BRPI9807292B1

BRPI9807292B1 - processo para melhorar o crescimento em plantas

Info

Publication number: BRPI9807292B1
Application number: BRPI9807292A
Authority: BR
Inventors: Dewen Qiu; Steven V Beer; Zhong-Min Wei
Original assignee: Cornell Res Foundation Inc
Priority date: 1997-01-27
Filing date: 1998-01-27
Publication date: 2016-04-19
Also published as: DE69830734D1; CN1251131A; DE69830734T2; WO1998032844A1; KR20000070495A; EP1012255A4; US6277814B1; JP5103446B2; CN1251131B; AU6043198A; EP1012255B1; BR9816222B1; ATE298792T1; JP4571240B2; PL334907A1; CA2279550A1; FI19991646A; KR100529268B1; BR9807292A; JP2001509670A

Abstract

"processo para melhorar o crescimento em plantas". a presente invenção refere-se a um processo para melhorar o crescimento de plantas. esta envolve aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de respota hipersensível em uma forma não infecciosa a uma planta ou semente de planta sob condições efetivas para melhorar o crescimento da planta ou plantas produzidas apartir da semente da planta. alternativamente, as plantas transgênicas ou sementes de plantas transgênicas transformadas com uma molécula de dna codificado uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível podem ser providas e as plantas transgênicas ou plantas resultantes das sementes de plantas transgênicas são cultivadas sob condições efetivas para melhorar o crescimento da planta.

Description

"PROCESSO PARA MELHORAR O CRESCIMENTO EM PLANTAS" Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente US provisório número de série 60/036.048, depositado em 27 de janeiro de 1997.

Esta invenção foi feita com o apoio do governo dos U.S. sob a bolsa USDA NRI Competitive Research Grant n2 91-37303-6430.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere ao melhoramento do crescimento de plantas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A melhora do crescimento de plantas pela aplicação de fertilizantes orgânicos é conhecida e tem sido realizada há séculos (H. Marschner, “Mineral Nutrition of Higher Plants”, Academic Press: New York pág. 674 (1986). O homem moderno desenvolveu um sistema de produção de fertilizantes inorgânicos complexo para produzir um produto fácil, que agricultores e fazendeiros podem aplicar a solos ou culturas em crescimento para melhorar o desempenho por meio da melhora do crescimento. Tamanho, coloração, maturação e produção das plantas podem também ser melhorados pela aplicação de produtos fertilizantes. Fertilizantes inorgânicos incluem os produtos químicos comumente aplicados como nitrato de amônio. Fertilizantes orgânicos podem incluir estrumes de animais e resíduos de gramados adubados, dentre muitas outras fontes.

Nos anos mais recentes, pesquisadores pensaram em melhorar o crescimento de plantas através do uso de produtos biológicos. Agentes de controle de doenças e insetos como Beauveria bassiana e Trichoderma harizamum foram registrados para o controle de problemas de doenças e insetos e, assim, melhoram indiretamente o desempenho e crescimento de plantas (Fravel et al., “Formulation of Microorganisms to Control Plant Diseases, “Formulation of Microbial Biopesticides. Beneficiai Microorganisms. and Nematodes. H.D. Burges, ed. Chapman and Hall: Londres (1996).

Existe alguma indicação da melhora do crescimento de plantas por meio de aplicação microbiana ou subprodutos microbianos. Bactérias de nodulação são adicionadas às sementes de culturas de leguminosas quando introduzidas em um sítio novo (Weaver et al., “Rhizobium.”Methods of Soil Analvsis. Part 2. Chemical and Microbiological Properties. 2- ed., American Society of Agronomy: madison (1982)). Estas bactérias podem melhorar a eficácia de nodulação da planta e, desse modo, melhorar a capacidade da planta de converter nitrogênio livre em uma forma utilizável, um processo denominado fixação de nitrogênio. Culturas de não leguminosas, como uma regra, não se beneficiam deste tratamento. Bactérias adicionadas como Rhizobium parasitizam diretamente os pêlos radiculares, iniciando então uma relação mutualística provendo benefício à planta enquanto recebendo proteção e sustento.

Fungos micorrizais são também reconhecidos como microorganismos necessários para crescimento opcional de muitas culturas, especialmente coníferas em solos que sofreram depleção de nutrientes. Mecanismos incluindo biossíntese de hormônios de plantas (Frankenberger et al., “Biosynthesis of Indole-3-Acetic Acid by the Pine Ectomycorrhizal Funges Pisolithus tinctorius,” Appl. Environ. Microbiol. 53: 2908-13 (1987)), absorção aumentada de minerais (Harley et al., “The Uptake of Phosphate by Excised Mycorrhizal Roots of Beech,” New Phytologist 49:388-97 (1950) e Harley et al., “The Uptake of Phosphate by Excised Mycorrhizal Roots of Beech. IV. The Effect of Oxygen Concentration Upon Host and Fungus,” New Phytologist 52: 124-32 (1953)), e água (A.B. Hatch, “The Physical Basis of Mycotrophy in Pinus,” Black Rock Forest Bull. n2 6, 168 pp. (1937)) foram postulados. Fungos micorrizais não obtiveram a frequência comum de uso que as bactérias de nodulação tiveram devido a resultados variáveis e inconsistentes com qualquer cepa micorrizal dada e a dificuldade de estudo dos organismos.

Rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (“PGPR”) reconheceram em anos recentes a melhora do desenvolvimento e crescimento de plantas. Mecanismos hipotéticos estão na faixa de influências diretas (por exemplo, absorção de nutrientes aumentada) para mecanismos indiretos (por exemplo, substituição de patógenos). O melhoramento do crescimento por aplicação de uma PGPR se refere, geralmente, à inoculação com uma bactéria viva no sistema radicular e à obtenção de crescimento melhorado através de efeitos hormonais produzidos por bactéria, sideróforos, ou por prevenção de doença através da produção de antibióticos, ou competição. Em todos os casos acima, o resultado é efetuado através da colonização radicular, algumas vezes através da aplicação de revestimentos de semente. Existe informação limitada para sugerir que algumas cepas de PGPR podem ser promotores diretos de crescimento que melhoram o alongamento da raiz em condições gnotobióticas (Anderson et al, “Responses of Bean to Root Colonization With Pseudomonas putida in a Hydroponic System,” Phvtopathology 75: 992-95 (1985), Lifshitz et al, “Growth Promotion of Canola (rapeseed) Seedlings by a Strain of Pseudomonas putida Under Gnotobiotic Conditions,” Can. J. Microbiol. 33: 390-95 (1987). Young et al., “PGPR”: Is There Relationship Between Plant Growth Regulators and the Stimulation of Plant Growth or Biological Activity?, “ Promoting Rhizobacteria: Progress and Prospects. Second International Workshop on Plant Growth-promoting Rhizobacteria, pp. 182-86 (1991), Loper et al., “Influence of Bacterial Sources of Indole-3-Acetic Acid on Root Elongation of Sugar Beet,” Phytopathology 76: 386-89 (1986), e Müller et al., “Hormonal Interactions in the Rhizosphere of Maize (Zea Mays L.) and Their Effect on Plant Development,” Z. Pflanzenemãhrung Bodenkunde 152: 247-54 (1989); no entanto, a produção de reguladores do crescimento de plantas foi proposta como o mecanismo mediando estes efeitos. Muitas bactérias produzem vários reguladores do crescimento de plantas in vitro (Atzom et al., “Production of Gibberellins and índole 3-Acetic Acid by Rhizobium phaseoli in Relation to Nodulation of Phaseolus vulgaris Roots,” Planta 175: 532-38 (1988) e M.E. Brown, “Plant Growth Substances Produced by Micro-Organism of Solid and Rhizosphere,” J. Annl. Bact. 35: 443-51 (1972) ou antibióticos (Gardner et al., “Growth Promotion and Inhibition by Antibiotic-Producing Fluorescent Pseudomonadas on Citrus Roots,” Plant Soil 77:103-13 (1984)). Produção de sideróforos é outro mecanismo proposto para cepas de PGPR (Ahl et al., “Iron Bound-Siderophores, Cyanid Acid, and Antibiotics Involved in Supression of Thievaliopsis basicola by a Pseudomonas fluorescens Strain,” J. Phytopathol. 116: 121-34 (1986), Kloepper et al., “Enhanced Plant Growth by Siderophores Produced by Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,” Nature 286: 885-86 (1980), e Kloepper et al., ‘Pseudomonas siderophores: A Mechanism Explaining Disease-Suppressive Soils,” Curr. Microbiol. 4: 317-20 (1980)). A colonização de superfícies de raízes e, assim, a competição direta com bactérias patogênicas sobre as superfícies é outro mecanismo de ação (Kloepper et al., “Relationship of in vitro Antibiosis of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria to Plant Growth and the Displacement of Root Microflora,” Phvtopathology 71: 1020-24 (1981), Weller et al., “Increased Growth of Wheat by Seed Treatments With Fluorescent Pseudomonads, and Implications of Pythium Control,” Can. J. Microbiol. 8: 328-34 (1986), e Suslow et al., “Rhizobacteria of Sugar Beets: Effects of Seed Application and Root Colonization on Yield,” Phytopathologv 72: 199-206 (1982)). Estudos de canola (colza) indicaram parâmetros de crescimento de plantas aumentados em PGPR incluindo produção, vigor e emergência de arbustos, crescimento de plantas com amadurecimento prematuro (número de folhas e comprimento de estolho médio), e área da folha (Kloepper et al., “Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Canola (rapeseed),” Plant Disease 72: 42-46 (1988)). Estudos com batata indicaram rendimentos da produção maiores quando cepas de Pseudomonas foram aplicadas a semente de batatas (Burr et al.5 “Increased Potato Yields by Treatment of Seed Pieces With Specific Strains of Pseudomonas Fluorescens and P. Putida,” Phvtopathology 68: 1377-83 (1978), Kloepper et al., “Effect of Seed Piece Inoculation With Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Populations of Erwinia carotovora on Potato Roots and in Daughter Tubers,” Phytopathology 73: 217-19 (1983), Geers et al., “Reduction of Yield Depressions in High Frequency Potato Cropping Soil After Seed Tuber Treatments With Antagonistic Fluorescent Pseudomonas spp.,” Phvtopathol. Z. 108: 207-38 (1983), Howie et al., “Rhizobacteria”Influence of Cultivar and Soil Type on Plant Growth and Yield of Potato,” Soil. Biol. Biochem. 15: 127-32 (1983), e Vrany et al., “Growth and Yield of Potato Plants Inoculated With Rhizosphere Bactéria,” Folia Microbiol. 29: 248-53 (1984)). Aumento em produção foi aparentemente devido aos efeitos competitivos de PGPR eliminarem bactérias patogênicas no tubérculo da semente, possivelmente por antibiose (Kloepper et al., “Effect of Seed Piece Inoculation With Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Populations of Erwinia carotovora on Potato Roots and in Daughter Tubers,” Phytopathology 73: 217-19 (1983), Kloepper et al., “Effects of Rhizosphere Colonization by Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Potato Plant Development and Yield,” Phvtopathology 70: 1078-82 (1980), Kloepper et al., “Emergence-Promoting Rhizobacteria: Description and Implications for Agriculture,” pp. 155-164, Iron, Siderophores, and Plant Disease, T.R., Swinbume, ed. Plenum, New York (1986), e Kloepper et al., “Relationship of in vitro Antibiosis of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria to Plant Growth and the Displacement of Root Microflora,” Phytopathology 71: 1020-24 (1981)). Em vários estudos, a emergência da planta foi melhorada usando PGPR (Tipping et al., “Development of Emergence-Promoting Rhizobacteria for Supersweet Com,” Phvtopathologv 76: 938-41 (1990) (resumo) e Kloeppet et al., “emergence-Promoting Rhizobacteria: Description and Impiications for Agriculture,”pp. 155-164, Iron. Sideropheres. and Plant Disease. T.R. Swinbume, ed. Plenum, New York (1986)). Numerosos outros estudos indicaram saúde das plantas melhorada quando do tratamento com rizobactéria, devido ao biocontrole dos patógenos das plantas (B. Schippers, “Biological Control of Pathogens With Rhizobacteria,” Phil. Trans. R. Soe. Lond. B. 318: 283-93 (1988), Schroth et al., “Disease-Supressive Soil and Root-Colonizing Bactéria,” Science 216: 1376-81 (1982), Stutz et al., “Naturally Occurring Fluorescent Pseudomonads Involved in Suppression of Black Root Rot of Tobacco,” Phvtopathologv 76: 181-85 (1986), e D.M. Weller, “Biological Control of Soilbome Plant Pathogens in the Rhizosphere With Bactéria,” Annu. Rev. Phvtopathol. 26: 379-407 (1988)).

