, bille, particule, etc.) ou ayant au moins une paroi présentant des irrégularités (rainures, bombages, etc.).

15. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de perfusion et de diffusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture.

16. - Réacteur selon la revendication 15, caractérisé en ce que la diffusion du milieu est obtenue par une expansion-contraction périodique de l'espace de culture et/ou un mouvement d'amplitude la plus régulière possible sur toutes les surfaces.

17.- Réacteur selon la revendication 16, caractérisé en ce que la fréquence de l'expansion-contraction et/ou du mouvement est comprise entre 1 et 80 cycles par minute.

18. - Réacteur selon la revendication 15, 16 ou 17, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs entrées et sorties pour l'alimentation et l'élimination du milieu, de préférence disposées en plan, à 90° les unes des autres, les sorties et entrées étant alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu.

19. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de régulation de la température du milieu de culture, de préférence un circuit d'eau ou de liquide ou de gaz, de température contrôlée, une résistance électrique, ou un transistor, par exemple un transistor à effet Peltier.

20. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la croissance, la culture, la différentiation et/ou l'adhésion de fibroblastes, cémentoblastes ou chondrocytes, ou des précurseurs de ces cellules.

21. - Réacteur (2) pour la préparation d'un implant, notamment par croissance et/ou différentiation cellulaires, éventuellement au sein d'une matrice biocompatible, comprenant une alvéole (28) pour la culture, la différentiation et/ou la croissance cellulaires, caractérisé en ce que l'alvéole (28) est délimitée par une membrane déformable élastiquement (26) et en ce que le réacteur (2) comprend des moyens de déformation de ladite membrane (26).

22.- Réacteur selon la revendication 21, caractérisé en ce que les moyens de déformation de ladite membrane (26) comportent des moyens (52) d'établissement d'une différence de pression entre les deux cotés de la membrane (26).

23.- Réacteur selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comporte un corps (10) délimitant avec la membrane (26) une chambre étanche (42), et en ce que les moyens (52) d'établissement d'une différence de pression comportent une pompe reliée à ladite chambre étanche (42).

24. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'il comporte un système de perfusion, permettant l'alimentation et le renouvellement du milieu baignant les cellules.

25.- Réacteur selon la revendication 24, caractérisé en ce que la membrane (26) est imperméable et présente un passage (36) de perfusion d'un milieu de culture.

26.- Réacteur selon l'une quelconque des revendications 21 à 25, caractérisé en ce que la membrane (26) est conformée pour maintenir entre le noyau (30) de l'implant et la membrane (26) un écart compris entre 0,001 et 5 mm.

27. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications 21 à 26, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de stimulation mécanique des cellules, lesdits moyens de simulation comportant des moyens de déplacement du noyau de l'implant par rapport à ladite alvéole (28).

28. - Réacteur (2) pour la préparation d'un implant recouvert d'une matrice composée en tout ou en partie de cellules, ledit réacteur comportant:
- une membrane (26) délimitant une alvéole (28) de réception de tout ou partie du noyau (30) de l'implant et des cellules, ladite membrane (26) étant déformable élastiquement ;
- des moyens (58) de support dudit implant avec sa matrice (30) dans l'alvéole (28);
- des moyens de déformation de ladite membrane (26); et - un système de perfusion permettant d'alimenter ou de renouveler le milieu baignant les cellules dans ladite alvéole.

29. - Utilisation d'un réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un implant dentaire par culture et/ou différentiation cellulaire sur la partie radiculaire de l'implant.

30.- Réacteur (2) pour la préparation d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur une partie radiculaire (30) de l'implant, comportant :
- une membrane (26) délimitant une alvéole (28) de réception de la partie radiculaire (30) de l'implant ;
- des moyens (58) de support dudit implant avec sa partie radiculaire (30) dans l'alvéole (28); et - des moyens de stimulation mécanique des cellules sur la partie radiculaire (30) de l'implant;
caractérisé en ce que la membrane (26) est déformable élastiquement et les moyens de stimulation mécanique comportent des moyens de déformation de ladite membrane (26).

31. - Procédé de fabrication d'un implant par croissance et/ou culture et/ou différentiation cellulaire sur un support d'adhésion solide (e.g., noyau de l'implant) au sein d'un milieu de culture, ledit procédé comportant - la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans l'alvéole ou l'espace de culture d'un bioréacteur selon l'une des revendications 1 à 28, préalablement ou concomitamment empli d'un milieu de culture; et - la sollicitation mécanique des cellules.

32.- Procédé de préparation d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur une partie radiculaire (30) de l'implant, comportant - la mise en place d'un tissu cellulaire autour de la partie radiculaire (30) d'un noyau d'implant (4) ;
- l'immersion de la partie radiculaire (30) recouverte du tissu cellulaire dans une alvéole (28) emplie d'un milieu de culture, l'alvéole (28) étant délimitée par une membrane (26) élastiquement déformable ; et - la sollicitation mécanique de la membrane (26) pour sa déformation au cours du temps.

33.- Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que la sollicitation mécanique de la membrane (26) est assurée par établissement d'une différence de pression entre les deux faces de la membrane (26).

34.- Réacteur de culture cellulaire ou tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre de culture et des moyens de régulation de la température de la chambre de culture, par exemple un circuit d'eau ou de liquide ou de gaz, de température contrôlée, la présence d'une résistance électrique, ou d'un transistor, par exemple d'un transistor à effet Peltier.