EP1366145A1 - Bioreacteur pour tissu cultive en couche mince et utilisations - Google Patents

Bioreacteur pour tissu cultive en couche mince et utilisations

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Publication number
EP1366145A1
EP1366145A1 EP02716881A EP02716881A EP1366145A1 EP 1366145 A1 EP1366145 A1 EP 1366145A1 EP 02716881 A EP02716881 A EP 02716881A EP 02716881 A EP02716881 A EP 02716881A EP 1366145 A1 EP1366145 A1 EP 1366145A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
implant
culture
reactor
cells
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02716881A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Gault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Natural Implant
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Natural Implant filed Critical Natural Implant
Publication of EP1366145A1 publication Critical patent/EP1366145A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61C—DENTISTRY; APPARATUS OR METHODS FOR ORAL OR DENTAL HYGIENE
    • A61C8/00—Means to be fixed to the jaw-bone for consolidating natural teeth or for fixing dental prostheses thereon; Dental implants; Implanting tools
    • A61C8/0003—Not used, see subgroups
    • A61C8/0004—Consolidating natural teeth
    • A61C8/0006—Periodontal tissue or bone regeneration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61C—DENTISTRY; APPARATUS OR METHODS FOR ORAL OR DENTAL HYGIENE
    • A61C8/00—Means to be fixed to the jaw-bone for consolidating natural teeth or for fixing dental prostheses thereon; Dental implants; Implanting tools
    • A61C8/0087—Means for sterile storage or manipulation of dental implants

Definitions

  • Bioreactor for tissue cultured in thin layer uses
  • the present invention relates to a cell and tissue culture reactor, optionally for the preparation of an implant, in particular by cell growth and / or differentiation, optionally in a biocompatible matrix and / or on an adhesion support.
  • the bioreactor is particularly suitable for the culture of tissue or cells in thin layer (s), and comprises means making it possible to ensure physiological stimulation of the tissues or cells and a supply in culture medium, adapted to the culture in thin layer.
  • the reactor also advantageously comprises means or a form making it possible to facilitate the introduction or the extraction of the tissue or of the solid part of an implant into the culture chamber, and for example a wall or a deformable element. elastically.
  • the reactor may also include means for regulating the temperature.
  • the reactor can be used for the cultivation of different cell types and the preparation of implants of various shapes, compositions and applications.
  • the present invention also relates to methods for preparing implants using a bio-reactor according to the invention.
  • the invention can therefore be used in particular for the preparation of dental, bone, cartilaginous implants, etc., comprising a tissue or a cellular composition, optionally associated with a biocompatible matrix and / or with a solid or semi-solid adhesion support. cells or tissues or matrix.
  • a reactor for manufacturing dental implants is known in particular from document WO 00/21456.
  • This reactor makes it possible to receive an implant core comprising a root part and a coronary part.
  • the core consists of an inert biocompatible material in a shape analogous to an extracted tooth.
  • the root part of the implant is immersed in a culture of mesenchymal cells, in a culture medium whose composition allows differentiation into cementoblasts and fibroblasts. This immersion is maintained for a time sufficient to allow adhesion of the cementoblasts on the root part, the formation of a first layer of cement and a blank of dental alveolus ligament attached to this cement.
  • the reactor is designed to allow mechanical stress on the tissue being formed around the implant. This stress reproduces the physiological constraints to which a tooth is normally subjected. Indeed, physiological stimulation is necessary to allow proliferation and differentiation in vitro of cementoblasts and fibroblasts.
  • the core of the implant is placed in a cell delimited by a rigid porous wall through which a culture medium is diffused.
  • mechanical means are arranged between the core of the implant and the reactor vessel. These means ensure a back and forth movement of the core of the implant relative to the vessel. The displacement takes place in particular along the length of the implant.
  • the excitation means comprise for example an electric actuator.
  • Such a reactor is difficult to manufacture since it must allow precise guiding in translation of the core of the implant relative to the vessel. Indeed, the space between the wall of the cell and the nucleus must be maintained within a determined range of values for satisfactory growth of the cementoblasts and fibroblasts. In addition, this reactor does not allow renewal or control of the composition of the medium surrounding the cells. On the other hand, the mechanical stimulation offered has certain limits. In addition, this reactor is described specifically for the preparation of a dental implant.
  • the object of the invention is to provide reactors which are easier to manufacture and which allow satisfactory growth and / or differentiation of the cells in the reactor chamber, preferably within a matrix (eg, extracellular matrix produced by cells or cultured tissue) and on the surface of a support (adhesion), more particularly of cell or tissue cultured in a thin layer.
  • a matrix eg, extracellular matrix produced by cells or cultured tissue
  • a support e.g., cell or tissue cultured in a thin layer.
  • This reactor is in particular to allow the control of several culture conditions to promote the proliferation and cell differentiation, extracellular matrix production, tissue organization and maturation.
  • the bioreactor is more particularly suitable for the culture of tissues or cells in a thin layer, in particular of structural tissue, for which there are numerous constraints and difficulties.
  • the first condition is a surface effect which allows cell adhesion or tissue attachment to a biocompatible wall in the reactor or to two opposite walls, separated by the culture space which is then subjected to a double effect. surface or attachment.
  • the second condition is a mechanical effect generated within the tissue to bring it closer to its natural physiological conditions.
  • the stresses can be in pressure, in stretching, in shearing, in friction or in a combination of these effects.
  • Another constraint resides in the supply of culture medium, allowing good homogeneous growth of the tissue in a thin layer, that is to say a homogeneous and controlled supply of the medium in the reduced space of the culture.
  • the present invention thus provides for the first time a biological culture reactor, suitable for the culture of tissue in a thin layer, ensuring mechanical stimulation of the cells and a suitable supply and diffusion of the nutritional medium.
  • the reactor is also provided with temperature control means and means allowing or facilitating the introduction or the extraction of the solid part of an implant (such as the adhesion support) in the culture space. without altering the cells or tissues present.
  • An object of the invention therefore resides, more precisely, in a reactor for cell or tissue culture in thin layer (s).
  • the reactor is more particularly characterized in that it comprises (i) a culture chamber delimiting, between two walls, a culture space of between 1 and 1000 microns, preferably between 10 and 1000 microns, more preferably between 50 and 800 microns, (ii) means for mechanically stimulating cells or tissues in said space and (iii), preferably, means for perfusing the culture medium within the culture space.
  • a culture chamber delimiting, between two walls, a culture space of between 1 and 1000 microns, preferably between 10 and 1000 microns, more preferably between 50 and 800 microns
  • means for mechanically stimulating cells or tissues in said space preferably, means for perfusing the culture medium within the culture space.
  • the bio-reactor according to the invention can make it possible to obtain, for a therapeutic, scientific or industrial purpose, biological tissues as such.
  • This bio-reactor also makes it possible to cultivate and develop tissues on the surface of an adhesion support or of a prosthesis which will keep on their surface or on a part of their surface the cultivated tissue, for example to improve or accelerate the tissue healing and organic repair after surgical placement of the mixed implant or said prosthesis thus produced.
  • the invention can be implemented with different types of implants, of varied shape, structure and composition and for different applications.
  • the term implant in fact designates any composition comprising cells or a reconstituted tissue, possibly associated with a solid support. It is preferably an implant comprising a solid nucleus (or component) and a cellular or biological component.
  • the implant core is also referred to herein as the "adhesion support" or heart of the implant.
  • the implant core can be made of any biocompatible material, for example metal, plastic, polymer, glass, biological material, ceramic, bone, coral, etc. Typically, it is bioverre, ceramic (for example zirconia), alloys, titanium or bone.
  • the implant according to a specific example of the invention is a dental implant, comprising a nucleus (root part) partially covered with cells by means of a reactor according to the invention.
  • a dental implant for example, can be made of any material biocompatible, for example metal (titanium for example), polymer, biological glass, ceramic, etc. It can also be other types of implants, such as for example a bone or joint implant.
  • the bioreactor according to the invention advantageously comprises a culture chamber delimiting, between two walls, a culture space suitable for the production of tissue in thin layer (s). It is advantageously a culture space with a thickness less than or equal to about 1000 microns, generally between about 10 and about 1000 microns, more preferably between 50 and 800 microns. Preferably, the culture space has at least one zone of thickness less than or equal to 900 microns, more preferably around 800 microns, preferably between 50 and 800 microns.
  • the reactor is suitable for the formation of biological tissues of controlled and low thickness, for example of structural tissues, for example of the sheet type.
  • the culture space is advantageously homogeneous within all or part of the culture chamber, so as to ensure the production of an essentially homogeneous cultured tissue.
  • the thickness of the culture space is advantageously constant in a large area of the chamber.
  • the walls delimiting the culture space can be made up or include different types of materials, rigid or not.
  • the walls delimiting the culture space are made of biocompatible material, for example polymer, glass, plastic, metal, etc. More preferably, at least one of the walls is made of a material promoting cell proliferation, or cell adhesion, or reproducing a physiological situation.
  • particularly preferred materials are biogreen, bone, coral, hydroxyapatite, titanium oxide, etc. (see also examples).
  • the reactor comprises a culture space delimited by two walls of biocompatible material, at least one of them being made up or base of a material favoring the culture of cells, preferably in bioverre, bone, coral.
  • the material promoting cell culture can be in partial or total covering of other biocompatible materials, such as ceramics, metals or polymers.
  • the two walls can be fixed or mobile, as will be described later.
  • at least one of the two walls is movable.
  • one of the walls can be formed by the core of the implant itself.
  • the reactor chamber is delimited by a wall of shape adapted to that of the implant core, the introduction of which into the chamber creates the reduced culture space.
  • the reactor chamber is delimited by a wall of conical or cylindrical shape and the core of the implant is respectively of conical or cylindrical shape.
  • the reactor further comprises means for supporting the core of the implant, arranged or adjustable so that the introduction of the core of the implant forms, with the wall of the culture chamber, a culture space. reduced as defined above.
  • the reactor culture chamber is delimited by a non-rigid wall, elastically deformable, making it possible to facilitate the introduction or the withdrawal of the implant core from the chamber, without damaging the tissue.
  • the bioreactor further comprises means for introducing or removing the nucleus from an implant in the culture chamber.
  • the invention also aims to provide a reactor making it possible to improve the conditions of introduction or extraction of the adhesion support (or core) of an implant in the culture chamber or cell, in particular without damaging the tissues adherent to the surface of the nucleus.
  • the reactor is characterized in particular by the presence of a membrane delimiting or bordering a cell (or a chamber) for culture, differentiation and / or cell growth, said membrane being elastically deformable to facilitate introduction cells or that of the adhesion support in said chamber.
  • the deformable membrane can also allow mechanical stimulation of the cells in said chamber.
  • the present invention proposes and relates to a reactor for the preparation of an implant, in particular by cell growth and / or differentiation, optionally within a biocompatible matrix, comprising a cell for the culture, the differentiation and / or cell growth, characterized in that the alveolus is delimited by an elastically deformable membrane.
  • the invention is based in part on the development of a chamber with a deformable wall, intended to receive the cells and, where appropriate, the adhesion support (or core) of an implant.
  • the use of such a cell provides multiple advantages, and in particular that of facilitating the introduction of the cells or of the support of the implant into said chamber, and / or of allowing mechanical stimulation of the cells in said chamber.
  • the reactor makes it possible, under sterile and reproducible conditions, to culture, differentiate and / or grow the cells on the surface of the implant nucleus .
  • an adhesion support solid part composed for example of bone, polymer, biocompatible material, bioverre, teflon, metal, etc.
  • the reactor makes it possible, under sterile and reproducible conditions, to culture, differentiate and / or grow the cells on the surface of the implant nucleus .
  • the cells in gel or in suspension or in exogenous biological matrix or in self-secreting matrix, both in the tank and on the nucleus of the implant or the prosthesis.
  • the cells can be identical or different in the tank and on the nucleus of the implant or prosthesis.
  • the deformability properties of the wall in particular its elastic characteristics, make it possible to exert, during culture, mechanical stimulation on the cells, and to promote their proliferation and / or differentiation.
  • the present invention therefore also relates to any bioreactor comprising a culture chamber delimited by an elastically deformable wall.
  • the tank of the bio-reactor thus comprises, in an intermediate chamber, an elastic wall deformable by depression.
  • the reactor according to the invention comprises means for mechanical deformation of the wall, in particular pneumatic or hydraulic means.
  • the reactor according to the invention advantageously comprises means for mechanical stimulation of the cells or tissues cultured.
  • the culture space can be subjected to constraints by relative movements of the two walls, the biological or micro-mechanical tissue attachment to one or to the two opposite walls producing mechanical stimulation.