Verificou-se que imunização induzida por patógenos de uma planta promove crescimento. Injeção de Peronospora tabacina extemamente ao xilema de tabaco não somente aliviou a paralisação do crescimento, mas também promoveu crescimento e desenvolvimento. Plantas de tabaco imunizadas, tanto em experiências de estufa como de campo, eram 40% mais altas, tiveram um aumento de 40% em peso seco, um aumento de 30% em peso novo, e 4-6 mais folhas do que as plantas de controle (Tuzun, S., et al., “The Effect of Stem Injection with Peronospora tabacina and Matalaxyl Treatment on Growth of Tobacco and Protection Against Blue Mould in the Field,” Phvtopathologv 74: 804 (1984). Estas plantas floresceram aproximadamente 2-3 semanas mais cedo do que plantas de controle (Tuzun, S., et al., “Movement of a factor in Tobacco Infected with Peronospora tabacina Adam which Systemically Protects Against Blue Mould,” Phvsiological Plant Pathology, 26: 321-30 (1985)). A presente invenção é dirigida a um aperfeiçoamento com relação aos procedimentos anteriores para melhora do crescimento de plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para melhorar o crescimento em plantas. Este processo envolve aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em uma forma não infecciosa a plantas ou sementes de planta em condições para conferir crescimento melhorado às plantas ou a plantas em crescimento a partir de sementes de planta.

Como uma alternativa para aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível a plantas ou sementes de planta, a fim de conferir crescimento melhorado às plantas ou a plantas em crescimento a partir de sementes, sementes de planta ou plantas transgênicas podem ser utilizadas. Quando se utiliza plantas transgênicas, isto envolve prover uma planta transgênica transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeos elicitor de resposta hipersensível e o crescimento da planta em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento. Altemativamente, uma semente de planta transgênica transformada com um molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser provida e plantada no solo. Uma planta é então propagada da semente plantada em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento. A presente invenção é dirigida a efetuar qualquer forma de promoção ou melhora no crescimento de plantas. Isto pode ocorrer o mais cedo possível quando o crescimento da planta começa das sementes ou depois na vida de uma planta. Por exemplo, o crescimento de plantas de acordo com a presente invenção engloba produção maior, quantidade aumentada de sementes produzidas, porcentagem aumentada de sementes germinadas, tamanho de planta aumentado, biomassa maior, mais e maiores frutas, coloração prematura dos frutos e maturação de plantas e de frutos prematura. Como um resultado, a presente invenção provê benefícios econômicos significativos aos agricultores. Por exemplo, germinação prematura e maturação prematura permitem que as culturas cresçam em áreas onde as estações curtas de crescimento podem de outro modo impossibilitar seu crescimento naquele local. Porcentagem aumentada da germinação de sementes resulta em culturas melhoradas permanentes e uso das sementes mais eficaz. Produção maior, tamanho aumentado e produção de biomassa melhorada permite maior geração de receita de um dado lote de terra. É evidente que a presente invenção constitui um avanço significativo na eficácia agrícola.

BREVE DESCRICÂO DOS DESENHOS

Figura 1 é um mapa do vetor de plasmídeo pCPP2139 que contém o gene elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora.

Figura 2 é um mapa do vetor de plasmídeo pCPP50 que não contém o gene elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora, mas é, de outro modo, o mesmo vetor de plasmídeo pCPP2139 mostrado na figura 1. Ver Masui et al, Bio/Technology 2: 81-85 (1984), que é incorporado aqui por referência.

DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a um processo para melhorar o crescimento em plantas. Este processo envolve aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em uma forma não infecciosa a toda ou parte de uma planta ou uma semente de planta em condições para conferir crescimento melhorado à planta ou um crescimento de planta a partir da semente de planta. Altemativamente, plantas podem ser tratadas deste modo para produzir sementes que, quando plantadas, conferem crescimento melhorado em plantas de progênie.

Como uma alternativa para aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível a plantas ou sementes de plantas a fim de conferir crescimento melhorado às plantas ou a crescimento de plantas a partir de sementes, sementes de plantas ou plantas transgênicas podem ser utilizadas. Quando se utiliza plantas transgênicas, isto envolve prover uma planta transgênica transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível e crescimento de planta em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento. Altemativamente, uma semente de planta transgênica transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser provida e plantada no solo. Uma planta é então propagada da semente plantada em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível utilizado na presente invenção pode corresponder proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível derivados de uma ampla variedade de patógenos bacterianos e fungicos. Estas proteínas ou polipeptídeos são capazes de elicitar necrose local no tecido da planta contactado com o elicitor.

Exemplos de fontes bacterianas apropriadas de elicitores de proteína ou polipeptídeo incluem espécies Erwinia, Pseudomonas e Xaníhamonas (por exemplo, as seguintes bactérias: Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia stewartii, Erwinia caroíovora, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campesíris, e misturas dos mesmos).

Como exemplo de uma fonte fungica de um polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível é Phytophthora. Espécies apropriadas de Phytophthora pythium, Phytophthora cryptogea, Phytophthora cinnamoni, Phytophtora capsici, Phytophthora megasperma e Phytophthora citrophthora. A forma de realização da presente invenção em que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é aplicado à planta ou semente de planta pode ser realizada de numerosos modos, incluindo: 1) aplicação de uma proteína ou polipeptídeo elicitor isolado, 2) aplicação de Ibactérias que não causam doença/e são transformadas com genes codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível; e 3) aplicação de bactérias que causam doença em algumas espécies de plantas (mas não nas em que elas são aplicadas) e contêm um gene codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. Além disso, sementes de acordo com a presente invenção podem ser recuperadas de plantas que foram tratadas com um polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível com a presente invenção.

Em uma forma de realização da presente invenção, as proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível podem ser isolados de seus organismos correspondentes e aplicados a plantas ou sementes de plantas. Os procedimentos de isolamento são bem conhecidos, como descrito em Arlat, M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet e C.A. Boucher, “PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum,” EMBO J. 13: 543-553 (1994); He, S.Y., H. C. Huang, e A. Collmer, “Pseudomonas syringae pv. syringae HarpinPss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants,” Çell 73: 1255-1266 (1993); and Wei, Z.-M, RJ. Labya, C.H. Zumoff, D.W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer, e S.V. Beer, “Harpin Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora, Science 257: 85-88 (1992), que são incorporados aqui por referência. Ver também pedidos de patente US pendentes números de série 08/200.024 e 08/062.024, que são incorporados aqui por referência. Preferivelmente, no entanto, as proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta" hipersensível da presente invenção são produzidos recombinantemente e purificados como descrito abaixo.

Em outras formas de realização da presente invenção, a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível da presente invenção pode ser aplicada a plantas ou sementes de plantas aplicando-se genes contendo bactérias codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. Estas bactérias devem ser capazes de secretar ou exportar o polipeptídeo ou proteína de modo que o elicitor pode contactar células de sementes de plantas ou plantas. Nestas formas de realização, a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é produzido pelas bactérias nas plantas ou nas sementes ou exatamente antes da introdução das bactérias nas plantas ou sementes de plantas.

Em uma forma de realização do modo de aplicação bacteriana da presente invenção, as bactérias não causam a doença e são transformadas (por exemplo, recombinantemente) com genes codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. Por exemplo, E. coli, que não elicita uma resposta hipersensível em plantas, pode ser transformado com genes codificando uma proteína ou polipeptídeo de resposta hipersensível e depois aplicado em plantas. Espécies bacterianas diferentes de E. coli também podem ser usadas nesta forma de realização da presente invenção.