  • the mechanical effect is preferably exerted in pressure, in stretching, in shearing, in friction or in a combination (s) of these effects. It is generally obtained by movement of one or both walls of the chamber, essentially producing a change in the thickness of the culture space.
  • the modification of the thickness is produced by movement of only one of the two walls, and is controlled not to exceed + or - approximately 20% of the initial thickness of the culture space, preferably + or - 10%.
  • the reactor comprises means for mechanical stimulation of the cells, for example by means of a piston, by displacement of the nucleus of the implant, if necessary, or by deformation of the culture chamber or of a part of it (for example by means of a deformable seal).
  • a displacement this can for example be exerted along the axis of the implant, by a movement back and forth, or by a slight partial rotation.
  • the stimulation is carried out by means of a deformable element (for example, flexible), introduced into the reactor (membrane of the cell, joint, etc.) and by application of pressure / depression or a crushing force.
  • elements to the culture space, such as absorbable or non-absorbable sponges, for example collagen, chitosan or collagen-chitosan sponge. , or else surface irregularities of one of the walls, for example grooves, or else fibers for example of biocompatible polymer, or balls with a diameter of 50 to 1000 microns, preferably from 50 to 500 microns, slightly less than the thickness of the culture space, and which may be made of polymer, glass, ceramic, etc., or a combination of these elements.
  • absorbable or non-absorbable sponges for example collagen, chitosan or collagen-chitosan sponge.
  • surface irregularities of one of the walls for example grooves
  • fibers for example of biocompatible polymer
  • balls with a diameter of 50 to 1000 microns, preferably from 50 to 500 microns, slightly less than the thickness of the culture space, and which may be made of polymer, glass, ceramic, etc., or a combination of these elements.
  • a preferred embodiment of the invention relates to a bioreactor as defined above comprising (i) a culture chamber delimiting, between two walls, a culture space with a thickness less than about 1000 microns, (ii) means for mechanically stimulating cells or tissues in said space and (iii), preferably, means for perfusing the culture medium within the culture space, the culture space further comprising elements making it possible to increase the mechanical stimulation (sponge, fiber, ball, particle, etc.) or having at least one wall having irregularities (grooves, bends, fibers, etc.).
  • a bioreactor as defined above, comprising (i) a culture chamber delimiting, between two walls, a culture space with a thickness less than about 1000 microns, (ii) means for mechanically stimulating cells or tissues in said space and (iii), preferably, means for perfusing the culture medium within the culture space, at least one of the two walls being made of material promoting culture cellular, preferably in bioverre or bone.
  • the invention more generally resides in a bioreactor comprising a culture chamber, said chamber being delimited by an internal wall produced by or comprising bioverre or bone.
  • the reactors of the invention also comprise means for perfusing the culture medium within the culture space.
  • Another advantageous characteristic of the bioreactors of the invention is to promote the diffusion of the nutritional medium in a culture space reduced in thickness, necessary for obtaining a surface and interface effect in the cultivated tissue. The diffusion of the medium is obtained by perfusion but its distribution is obtained by a periodic expansion-contraction of this space and / or a movement of amplitude as regular as possible on all surfaces.
  • the effect then approximates the blood pulse, and can be adjusted in amplitude and frequency for sufficient and suitable nutrition and functional stimulation, without risking destroying the tissue.
  • the frequency of stimulation in particular expansion-contraction cycles is advantageously between 1 and 80 cycles per minute.
  • the angle between the axis of movement of the rigid parts constituting the interface and the culture surface is an important element for obtaining a good adjustment.
  • the pressure variations applied in the intermediate chamber make it possible to communicate the expansion-contraction effect which will promote the diffusion of the nutritive medium and the functional stimulation, or part of this stimulation, to the cultivated tissue.
  • the culture space can vary by 10% around an average value of 50 to 1000 microns depending on the cultures.
  • the number of inputs and outputs from the culture medium can be adapted to the tissue to be cultivated and to the material of the cell.
  • the input can also come from the implant core, for example.
  • a rigid cell in addition to or as a replacement for the previous solution, multiple inputs and outputs are possible to optimize the distribution of the medium in the culture space ( Figures 5 and 6).
  • the inlets and outlets are arranged in plan, at 90 ° from one another, the outlets and inlets being alternated to obtain optimum diffusion of the medium. Channels dug on the surface in the wall of the cell can also help the diffusion of the medium.
  • the reactor therefore also comprises a perfusion system, making it possible to supply and / or renew the culture medium present in the cell.
  • the infusion rate can be adjusted by a person skilled in the art depending on the cell type and the type of culture, medium, etc.
  • the diffusion of the medium within the reduced culture space is advantageously favored by the movement of one or more walls of the culture chamber (pressure, elastic deformation, back-and-forth movement, etc.) .
  • the reactors of the invention also comprise means for regulating the temperature of the culture medium.
  • Said means are for example a water or liquid or gas circuit, of controlled temperature, the presence of an electrical resistance, or of a transistor, for example of a Peltier effect transistor.
  • the invention also relates to any cell or tissue culture reactor, characterized in that it comprises a culture chamber and means for regulating the temperature of the culture chamber. It is advantageously a reactor as defined above, comprising means of mechanical stimulation of the cells, and / or means of perfusion of the medium.
  • the reactors according to the invention can be used for the culture of different cell types and the preparation of implants of various shapes, compositions and applications.
  • it is used for the preparation of cellular products comprising cells whose growth, culture, differentiation and / or adhesion is favored by mechanical stimulation.
  • Mention may in particular be made of fibroblasts, cementoblasts, chondrocytes, etc.
  • Particular examples of cells are fibroblasts of the dermis, of the oral mucosa, of the gum, of alveolo-dental ligaments (desmodontals), of chondrocytes, or of precursors of these cells.
  • the cell populations used can be mixed populations, comprising different cell types.
  • the cells used in the invention can be autologous, allogenic or xenogenic. They can be primary cultures or established lines. They are preferably human cells or cells of human origin. They can be used in the form of a suspension, aggregates, clusters, carpets, possibly in a natural or synthetic extracellular matrix making it possible to facilitate adhesion to the nucleus of the implant.
  • the cells can be genetically modified cells, that is to say cells containing a recombinant nucleic acid enabling them to be given properties of interest.
  • the present invention also relates to the use of a bioreactor as defined above for the preparation of a tissue or a cell culture or an implant.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of an implant, cultured tissue or cell culture, by means of a reactor as defined above.
  • the composition or cell tissue (which may include several types of cells) can be placed in the bio-reactor tank before it is closed. It can also be placed in adhesion to the surface of the adhesion support of the implant or prosthesis before they are placed in the bio-reactor tank.
  • These two techniques can be used simultaneously, by placing cells in gel or in suspension or in an exogenous biological matrix or in a self-secreting matrix, both in the tank and on the adhesion support of the implant or the prosthesis. In this case, the cells can be identical or different in the tank and on the implant or prosthesis.
  • the bio-reactor is adapted to provide a relatively thin culture space around the implant. Two situations can occur depending on the shape of the implant or prosthesis.
  • the part can be placed or removed from the bio-reactor, without tearing off or scratching by friction the tissues adhering to its surface, due to a so-called "draft" shape with respect to an axis of insertion and establishment or withdrawal.
  • the surfaces intended for cultivation can for example have a conical shape.
  • the implant core or the prosthesis has a shape capable of causing friction on the cultivated surfaces, during installation in the bio-reactor or removal of the part from the bio-reactor, it is advantageous to '' use a deformable socket as described above, which can be spaced from the implant at these times.
  • the subject of the invention is a reactor as defined above, for the preparation of an implant comprising a core covered with a matrix composed in whole or in part of cells, said reactor comprising:
  • a specific example of implementation of the invention consists of a reactor for the preparation of a dental implant by cell growth on a root part of the implant, comprising:
  • the membrane is elastically deformable and the mechanical stimulation means comprise means for deformation of said membrane.
  • the invention relates to a reactor as defined above, for the preparation of an implant comprising a core covered with a matrix composed in whole or in part of cells, said reactor comprising:
  • - a flexible or rigid wall delimiting or bordering a cell (or culture chamber) intended to receive all or part of the core of the implant; - means for supporting said implant core in the socket;
  • the core support means further comprise an elastically deformable element (for example a seal), making it possible to ensure movement of the implant in the socket.
  • an elastically deformable element for example a seal
  • the cell is delimited by a rigid wall composed of or based on biogreen, bone or other biocompatible materials (polymer, glass, plastic, metal, or coral).
  • the bioreactor further comprises means for regulating its temperature.
  • the subject of the invention is a method of manufacturing an implant by growth and / or culture and / or cell differentiation on a solid adhesion support (eg, implant nucleus) within a medium. for culture, said method comprising: - bringing the nucleus of the implant into contact with cells, under conditions allowing adhesion of cells to said nucleus of the implant or to a part thereof;
  • the method comprises: - bringing the nucleus of the implant into contact with cells, under conditions allowing adhesion of cells to said nucleus of the implant or to a part thereof;
  • Another subject of the invention relates to a method for manufacturing an implant by growth and / or culture and / or cell differentiation on a solid adhesion support (eg, implant nucleus) within a culture, said process comprising:
  • the term “adhesion” designates the fact that the cells (possibly in a matrix) can be maintained in contact with the nucleus of the implant, at least partially and temporarily, the time to introduce the nucleus into the cell or the reactor of the invention.
  • This adhesion can be achieved by using surfaces naturally ensuring such adhesion or pre-treated for this purpose. It is also possible to include the cells in a gel, paste, sponge, self-secreting matrix, such as to facilitate this adhesion. It is also possible to cover the cells, after their deposition on the implant nucleus, with a film ensuring their maintenance, preferably with a porous biodegradable film.
  • a particular example of application of the invention lies in the preparation of a dental implant, by culture of cells on the root part of said implant, introduced into a deformable socket according to the invention.
  • the subject of the invention is also a method of cell culture, differentiation and / or proliferation, said method, comprising:
  • the tissue is preferably perfused, so as to renew the culture medium.
  • the perfusion is preferably provided by the presence of an opening in the lower part of the cell, ensuring the supply in fresh medium.
  • This supply can also be carried out by a pipe provided in the nucleus (or body) of the implant, or in a plunger used for mechanical stimulation, if applicable.
  • the outlet from the medium is generally provided by an opening located in the upper part of the cell.
  • the medium used for cell culture can be any medium known to a person skilled in the art, in particular any medium suitable for the culture, growth or differentiation of mammalian cells. It may in particular be DMEM, RPMI, HAF, etc. medium, optionally supplemented with antibiotics, amino acids, serum, etc.
  • the invention also relates to the use of a reactor as described above, or of a cell as described above, for the preparation of cellular compositions, in particular of implants, typically for use in the man.
  • FIG. 1 is a view in longitudinal section of a reactor according to l the invention comprising a deformable wall
  • Figure 2 is a top view of the reactor body according to the invention
  • Figure 3 is a longitudinal sectional view of the reactor body according to the invention
  • Figure 4 is a longitudinal sectional view of a transport container for a dental implant
  • FIG. 5 is a view in longitudinal section of a reactor according to the invention, perfused for the culture of chondroblasts, comprising a rigid wall, with functional stimulation
  • FIG. 6 is a view in longitudinal section of a reactor according to the invention, perfused for the culture of fibroblasts of the alveolodental ligament, with functional stimulation.
  • the reactor 2 represented in FIG. 1 is intended in particular for the manufacture of a dental implant by cell growth on a nucleus of implant 4 made of a bio-compatible material.
  • This core consists for example of ceramic, titanium, bio-glass or a composition of these materials.
  • the reactor 2 is generally of revolution of axis x-x '. It comprises a tank 6 delimiting an enclosure 8.
  • the tank 6 has a cylindrical body 10 and a cover 12 secured to the body.
  • the body and the cover are both advantageously made of PTFE. It is understood that other materials can be used for the production of the reactor.
  • the cover 12 is secured to the body 10 by three screws, not shown. The screws are engaged in passages 14 formed through the cover 12. The threaded end of the screws is received in tapped holes 16 formed in the body 10.
  • blind holes 18, visible in FIG. 2 are provided in the facing faces of the cover and of the body to receive centering pins not shown.
  • the enclosure 8 comprises an axial well 22 formed in the body 16. This well opens out at the center of the generally flat bottom 23 of a coaxial bowl 24 hollowed out in the body 10. This bowl opens onto a first plane end face 10A of the cylindrical body 10.