Em outra forma de realização do modo de aplicação bacteriano da presente invenção, as bactérias causam doença e, naturalmente, contêm um gene codificando uma proteína ou polipeptídeo de resposta hipersensível. Exemplos destas bactérias são indicados acima. No entanto, nesta forma de realização, estas bactérias são aplicadas a plantas ou suas sementes que não são suscetíveis a doença conduzida pelas bactérias. Por exemplo, Erwinia amylovora causa doença em maçã ou pera, mas não em tomate. No entanto, estas bactérias elicitarão uma resposta hipersensível em tomate. Consequentemente, de acordo com esta forma de realização da presente invenção, Erwinia amylovora pode ser aplicada a sementes ou plantas de tomate para melhorar o crescimento sem causar doença nesta espécie. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Envinia chjysanthemi tem uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQID NO: 1, como a seguir: Met Gin Ile Thr Ile Lys Ala Kis lie Gly c-ly As? Leu Glv Vai Ser l” S 10 15 Gly Leu Gly Ala Glr. Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser 20 25 30 Leu Gly Ser Ser Vai As? Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr 35 40 4 S

Ser Ala Leu Thr Ser Met Meo Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gin Gly Leu 50 55 60 G^v Ala Ser Ser Lvs Glv Leu Gly Meu Ser Asn Gin Leu Gly Glr. Ser 55' * 7θ" 75 80 Phe Gly Asn Glv Ala Gin Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Vai ?ro Lys 85 90 95 Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asn Lvs Ala Leu Asn Asd 100 105 * ’ 110 Leu Leu c-ly His As? Thr Vai Thr Lys Leu Thr Asn Gin Ser Asr. Gin 115 120 125 Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Glr. Met Thr Glr. Gly Asn Met 130 135 140 Asr. Ala Phe Gly Ser Gly Vai Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly 145 ISO 155 ISO

Asn Gly Leu Gly Gin Ser Met Ser Gly Phe Ser Gin Pro Ser Leu Gly 165 170 175 Ala Gly Gly Leu Glr. Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gin Leu 180 IBS " ISO

Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Vai Gly Gin Asn Ala Ala Leu Ser Ala 195 ‘ ‘ 200 ' 205 Leu Ser Asn Vai Ser Thr Kis Vai As? Gly Asn Asn Arç His Phe Vai 210 215 " ' 220 As? Lys Glu As? Arg Gly Met Ala Lys C-lu Ile Gly Gin Phe Met As? 225 ' " 230 ‘ 235 ' 240 Gin Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gin Lys As? Gly Tr? 245 ‘ 250 * ' " 255 Ser Ser Pro Lys Thr As? As? Lys Ser Tr? Ala Lys Ala Leu Ser Lys 260 ' * ' 265 * " 270 Pro As? Asp As? Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gin 275 * 2S0 * 285 Ala ·ν·=Gly :■·=: Ile' Lys Sar Ala Vai Ala Glv Aso Thr Glv Asr. Thr :s3 :?s ‘ 3ob Asr. Lau As:i Leu Ar= Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Glv’ XTe As? Ala 305 210 315 220 Aua Vai Vai Gly As? Lys 11= Ala Asn Met Ser Leu Glv Lys Leu Ala 325 330 ‘ ' 335 s~>3 Π Ai 3. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tem um peso molecular de 34 kDa, é estável ao calor, tem um teor de glicina maior do que 16% e contém substancialmente nenhuma cisteína. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Erwinia chiysanthemi é codificado por uma molécula de DNA tendo uma sequência de nucleotídeos correspondente à SEQ ID NO: 2, como a seguir: CGA^^ACC C3GGTGAACG TCCTATGACC G AC.*\G*-λíC.*\ CuyTm.ccA CACwuTTACG o0 GCG777A7GG CGGCGATG.~-A CCGGCATCAG GwGGwjvjl. uuiaí^vv-jwuT*. 120 GA7C73GTAT 7TCAGTT7GG GGACACGGGG CG7GAACiCA TuA:GCAGAi -GAu-CGGGG ISO CAGGAJVTATC CCGGCATG. - GCGCACGCTG CTG3C7CG7C G77A7CA3CA GGGGGGAGAG 240 iG-jA.yu».; GCCA7C:ui^ CwíG.-ACGGC AGvoATGTAT 73ATCC7CTG G7GGGCGC7G 300 C--77GGA7C CCGGCAGTTn iCCGCAGGTG A.77GAACG77 7G77TGAAC7 GGCGGGAA7G 3í0 ACG77GCCG7 CGC7A7CCA7 AGCACCGACG GC3CG7CCGC· AGACAGGG.AA CG3ACGCGCC 420 CGA7GA7TAA GATAAAGGCG GC77TT777A 773CAAAACG G7AACGGTGA GGAACCG7TT 48 0 CA2CG7CGGC G7CACTGAGT AACAAGTATC CA7GA7GA7G CC7ACA7CGG GA7G3GCGTG 54G GGCA7CCGTT G^AGATACi. 77GCGAACAC C7GACA7GAA 7GAGGAAACG AAA77A7GCA £00 AA77ACGA7C AAAGCGCACA 7CGGCGGTGA 7T7G3GCCTC 7CCG37C7GG GGC7GCG7GC 5£0 7CA33GACTG AAAGGAC7GA A7TGCGCGGC TTCA7CGCTG GG77CCAGCG 7GGA7AAACT 72 0 GAGCAGCACC ATCGATAAG7 TGACCTCCGC GC7GAG77CG A7GATG7TTG GCG3CGCGC7 750 GGG3CAGGGG C7GGGCGCCA GCTCGAAGGG GC73GGGA7G AGCAATCAAC TGGGCCAG7C 840 777CGGCAA7 G3CGCGCAG3 G7GCGAGCAA CC7GC7A7CC G7AGCGAAAT CCGGCGGCGA 900 7GC377G7CA AAA/% tuTTTG ATAAAGCGC7 GGACGAT- .u CTGGG7CATo ACACCGTGAC 950 CA-.3CTGACT AACC.nGAG^A ACCAACTGGC TA^TTCAATG GTGAACGCCA GCCAGATGAC 1G2C CCA33GTAA7 ATGAATGCG: 7CGGCAGCGG 7G7GAACAAC GGAC7G7CG7 CCA7TC7CGC 10 8 0 CAACGGTC7C GGCC/w- TGAG7GGCTT CTC7GAGCGT TCTCTGG3GG CAGGCGGC77 114 C

u3GGGC»o rvGCo^CoCG^ GioCAt .CAA C>_.-.o7.oGj·, fw-.TGCCATCG GGA7GGGCG7 12GC GGGGGAGAAT GCiG.-.Gs.TGA G;Gv.GT*GAG íAACOíCAGC ACCCACG7AG ACGGTAACAA 12c 0 CCGCCAC77T GTAGA7AAAG AAGATCuCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AG777AT3GA 13 2 0 7CA37ATCCG GAAA±A»;TCG GTA.AACCGGA A7ACCAGAAA GATGG*GTGGA GTTCGCCGAn 13SC GA.CajACGAC AkAís_CíGGG CT^-AAGCGCT GAG7AAACCG GATGATGACG G7A7GACGGG 144 0 CGCCAGCA.T3 GACAjw^TCC GT^.A«j\jG^rv-. Gv»GTATGaTC A.*vAAGCGCGG 7GGCGGGTGA 250 0 7ACCGGCAA7 ACCAACC7GA ACCTGCGaGG CvjCGGGCGGT GCATCGC7GG G7A7CGATGC 1550 GGC7GTGG7C G G CG ATj-vAAA TAuC^-.^vrvCAT GíCoUíuuuT AAGCTGGCC/*. AC3CCTGATA. 1520 1 A7C7G7GCTG GCCTGATAAA GC3G.rvAACGA AAA-vAGAGAC GGGGAA3CC7 GTCTG7T7TC 156 0 T7A7TA7GC3 G7T7A7GCGG T7ACC-vjoAC CGuTTaAíCA 7CGTCATCGA TCTGGTACrvA 174 0 ACGCACAT7T 7CCCG7TCAT TC3GG7CGTT ACGCGCCACA ATCGCGA7GG CA7C7TCC7C 1600 G7C3C7CAGA TTGCGCG3G7 GATGujGArtC GCCGGGTGGA A7ATAGAGAA AG7CGCCGGC 1850 CAGATGGAGA CACGTC7GCG ATAAA7CTGT GCCGTAACGT G777C7ATCC GCCCCTT7AG 1520 CAGA7AGATT GCoGTiTCGT Aj-.TCArv.CATG GTí-.AaG^-oGT -CCGCCTGTG CGGCGGCCGG 1560 GA7CACCACA A7ATTCATAG AAj-vuCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCG3G AGA.ACCGAC 204 0 AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGoTn.CCijT GGGG7G.7CC GvjCCTGACAA 7C77GAGT7G 220 0 GT7CGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGA7C3GT 7 214 1 A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Erwinia amvlovora tem uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 3, como a seguir: Ms: Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Me: Glr. Ile Ser 1 5 10 13 T's Glv Glv Ala Glv Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gin 20 ‘ 25 30 Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn 35* 40 45 Gin Asn Asp Thr Vai Asn Gin Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Me: Mec 50 53 60 Me: Met Met Ser Me: Me: Glv Gly Glv Gly Leu Me: Gly Gly Gly Leu 65 10 75 80 Glv Gly Glv Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu e5 90 93 Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr 100 105 no Leu Glv Ser Lvs Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Se*· Pro 115 ‘ 120 · 12S

Leu Asp Glr. Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gin Asn Asm Asn Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gin Gin 145 " 150 ' 155 ISO

Leu Leu Lys Me: Phe Ser Glu Ile Met C-ln Ser Leu Phe Gly A.sp Gly 165 170 * 175 Gin Aso Gly Thr Glr. Glv Ser Ser Ser Gly Gly Lvs Gin Pro Thr Glu 180 185 ' 190 Gly Glu Gin Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Vai Thr Asp Ala Leu Ser Gly 195 200 " 20S

Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Glr. Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly 210 215 " 220 Gly Gly Gin Gly Gly Asn Ala Gly Thr Glv Leu Aso Gly Ser Ser Leu 22*5 230 * 235 240 Glv Glv Lys Gly Leu Gin Asn Leu Ser Glv Pro Vai Aso Tvr Gin Gin 245 25*0 ‘ * 255 Leu Gly Asn Ala Vai Gly Thr Gly Ile Glv Met Lvs Ala Gly Ile Gin 260 2ó5 * * 270 Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr Kis Arg Eis Ser Ser Thr Arg Ser Phe 275 * " 280 28S