  • An elastic membrane 26 in the shape of a bell is disposed in the enclosure 8. This membrane delimits a generally cylindrical cell 28 for receiving the root part, denoted 30, of the implant.
  • the membrane 26 has a cylindrical section 32 closed by a bottom 34 pierced axially with a passage 36. At its end opposite the bottom, the membrane has an external flange 38 for securing the membrane 26 to the body 10. This flange came from material with the cylindrical section 32. It has on its face facing the bottom 34, a peripheral bead 40 received in a peripheral groove formed in the bottom 23 of the bowl.
  • the membrane 26 is impermeable to liquids and gases and is deformable. It is formed for example from biocompatible silicone.
  • the internal diameter of the cylindrical section 32 that is to say the diameter of the cell 28 is very slightly greater than the diameter of the root portion 30 of the implant.
  • the difference in diameters is such that when the membrane 26 is at rest and that it is not deformed, the distance between the implant core 4 received in the socket and the membrane 26 is between 0, 1 and 5 mm.
  • the annular space formed between the nucleus and the membrane corresponds to the tissue culture region.
  • annular chamber 42 of non-zero thickness is formed between the body 10 and the membrane 26.
  • the thickness of the annular chamber 42 is at least 1 mm. It is for example 3 mm.
  • An axial bore 44 extends the well 22. This bore opens onto the second flat end face, denoted 10B, of the body.
  • the bore 44 is normally closed by a pin 46 mounted tightly in this bore in order to close it sealingly.
  • One end of the pin 46 projects inside the well 22. This end has a protuberance 47 adapted to engage elastically inside a recess 48 of complementary shape formed in the thickness of the bottom 34 of the membrane .
  • the pin 46 has an internal conduit 49 opening axially at the top of the protuberance 47 opposite the passage 36 formed in the bottom 34 of the membrane.
  • the conduit 49 opens, at the other end, from the pin 46, outside the reactor.
  • the conduit 49 allows the supply of culture medium in the cell, by means of any suitable device (pump, syringe, etc.).
  • the conduit 49 may also have a bend, so as to open onto the side wall of the reactor.
  • a conduit 50 connected to the annular chamber 42 is formed through the body 10. This conduit is adapted to connect the chamber 42 to a source of variable vacuum, denoted 52.
  • This source of variable vacuum consists for example of a pump empty.
  • the duct 50 extends radially and opens into the side wall of the cylindrical body 10 where it has a connection profile to the vacuum source 52.
  • an evacuation conduit 54 is formed through the body 10 for the circulation of a culture medium in which the root part 30 of the implant is immersed. This conduit opens, at one end, into the dish 24 and, at its other end, through the cylindrical wall of the body 10. This conduit is adapted to be connected to a collector 56 of culture medium.
  • the reactor 2 comprises means 58 for supporting the core 4 of the implant in a fixed position relative to the vessel 6 and to the enclosure 8. These support means are engaged through a central orifice
  • the support means 58 comprise a support pin 62 shown alone in FIG. 3.
  • This pin 62 is generally of revolution. It comprises an shouldered axial passage 64 in which a rod, noted 66, is received, extending axially the core 4 of the implant.
  • a through threaded hole 68 is formed radially through the wall of the pin 62.
  • This hole receives a grub screw 70 for retaining the implant relative to the pin.
  • the end of the screw 70 bears against a flat portion of the rod 66, thus ensuring its axial immobilization and in rotation.
  • the rod 66 extends beyond the pin 62 at its end opposite to the implant core 4.
  • This end of the rod is linked to the axial stud 72.
  • This stud comprises, axially at one end, a housing in which the end rod 66 is received. The latter is held there by gluing.
  • the stud 72 has an external thread 76 on which a nut 78 is attached.
  • the pin 62 is received in a chamber 80 delimited by a cylindrical ferrule 82.
  • the ferrule delimits a cylindrical passage opening at its two ends and in the length of which the chamber 80 is defined.
  • the diameter of the passage is reduced by a re-entrant peripheral lip 84 forming a diaphragm.
  • This re-entrant lip defines an annular bearing surface for the pin 62.
  • the ferrule 82 has a thread adapted to receive a threaded closure plug 90 holding the pin 62 pressed against the lip 84.
  • the pad 90 is axially traversed by a bore 92 for the passage of the stud 72. It has an external thread capable of cooperating with the tapping. Beyond the thread, the pad 90 has a knurled crown 94.
  • the ferrule 82 has at its end having the lip 84 an outer collar 96 adapted to be clamped between the body 10 and the cover 12. This collar has a diameter greater than diameter of the bowl 24. Its outer peripheral edge is partially received in an annular cavity 100 formed in the first main face 10A of the body around the bowl 24. This cavity 100 has a flat bottom in which is formed an annular channel 102 receiving a O-ring seal 104.
  • the depth of the cavity 100 is less than the thickness of the collar 96 so that the collar 96 and the ferrule 82 are kept tight between the bottom of the cavity 100 and the cover 12.
  • the reactor is first assembled as illustrated in FIG. 1 while the core of the implant is not yet installed.
  • the membrane 26 is placed in the well 22, and the ferrule 82 is engaged in the orifice 60 of the cover.
  • the cover being immobilized on the body 10, the ferrule 82 is retained by the collar 96 sandwiched between the body and the cover.
  • the core 4 of the implant is secured to the support pin 62 by the screw 70 retaining the rod 66 extending the core.
  • the root part of the nucleus is incubated in the presence of a cell composition under conditions ensuring adhesion of cells to said root part.
  • the cell composition typically comprises fibroblasts of the alveolo-dental ligament and / or precursors of these fibroblasts and cementoblasts.
  • the root part of the nucleus is covered with cellular tissue. This cell tissue is previously cultivated flat and then wrapped around the root part of the implant nucleus.
  • the root part of the nucleus is covered with a matrix impregnated with cells, for example of the sponge, gel, paste, etc. type.
  • a depression is established in the annular chamber 42. This depression is created by the pump 52. Under the action of this depression, the membrane 26 is deformed in particular by radial expansion of its cylindrical section 32.
  • the cell 28 is thus dilated increasing its internal section.
  • the implant core is then introduced into the reactor 2 through the passage of the cover.
  • the root part of the core is received in the socket 28.
  • the pad 90 is engaged around the stud 72 and is screwed into the ferrule 82.
  • the screwing is carried out until the support pin 62 is clamped and immobilized axially between the lip 84 and the tampon 90.
  • the socket 28 is released by stopping the depression created in the chamber 42. It is understood that the invention is not limited to this mode of use, and that it is possible to bring the implant and the cell composition into contact directly in the cell of the reactor.
  • the cell 28 For the culture of the cellular tissue, the cell 28 is permanently perfused with a culture medium introduced through the bottom 34 of the membrane by the conduit 49. The culture medium then circulates in the cell 28 along the nucleus 4 and comes out in the upper part of the cell to open into the bowl 24. The culture liquid is discharged from the bowl 24 through the discharge conduit 54.
  • each cycle comprises a first phase tending to increase the volume of the cell 28 by establishing a depression in the sealed chamber 42 and a second phase during which the sealed chamber 42 is vented making the depression stop and tending to reduce this volume when the membrane relaxes by elasticity.
  • This cyclic vacuum is caused by the vacuum source 52 connected to the chamber 42 by the conduit 50.
  • the deformation of the membrane causes a mechanical action on the cells in culture.
  • the pulsations created by the membrane in the culture medium favor the diffusion of the latter into the cell 28.
  • the depression created by the source is periodic and its frequency can approach the natural pulse, without this reference being considered necessary for the result. For a human being, this frequency is such that 40 to 80 pulsations take place every minute. In the bioreactor, one pulse every three to ten seconds may be sufficient.
  • the periodic depressions created in chamber 42 are advantageously repeated throughout the duration of the cell culture. They cause physiological stimulation of cells, capable of promoting tissue development.
  • the chamber 42 delimited between the membrane 26 and the body 10 is compartmentalized by separation walls. Each closed compartment thus created is connected to its own vacuum source.
  • the sources of vacuum are controlled successively to ensure successive deformations of the membrane and thus create a wave propagating along the membrane 26. This wave generates a pulsatile phenomenon in the culture space formed between the membrane and the nucleus of implant.
  • the culture medium is perfused at several points distributed horizontally around the circumference of the tank.
  • the inlets and outlets of the culture medium are located on either side of the implant core at multiple points on a vertical plane but diametrically opposite with respect to the implant core.
  • the inputs and outputs are advantageously arranged along vertical lines, but at 90 ° from each other in plan and alternated to obtain optimal diffusion of the medium.
  • the inputs and outputs can be inverted periodically so that all the cells are irrigated equally.
  • the angle between the axis of movement of the rigid parts constituting the interface and the culture surface is an important element for obtaining a good adjustment.
  • the pressure variations applied in the intermediate chamber make it possible to communicate the effect of dilation-contraction which will favor the diffusion of the nutritive medium and the functional stimulation, or part of this stimulation, to the cultivated tissue.
  • the growing space can vary from
  • the number of inputs and outputs of the culture medium can also be adapted to the tissue to be cultivated and to the material of the cell.
  • an entry from the bottom of the tank and an exit from the top is the simplest method.
  • multiple inputs and outputs are possible to optimize the distribution of the medium in the culture space. Channels dug on the surface in the wall of the cell can also help the diffusion of the medium.
  • the nucleus 4 covered with the cultured cells is extracted from the reactor through the cover 12.
  • the alveolus 28 is kept dilated by a depression created in the chamber 42.
  • the implant is kept in a cylindrical container 130 illustrated in FIG. 4.
  • This container has a cylindrical cavity 132 suitable for receiving the root part of the implant covered with cells.
  • the cylindrical cavity 132 has a thread 134 allowing the threaded pad 90 to be screwed.
  • the cavity has a shoulder 136 forming a bearing surface for the support pin 62.
  • the support pin is immobilized axially by being clamped between the shoulder 136 and buffer 90.
  • the distance between the bottom of the cavity and the shoulder 136 is such that when the support pin 62 is in abutment against the shoulder 136, the root part of the implant is at all points spaced from the wall of the cavity.
  • the cavity is filled with a conservation liquid in which bathes the root part of the implant.
  • the reactor shown in FIG. 5 comprises a tank 202 which preferably is made of bio-glass with a truncated-conical concavity to provide the interface with the internal cone 203 and thus obtain mechanical stimulation of the gel culture with an effect pressure and shear-friction which approaches the physiological conditions to which the cartilages are subjected.
  • the size of the device can be adapted to the desired culture surface (frusto-conical), and therefore to the quantity of cells.
  • the internal truncated cone 203 may also preferably be made of bioverre or any other material which mimics the support bone as much as possible. The flatter the cone, the greater the pressure variations and the diffusion of the medium, and the reduced shear stresses, and vice versa.
  • the tank 202 can be inserted into a tank 201 provided with a cover 204 and having a flat bottom so as to allow the possible use of the reactor on a heating table and thus ensuring a homogeneous distribution of the temperature.
  • the temperature regulation system can also be directly included in the wall of the tank 201 of the bio-reactor. It can, for example, be a water circuit or an electrical resistance or a Peltier effect transistor, etc.
  • Two centering pins 213 are inserted in the cover 204 and the body 201.
  • an inlet 212 intended to allow the penetration of the compressed air responsible for the movement and which thus allows the mechanical stimulation.
  • a lower O-ring 210 allows the amplitude of the vertical movement applied to the middle. It is also possible to add an upper O-ring 211 to the device. which in turn facilitates the amplitude of the vertical movement applied to the pressurized air.
  • the device further comprises a cylindrical movable part 205 provided with a lower diaphragm and carrying the internal cone.
  • an inlet 208 allows the perfusion of the culture medium and an outlet 209 ensures its evacuation.
  • a washer 207 associated with a spring leaf or a return silicone washer allows, by its thickness, the adjustment of the height of the movement printed by the movable part 205.
  • a rod or blocking clamp 206 limits the vertical movement by abutting against washer 207.
  • the reactor represented in FIG. 6 comprises a vessel 302 "alveolate” which preferably is made of bio-glass, with a truncated-conical alveolus which makes it possible to provide the interface with the internal cone 313 (solid part of the implant , for example the ligaplant) and thus obtain a mechanical stimulation of the culture with a shearing effect which approximates the physiological conditions to which the periodontal ligament is subjected and with a dilation-compression effect allowing a homogeneous diffusion of the culture medium between the rigid walls.
  • the size of the device can be adapted to the desired culture surface (frusto-conical), and therefore to the quantity of cells.
  • the space between the internal cone 313 and the cell is 0.2 ⁇ 0.1 mm.