Vai Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gin Phe Met 290 295 * 300 As? Gin Tyr Pro Glu Vai Phe Gly Lys Pro Gin Tyr Gin Lys Gly Pro 30*5 310 * ' 315 ’ 220 Gly Gin Glu Vai Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser 325 * * 330 * * 335 Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Glr. Phe Asn 34*0 345 350 Lvs Ala Lys Gly Ke; Ile Lvs Arg Pro Met Ala Glv Aso Thr Gly Asn 3S5 360 ^ 365 Gly Asn Leu Gin Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly ile Asp 370 375 3 B0 Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lvs Leu 365 3 90 395 ” * 400 Gly Ala Ala Esta proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tem um peso molecular de cerca de 39 kDa, tem um pi de aproximadamente 4,3 e é estável ao calor a 100°C durante pelo menos 10 minutos. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível não tem substancialmente cisteína. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Erwinia amylovora é mais completamente descrita em Wei, Z.-M, R.J. Laby, C.H. Zumoff, D.W. Bauer, S. -Y. He, A. Collmer e S.V. Beer, “Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora,” Science 257: 85-88 (1992), que é incorporado aqui por referência. A molécula de DNA codificando este polipeptídeo ou proteína tem uma sequência de nucleotídeos correspondente à SEQID NO: 4, como a seguir: AAGC77CGGC A7GGCACGTT TGACGGTTGG GTGGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 63 GAGGArtTACsj TTA7GAGTCT GArt»ACAAv . GGGGTGGGAu CG.CAACGAT GCAAA-TTÍ*T 2.20 ATCGGCGvj*o CGGGCuoAAA iAAC^ou*io CTGGGTAGCA G*>«GCCAGAA 7GCTGGG7TG 180 GGTGGCAA7T C7GCACTGGG GCTw-joCGGC GG7AA7CAAA A7GA7ACCGT CAATCAGCTG 24 0 CCTGGC77AC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA 7GGGCGGTGG 7GGGCTGA.TG 3 00 GGCGG7GCC7 7AG3CGG7GG C77AGGTAA7 GGC77GGGTG GCTCAGGTGG CCTG3GCGAA 3 60 GGAC7G7CGA ACGCGCTGAA CG.n.nTGTTA GGCGG7TCGC TGrtACACGCT GGGCTCGAAA 42 0 GGCGGCAACA ATACCACT7C /“ACAACAAAT TCCCCGC7GG ACCAGGCGCT GGG7AT7AAC 4 80 7CAACG7CCC AAAACGACGA T7CCACCTCC GGCACAGA77 CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540 CCGATGCAGC AGCTGC7GAA GA7G7TCAGC GAGA7AA7GC AAAGCCTGT7 TGG7GA7GGG 600 CAAGA7GGCA CCCAGGGCAG 7TCC7C7GGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660 GCCTA7AAAA AAGGAGTCAC 7GATGCGCTG 7CGGGCCTGA 7GGG7AATGG 7C7GAGCCAG 720 C7CCT7GGCA ACGGGGGACT GGGAGG7GGT CAGGGCGGTA A7GC7GGCAC GGGTCTTGAC 780 GGTTCGTCGC TGGGCG3CAA AGGGC7GCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840 77AGGTAAC3 CCG7GGG7AC CGGTA7CGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 80C ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA A7AAAGGCGA TCGGGCGATG 560 GCGAAGGAAA TCGGTCAGT7 CA7GGACCAG TATCCTGAGG 7GTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020 CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GG7GAAAACC GATGACAAA7 CATGGGCAAA AGCAC7GAGC 1060 AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AG7ATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140 ATGATCAAAA GGCCCA7GGC GGG7GATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200 GGTGGTTCTT CGCTGGGTA7 7GA7GCCATG A7GGCCGG7G ATGCCAT7AA CAATATGGCA 126C CTTGGCAAGC 7GGGCGCGGC TTAAGCTT 128Θ A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivada de Pseudomonas syringae tem uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQID NO: 5, como a seguir: Mer Glr. Ser Leu Ser Leu Asr. Ser Ser Ser Leu Gin Thr Pro Ala Mer 1 S 10 15 Ala Leu Vai Leu Vai Arg Pro C-lu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Lys Ala Leu Gin Glu Vai Vai Vai Lys Leu Ala Glu Glu Leu Mel 35 40 45 Arg Asn Gly Gin Leu As? Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala 50 55 60 Lys Ser Mel Ala Ala As? Gly Lys Ala Gly Gly Gly lie Glu As? Vai 55 70 75 80 Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile Kis Glu Lys Leu Gly A.s? Asn Phe 55* * S0 *95 Glv Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gin Gin Aso Leu Me* 100 105 ‘ 110 Thr Gin Vai Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp As? Leu Leu 115 ’ 120 ‘ 125 Thr Lvs Gin As? Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu As? Asp Mer Pro Mer 130 * 135 140 Leu Asn Lys Ile Ala Gin Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gin Phe Pro 145 ’ 150 ' 153 160 Lvs Pro Aso Ser Glv Ser Tro Vai Asn Glu Leu Lvs Glu Aso Asn Phe 165 ‘ 170 175 Leu Aso Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu As? Ile Ile ISO 185 190 Glv Gin Gin Leu Gly Asr. C-ln Glr. Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly 195 ‘ 200 * 205 Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asr. Asn Ser Ser 210 215 220 Vai Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly A.sp Ser 225 * 230 * 235 * * 240 Glv Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gin Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp 245 " 250 * 255 Arg Gly Leu Gin Ser Vai Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Vai 260 26*5 ‘ 270 Asn Thr Pro Gin Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gin Ser Ala Gin 275 280 * 2S5 Asp Leu As? Glr. Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala 290 295 · 300 Thr Leu Lys Asp Ala Gly Glr. Thr Gly Thr Asp Vai Gin Ser Ser Ala 305 ’ 31Ò 315 320 Ala Glr. Ile Ala Thr Leu Leu Vai Ser Thr Leu Leu Gin Gly-Thr Arg 325 330 * 335 Asn Gin Ala Ala Ala 340 A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tem um peso molecular de 34-35 kDa. É rico em glicina (cerca de 13,5%)e desprovido de cisteína e tirosina. Outra informação sobre o elicitor de resposta hipersensível derivado de Pseudomonas syringae é encontrada em He, S.Y., H.C. Huang e A. Collmer, “Pseudomonas syringae pv. syringae HarpinPss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants,” Cell 73: 1255-1266 (1993), que é incorporado aqui por referência. A molécula de DNA codificando o elicitor de resposta hipersensível de Pseudomonas syringae tem uma sequência de nucleotídeos correspondente à SEQID NO: 6, como a seguir: A7GCAGAG7C TCAGTC77AA CAGCA3CTCG C7GCAAACCC CGGCAATGGC CCT7G7CCTG 60 G7AC37CCTG AAGCCGAGAC GACTG3CAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 220 G7GAAGC7GG CCGAGGAACi GATG^.GCAA± GuaCAACTCG ACGACAGC7C GCCATTGGGA ISO

AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGA7 GGCAAGGCGG GCGGCGGTA7 TGAGGA7G7C 24C ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATC^AiG/^A AAGCTCGGTG ACAAC77CGG CGCGTCTGCG 3 00 GACAGCGCC? CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360 AAGTGGATGC 7CGA7GATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGC77 CTCGGAAGAC 420 GATATGCCGA TGC7GAACAA GAiCGCGCAG 7TCA7GGATG ACAATCCCGC ACAG7T7CCC 480 AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GuTvjmACGAA CTCAAGGAAG ACAAC7TCC7 TGATGGCGAC S4 0 GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GoCACíAC ATCATaGGCC AGCAACTGGG TAATCAGC-*%G 60C A3TGACGC7G GCAG7CTGGC AGGoACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAG7T7TTCC 660 AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC C3GTGACAGC 720 GGCAATACCC G7GGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCGTGCAA 790 7CGGTATTGG CCGGTGG7GG AC7GGGCACA CCCG7AAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840 GCGAA7GGCG GAGAG7CCGC TCAGGA7C7T GATCAGT7GC TGGGCGGCT7 GCTGCTCAAG 900 G3CC7GGAGG CAACGCTCAA GGA7GCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA G7CGAGCGC7 960 GCGCAAA7CG CCACC77GCT GGTGA37AC3 CTGCTGCAAG GCACCCGCAA 7CAGGCTGCA 1020 GCCTGA 1025 A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado>de Pseudomonas solanacearum tem uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 7, como a seguir: Met Ser Vai Glv Asn Xle Gin ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gin 1 ' 5 10 15 Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gin Gin Ser Gly Gin Ser 20 25 30 Vai Gin Asp Leu lie Lys Gin Vai Glu Lvs Asp lie Leu Asn Ile Ile 35* 40 ' 45 Ala Ala Leu Vai C-ln Lys Ala Ala Glr. Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly 50 55 50 Asr. Thr Gly Asr. Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala 65 70 75 ' 30 Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gin Ala Pro Gin Ser E5 90 95 Ala Asn Lys Thr Gly Asn Vai Asp Asp Ala Asn Asn Gin Asp Pro Met 100 ’ ’ 105 11Ò Gin Ala Leu Met Gin Leu Leu Glu Asp Leu Vai Lys Leu Leu Lvs Ala 115 120 ’ 125 Ala Leu His Met Gin Glr- Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Vai 130 135 ’ 140 Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gin Gly Gly Leu Ala 145 150 155 ISO

Glu Ala Leu Gin Glu Ile Glu Glr. Ile Leu Ala Gin Leu Gly Glv Glv 165 170 ‘ 175 Gly Ala Gly Ala Gly Glv Ala Gly Gly Gly Vai Gly Gly Ala Gly Gly 180 185 ‘ ISO

Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala 195 ‘ 200 205· Asn Gly Gly Asn Gly Vai Asn Glv Asn Gin Ala Asn Gly Pro Gin Asn 210 215 ' 220 Ala Gly Asp Vai Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp 225 ‘ 23Ô 235 ‘ 240 Gin Gly Gly Leu Thr Gly Vai Leu Glr. Lys Leu Met Lvs Ile L=u Asn “50 255 Ala Leu Vai Glr. Met Met Gin Gin Gly Gly Leu Gly Glv Glv Asr. G' - -== 270 Ala Gin Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala s- Glv 27o 280 2SS

Ala Pro G1y Ala As:l Gin Pro Gly Ser Ala Asp Asd Gin Ser Se- 2S= 300 Gly Glr. Asn Asr. Leu Glr. Ser Glr. Ile Met Asp Vai Vai Lvs Glu Vai -10 315 ' 32~Q

Vai Gin Ile Leu Gin Glr. Met Leu Ala Ala Gin Asn Gly Gly Se- Gin 323 330 333 Gin Ser Thr Ser Thr Gin Pro Met 340 E codificado por uma molécula de DNA tendo uma sequência de nucleotídeos correspondente à SEQ ID NO: 8, como a seguir: ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACGTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60 AACACCAAn.A CuAACAGCCA GCArt.wGwGC CAG7CCvj7Gw» /“w^ACCTGPxT CAAGCAGG7C 12 0 GAGAAGGrv„A 7CC7CAACA7 CATCoC/iGuC C7CvjTGCAGA AGuCCGCACA G7CG3CGGGC 18 0 GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240 AACGACCCGA GCAAGA/*CGA CCCGAG\~mAG AGC^.AGoC7C CvjC/\G7CGGC CAACrvAGACC 30 0 GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGA7 CCGATGCAAG CGCTGATGCA GC7GCTGGAA 360 GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACA7GCAGC AGCCCGGCGG C.AA7GACAAG 42 0 GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480 GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCC7C GCCCAGCTCG GwGGCGGCGG 7GC7GGCGCC 54 0 GGCGGCGGGG GTGGCGGTGT CGGCGG7GCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGG7GCGGG7 600 G3CGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660 GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGAGGG CAGCGAAGAC 720 CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GC7GGTGCAG 780 ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840 GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGA7 900 GA7CAATCG7 CCGGCCAGAA CAATCTGCAA 7CCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 96 0 G7CCAGATCC 7GCAGCAGAT GC7GGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA G7CCACCTCG 1020 ACGCAGCCGA TGTAA 1035 Outra informação com respeito a uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Pseudomonas solanacearum é descrita em Arlat, M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet e C.A. Boucher, “PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearumEMBO J. 13: 543-533 (1994), que é incorporado aqui por referência. A uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Xanthomonas campestris pv. glicinas tem uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 9, como a seguir: Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Vai Vai Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala 15 10 15 Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tvr Glr. Asp Tyv 20 25 Esta sequência é uma sequência terminal amino tendo 26 resíduos somente da proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Xanthomonas campestris pv. glicinas. Ela se iguala com proteínas de subunidades fimbriais determinadas em outros patovares de Xanthomonas campestris. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Xanthomonas campestris pv. pelargonii é estável ao calor, sensível a protease e tem um peso molecular de 20 kDa. Ele inclui uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQID NO: 10, como a seguir: c»- Se'- Gin Gin Ser Pro Ser Ala Glv Ser Glu Gin Gin Leu Asp Gin V *5 10 15 Leu Leu Ala Met 20 Isolamento do polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível de Erwinia carotovora é descrito em Cui et al., “The RsmA Mutants of Eiwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrp NEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco Leaves,” MPMI. 9(7): 565-73 (1996), que é incorporado aqui por referência. O polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível é mostrado em Ahmad et al., “Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity of Envinia stewartii on Maize,” 8th. Int’l. Cong. Molec. Plant-Microbe Internet.. 14-19 de julho de 1996 e Ahmad et al., “Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity of Ewrinia stewartii on Maize,” Ann. Mtg. Am. Phvtopath, Soe.. 27-31 de julho de 1996, que são incorporados aqui por referência.

Polipeptídeos ou proteínas elicitores de resposta hipersensível de Phytophthora parasitica, Phytophthora ciyptogea, Phytophthora cinnamoni, Phytophthora capsici, Phytophthora megasperma e Phytophthora citrophtòra são descritos em Kaman et al., “Extracellular Protein Elicitors fforn Phytophthora: Most Specificity and Induction of Resistance to Bacterial íd Fungai Phytopathogens,” Molec. Plant-Microbe Internet.. 6(1)· 15-25. 993), Ricci et al., “Structure and Activity of Proteins firam Pathogenic ingi Phytophthora Eliciting Necrosis and Acquired Resistance in Tobacco,” ir. J. Biochem.. 183: 555-63 (1989), Ricci et al., “Differencial Production ■ Parasiticein, and Elicitor of Necrosis and Resistance in Tobacco, by olates of Phytophthora parasitica,” Plant Path. 41: 298-307 (1992), aillreul et al., “A New Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobacco: Fungai Glycoprotein Elicits Cell Death, Expression of Defense Genes, •oduction of Salicylic Acid, and Induction of Systemic Acquired esistance,” Plant. J.. 8(4): 551-60 (1995), e Bonnet et al, “Acquired ssistance Triggered by Elicitors in Tobacco and Other Plants,” Eur. J. Plant. ith., 102: 181-92 (1996), que são incorporados aqui por referência.

Os elicitores acima são ilustrativos. Outros elicitores podem r identificados por bactérias ou fungos em crescimento que elicitam uma sposta hipersensível na qual genes codificando um elicitor são expressados, eparações isentas de células de sobrenadantes de cultura podem ser testadas ira atividade de elicitor (isto é, necrose local) usando os mesmos para filtrar tecidos de planta apropriados. É também possível usar fragmentos das proteínas ou ilipeptídeos elicitores de resposta hipersensível acima bem como igmentos de elicitores de comprimento completo de outros patógenos, no ocesso da presente invenção.

Fragmentos apropriados podem ser produzidos por vários eios. No primeiro, subclones do gene codificando uma proteína elicitora mhecida são produzidos por manipulação genética molecular convencional bclonando fragmentos genéticos. Os subclones são então expressados in tro ou in vivo em células bacterianas para dar uma proteína menor ou um ptídeo que pode ser testado para atividade elicitora de acordo com o ocedimento descrito abaixo.

Como uma alternativa, fragmentos de uma proteína elicitora podem ser produzidos por digestão de uma proteína elicitora de comprimento completo com enzimas proteolíticas como quimotripsina ou proteinase A de Staphylococcus, ou tripsina. Enzimas proteolíticas diferentes clivam arovavelmente proteínas elicitoras em sítios diferentes com base na sequência de aminoácidos da proteím elicitora. Alguns dos fragmentos que resultam de proteólise podem ser elicitoreà ativos de resistência.

Em outra abordagem, com base no conhecimento da estrutura primária da proteína, fragmentos do gene da proteína elicitora podem ser sintetizados usando a técnica PCR junto com conjuntos específicos de miciadores escolhidos para representar porções particulares da proteína. Estes mtão podem ser clonados em um vetor apropriado para aumento e expressão de uma proteína ou peptídeo truncado. Síntese química pode também ser usada para preparar fragmentos apropriados. Esta síntese é realizada usando sequências de iminoácidos para o elicitor sendo produzido. Altemativamente, submetendo-se um elicitor de comprimento completo a pressões e temperaturas elevadas serão produzidos fragmentos. Estes fragmentos podem, então, ser separados Dor procedimentos convencionais (por exemplo, cromatografia, SDS-PAGE).

Um exemplo de um fragmento útil é o fragmento popAl da iroteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Pseudomonas wlanacearum. Ver Arlat, M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet e 2 A. Boucher, “PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-like lesponse in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of °seudomonas solanacearum,” EMBQ J. 13: 543-53 (1994), que é ncorporado aqui por referência. Como para Erwinina amylovora, um fragmento apropriado pode ser, por exemplo, qualquer um ou ambos lolipeptídeo se estendendo entre e incluindo aminoácidos 1 e 98 da SEQ ID SÍO: 3 e o polipeptídeo se estendendo entre e incluindo aminoácidos 137 e 204 da SEQID NO: 3.

Variantes podem também (ou altemativamente) ser modificadas, por exemplo, pela deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima sobre as propriedades, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma sequência de sinal (ou líder) na extremidade terminal N da proteína que dirige co-translacionalmente ou pós-translacionalmente a transferência da proteína. O polipeptídeo pode ser também conjugado a uma sequência ligadora ou outra para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo. A proteína ou polipeptídeo da presente invenção é, preferivelmente, produzida na forma purificada (preferivelmente pelo menos cerca de 60%, mais preferivelmente 80%, pura) por técnicas convencionais. Tipicamente, a proteína ou polipeptídeo da presente invenção é produzida, mas não secretada, no meio de crescimento de células hospedeiras recombinantes. Altemativamente, a proteína ou polipeptídeo da presente invenção é secretada no meio de crescimento. No caso de proteína não secretada, isolar a proteína, a célula hospedeira (por exemplo, E. coli) conduzindo um plasmídeo recombinante é propagada, lisada por tratamento por som, tratamento a quente ou químico, e o homogenado é centrifugado para remover resíduos bacterianos. O sobrenadante é então submetido a tratamento a quente e a proteína elicitora de resposta hipersensível é separada por centrífiigação. A fração do sobrenadante contendo o polipeptídeo ou proteína da presente invenção é submetida a filtragem com gel em uma dextrano apropriadamente dimensionado ou coluna de poliacrilamida para separar as proteínas. Se necessário, a fração de proteína pode ser ainda purificada por troca iônica ou HPLC. A molécula de DNA codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser incorporada nas células usando tecnologia de DNA recombinante convencional. Geralmente, i&to envolve inserir a molécula de DNA em um sistema de expressão em que a molécula de DNA é heteróloga (isto é, não normalmente presente). A molécula de DNA heteróloga é inserida no vetor ou sistema de expressão na orientação de sentido próprio e quadro de leitura correto. O vetor contém os elementos necessários para a transcrição e tradução de sequências de codificação de proteína inseridas.

Patente US n2 4.237.224 para Cohen e Boyer, que é incorporada aqui por referência, descreve a produção de sistemas de expressão na forma de plasmídeos recombinantes usando clívagem de enzimas de restrição e ligação com ligase de DNA. Estes plasmídeos recombinantes são então introduzidos por meio de transformação e replicados em culturas unicelulares incluindo organismos procarióticos e células eucarióticas crescendo na cultura de tecidos.

Genes recombinantes podem também ser introduzidos em vírus, como vírus de vacina. Vírus recombinantes podem ser gerados por transfecção de plasmídeos em células infectadas com vírus.

Vetores apropriados incluem, mas não estão limitados aos seguintes vetores virais como sistema de vetor lambda gtll, gt WES.tB, Charon 4, e vetores de plasmídeos como pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC1084, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKClOl, SV 40, pBíuescript II SK +/- ou KS +/- (ver Catálogo “Stratagene Cloning Systems” (1993) de Stratagene, La Jolla, Calif, que é incorporado aqui por referência), séries pQE, pIH821, pGEX, pET (ver F.W. Studier et al., “Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes,” Gene Expression Techonology vol. 185 (1990), que é incorporado aqui por referência), e quaisquer derivados dos mesmos. Moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células via transformação, particularmente transdução, conjugação, mobilização ou eletroporação. As sequências de DNA são clonadas no vetor usando procedimentos de clonagem padrões na arte, como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1989), que é incorporado aqui por referência.

Uma variedade de sistemas de vetor-hospedeiro pode ser utilizada para expressar a(s) sequência(s) codificando proteínas. Primeiramente, o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Sistemas vetor-hospedeiro incluem, mas não estão limitados aos seguintes: bactérias transformadas com DNA de bacteriófago, DNA de plasmídeo, ou DNA de comídeo; microorganismos como levedura contendo vetores de levedura; sistemas de células de mamíferos infectadas com vírus (por exemplo, vírus vacínia, adenovírus, etc.); sistemas de células de insetos infectadas com vírus (por exemplo, baculovírus); e células de plantas infectadas por bactérias. Os elementos de expressão destes vetores variam em sua resistência e especificidades. Dependendo do sistema vetor-hospedeiro utilizado, qualquer um de um número de elementos de tradução e transcrição apropriados pode ser usado.

Sinais genéticos diferentes e eventos de processamento controlam muitos níveis de expressão de genes (por exemplo, transcrição de DNA e tradução de RNA mensageiro (mRNA).

Transcrição de DNA depende da presença de um promotor que é uma sequência de DNA que dirige a ligação de polimerase RNA e, assim, promove síntese, de mRNA. As sequências de DNA de promotores eucarióticos diferem das dos promotores procarióticos. Além disso, promotores eucarióticos e sinais genéticos que os acompanham podem não ser reconhecidos em ou podem não funcionar em um sistema procariótico, e, ainda, promotores procarióticos não são reconhecidos e não funcionam em células eucarióticas.

Similarmente, tradução de mRNA em procarióticos depende da presença dos sinais procarióticos próprios que diferem dos de eucarióticos. Tradução eficaz de mRNA em procarióticos requer um sítio de ligação de ribossomas denominado a sequência Shine-Dalgamo (“SD”) no mRNA. Esta sequência é uma sequência de nucleotídeos curta do mRNA que está localizado antes do códon de partida, geralmente AUG, que codifica a metionina terminal amino da proteína. As sequências SD são complementares à extremidade 3’ do rRNA 16S (RNA ribossomal) e, provavelmente, promove ligação de mRNA a ribossomas por duplexação com o rRNA para permitir posicionamento correto do ribossoma. Para um estudo na maximização da expressão de genes, ver Roberts and Lauer, Methods in Enzvmologv. 68:473 (1979), que é incorporado aqui por referência.