  • the tank 302 can be inserted into a tank 301, preferably made of polymer and for example of PTFE, which is provided with a cover 303 which is also advantageously made of polymer.
  • the tank 301 has a flat bottom so as to allow the possible use of the reactor on a heating table and thus ensuring a homogeneous distribution of the temperature.
  • the temperature regulation system can also be directly included in the wall of the tank 301 of the bio-reactor. Again, it may be a water circuit or an electrical resistance or a Peltier effect transistor, etc.
  • Two centering pins 308 are inserted in the cover 303 and the body 301.
  • inlets-outlets 309 intended to allow the circulation of the medium.
  • These inputs-outputs are arranged in vertical lines, 90 ° from each other in plan and alternated to obtain optimal diffusion middle. These input-output are most often two or three.
  • the development of vertical slots can also be achieved as well as that of a cell in four quarters.
  • Openings 310 are also made in the tank 302 to allow the passage of the pipes and connection fittings or that of the threads possibly allowing locking.
  • a flexible and thick lower O-ring 312 allows the amplitude of the vertical movement applied in the middle.
  • the latter is preferably applied with an amplitude of 0.1 ⁇ 0.05 mm for a period of 10 seconds.
  • the device further comprises, in a nut 307, an implant holder
  • a safety key 306 provided on the disinsertion axis 305, makes it possible to block the rotation of the mobile assembly carrying the implant and which comprises the parts 305, 306, 307, 304 and 313.
  • a diaphragm 311, associated with the cylinder prevents rotation of the mobile assembly.
  • Such a device makes it possible to optimize and equalize the flow of nutrient medium thanks to the multiple inputs-outputs provided.
  • the invention can be implemented with different types of implants, of varied shape, structure and composition and for different applications. It is advantageously a dental implant, the root part of which is covered with cells by means of a reactor according to the invention.

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Abstract

L'invention concerne un réacteur de culture cellulaire et tissulaire particulièrement adapté à la culture de cellules ou tissus de structure en couche mince, et comprend des moyens permettant d'assurer une stimulation physiologique et une alimentation en milieu de culture adaptée à l'épaisseur réduite de la culture. Le réacteur peut servir à la préparation d'un implant et comporte également des moyens permettant d'assurer une stimulation mécanique des tissus ou cellules et une alimentation en milieu de culture adaptée aux tissus de structure. Le réacteur comporte également, de manière avantageuse, des moyens ou une forme permettant de faciliter l'introduction du tissu ou de la partie solide d'un implant dans la chambre de culture, et par exemple une paroi ou un élément déformable élastiquement. Le réacteur peut en outre comporter des moyens de régulation de la température. Le réacteur est utilisable pour la culture de différents types cellulaires et la préparation d'implants de formes, compositions et applications variées.

Description

Bioréacteur pour tissu cultivé en couche mince et utilisations
La présente invention concerne un réacteur de culture cellulaire et tissulaire, éventuellement pour la préparation d'un implant, notamment par croissance et/ou différentiation cellulaire, éventuellement dans une matrice biocompatible et/ou sur un support d'adhésion.
Le bioréacteur est particulièrement adapté à la culture de tissu ou cellules en couche(s) mince(s), et comprend des moyens permettant d'assurer une stimulation physiologique des tissus ou cellules et une alimentation en milieu de culture, adaptées à la culture en couche mince. Le réacteur comporte également, de manière avantageuse, des moyens ou une forme permettant de faciliter l'introduction ou l'extraction du tissu ou de la partie solide d'un implant dans la chambre de culture, et par exemple une paroi ou un élément déformable élastiquement. Le réacteur peut en outre comporter des moyens de régulation de la température.
Le réacteur est utilisable pour la culture de différents types cellulaires et la préparation d'implants de formes, compositions et applications variées. La présente invention concerne également des procédés de préparation d'implants à l'aide d'un bio-réacteur selon l'invention. L'invention est donc utilisable notamment pour la préparation d'implants dentaires, osseux, cartilagineux, etc., comprenant un tissu ou une composition cellulaire, éventuellement associés à une matrice biocompatible et/ou à un support solide ou semi-solide d'adhésion des cellules ou tissus ou matrice.
Un réacteur pour la fabrication d'implants dentaires est connu notamment du document WO 00/21456. Ce réacteur permet de recevoir un noyau d'implant comportant une partie radiculaire et une partie coronaire. Le noyau est constitué d'un matériau inerte biocompatible selon une forme analogue à une dent extraite. La partie radiculaire de l'implant est immergée dans une culture de cellules mésenchymateuses, dans un milieu de culture dont la composition permet la différenciation en cémentoblastes et en fibroblastes. Cette immersion est maintenue un temps suffisant pour permettre l'adhésion des cémentoblastes sur la partie radiculaire, la formation d'une première couche de cément et d'une ébauche de ligament alvéolo-dentaire attaché à ce cément.
Le réacteur est conçu pour permettre une sollicitation mécanique du tissu en formation autour de l'implant. Cette sollicitation reproduit les contraintes physiologiques auxquelles une dent est normalement soumise. En effet, une stimulation physiologique est nécessaire pour permettre une prolifération et une différenciation in vitro des cémentoblastes et des fibroblastes.
Dans le réacteur décrit dans le document WO 00/21456, le noyau de l'implant est disposé dans une alvéole délimitée par une paroi poreuse rigide au travers de laquelle est diffusé un milieu de culture. Pour la sollicitation du tissu cultivé, des moyens mécaniques sont disposés entre le noyau de l'implant et la cuve du réacteur. Ces moyens assurent un déplacement en va et vient du noyau de l'implant par rapport à la cuve. Le déplacement s'effectue notamment suivant la longueur de l'implant. Les moyens d'excitation comportent par exemple un actionneur électrique.
Un tel réacteur est d'une fabrication délicate puisqu'il doit permettre un guidage en translation précis du noyau de l'implant par rapport à la cuve. En effet, l'espace entre la paroi de l'alvéole et le noyau doit être maintenu dans une plage de valeurs déterminée pour une croissance satisfaisante des cémentoblastes et des fibroblastes. En outre, ce réacteur ne permet pas le renouvellement ou le contrôle de la composition du milieu baignant les cellules. D'autre part, la stimulation mécanique offerte présente certaines limites. En outre, ce réacteur est décrit spécifiquement pour la préparation d'un implant dentaire.
L'invention a pour but de fournir des réacteurs dont la fabrication est plus aisée et qui permettent une croissance et/ou une différentiation satisfaisantes des cellules dans la chambre du réacteur, de préférence au sein d'une matrice (e.g., matrice extracellulaire produite par les cellules ou tissus cultivés) et à la surface d'un support (d'adhésion), plus particulièrement de cellule ou tissu cultivé en couche mince.
Les particularités de ce réacteur sont notamment de permettre le contrôle de plusieurs conditions de culture pour favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires, la production de matrice extracellulaire, l'organisation et la maturation tissulaire. Le bioréacteur est plus particulièrement adapté à la culture de tissus ou cellules en couche mince, notamment de tissu de structure, pour lesquels il existe de nombreuses contraintes et difficultés.
La première condition est un effet de surface qui permette une adhésion cellulaire ou un attachement tissulaire à une paroi biocompatible dans le réacteur ou à deux parois en vis-à-vis, séparées par l'espace de culture qui est alors soumis à un double effet de surface ou d'attachement. La seconde condition est un effet mécanique généré au sein du tissu pour le rapprocher de ses conditions physiologiques naturelles. Les contraintes peuvent être en pression, en étirement, en cisaillement, en frottement ou en une combinaison de ces effets.
Une autre contrainte réside dans l'alimentation en milieu de culture, permettant une bonne croissance homogène du tissu en couche mince, c'est-à-dire une alimentation homogène et contrôlée du milieu dans l'espace réduit de la culture.
Ces effets sont importants pour le développement in vivo et in vitro notamment des tissus de structure, par exemple ligament, os, cartilage, desmodonte, cément, aponévroses, insertions ligamentaires sur l'os, etc.
Ces tissus sont très sensibles à une stimulation physiologique et il existe un intérêt majeur à les cultiver avec ces modes de sollicitation.
La présente invention fournit ainsi pour la première fois un réacteur de culture biologique, adapté à la culture de tissu en couche mince, assurant une stimulation mécanique des cellules et une alimentation et une diffusion adaptées du milieu nutritionnel. Avantageusement, le réacteur est également muni de moyens de contrôle de la température et de moyens permettant ou facilitant l'introduction ou l'extraction de la partie solide d'un implant (tel que le support d'adhésion) dans l'espace de culture sans altérer les cellules ou tissus présents. Un objet de l'invention réside donc, plus précisément, dans un réacteur pour la culture cellulaire ou tissulaire en couche(s) mince(s). Le réacteur est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il comprend (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture compris entre 1 et 1000 microns, de préférence entre 10 et 1000 microns, plus préférentiellement entre 50 et 800 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture. Le bio-réacteur selon l'invention peut permettre d'obtenir dans un but thérapeutique ou scientifique ou industriel des tissus biologiques en tant que tels. Ce bio-réacteur permet également de cultiver et développer des tissus à la surface d'un support d'adhésion ou d'une prothèse qui garderont à leur surface ou sur une partie de leur surface le tissu cultivé, par exemple pour améliorer ou accélérer la cicatrisation tissulaire et la réparation organique après la mise en place chirurgicale de l'implant mixte ou de ladite prothèse ainsi produits.
L'invention peut être mise en œuvre avec différents types d'implants, de forme, structure et composition variées et pour des applications différentes. Au sens de l'invention, le terme implant désigne en effet toute composition comprenant des cellules ou un tissu reconstitué, éventuellement associé à un support solide. Il s'agit de préférence d'un implant comportant un noyau (ou une composante) solide et une composante cellulaire ou biologique. Le noyau de l'implant est également désigné dans la présente par le terme « support d'adhésion » ou cœur de l'implant. Le noyau de l'implant peut être réalisé en tout matériau biocompatible, par exemple métal, plastique, polymère, verre, matériau biologique, céramique, os, corail, etc. Typiquement, il s'agit de bioverre, céramique (par exemple zircone), d'alliages, de titane ou d'os. L'implant selon un exemple spécifique de l'invention est un implant dentaire, comportant un noyau (partie radiculaire) couvert en partie de cellules au moyen d'un réacteur selon l'invention. Un implant dentaire, par exemple, peut être réalisé en tout matériau biocompatible, par exemple métal (titane par exemple), polymère, verre biologique, céramique, etc. Il peut également s'agir d'autres types d'implants, comme par exemple d'un implant osseux ou articulaire.
Comme indiqué ci-avant, le bioréacteur selon l'invention comporte avantageusement une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture adapté à la production de tissu en couche(s) mince(s). Il s'agit avantageusement d'un espace de culture d'une épaisseur inférieure ou égale à environ 1000 microns, généralement comprise entre environ 10 et environ 1000 microns, plus préférentiellement entre 50 et 800 microns. De manière préférentielle, l'espace de culture présente au moins une zone d'épaisseur inférieure ou égale à 900 microns, plus préférentiellement à environ 800 microns, de préférence entre 50 et 800 microns. Le réacteur est adapté à la formation de tissus biologiques d'épaisseur contrôlée et faible, par exemple de tissus de structure, par exemple de type feuillets.
L'espace de culture est avantageusement homogène au sein de tout ou partie de la chambre de culture, de manière à assurer la production d'un tissu cultivé essentiellement homogène. Ainsi, l'épaisseur de l'espace de culture est avantageusement constante dans une zone importante de la chambre.
Les parois délimitant l'espace de culture peuvent être composée ou comprendre différents types de matériaux, rigides ou non. Préférentiellement, les parois délimitant l'espace de culture sont en matériau biocompatible, par exemple en polymère, verre, plastique, métal, etc. Plus préférentiellement, l'une au moins des parois est dans un matériau favorisant la prolifération cellulaire, ou l'adhésion cellulaire, ou reproduisant une situation physiologique. A cet égard, des matériaux particulièrement préférés sont le bioverre, l'os, le corail, l'hydroxyapatite, l'oxyde de titane etc. (voir également les exemples). Ainsi, dans un premier mode de réalisation, le réacteur comporte un espace de culture délimité par deux parois en matériau biocompatible, l'une au moins d'entre elles étant composée ou à base d'un matériau favorisant la culture des cellules, de préférence en bioverre, os, corail. Le matériau favorisant la culture des cellules peut être en recouvrement partiel ou total d'autres matériaux biocompatibles, tels que céramiques, métaux ou polymères.