Promotores variam em sua “resistência” (isto é, sua capacidade de promover transcrição). Para os fins de expressar um gene clonado, é desejável usar promotores fortes a fim de obter um nível alto de transcrição e, consequentemente, expressão do gene. Dependendo do sistema de célula hospedeira utilizado, qualquer um dentre vários promotores apropriados pode ser usado. Por exemplo, quando clonando em E. coli, seus bacteriófagos, ou plasmídeos, promotores como o promotor de fago T7, promotor lac, promotor írp, promotor recA, promotor de DNA ribossomal, os promotores PR e PL de lambda colifago e outros, incluindo mas não limitado, a lac\JV5, ompF, bla, Ipp, e outros, podem ser usados para dirigir níveis altos de transcrição de segmentos de DNA adjacentes. Adicionalmente, um promotor (tac) trp-lac\JV5 híbrido ou outros promotores de E. coli produzidos por DNA recombinante ou outras técnicas de DNA sintéticas podem ser usados para prover transcrição do gene inserido.

Cepas de células hospedeiras bacterianas e vetores de expressão podem ser escolhidos, os quais inibem a ação do promotor, a menos que especificamente induzidos. Em algumas operações, a adição de indutores específicos é necessária para transcrição eficaz do DNA inserido.

Por exemplo o operon lac é induzido pela adição de lactose ou IPTG (isopropiltio-beta-D-galactosídeo). Uma variedade de outros operons, como trp,pro, etc., estão sob controles diferentes.

Sinais de iniciação específicos são também requeridos para translação e transcrição de genes eficazes em células procarióticas. Estes sinais de iniciação para translação e transcrição podem variar na “resistência” quando medidos pela quantidade de RNA mensageiro específico de genes e proteína sintetizada, respectivamente. O vetor de expressão de DNA, que contém um promotor, pode também conter qualquer combinação de vários sinais de iniciação para translação e/ou transcrição “fortes”. Por exemplo, translação eficaz em E. coli requer uma sequência SD de cerca de 7-9 bases 5’ no códon de iniciação (ATG) para prover um sítio de ligação de ribossoma. Assim, qualquer combinação SD-ATG que pode ser utilizada pelos ribossomas de células hospedeiras pode ser empregada. Estas combinações incluem, mas não estão limitadas à combinação SD-ATG do gene cro ou do gene N de lambda colifago, ou dos genes E, D, C, B ou A triptofano E. coli. Adicionalmente, qualquer combinação SD-ATG produzida por técnicas de DNA recombinante ou outras envolvendo incorporação de nucleotídeos sintéticos pode ser usada.

Uma vez a molécula de DNA isolada codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tenha sido clonada em um sistema de expressão, ela está pronta para ser incorporada em uma célula hospedeira. Esta incorporação pode ser realizada pelas várias formas de transformação acima indicadas, dependendo do sistema vetor/célula hospedeira. Células hospedeiras apropriados incluem, mas não estão limitadas a, bactérias, vírus, levedura, células de mamíferos, inseto, plant^e outros. O processo da presente invenção pode ser utilizado para tratar uma ampla variedade de plantas ou suas sementes para melhorar o crescimento. Plantas apropriadas incluem dicotiledôneas e moncotiledôneas. Mais particularmente, plantas de cultura utilizáveis pode incluir, arroz, trigo, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, abóbora-moranga, zuccini, pepino, maçã, pera, melão, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo e cana-de-açúcar. Exemplos de plantas ornamentais apropriadas são: rosa, Saintpaulia, petúnia, V pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo e zínia. O processo da presente invenção envolvendo aplicação da proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser realizado através de uma variedade de procedimentos quando toda ou parte da planta é tratada, incluindo folhas, caules, raízes, etc. Isto pode (mas não necessita) envolver infiltração da proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível na planta. Processos de aplicação apropriados incluem aplicação tópica (por exemplo, pulverização alta e baixa pressão), injeção, polvilhamento, e abrasão da folha próxima quando a aplicação do elicitor se realiza. Quando do tratamento de sementes de planta, de acordo com a forma de realização da aplicação da presente invenção, o polipeptídeo ou proteína í elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado por aplicação tópica (pulverização em baixa ou alta pressão), revestimento, imersão, polvilhamento ou injeção. Outros procedimentos de aplicação apropriados podem ser considerados pelos versados na arte com a condição de que eles sejam capazes de efetuar o contacto da proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível com células da planta ou sementes da planta. Uma vez tratadas com o elicitor de resposta hipersensível da presente invenção, as sementes podem ser plantadas em solo natural ou artificial e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas. Após as plantas terem se propagado das sementes tratadas de acordo com a presente invenção, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações do polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível para melhorar o crescimento nas plantas. As plantas propagadas podem, por sua vez, ser úteis na produção de sementes ou propágulos (por exemplo, mudas) que produzem plantas capazes de crescimento melhorado. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado a plantas ou sementes de plantas, de acordo com a presente invenção, sozinho ou em mistura com outros materiais. Altemativamente, a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado separadamente a plantas com outros materiais sendo aplicados em períodos diferentes.

Uma composição apropriada para tratar plantas ou sementes de plantas de acordo com a forma de realização de aplicação da presente invenção contém uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em um veículo. Veículos apropriados incluem água, soluções aquosas, suspensões ou pós secos. Nesta forma de realização,-a composição contém mais do que 0,5 nM de proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível.

Apesar de não requerido, esta composição pode conter aditivos adicionais incluindo fertilizante, inseticida, fungicida, nematicida, herbicida e misturas dos mesmos. Fertilizantes apropriados incluem (NH4)2N03. Um exemplo de um inseticida apropriado é Malathion. Fungicidas úteis incluem Captan.

Outros aditivos apropriados incluem agentes de tamponamento, agentes umectantes, agentes de revestimento e agentes de abrasão. Estes materiais podem ser usados para facilitar o processo da presente invenção. Além disso, a proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado a sementes de plantas com outra formulação de semente convencional e materiais de tratamento, incluindo irgilas e polissacarídeos.

Na forma de realização alternativa da presente invenção involvendo o uso de plantas transgênicas e sementes transgênicas, uma >roteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível não necessita ier aplicado topicamente às plantas ou sementes. Em vez disso, plantas ransgênicas transformadas com uma molécula de DNA codificando uma woteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível são produzidas de icordo com procedimentos bem conhecidos na arte, como por biolísticos ou ransformação mediada por Agrobacterium. Exemplos de vasoínas ou lolipeptídeos elicitores de resposta hipersensível e as sequências de ácido tucleico para seu DNA de codificação são descritos supra. Uma vez que >lantas transgênicas deste tipo são produzidas, as plantas propriamente ditas >odem ser cultivadas de acordo com procedimento convencional com a iresença do gene codificando o elicitor de resposta hipersensível resultando lo crescimento melhorado da planta. Altemativamente, sementes ransgênicas são recuperadas de plantas transgênicas. Estas sementes podem ntão ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais tara produzir plantas transgênicas. As plantas transgênicas são propagadas Ias sementes transgênicas plantadas em condições eficazes para conferir rescimento melhorado. Apesar de não se desejar estar ligado por teoria, a nelhora do crescimento pode ser mediada por RNA ou pode resultar da xpressão da proteína ou polipeptídeo elicitor.

Quando plantas transgênicas e sementes de plantas são usadas ,e acordo com a presente invenção, elas, além disso, podem ser tratadas com 'S mesmos materiais como são usados para tratar as plantas e sementes às uais uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é plicada. Estes outros materiais, incluindo elicitores de resposta hipersensível podem ser aplicados às plantas transgênicas e sementes de plantas pelos rocedimentos indicados acima, incluindo pulverização com alta ou baixa pressão, injeção, revestimento, polvilhamento e imersão. Similarmente, após as plantas serem propagadas de sementes de plantas transgênicas, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações do elicitor de resposta hipersensível para melhorar o crescimento das plantas. Estas plantas podem ser também tratadas com agentes de tratamento de plantas convencionais (por exemplo, inseticidas, fertilizantes, etc.). As plantas transgênicas da presente invenção são utilizáveis em propágulos ou sementes em produção (por exemplo, mudas) dos quais as plantas capazes de crescimento melhorado podem ser produzidas.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora sobre a porcentagem de germinação Sementes da variedade tomate Marglobe foram submergidas em 40 ml da solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora (“harpin”). Harpin foi preparado cultivando a cepa DH5 de E. coli contendo o plasmídeo pCPP2139 (ver figura 1), lisando as células por tratamento com som, tratando com calor mantendo-se em água quente durante 5 minutos antes de centrifugar para remover resíduos celulares, e precipitando proteínas e outros componentes instáveis ao calor. A preparação resultante (“CFEP”) foi diluída em série. Estas diluições (1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640) continham 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 pgm/ml, respectivamente, de harpin com base em teste Western Blot. Sementes foram embebidas em harpin ou tampão em béquers no dia 0, durante 24 h a 28°C, em uma câmara de crescimento. Após embaimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1. Este procedimento foi realizado em 100 sementes por tratamento.

Tratamentos: 1. Sementes em harpin (1:40) (20 pgm/ml). 2. Sementes em harpin (1:80) (10 pgm/rnl). 3. Sementes em harpin (1:160) (5 pgm/ml). 4. Sementes em harpin (1:320) (2,5 pgm/ml). 5. Sementes em harpin (1:640) (1,25 pgm/ml). 6. Sementes em harpin (KP04 5mM, pH 6,8). TABELA 1 - Número de arbustos após tratamento das sementes Tratamento Número de sementes germinadas Dia 0 Dia 1 Dia 5 Dia 7 Dia 9 Embeber semente em harpin (20 pgm/ml) 43 57 59 Embeber semente em harpin (10 pgm/ml) 43 52 52 Embeber semente em harpin (5 pgm/ml)) 40 47 51 Embeber semente em harpin (2,5 pgm/ml) 43 56 58 Embeber semente em harpin (1,25 pgm/ml) 38 53 57 Embeber semente em tampão 27 37 40 Como mostrado na tabela 1, o tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora reduziu o tempo necessário para germinação e aumentou grandemente a porcentagem de germinação.

Exemplo 2 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na altura do tomateiro Sementes da variedade de tomate Marglobe foram submergidas em tampão ou harpin de Erwinia amylovora (1:15, 1:30, 1:60 e 1:120) em béquers no dia 0 durante 24 h a 28°C em uma câmara de crescimento. Após embebimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1.