Selon la forme du bioréacteur, les deux parois peuvent être fixes ou mobiles, comme il sera décrit plus loin. De manière préférée, l'une au moins des deux parois est mobile. En outre, l'une des parois peut être formée par le noyau de l'implant lui-même. Dans ce cas, la chambre du réacteur est délimitée par une paroi de forme adaptée à celle du noyau de l'implant, dont l'introduction dans la chambre crée l'espace réduit de culture. Dans des modes particuliers de réalisation, la chambre du réacteur est délimitée par une paroi de forme conique ou cylindrique et le noyau de l'implant est respectivement de forme conique ou de forme cylindrique. Dans ce cas, le réacteur comporte en outre des moyens de support du noyau de l'implant, disposés ou réglables de sorte que l'introduction du noyau de l'implant forme, avec la paroi de la chambre de culture, un espace de culture réduit comme défini ci-avant.
Selon une variante de réalisation particulière, la chambre de culture du réacteur est délimitée par une paroi non rigide, déformable élastiquement, permettant de faciliter l'introduction ou le retrait du noyau de l'implant de la chambre, sans altérer le tissu. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le bioréacteur comporte en outre des moyens d'introduction ou de retrait du noyau d'un implant dans la chambre de culture. L'invention a également pour but de fournir un réacteur permettant d'améliorer les conditions d'introduction ou d'extraction du support d'adhésion (ou noyau) d'un implant dans la chambre ou alvéole de culture, notamment sans endommager les tissus adhérents à la surface du noyau. Selon un mode particulier, le réacteur est caractérisé notamment par la présence d'une membrane délimitant ou bordant une alvéole (ou une chambre) pour la culture, la différentiation et/ou la croissance cellulaire, ladite membrane étant déformable élastiquement pour faciliter l'introduction des cellules ou celle du support d'adhésion dans ladite chambre. Comme il sera décrit dans la suite du texte, la membrane déformable peut également permettre une stimulation mécanique des cellules dans ladite chambre.
A cet effet, la présente invention propose et a pour objet un réacteur pour la préparation d'un implant, notamment par croissance et/ou différentiation cellulaire, éventuellement au sein d'une matrice biocompatible, comprenant une alvéole pour la culture, la différentiation et/ou la croissance cellulaires, caractérisé en ce que l'alvéole est délimitée par une membrane déformable élastiquement. Ainsi, l'invention repose en partie sur la mise au point d'une chambre à paroi déformable, destinée à recevoir les cellules et, le cas échéant, le support d'adhésion (ou noyau) d'un implant. L'utilisation d'une telle alvéole procure de multiples avantages, et notamment celui de faciliter l'introduction des cellules ou du support de l'implant dans ladite chambre, et/ou de permettre une stimulation mécanique des cellules dans ladite chambre.
Ainsi, pour la préparation par exemple d'un implant comprenant des cellules associées à un support d'adhésion (partie solide composée par exemple d'os, de polymère, de matériau biocompatible, de bioverre, de teflon, de métal, etc., également désignée noyau de l'implant), et comprenant éventuellement une matrice extracellulaire, le réacteur permet de réaliser, dans des conditions stériles et reproductibles, la culture, la différentiation et/ou la croissance des cellules à la surface du noyau de l'implant. En effet, en opérant une déformation de la paroi de l'alvéole, il est possible d'introduire le noyau de l'implant dans celle-ci sans risque de frottements importants entre le noyau et la paroi, et donc sans endommager les cellules disposées à la surface du noyau. Dans ce mode de réalisation, il est également possible de placer les cellules en gel ou en suspension ou en matrice biologique exogène ou en matrice auto-sécrétée, à la fois dans la cuve et sur le noyau l'implant ou la prothèse. Dans ce cas, les cellules peuvent être identiques ou bien différentes dans la cuve et sur le noyau de l'implant ou de la prothèse. De plus, les propriétés de déformabilité de la paroi, notamment ses caractéristiques élastiques, permettent d'exercer, au cours de la culture, une stimulation mécanique sur les cellules, et d'en favoriser la prolifération et/ou la différentiation. La présente invention a donc également pour objet tout bioréacteur comportant une chambre de culture délimitée par une paroi déformable élastiquement. La cuve du bio-réacteur comporte ainsi, dans une chambre intermédiaire, une paroi élastique déformable par dépression. Dans un mode de réalisation préféré, le réacteur selon l'invention comporte des moyens de déformation mécanique de la paroi, notamment des moyens pneumatiques ou hydrauliques.
Comme indiqué ci-avant, le réacteur selon l'invention comprend avantageusement des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus cultivés. Pour cela, l'espace de culture peut être soumis à des contraintes par mouvements relatifs des deux parois, l'attachement tissulaire biologique ou micro-mécanique à l'une ou aux deux parois en vis-à-vis produisant la stimulation mécanique.
L'effet mécanique est préférentiellement exercé en pression, en étirement, en cisaillement, en frottement ou en une combinaison(s) de ces effets. Il est généralement obtenu par mouvement de l'une ou des deux parois de la chambre, produisant essentiellement une modification de l'épaisseur de l'espace de culture. Avantageusement, la modification de l'épaisseur est produite par mouvement d'une seule des deux parois, et est contrôlée pour ne pas excéder + ou - 20% environ de l'épaisseur initiale de l'espace de culture, de préférence + ou - 10%.
Il peut être obtenu au moyen de parois déformables, de joints souples
(notamment de joints toriques) introduits dans la structure de la chambre de culture ou entre celle-ci et des moyens de support des parois, par une stimulation mécanique (pression, rotation, écrasement, etc.) etc., comme décrit ci-après et dans les exemples. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le réacteur comporte des moyens de stimulation mécanique des cellules, par exemple au moyen d'un piston, par déplacement du noyau de l'implant, le cas échéant, ou par déformation de la chambre de culture ou d'une partie de celle-ci (par exemple au moyen d'un joint déformable). Dans le cas d'un déplacement, celui-ci peut être par exemple exercé suivant l'axe de l'implant, par un mouvement de va et vient, ou par une légère rotation partielle. De manière avantageuse, la stimulation est réalisée au moyen d'un élément déformable (par exemple, souple), introduit dans le réacteur (membrane de l'alvéole, joint, etc.) et par application d'une pression/dépression ou d'une force d'écrasement.
Par ailleurs, pour augmenter la transmission des contraintes au sein du tissu cultivé, il est possible d'ajouter dans l'espace de culture des éléments tels que des éponges résorbables ou non, par exemple éponge de collagène, de chitosan ou de collagène-chitosan, ou bien des irrégularités de surface de l'une des parois, par exemple des rainures, ou bien des fibres par exemple en polymère biocompatible, ou des billes d'un diamètre de 50 à 1000 microns, de préférence de 50 à 500 microns, un peu inférieur à l'épaisseur de l'espace de culture, et qui peuvent être en polymère, en verre, en céramique, etc., ou bien une combinaison de ces éléments.
Un mode de réalisation préféré de l'invention concerne un bioréacteur tel que défini ci-avant comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture d'une épaisseur inférieure à environ 1000 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture, l'espace de culture comprenant en outre des éléments permettant d'augmenter la stimulation mécanique (éponge, fibre, bille, particule, etc.) ou ayant au moins une paroi présentant des irrégularités (rainures, bombages, fibres, etc.). Un autre objet particulier de l'invention réside dans un bioréacteur tel que défini ci-avant, comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture d'une épaisseur inférieure à environ 1000 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture, l'une au moins des deux parois étant en matériau favorisant la culture cellulaire, préférentiellement en bioverre ou en os. L'invention réside, plus généralement, dans un bioréacteur comprenant une chambre de culture, ladite chambre étant délimitée par une paroi interne réalisée en ou comprenant du bioverre ou de l'os.
Selon un mode de réalisation préféré, les réacteurs de l'invention comportent en outre des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture. Une autre caractéristique avantageuse des bioréacteurs de l'invention est de favoriser la diffusion du milieu nutritionnel dans un espace de culture réduit en épaisseur, nécessaire pour obtenir un effet de surface et d'interface dans le tissu cultivé. La diffusion du milieu est obtenue par perfusion mais sa répartition est obtenue par une expansion- contraction périodique de cet espace et/ou un mouvement d'amplitude la plus régulière possible sur toutes les surfaces.
L'effet se rapproche alors du pouls sanguin, et peut être réglé en amplitude et en fréquence pour une nutrition et une stimulation fonctionnelle suffisantes et adaptées, sans risquer de détruire le tissu. La fréquence de la stimulation (notamment des cycles expansion-contraction est avantageusement comprise entre 1 et 80 cycles par minute.
L'angle entre l'axe du mouvement des pièces rigides constituant l'interface et la surface de culture est un élément important pour obtenir un bon réglage. Pour une alvéole élastique, les variations de pression appliquée dans la chambre intermédiaire permettent de communiquer l'effet de dilatation-contraction qui va favoriser la diffusion du milieu nutritif et la stimulation fonctionnelle, ou une partie de cette stimulation, au tissu cultivé. Par exemple, l'espace de culture peut varier de 10% autour d'une valeur moyenne de 50 à 1000 microns selon les cultures.
Le nombre d'entrées et de sorties du milieu de culture peut être adapté au tissu à cultiver et à la matière de l'alvéole. Pour une alvéole élastique, une entrée par le fond de la cuve et une sortie à la partie supérieure est la modalité la plus simple. L'entrée peut également provenir du noyau de l'implant, par exemple. Pour une alvéole rigide, en plus de ou en remplacement de la solution précédente, des entrées et sorties multiples sont possibles pour optimiser la répartition du milieu dans l'espace de culture (Figures n° 5 et 6). Avantageusement, les entrées et sorties sont disposées en plan, à 90° les unes des autres, les sorties et entrées étant alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu. Des canaux creusés en surface dans la paroi de l'alvéole peuvent aussi aider à la diffusion du milieu. Dans un mode de réalisation préféré, le réacteur comporte donc en outre un système de perfusion, permettant d'alimenter et/ou de renouveler le milieu de culture présent dans l'alvéole. Le débit de perfusion peut être réglé par l'homme du métier en fonction du type cellulaire et du type de culture, milieu, etc. Comme indiqué, la diffusion du milieu au sein de l'espace réduit de culture est avantageusement favorisée par le mouvement d'une ou des parois de la chambre de culture (pression, déformation élastique, mouvement de va-et-vient, etc.).
Selon un mode particulier, les réacteurs de l'invention comprennent en outre des moyens de régulation de la température du milieu de culture.
Lesdits moyens sont par exemple un circuit d'eau ou de liquide ou de gaz, de température contrôlée, la présence d'une résistance électrique, ou d'un transistor, par exemple d'un transistor à effet Peltier.
A cet égard, selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne également tout réacteur de culture cellulaire ou tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre de culture et des moyens de régulation de la température de la chambre de culture. Il s'agit avantageusement d'un réacteur tel que défini ci-avant, comprenant des moyens de stimulation mécanique des cellules, et/ou des moyens de perfusion du milieu.
Les réacteurs selon l'invention sont utilisables pour la culture de différents types cellulaires et la préparation d'implants de formes, compositions et applications variées. Préférentiellement, il est utilisé pour la préparation de produits cellulaires comprenant des cellules dont la croissance, la culture, la différentiation et/ou l'adhésion est favorisée par une stimulation mécanique. On peut citer notamment les fibroblastes, cémentoblastes, chondrocytes, etc. Des exemples particuliers de cellules sont des fibroblastes du derme, de la muqueuse buccale, de la gencive, de ligaments alvéolo-dentaires (desmodontaux), des chondrocytes, ou des précurseurs de ces cellules. En outre, les populations cellulaires utilisées peuvent être des populations mixtes, comprenant différents types cellulaires. Les cellules utilisées dans l'invention peuvent être autologues, allogéniques ou xénogéniques. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. Il s'agit préférentiellement de cellules humaines ou d'origine humaine. Elle peuvent être utilisées sous forme de suspension, agrégats, amas, tapis, éventuellement dans une matrice extracellulaire naturelle ou synthétique permettant de faciliter l'adhésion sur le noyau de l'implant. En outre, les cellules peuvent être des cellules modifiées génétiquement, c'est-à-dire contenant un acide nucléique recombinant permettant de leur conférer des propriétés d'intérêt.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un bioréacteur tel que défini ci-avant pour la préparation d'un tissu ou d'une culture cellulaire ou d'un implant. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un implant, tissu cultivé ou culture cellulaire, au moyen d'un réacteur tel que défini ci-avant. La composition ou le tissu cellulaire (qui peut comprendre plusieurs types de cellules) peut être placée dans la cuve du bio-réacteur avant qu'elle soit refermée. Elle peut encore être placée en adhésion à la surface du support d'adhésion de l'implant ou de la prothèse avant que ceux-ci ne soient placés dans la cuve du bio-réacteur. Ces deux techniques peuvent être utilisées simultanément, en plaçant des cellules en gel ou en suspension ou en matrice biologique exogène ou en matrice auto-sécrétée, à la fois dans la cuve et sur le support d'adhésion de l'implant ou la prothèse. Dans ce cas, les cellules peuvent être identiques ou bien différentes dans la cuve et sur l'implant ou la prothèse.
Le bio-réacteur est adapté pour ménager un espace de culture d'épaisseur relativement faible autour de l'implant. Deux situations peuvent se produire selon la forme de l'implant ou de la prothèse.
- La pièce peut être placée ou retirée du bio-réacteur, sans arracher ou gratter par frottement les tissus adhérents à sa surface, du fait d'une forme dite « de dépouille » par rapport à un axe d'insertion et de mise en place ou de retrait. Les surfaces destinées à la culture peuvent par exemple avoir une forme conique.
- Si le noyau d'implant ou la prothèse présente une forme susceptible d'engendrer des frottements sur les surfaces cultivées, lors de la mise en place dans le bio-réacteur ou du retrait de la pièce du bio-réacteur, il est avantageux d'utiliser une alvéole déformable telle que décrite ci-avant, qui peut s'espacer de l'implant à ces moments-là.
Dans un mode particulier, l'invention a pour objet un réacteur tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un implant comprenant un noyau recouvert d'une matrice composée en tout ou en partie de cellules, ledit réacteur comportant :
- une membrane délimitant ou bordant une alvéole (ou chambre de culture) destinée à recevoir tout ou partie du noyau de l'implant ;
- des moyens de support dudit noyau d'implant dans l'alvéole ; et
- des moyens de stimulation mécanique des cellules autour de l'implant ; caractérisé en ce que la membrane est déformable élastiquement et en ce que les moyens de stimulation mécanique comportent des moyens de déformation répétée de ladite membrane. Un exemple spécifique de mise en œuvre de l'invention est constitué d'un réacteur pour la préparation d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur une partie radiculaire de l'implant, comportant :
- une membrane délimitant une alvéole de réception de la partie radiculaire de l'implant ;
- des moyens de support dudit implant avec sa partie radiculaire dans l'alvéole; et
- des moyens de stimulation mécanique des cellules sur la partie radiculaire de l'implant ; caractérisé en ce que la membrane est déformable élastiquement et les moyens de stimulation mécanique comportent des moyens de déformation de ladite membrane.
Dans un autre mode particulier, l'invention a pour objet un réacteur tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un implant comprenant un noyau recouvert d'une matrice composée en tout ou en partie de cellules, ledit réacteur comportant :
- une paroi souple ou rigide délimitant ou bordant une alvéole (ou chambre de culture) destiné à recevoir tout ou partie du noyau de l'implant ; - des moyens de support dudit noyau d'implant dans l'alvéole ;
- des moyens de stimulation mécanique des cellules autour de l'implant ; et
- des moyens de perfusion du milieu de culture dans l'alvéole.
Dans un mode particulier, les moyens de support du noyau comportent en outre un élément déformable élastiquement (par exemple un joint), permettant d'assurer un mouvement à l'implant dans l'alvéole.
Dans un autre mode particulier, l'alvéole est délimitée par une paroi rigide composée ou à base de bioverre, d'os ou d'autres matériaux biocompatibles (polymère, verre, plastique, métal, ou corail). Dans un autre mode particulier, le bioréacteur comporte en outre des moyens de régulation de sa température. En outre, l'invention a pour objet un procédé de fabrication d'un implant par croissance et/ou culture et/ou différentiation cellulaire sur un support d'adhésion solide (e.g., noyau de l'implant) au sein d'un milieu de culture, ledit procédé comportant : - la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans l'alvéole ou l'espace de culture d'un bioréacteur tel que défini ci-avant, préalablement ou concomitamment empli d'un milieu de culture; et
- la sollicitation mécanique des cellules.
Selon un mode particulier, le procédé comprend : - la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans une alvéole emplie d'un milieu de culture, l'alvéole étant délimitée ou bordée par une membrane élastiquement déformable ; et
- la sollicitation mécanique de la membrane pour sa déformation au cours du temps.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de fabrication d'un implant par croissance et/ou culture et/ou différentiation cellulaire sur un support d'adhésion solide (e.g., noyau de l'implant) au sein d'un milieu de culture, ledit procédé comportant :
- la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans une alvéole emplie d'un milieu de culture, l'alvéole étant délimitée par une membrane élastiquement déformable et l'alvéole étant préalablement déformée par expansion radiale ;
- l'arrêt de la déformation de l'alvéole ; et
- le maintien du noyau de l'implant dans l'alvéole pendant une période suffisante pour permettre la croissance et/ou la culture et/ou la différentiation cellulaire sur ledit noyau de l'implant.
Au sens de l'invention, le terme « adhésion » désigne le fait que les cellules (éventuellement dans une matrice) peuvent être maintenues au contact du noyau de l'implant, au moins partiellement et temporairement, le temps d'introduire le noyau dans l'alvéole ou le réacteur de l'invention. Cette adhésion peut être réalisée en utilisant des surfaces assurant naturellement une telle adhésion ou pré-traitée dans ce but. Il est également possible d'inclure les cellules dans un gel, pâte, éponge, matrice auto-sécrétée, de nature à faciliter cette adhésion. Il est également possible de recouvrir les cellules, après leur dépôt sur le noyau de l'implant, d'un film assurant leur maintien, de préférence d'un film poreux biodégradable.
Comme indiqué ci-avant, un exemple particulier d'application de l'invention réside dans la préparation d'un implant dentaire, par culture de cellules sur la partie radiculaire dudit implant, introduite dans une alvéole déformable selon l'invention.
L'invention a également pour objet un procédé de culture, différentiation et/ou prolifération cellulaire, ledit procédé, comportant :
- l'introduction d'une composition cellulaire dans une alvéole emplie d'un milieu de culture, l'alvéole étant délimitée par une membrane élastiquement déformable ; et
- la sollicitation mécanique de la membrane pour sa déformation au cours du temps.
Comme indiqué avant, dans le procédé de l'invention, le tissu est préférentiellement perfusé, de manière à renouveler le milieu de culture. La perfusion est préférentiellement assurée par la présence d'une ouverture dans la partie inférieure de l'alvéole, assurant l'alimentation en milieu frais.
Cette alimentation peut également être effectuée par une conduite ménagée dans le noyau (ou corps) de l'implant, ou dans un piston utilisé pour la stimulation mécanique, le cas échéant. La sortie du milieu est généralement assurée par une ouverture située dans la partie supérieure de l'alvéole.
Le milieu utilisé pour la culture cellulaire peut être tout milieu connu de l'homme du métier, notamment tout milieu adapté à la culture, croissance ou différentiation de cellules de mammifères. Il peut s'agir en particulier de milieu DMEM, RPMI, HAF, etc., éventuellement supplémentés d'antibiotiques, acides aminés, sérum, etc.
L'invention concerne également l'utilisation d'un réacteur tel que décrit ci-avant, ou d'une alvéole tel que décrite ci-avant, pour la préparation de compositions cellulaires, notamment d'implants, typiquement pour une utilisation chez l'homme.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs, ainsi que dessins sur lesquels : la figure 1 est une vue en coupe longitudinale d'un réacteur selon l'invention comprenant une paroi déformable ; la figure 2 est une vue de dessus du corps du réacteur selon l'invention ; la figure 3 est une vue en coupe longitudinale du corps du réacteur selon l'invention ; la figure 4 est une vue en coupe longitudinale d'un conteneur de transport d'un implant dentaire ; la figure 5 est une vue en coupe longitudinale d'un réacteur selon l'invention, perfusé pour la culture de chondroblastes, comportant une paroi rigide, avec stimulation fonctionnelle ; et la figure 6 est une vue en coupe longitudinale d'un réacteur selon l'invention, perfusé pour la culture de fibroblastes du ligament alvéolo- dentaire, avec stimulation fonctionnelle.
Le réacteur 2 représenté sur la figure 1 est destiné notamment à la fabrication d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur un noyau d'implant 4 réalisé dans un matériau bio-compatible. Ce noyau est constitué par exemple de céramique, de titane, de bio-verre ou d'une composition de ces matériaux.
Le réacteur 2 est généralement de révolution d'axe x-x'. Il comporte une cuve 6 délimitant une enceinte 8. La cuve 6 comporte un corps cylindrique 10 et un couvercle 12 solidarisé au corps. Le corps et le couvercle sont tous les deux réalisés avantageusement en PTFE. Il est entendu que d'autres matériaux peuvent être utilisés pour la réalisation du réacteur. Le couvercle 12 est solidarisé au corps 10 par trois vis non représentées. Les vis sont engagées dans des passages 14 ménagés au travers du couvercle 12. L'extrémité filetée des vis est reçue dans des trous taraudés 16 ménagés dans le corps 10. En outre, des trous borgnes 18, visibles sur la figure 2 sont ménagés dans les faces en regard du couvercle et du corps pour recevoir des pions de centrage non représentés.
L'enceinte 8 comporte un puits axial 22 ménagé dans le corps 16. Ce puits débouche au centre du fond généralement plat 23 d'une cuvette coaxiale 24 creusée dans le corps 10. Cette cuvette s'ouvre sur une première face d'extrémité plane 10A du corps cylindrique 10. Une membrane élastique 26 en forme de cloche est disposée dans l'enceinte 8. Cette membrane délimite une alvéole généralement cylindrique 28 de réception de la partie radiculaire, notée 30, de l'implant. La membrane 26 présente un tronçon cylindrique 32 obturé par un fond 34 percé axialement d'un passage 36. A son extrémité opposée au fond, la membrane présente une collerette extérieur 38 de solidarisation de la membrane 26 au corps 10. Cette collerette est venue de matière avec le tronçon cylindrique 32. Elle présente sur sa face tournée vers le fond 34, un bourrelet périphérique 40 reçu dans une gorge périphérique ménagée dans le fond 23 de la cuvette. La membrane 26 est imperméable aux liquides et aux gaz et est déformable. Elle est formée par exemple en silicone biocompatible.
Le diamètre intérieur du tronçon cylindrique 32, c'est-à-dire le diamètre de l'alvéole 28 est très légèrement supérieur au diamètre de la partie radiculaire 30 de l'implant. En particulier, la différence de diamètres est telle que lorsque la membrane 26 est au repos et qu'elle n'est pas déformée, la distance entre le noyau d'implant 4 reçu dans l'alvéole et la membrane 26 est compris entre 0,1 et 5 mm. L'espace annulaire formé entre le noyau et la membrane correspond à la région de culture tissulaire.
Par ailleurs, les diamètres extérieur et intérieur respectivement du tronçon cylindrique 32 et du puits 22 sont tels qu'une chambre annulaire 42 d'épaisseur non nulle est formée entre le corps 10 et la membrane 26. L'épaisseur de la chambre annulaire 42 est d'au moins 1 mm. Elle est par exemple de 3 mm.
Un alésage axial 44 prolonge le puits 22. Cet alésage débouche sur la seconde face plane d'extrémité, notée 10B, du corps. L'alésage 44 est normalement obturé par un pion 46 monté serré dans cet alésage afin de l'obturer de manière étanche. Une extrémité du pion 46 fait saillie à l'intérieur du puits 22. Cette extrémité comporte une protubérance 47 adaptée pour s'enclencher élastiquement à l'intérieur d'un évidement 48 de forme complémentaire ménagé dans l'épaisseur du fond 34 de la membrane. En outre, le pion 46 comporte un conduit interne 49 débouchant axialement au sommet de la protubérance 47 en regard du passage 36 ménagé dans le fond 34 de la membrane. Le conduit 49 débouche, à l'autre extrémité, du pion 46, à l'extérieur du réacteur. Ainsi, le conduit 49 permet l'alimentation en milieu de culture dans l'alvéole, au moyen de tout dispositif adapté (pompe, seringue, etc.). Le conduit 49 peut également présenter un coude, de manière à déboucher sur la paroi latérale du réacteur.
Un conduit 50 connecté à la chambre annulaire 42 est ménagé au travers du corps 10. Ce conduit est adapté pour relier la chambre 42 à une source de dépression variable, notée 52. Cette source de dépression variable est par exemple constituée d'une pompe à vide.