Dez plantas parecendo uniformes por tratamento, foram ,χ'"Λ / escolhidas aleatoriamente e medidas. Os arbustos foram ^medidor pór régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos: 1. Harpin (1:15) (52 μ§ιη/πι1). 2. Harpin (1:30( (26 μ§τη/πι1). 3. Harpin (1:60) (13 μ§τηΛη1). 4. Harpin (1:120) (6,5 pgm/ml). 5. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8) TABELA 2 Alturpsdo arbustos (cm) 15 dias após tratamento da semente. TABELA 3 Altura dos arbustos (cm) 21 dias após tratamento da semente. TABELA 4 " Altura dos arbustos (cm) 27 dias após tratamento da semente. TABELA 5 -Sumário - Altura média dos tomateiros após tratamento. Tratamento Altura média das tomateiros (cm) DiaO Dia 1 Dia 15 Dia 21 Dia 27 Embeber semente em harpin (1:15) semeadura 5,7 7,7 10,5 Embeber semente em harpin (1:30) semeadura 7,0 8,6 11,6 Embeber semente em harpin (1:60) semeadura 5,9 6,9 9,7 Embeber semente em harpin (1:120) semeadura 5,4 6,7 9,5 Embeber semente em tampão semeadura 5,3 6,5 10,0 Como mostrado nas tabelas 2-5, o tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível de Erwinia amylovora aumentou o crescimento das plantas. Uma diluição 1:30 teve o efeito maior -um aumento de 16% na altura dos arbustos.

Exemplo 3 - Efeito do tratamento de tomateiros com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na altura dos tomateiros Quando tomateiros Marglobe tinham 4 semanas de idade, foram pulverizados com 6 ml/solução de harpin de Erwinia amylovora contendo 13 pgm/ml (1:60) ou 8,7 pgm/ml (1:90) de harpin ou tampão (KP04 5mM) em uma câmara de crescimento a 28°C. As alturas dos tomateiros foram medidas 2 semanas após pulverização com harpin (tomateiros com 6 semanas de idade) e 2 semanas mais 5 dias após pulverização. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medidas. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos: 1. Harpin (1:60) 13 pgm/ml). 2. Harpin (1:90) 8,7 pgm/ml).) 3. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8). TABELA 6 - Altura média dos tomateiros após tratamento com harpin.

Operação e Tratamento Altura média (cm) dos tomateiros DiaO Dia 14 Dia 28 Dia 42 Dia 47 semeadura transplante harpin 1:60 35,5 36,0 (13 pgm/ml) semeadura transplante harpin 1:90 35,7 36,5 (8,7 pgml/ml) semeadura transplante tampão 32,5 33,0 Como mostrado na tabela 6, pulverização de arbustos de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. Aumentos similares no crescimento foram observados para as duas doses do elicitor de resposta hipersensível testado comparado com o controle tratado com tampão.

Exemplo 4 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na altura de tomateiros.

Sementes de tomate Marglobe foram submergidas em solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora (“harpin”) (1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640) ou tampão em béquers no dia 0 durante 24 h a 28°C na câmara de crescimento. Após embeber as sementes em harpin ou tampão, elas foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medidas. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos: 1. Harpin (1:40) (20 pgm/ml). 2. Harpin (1:80) (10 pgm/ml). 3. Harpin (1:160) (5 pgm/ml). 4. Harpin (1:320) (2,5 pgm/ml). 5. Harpin (1:640) (1,25 pgm/ml). 6. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8). TABELA 7 - Altura dos arbustos (cm) 12 dias após tratamento das sei Trat. Plantas 12 3 4 5 6 7 8 9 20 /tgm/tnl 10 6.5 6.8 6.8 6.5 6.4 6.4 6.8 6.4 6.8 10 Mgm/ml 10 6.8 6.2 6.6 6.4 6.8 6.8 6.6 6.4 6.8 , 5 figm/nil 10 6.2 6.6 6.0 6.6 6.4 6.2 6.6 6.2 6.0 2.5 jigm/ml 10 6.4 6.2 6.6 6.0 6.2 6.4 6.0 6.0 6.2 1.25 /igm/ml 10 6.2 6.2 6.0 6.4 6.0 6.0 6.4 6.2 6.4 Tampão 10 5.8 6.0 6.2 6.2 5.8 5.8 6.0 6.2 6.0 TABELA 8 ' Altura dos arbustos (cm) 14 dias após tratamento das st Trat. Plantas 123456789: 20 /igm/ml 10 7.8 7.8 8.2 8.0 8.2 8.4 7.B 8.4 7.6 7 10 figm/ml 10 8.6 8.8 8.4 9.2 8.4 8,6 7.8 7.8 8.4 8 5 /tgm/ml 10 9.8 9.2 9.8 9.6 9.2 9.4 8.6 9.2 9.0 8 2.5 jigm/ml 10 8.8 8.6 8.6 8.4 7.8 8.6 8.4 9.0 8.0 7 1.25 figm/ml 10 8.4 7.8 8.4 8.0 8.6 8.4 8.0 8.2 8.4 8 Tampão íg 7.2 8.2 7.4 7.6 7,8 7.6 7,8 7.4 7.8 7 TABELA 9 - Altura dos arbustos (cm) 17 dias após tratamento das sementes. TABELA 10 - Sumário - Altura média dos tomateiros após tratamento Operação e Tratamento Altura média de tomateiros (cm) DiaO Dia 1 Dia 12 Dia 14 Dia 17 Embeber semente em harpin (20 pgm/ml) semeadura 6,6 8,0 11,5 Embeber semente em harpin (I0pgm/ml) semeadura 6,6 8,4 13,2 Embeber semente cm harpin (5 pgm/ml) semeadura 6,3 9,2 13,5 Embeber semente em harpin (2,5 pgm/ml) semeadura 6,2 8,4 12,0 Embeber semente em harpin (1,25 pgm/inl) semeadura 6,2 8,2 11,0 Embeber semente em tampão semeadura 6,0 7,6 10,4 Como mostrado nas tabelas 7-10, o tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. Uma diluição 1:160 (5 pgm/ml harpin) teve o o maior efeito - altura do arbusto foi aumentada em mais do que 20% sobre as plantas tratadas com tampão.

Exemplo 5 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na porcentagem de geração de sementes Sementes de tomate Marglobe foram submergidas em 40 ml de solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora (“harpin”) (diluições de CFEP de DH5 E. coli (pCPP2139) de 1:50 ou 1:100 que continha, respectivamente, 8 pgrn/ml e 4 pgm/l do elicitor de resposta hipersensível) e tampão em béquers no dia 0 durante 24 h a 28°C em uma câmara de crescimento. Após embebimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1. Este tratamento foi realizado em 20 sementes por vaso e 4 vasos por tratamento.

Tratamentos: 1. Harpin (8 pgm/ml). 2. Harpin (8 μgm/ml). 3. Harpin (8 μ§πι/ιη1). 4. Harpin (8 μgm/ml). 5. Harpin (4 pgm/ml). 6. Harpin (4 μ£ΐη/ιη1). 7. Harpin (4 pgm/ml). 8. Harpin (4 pgm/ml). 9. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8). 10. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8). 11. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8). 12. Tampão (KP04 5mM, pH 6,8). TABELA 11 - Número de arbustos após tratamento das sementes com harpin.

Operação e Tratamento Número de sementes germinadas (fora de um total de 20) Dia 0 Dia 1 Dia 5 Dia 42 Dia 47 Média Média Média Harpin (8 pgm/l) Semeadura 11 15 19 Harpin (8 pgm/l) Semeadura 13 17 20 Harpin (8 pgm/l) Semeadura 10 13 16 Harpin (8 jü.gm/1) Semeadura 9 10,8 15 15,0 16 17,8 Harpin (4 pgm/l) Semeadura 11 17 17 Harpin (4 pgm/l) Semeadura 15 17 18 Harpin (4 pgm/l) Semeadura 9 12 14 Harpin (4 pgm/l) Semeadura 9 11,0 14 15,0 16 16,3 Tampão Semeadura 11 11 14 Tampão Semeadura 9 14 15 Tampão Semeadura 10 14 14 Tampão Semeadura 10 10,0 12 12,8 14 14,3 Como mostrado na tabela 11, tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar a taxa de germinação e o nível de tomateiros. A dose mais alta usada pareceu ser mais eficaz do que tampão ao término da experiência. Exemplo 6 - Efeito no crescimento de plantas do tratamento de sementes de tomate com proteínas preparadas de E. coli contendo uma construção codificando o elicitor de resposta hipersensível , pCPP2139, ou vetor de plasmídeo pCPP50 Sementes de tomate Marglobe foram submergidas no elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora (“harpin”) (de DH5a E. coli (pCPP2139) (figura 1) ou preparação de vetor (de DH5a (pCPP50) (figura 2) com proteína BSA adicionada como controle. A preparação do vetor de controle continha, por ml, 33,6 μΐ de BSA (10 mg/1) para prover cerca da mesma quantidade da proteína contida na preparação de pCPP2139 devido a harpin. Diluições de 1:50 (8,0 μg/ml), 1:100 (4,0 μg/ml) e 1:200 (2,0 μg/ml) foram preparadas em béquers no dia 1, e a semente foi submergida durante 24 horas a 28°C, em uma câmara com ambiente controlado.

Após embebimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 2. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento, foram escolhidas aleatoriamente e medidas três vezes após transplante. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos: 1. Harpin 1:50 (8,0 μg/ml) 2. Harpin 1:100 (4,0 μg/ml) 3. Harpin 1:200 (2,0 μg/ml) 4. Vetor + BS A 1:50 (0 harpin) 5. Vetor+ BSA 1:100(0 harpin) 6. Vetor + BS A 1:200 (0 harpin) TABELA 12 Altura dos arbustos (cm) 18 dias após tratamento das sementes. TABELA 13 Altura dos arbustos (cm) 22 dias após tratamento das sementes. TABELA 14 - Altura dos arbustos (cm) 36 dias após tratamento das sementes. TABELA 15 - Altura media dos tomateiros após tratamento.

Operação e Tratamento Altura média de tomateiros (cm) Dia 1 Dia 2 Dia 18 Dia 22 Dia 26 Harpin (1:50) (8,0 pgm/ml) semeadura 4,7 5,2 8,5 Harpin (1:100) (4,0 pgm/ml) semeadura 5,8 7,2 11,2 Harpin (1:200) (2,0 pgm/inl) semeadura 5,1 7,0 10,8 Vetor + BSA (1:50) (0) semeadura 4,9 5,8 9,2 Vetor + BSA (1:100) (0) semeadura 4,8 5,7 9,3 Vetor -i- BSA (1:200) (0) semeadura 4,9 5,9 9,0 Como mostrado nas tabelas 12-15, tratamento com E. coli contendo o gene codificando o elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. A diluição 1:100 (4,0 pg/ml) teve o efeito maior, enquanto concentrações mais baixas e mais altas tiveram efeito menor. Altura média de arbustos para tratamento com 4,0 μ g/ml de harpin foi aumentada a cerca de 20% com relação à preparação do vetor de controle que continha uma quantidade similar de proteína não-harpin. Componentes de preparação de célula lisada da cepa DH5a de E. coli (pCPP50), que abrigam o vetor do gene hrpN na cepa DH5ot de E. coli (pCPP2139), não têm o mesmo efeito promotor de crescimento como a preparação contendo harpin, mesmo dado que é suplementado com proteína BS A na mesma extensão que a preparação de DH5a (pCPP2139), que contém quantidades grandes da proteína harpin.