Le conduit 50 s'étend radialement et débouche dans la paroi latérale du corps cylindrique 10 où il présente un profil de connexion à la source de dépression 52. En outre, un conduit d'évacuation 54, visible sur les figures 2 et 3, est ménagé au travers du corps 10 pour la circulation d'un milieu de culture dans lequel baigne la partie radiculaire 30 de l'implant. Ce conduit débouche, à une première extrémité, dans la cuvette 24 et, à son autre extrémité, au travers de la paroi cylindrique du corps 10. Ce conduit est adapté pour être relié à un collecteur 56 de milieu de culture.
Par ailleurs, le réacteur 2 comporte des moyens 58 de support du noyau 4 de l'implant dans une position fixe par rapport à la cuve 6 et à l'enceinte 8. Ces moyens de support sont engagés au travers d'un orifice central
60 traversant le couvercle 12.
Les moyens de support 58 comportent un pion de support 62 représenté seul sur la figure 3. Ce pion 62 est généralement de révolution. Il comporte un passage axial épaulé 64 dans lequel est reçue une tige, notée 66, prolongeant axialement le noyau 4 de l'implant.
Un trou taraudé traversant 68 est ménagé radialement au travers de la paroi du pion 62. Ce trou reçoit une vis sans tête 70 de retenue de l'implant par rapport au pion. L'extrémité de la vis 70 s'appuie contre un méplat de la tige 66, assurant ainsi son immobilisation axiale et en rotation. La tige 66 se prolonge au-delà du pion 62 à son extrémité opposée au noyau d'implant 4. Cette extrémité de la tige est liée au goujon axial 72. Ce goujon comporte, axialement à une extrémité, un logement dans lequel l'extrémité de la tige 66 est reçue. Cette dernière y est maintenue par collage. A son autre extrémité, le goujon 72 comporte un filetage extérieur 76 sur lequel est rapporté un écrou 78.
Le pion 62 est reçu dans une chambre 80 délimitée par une virole cylindrique 82. La virole délimite un passage cylindrique débouchant à ses deux extrémités et dans la longueur duquel la chambre 80 est définie.
A une première extrémité, le diamètre du passage est réduit par une lèvre rentrante périphérique 84 formant un diaphragme. Cette lèvre rentrante définit une surface annulaire d'appui pour le pion 62.
A l'autre extrémité du passage, la virole 82 présente un taraudage adapté pour recevoir un tampon d'obturation fileté 90 maintenant le pion 62 plaqué contre la lèvre 84. Le tampon 90 est traversé axialement d'un alésage 92 pour le passage du goujon 72. Il comporte un filetage extérieur apte à coopérer avec le taraudage. Au-delà du filetage, le tampon 90 présente une couronne moletée 94. La virole 82 présente à son extrémité présentant la lèvre 84 une collerette extérieure 96 adaptée pour être enserrée entre le corps 10 et le couvercle 12. Cette collerette a un diamètre supérieur au diamètre de la cuvette 24. Son bord périphérique extérieur est reçu partiellement dans une empreinte annulaire 100 ménagée dans la première face principale 10A du corps autour de la cuvette 24. Cette empreinte 100 présente un fond plat dans lequel est ménagé un canal annulaire 102 recevant un joint torique d'étanchéité 104.
La profondeur de l'empreinte 100 est inférieure à l'épaisseur de la collerette 96 afin que la collerette 96 et la virole 82 soient maintenues serrées entre le fond de l'empreinte 100 et le couvercle 12.
Pour la fabrication d'un implant, par exemple dentaire, le réacteur est d'abord assemblé comme illustré sur la figure 1 alors que le noyau de l'implant n'est pas encore installé.
En particulier, la membrane 26 est mise en place dans le puits 22, et la virole 82 est engagée dans l'orifice 60 du couvercle. Le couvercle étant immobilisé sur le corps 10, la virole 82 est retenue par la collerette 96 enserrée entre le corps et le couvercle.
Par ailleurs, le noyau 4 de l'implant est solidarisé au pion de support 62 par la vis 70 retenant la tige 66 prolongeant le noyau. Après fixation du noyau au pion de support, la partie radiculaire du noyau est incubée en présence d'une composition cellulaire dans des conditions assurant l'adhésion de cellules sur ladite partie radiculaire. Pour la préparation d'un implant dentaire, la composition cellulaire comprend typiquement des fibroblastes du ligament alvéolo-dentaire et/ou des précurseurs de ces fibroblastes et des cémentoblastes. Dans un mode particulier, la partie radiculaire du noyau est recouverte d'un tissu cellulaire. Ce tissu cellulaire est préalablement cultivé à plat puis est enroulé autour de la partie radiculaire du noyau d'implant. Dans un autre mode de réalisation, la partie radiculaire du noyau est recouverte d'une matrice imprégnée de cellules, par exemple de type éponge, gel, pâte, etc.
Afin de permettre la mise en place du noyau 4 ainsi recouvert dans le réacteur, sans risque d'endommager le tissu cellulaire, une dépression est établie dans la chambre annulaire 42. Cette dépression est créée par la pompe 52. Sous l'action de cette dépression, la membrane 26 se déforme notamment par expansion radiale de son tronçon cylindrique 32.
L'alvéole 28 se trouve ainsi dilatée augmentant sa section intérieure. Le noyau de l'implant est alors introduit dans le réacteur 2 au travers du passage du couvercle. La partie radiculaire du noyau est reçue dans l'alvéole 28. Pour maintenir le noyau d'implant en place, le tampon 90 est engagé autour du goujon 72 et est vissé dans la virole 82. Le vissage est effectué jusqu'à ce que le pion de support 62 soit serré et immobilisé axialement entre la lèvre 84 et le tampon 90. Après mise en place initiale du noyau d'implant, l'alvéole 28 est relâchée par arrêt de la dépression créée dans la chambre 42. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée à ce mode d'utilisation, et qu'il est possible de mettre en contact l'implant et la composition cellulaire directement dans l'alvéole du réacteur. Pour la culture du tissu cellulaire, l'alvéole 28 est en permanence perfusée d'un milieu de culture introduit au travers du fond 34 de la membrane par le conduit 49. Le milieu de culture circule alors dans l'alvéole 28 le long du noyau 4 et ressort dans la partie supérieure de l'alvéole pour déboucher dans la cuvette 24. Le liquide de culture est évacué de la cuvette 24 par le conduit d'évacuation 54.
Pendant la phase de culture ou croissance cellulaire, la membrane 26 subit des cycles répétés de déformations élastiques. Chaque cycle comporte une première phase tendant à augmenter le volume de l'alvéole 28 par établissement d'une dépression dans la chambre étanche 42 et une seconde phase au cours de laquelle la chambre étanche 42 est mise à l'air faisant cesser la dépression et tendant à réduire ce volume lors du relâchement de la membrane par élasticité. Cette dépression cyclique est provoquée par la source de dépression 52 connectée à la chambre 42 par le conduit 50.
La déformation de la membrane provoque une action mécanique sur les cellules en culture. De plus, les pulsations créées par la membrane dans le milieu de culture favorisent la diffusion de celui-ci dans l'alvéole 28.
La dépression créée par la source est périodique et sa fréquence peut se rapprocher du pouls naturel, sans que cette référence puisse être considérée comme nécessaire pour le résultat. Pour un être humain, cette fréquence est telle que 40 à 80 pulsations ont lieu chaque minute. Dans le bioréacteur, une pulsation toute les trois à dix secondes peut être suffisante. Les dépressions périodiques créées dans la chambre 42 sont avantageusement répétées tout au long de la durée de la culture cellulaire. Elles provoquent une stimulation physiologique des cellules, propre à favoriser le développement tissulaire. En variante et afin d'accentuer encore l'effet de diffusion du milieu de culture sous l'action de la déformation de la membrane, la chambre 42 délimitée entre la membrane 26 et le corps 10 est compartimentée par des parois de séparation. Chaque compartiment clos ainsi créé est relié à une source de dépression propre. Les sources de dépression sont commandées successivement pour assurer des déformations successives de la membrane et ainsi créer une onde se propageant le long de la membrane 26. Cette onde engendre un phénomène pulsatile dans l'espace de culture formé entre la membrane et le noyau d'implant.
Suivant encore une autre variante, le milieu de culture est perfusé en plusieurs points répartis horizontalement à la circonférence de la cuve. Les entrées et les sorties du milieu de culture sont situées de part et d'autre du noyau d'implant en des points multiples sur un plan vertical mais diamétralement opposés par rapport au noyau d'implant.
Les entrées et sorties sont avantageusement disposées suivant des lignes verticales, mais à 90° les unes des autres en plan et alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu. Les entrées et sorties peuvent être inversées périodiquement pour que toutes les cellules soient irriguées de façon équivalente. Comme précisé précédemment, l'angle entre l'axe du mouvement des pièces rigides constituant l'interface et la surface de culture est un élément important pour obtenir un bon réglage. Pour une alvéole élastique, les variations de pression appliquée dans la chambre intermédiaire permettent de communiquer l'effet de dilatation-contraction qui va favoriser la diffusion du milieu nutritif et la stimulation fonctionnelle, ou une partie de cette stimulation, au tissu cultivé. Par exemple, l'espace de culture peut varier de
10% autour d'une valeur moyenne de 50 à 1000 microns selon les cultures.
Le nombre d'entrées et de sorties du milieu de culture peut également être adapté au tissu à cultiver et à la matière de l'alvéole. Pour une alvéole élastique, une entrée par le fond de la cuve et une sortie à la partie supérieure est la modalité la plus simple. Pour une alvéole rigide, en plus de la solution précédente, des entrées et sorties multiples sont possibles pour optimiser la répartition du milieu dans l'espace de culture. Des canaux creusés en surface dans la paroi de l'alvéole peuvent aussi aider à la diffusion du milieu.
A l'issue de la culture cellulaire, le noyau 4 recouvert des cellules cultivées est extrait du réacteur au travers du couvercle 12. Pendant l'extraction, l'alvéole 28 est maintenue dilatée par une dépression créée dans la chambre 42.
Pour sa conservation et son transport jusqu'au lieu où l'intervention chirurgicale doit avoir lieu, l'implant est maintenu dans un conteneur cylindrique 130 illustré sur la figure 4. Ce conteneur présente une cavité cylindrique 132 propre à recevoir la partie radiculaire de l'implant recouvert des cellules.
A son extrémité ouverte, la cavité cylindrique 132 présente un taraudage 134 permettant le vissage du tampon fileté 90.
Entre le fond de la cavité et le taraudage 134, la cavité présente un épaulement 136 formant une surface d'appui pour le pion de support 62. Après vissage du tampon 90, le pion de support est immobilisé axialement en étant serré entre l'épaulement 136 et le tampon 90. La distance entre le fond de la cavité et l'épaulement 136 est telle que lorsque le pion de support 62 est en appui contre l'épaulement 136, la partie radiculaire de l'implant est en tout point espacée de la paroi de la cavité.
Pour la conservation de l'implant, la cavité est emplie d'un liquide de conservation dans lequel baigne la partie radiculaire de l'implant.
Le réacteur représenté sur la figure 5 comprend une cuve 202 qui de façon préférentielle est en bio-verre avec une concavité tronc-conique pour assurer l'interface avec le cône interne 203 et ainsi obtenir une stimulation mécanique de la culture en gel avec un effet de pression et de cisaillement- frottement qui se rapproche des conditions physiologiques auxquelles sont soumis les cartilages. La taille du dispositif peut être adaptée à la surface de culture souhaitée (tronc-conique), et donc à la quantité de cellules. Le tronc de cône interne 203 peut également être, de façon préférentielle, en bioverre ou en tout autre matériau qui mime le plus possible l'os support. Plus le cône est plat, plus les variations de pression et la diffusion du milieu seront importantes, et les contraintes en cisaillement réduites, et inversement. La cuve 202 peut être insérée dans une cuve 201 muni d'un couvercle 204 et possédant un fond plat de façon à permettre l'utilisation éventuelle du réacteur sur une table chauffante et d'assurer ainsi une répartition homogène de la température. Le système de régulation de la température peut également être directement inclus dans la paroi de la cuve 201 du bio-réacteur. Il peut, par exemple, s'agir d'un circuit d'eau ou encore d'une résistance électrique ou d'un transistor à effet Peltier, etc. Deux axes de centrage 213 sont insérés dans le couvercle 204 et le corps 201.
Dans le couvercle 204 est également ménagée une entrée 212 destinée à permettre la pénétration de l'air comprimé responsable du mouvement et qui permet ainsi la stimulation mécanique. Un joint torique inférieur 210 autorise l'amplitude du mouvement vertical appliqué au milieu. Il est également possible d'ajouter au dispositif un joint torique supérieur 211 qui facilite quant à lui l'amplitude du mouvement vertical appliqué à l'air sous pression.
Le dispositif comprend en outre une partie mobile cylindrique 205 munie d'un diaphragme inférieur et portant le cône interne. Dans cette partie mobile, une entrée 208 permet la perfusion du milieu de culture et une sortie 209 assure son évacuation. Une rondelle 207 associée à une lame-ressort ou une rondelle en silicone de rappel, permet, par son épaisseur, le réglage de la hauteur du mouvement imprimé par la partie mobile 205. Une tige ou étrier de blocage 206 limite le mouvement vertical en butant contre la rondelle 207.
Le réacteur représenté sur la figure 6 comprend une cuve 302 « alvéolée » qui de façon préférentielle est en bio-verre, avec une alvéole tronc-conique qui permet d'assurer l'interface avec le cône interne 313 (partie solide de l'implant, par exemple du ligaplant) et ainsi d'obtenir une stimulation mécanique de la culture avec un effet de cisaillement qui se rapproche des conditions physiologiques auxquelles est soumis le ligament parodontal et avec un effet de dilatation-compression permettant une diffusion homogène du milieu de culture entre les parois rigides. La taille du dispositif peut être adaptée à la surface de culture souhaitée (tronc-conique), et donc à la quantité de cellules. D'une manière préférée, l'espace compris entre le cône interne 313 et l'alvéole est de 0,2 ± 0,1 mm.
La cuve 302 peut être insérée dans une cuve 301 , de préférence en polymère et par exemple en PTFE, laquelle est munie d'un couvercle 303 qui est lui aussi de façon avantageuse en polymère. La cuve 301 possède un fond plat de façon à permettre l'utilisation éventuelle du réacteur sur une table chauffante et d'assurer ainsi une répartition homogène de la température. Le système de régulation de la température peut également être directement inclus dans la paroi de la cuve 301 du bio-réacteur. Il peut, là encore, s'agir d'un circuit d'eau ou encore d'une résistance électrique ou d'un transistor à effet Peltier, etc.
Deux axes de centrage 308 sont insérés dans le couvercle 303 et le corps 301. Dans la masse de l'alvéole 302 sont préférentiellement ménagées des entrées-sorties 309 destinées à permettre la circulation du milieu. Ces entrées-sorties, dont le nombre est dépendant de la longueur de la partie solide (e.g., radiculaire) de l'implant 313, sont disposées en lignes verticales, à 90° les unes des autres en plan et alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu. Ces entrées-sorties sont le plus souvent de deux ou trois. L'aménagement de fentes verticales peut également être réalisé de même que celui d'une alvéole en quatre quart. Des ouvertures 310 sont également ménagées dans la cuve 302 pour permettre le passage des tuyaux et embouts de connexion ou celui des filetages permettant éventuellement un verrouillage. Un joint torique inférieur 312, souple et épais, autorise l'amplitude du mouvement vertical appliqué au milieu. Ce dernier est appliqué de façon préférentielle avec une amplitude de 0,1 ± 0,05 mm pour une période de 10 secondes. Le dispositif comprend en outre, dans un écrou 307, un porte-implant
304 dans lequel vient s'insérer le cône interne 313 et l'axe de désinsertion
305 dudit cône. Une clavette de sécurité 306 prévue sur l'axe de désinsertion 305, permet de bloquer la rotation de l'ensemble mobile portant l'implant et qui comprend les pièces 305, 306, 307, 304 et 313. Un diaphragme 311 , associé au cylindre, permet d'éviter la rotation de l'ensemble mobile.
Un tel dispositif permet d'optimiser et d'égaliser le flux de milieu nutritif grâce aux multiples entrées-sorties prévues.
L'invention peut être mise en œuvre avec différents types d'implants, de forme, structure et composition variées et pour des applications différentes. Il s'agit avantageusement d'un implant dentaire, dont la partie radiculaire est couverte de cellules au moyen d'un réacteur selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. - Réacteur pour la culture cellulaire ou tissulaire, comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture compris entre 1 et 1000 microns, de préférence entre 10 et 1000 microns, plus préférentiellement entre 50 et 800 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture.
2. - Réacteur selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les parois délimitant l'espace de culture sont en matériau biocompatible, par exemple à base de polymère, verre, plastique, métal, bioverre, os ou corail.
3. - Réacteur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte un espace de culture délimité par deux parois en matériau biocompatible, l'une au moins d'entre elles étant composée ou à base d'un matériau favorisant la culture des cellules, de préférence en bioverre, os ou corail.
4. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'une au moins des deux parois est mobile.
5. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un implant comprenant un noyau recouvert en tout ou partie de cellules.
6. - Réacteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'une des parois est formée par le noyau de l'implant lui-même.
7. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un implant, caractérisé en ce qu'il comporte une chambre de culture délimitée par une paroi rigide en matériau biocompatible, ladite chambre ayant une forme cylindrique ou conique, et des moyens de support du noyau de l'implant, l'implant ayant une forme adaptée à celle de la chambre et les moyens de support étant disposés ou réglés pour que l'introduction du noyau d'implant forme, entre la paroi de la chambre et celle du noyau, un espace de culture réduit.
8. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chambre de culture du réacteur est délimitée par une paroi non rigide, déformable élastiquement.
9. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus comportent des moyens de déplacement de l'une au moins des parois de l'espace de culture.
10. - Réacteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que les moyens de déplacement génèrent dans l'espace de culture une force de pression, étirement, cisaillement et/ou frottement.
11. - Réacteur selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les moyens de déplacement induisent une modification de l'épaisseur de l'espace de culture, de préférence inférieure ou égale à environ 20% de l'épaisseur initiale de l'espace de culture, plus préférentiellement à environ 10%.
12. - Réacteur selon la revendication 11 , caractérisé en ce que la stimulation mécanique est obtenue par des moyens de déplacement du noyau de l'implant, par un mouvement de va et vient et/ou par une rotation partielle, de préférence par un mouvement de va et vient dans l'axe du noyau de l'implant.
13. - Réacteur selon la revendication 11 , caractérisé en ce que la stimulation mécanique est obtenue par déformation de la chambre de culture ou d'une partie de celle-ci, par exemple au moyen d'un joint déformable ou d'une paroi élastique, et en ce que le réacteur comporte de moyens de déformation de ladite chambre.
14. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant (i) une chambre de culture délimitant, entre deux parois, un espace de culture d'une épaisseur inférieure à environ 1000 microns, (ii) des moyens de stimulation mécanique des cellules ou tissus dans ledit espace et (iii), préférentiellement, des moyens de perfusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture, l'espace de culture comprenant en outre des éléments permettant d'augmenter la stimulation mécanique (éponge, fibre, bille, particule, etc.) ou ayant au moins une paroi présentant des irrégularités (rainures, bombages, etc.).
15. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de perfusion et de diffusion du milieu de culture au sein de l'espace de culture.
16. - Réacteur selon la revendication 15, caractérisé en ce que la diffusion du milieu est obtenue par une expansion-contraction périodique de l'espace de culture et/ou un mouvement d'amplitude la plus régulière possible sur toutes les surfaces.
17.- Réacteur selon la revendication 16, caractérisé en ce que la fréquence de l'expansion-contraction et/ou du mouvement est comprise entre 1 et 80 cycles par minute.
18. - Réacteur selon la revendication 15, 16 ou 17, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs entrées et sorties pour l'alimentation et l'élimination du milieu, de préférence disposées en plan, à 90° les unes des autres, les sorties et entrées étant alternées pour obtenir une diffusion optimale du milieu.
19. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de régulation de la température du milieu de culture, de préférence un circuit d'eau ou de liquide ou de gaz, de température contrôlée, une résistance électrique, ou un transistor, par exemple un transistor à effet Peltier.
20. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la croissance, la culture, la différentiation et/ou l'adhésion de fibroblastes, cémentoblastes ou chondrocytes, ou des précurseurs de ces cellules.
21. - Réacteur (2) pour la préparation d'un implant, notamment par croissance et/ou différentiation cellulaires, éventuellement au sein d'une matrice biocompatible, comprenant une alvéole (28) pour la culture, la différentiation et/ou la croissance cellulaires, caractérisé en ce que l'alvéole (28) est délimitée par une membrane déformable élastiquement (26) et en ce que le réacteur (2) comprend des moyens de déformation de ladite membrane (26).
22.- Réacteur selon la revendication 21 , caractérisé en ce que les moyens de déformation de ladite membrane (26) comportent des moyens (52) d'établissement d'une différence de pression entre les deux cotés de la membrane (26).
23.- Réacteur selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comporte un corps (10) délimitant avec la membrane (26) une chambre étanche (42), et en ce que les moyens (52) d'établissement d'une différence de pression comportent une pompe reliée à ladite chambre étanche (42).
24. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'il comporte un système de perfusion, permettant l'alimentation et le renouvellement du milieu baignant les cellules.
25.- Réacteur selon la revendication 24, caractérisé en ce que la membrane (26) est imperméable et présente un passage (36) de perfusion d'un milieu de culture.
26.- Réacteur selon l'une quelconque des revendications 21 à 25, caractérisé en ce que la membrane (26) est conformée pour maintenir entre le noyau (30) de l'implant et la membrane (26) un écart compris entre 0,001 et 5 mm.
27. - Réacteur selon l'une quelconque des revendications 21 à 26, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de stimulation mécanique des cellules, lesdits moyens de simulation comportant des moyens de déplacement du noyau de l'implant par rapport à ladite alvéole (28).
28. - Réacteur (2) pour la préparation d'un implant recouvert d'une matrice composée en tout ou en partie de cellules, ledit réacteur comportant :
- une membrane (26) délimitant une alvéole (28) de réception de tout ou partie du noyau (30) de l'implant et des cellules, ladite membrane (26) étant déformable élastiquement ;
- des moyens (58) de support dudit implant avec sa matrice (30) dans l'alvéole (28) ;
- des moyens de déformation de ladite membrane (26) ; et
- un système de perfusion permettant d'alimenter ou de renouveler le milieu baignant les cellules dans ladite alvéole.
29. - Utilisation d'un réacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un implant dentaire par culture et/ou différentiation cellulaire sur la partie radiculaire de l'implant.
30.- Réacteur (2) pour la préparation d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur une partie radiculaire (30) de l'implant, comportant :
- une membrane (26) délimitant une alvéole (28) de réception de la partie radiculaire (30) de l'implant ;
- des moyens (58) de support dudit implant avec sa partie radiculaire (30) dans l'alvéole (28) ; et - des moyens de stimulation mécanique des cellules sur la partie radiculaire (30) de l'implant ; caractérisé en ce que la membrane (26) est déformable élastiquement et les moyens de stimulation mécanique comportent des moyens de déformation de ladite membrane (26).
31. - Procédé de fabrication d'un implant par croissance et/ou culture et/ou différentiation cellulaire sur un support d'adhésion solide (e.g., noyau de l'implant) au sein d'un milieu de culture, ledit procédé comportant :
- la mise au contact du noyau de l'implant avec des cellules, dans des conditions permettant l'adhésion de cellules sur ledit noyau de l'implant ou sur une partie de celui-ci;
- l'immersion d'une partie au moins du noyau de l'implant recouvert de cellules obtenu ci-avant dans l'alvéole ou l'espace de culture d'un bioréacteur selon l'une des revendications 1 à 28, préalablement ou concomitamment empli d'un milieu de culture; et - la sollicitation mécanique des cellules.
32.- Procédé de préparation d'un implant dentaire par croissance cellulaire sur une partie radiculaire (30) de l'implant, comportant :
- la mise en place d'un tissu cellulaire autour de la partie radiculaire (30) d'un noyau d'implant (4) ; - l'immersion de la partie radiculaire (30) recouverte du tissu cellulaire dans une alvéole (28) emplie d'un milieu de culture, l'alvéole (28) étant délimitée par une membrane (26) élastiquement déformable ; et - la sollicitation mécanique de la membrane (26) pour sa déformation au cours du temps.
33.- Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que la sollicitation mécanique de la membrane (26) est assurée par établissement d'une différence de pression entre les deux faces de la membrane (26).
34.- Réacteur de culture cellulaire ou tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre de culture et des moyens de régulation de la température de la chambre de culture, par exemple un circuit d'eau ou de liquide ou de gaz, de température contrôlée, la présence d'une résistance électrique, ou d'un transistor, par exemple d'un transistor à effet Peltier.
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