Exemplo 7 - Efeito no crescimento de tomateiros do tratamento de sementes de tomate com proteínas preparadas de E. coli contendo uma construção codificando um elicitor, pCPP2139, ou seu vetor de plasmídeo pCPP50 Sementes de tomate Marglobe foram submergidas em solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora (“harpin”) (do vetor de plasmídeo pCPP2139 codificando harpin) e da solução contendo o vetor pCPP50 em diluições de 1:25, 1:50 e 1:100 em béquers, no dia 1 durante 24 h a 28oC em uma câmara de crescimento. Após embebimento das sementes, elas foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 2. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medida. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos: 1. Harpin 16 pgm/ml 2. Harpin 8 pgm/ml 3. Harpin 4 pgm/ml 4. Vetor 16 μ^ρη/ιτιΐ 5. Vetor 8 μgm/ml 6. Vetor 4 μ$πη/ιη1 TABELA 16 - Altura dos arbustos (cm) 11 dias após tratamento das sementes. TABELA 17 " Altura dos arbustos (cm) 14 dias após tratamento das sementes. TABELA 18 - Altura média dos tomateiros após tratamento. Operação e Tratamento Altura média de tomateiros (cm) Dia 1 Dia 2 Dia 11 Dia 14 Embeber semente em harpin (16 pgm/ml) semeadura 4,5 7,4 Embeber semente em harpin (8 pgm/ml) semeadura 5,5 8,2 Embeber semente em harpin (4 pgm/ml) semeadura 5,1 7,9 Embeber semente em vetor (16 pgm/ml) semeadura 4,5 6,7 Embeber semente em vetor (8 pgm/ml) semeadura 4,4 6,7 Embeber semente em vetor semeadura 4,3 6,4 Como mostrado nas tabelas 16-18, o tratamento com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. Uma diluição de 1:50 (8 pg/ml de elicitor de resposta hipersensível) teve o efeito maior com a altura do arbusto sendo aumento por cerca de 20% sobre o controle.

Exemplo 8 - Efeito do elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora isento de célula no crescimento de batata Tomateiros com 3 semanas de idade, variedade Norchip, cresceram em pedaços de tubérculos em recipientes individuais. A folhagem de cada planta foi pulverizada com uma solução contendo elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora (“harpin”), ou uma solução de controle contendo proteínas de E. coli e as do vetor pCPP50 (“vetor”), diluída 1:50, 1:100 e 1:200. No dia 20, 12 plantas parecendo uniformes foram escolhidas aleatoriamente para um dos seguintes tratamentos. Uma planta de cada tratamento foi mantida a 16°C em uma câmara de crescimento, enquanto duas plantas de cada tratamento foram mantidas em um banco de estufa a 18-25°C. Vinte e cinco dias após tratamento, os brotos (caules) de todas as plantas foram medidos individualmente.

Tratamentos: 1. Harpin 1:50 16 pgm/ml 2. Harpin 1:100 8 μ§τη/ηι1 3. Harpin 1:200 4 μίρη/τηΐ 4. Vetor 1:50 0 harpin 5. Vetor 1:100 0 harpin 6. Vetor 1:200 0 harpin TABELA 19 - Comprimento dos caules de plantas de batata a 16"C Tratamento no dia 20 Comprimento dos caules de batata (cm) Caule no dia 45 Caule 1 Caule 2 Caule 3 Caule 4 Caule 5 Caule 6 Planta media Harpíti 1:50 43,0 39,5 42,5 34,0 38,0 39,5 39,4 Harpin 1:100 42,0 38,5 (2 ramos) 40,3 Harpin 1:200 35,5 30,5 31,5 (3 ramos) 32,5 Vetor 1:50 34,0 32,0 31,5 28,0 27,5 (5 ramos) 30,6 Vetor 1:100 . 30,0 33,5 33,0 30,0 28,0 33,0 31,3 Vetor 1:200 _ 33,5 31,5 _ 32,5 (3 ramos) _ _ 32,5 TABELA 20 - Comprimento dos caules de batata em um banco de estufa Tratamento no dia 20 Comprimento dos caules de batata (cm) Caule no dia 45 Caule 1 Caule 2 Caule 3 Caule 4 Caule 5 Caule 6 Planta média Tratam, medio Harpin 1:50 65,5 58,5 57,5 62,5 68,5 (5 ramos) 62,5 Harpin 1:50 62,5 67,0 65,0 69,0 (4 ramos) 65,9 64,2 Harpin 1:100 70,5 73,5 74,0 80,5 (4 ramos) 74,6 Harpin 1:100 83,0 80,5 76,5 76,0 81,5 (5 ramos) 79,5 77,1 Harpin 1:200 56,5 59,5 50,5 53,0 55,5 48,0 53,9 Harpin 1:200 57,0 59,5 69,5 (3 ramos) 62,0 58,0 Vetor 1:50 53,0 62,0 59,5 62,5 (4 ramos) 59,3 Vetor 1:50 52,0 46,0 61,5 56,5 61,5 57,0 55,8 57,6 Vetor 1:100 62,0 51,5 66,0 67,5 62,0 63,0 62,0 Vetor 1:100 61,5 62,5 59,0 65,5 63,0 63,5 62,5 62,3 Vetor 1:200 62,0 66,0 (2 ramos) 64,0 Vetor 1:200 61,0 60,0 _63,5 _ (3 ramos) _ __ _61,5 ________62,8 Como mostrado nas tabelas 19 e 20, o tratamento de plantas de batata com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora melhorou o crescimento dos brotos (caules). Assim, o crescimento total, como julgado tanto pelo número e comprimentos médios dos caules, foi maior nas plantas tratadas com harpin tanto em plantas crescendo em câmara de crescimento como em estufa. As plantas de batata tratadas com a dose média de harpin (6 pgm/ml) pareceram melhorar em seu crescimento de caule mais do que as tratadas tanto com doses mais altas como mais baixas. Tratamento com a dose média de harpin resultou em crescimento maior em ambas as condições de crescimento.

Exemplo 9 - Efeito da pulverização em tomates com uma preparação de elicitor isenta de célula contendo o harpin de Erwinia amylovora Tomateiros Marglobe foram pulverizados com preparação de harpin (de DH5ct de E. coli (pCPP2139)) ou preparação de vetor (de DH5 cc de E. coli (pCPP50)) com proteína BSA adicionada como controle 8 dias após transplante. A preparação do vetor de controle continha, por ml, 33,6 μΐ de BSA (10 mg/ml) para prover cerca da mesma quantidade de proteína como contida na preparação de pCPP2139 devido a harpin. Diluições de 1:50 (8,0 pg/ml), 1:100 (4,0 μg/ml), e 1:200 (2,0 μg/ml) foram preparadas e pulverizadas nas plantas até escoar com um atomizador em pó com eletricidade. Quinze plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e designadas para tratamento. As plantas foram mantidas a 28°C em uma câmara com ambiente controlado antes e após o tratamento.

Alturas totais foram medidas várias vezes após tratamento da superfície do solo ao topo da planta. Os topos dos tomateiros foram pesados imediatamente após cortar os caules próximo à superfície do solo. Tratamentos: (Diluições e teor de harpin) 1. Harpin 1:50 (8,0 pg/ml) 2. Harpin 1:100 (4,0 pg/ml) 3. Harpin 1:200 (2,0 pg/ml) 4. Vetor + BSA 1:50 (0 harpin) 5. Vetor + BSA 1:100 (0 harpin) 6. Vetor + BSA 1:200 (0 harpin) TABELA 21 Altura dos tomateiros (cm) 1 dia após tratamento com pulverização ' TABELA 22 ’ Altura dos tomateiros (cin) 15 dia após tratamento com pulverização TABELA 23 - Altura dos tomateiros (cm) 21 dias após tratamento com pulverização TABELA 24 - Altura média dos tomateiros após pulverização Tratamento (Dil. & harpin) Altura media dos tomateiros (cm) Dias após tratamento Dial Dia 11 Dia 14 Harpin 1:50 (8,0 pg/ml) 5,16 22,2 28,1 Harpin 1:100 (4,0 pg/ml) 5,15 27,5 37,5 Harpin 1:200 (2,0 pg/ml) 5,13 26,0 33,2 Vctor+BSA 1:50 (0) 5,15 21,7 28,5 Vclor + BSA 1:100 (0) 5,123 21,4 28,6 Vctor + BSA 1:200 (0) 5,16 21,8 28,7 TABELA 25 - Peso novo dos tomateiros (g/planta) 21 dias após tratamento com pulverização Uma pulverização única de arbustos de tomate com harpin, em geral, resultou no crescimento subsequente maior do que tratamento com pulverização com a preparação de controle (vetor), que foi suplementada com proteína BSA. Crescimento melhorado em plantas tratadas com harpin foi observado em ambas as medições de altura e de peso novo. Das três concentrações testadas, as duas mais baixas resultaram em mais crescimento das plantas (com base em qualquer medição) do que a dose mais alta (8,0 μ g/ml). Houve uma diferença pequena no crescimento das plantas tratadas com as duas concentrações mais baixas (2 e 4 μg/ml). Componentes de preparação de célula lisada de DH5ot de E. coli (pCPP50), que abriga o vetor do gene hrpNna cepa DH5a de E. coli (pCPP2139), não têm o mesmo efeito de promoção de crescimento como a preparação contendo harpin, ainda que ele seja suplementado com proteína BSA na mesma extensão como a preparação com DH5a (pCPP2139), que contém quantidades grandes da proteína harpin. Assim, esta experiência demonstra que harpin é responsável pelo crescimento de plantas melhorado.

Exemplo 10 - Amadurecimento e coloração prematuros de frutas pequenas Uma tentativa de campo foi conduzida para avaliar o efeito do tratamento (“harpin”) com elicitor de resposta hipersensível nos parâmetros e amadurecimento e produção de framboesas cv. Canby. Plantas estabelecidas foram tratadas com harpin a 2,5 mg/9,3 m2 em pedaços de 1200 cm de comprimento x 90 cm de largura), não tratadas (“Controle”), ou tratadas com o produto químico padrão na indústria Ronilam nas taxas recomendadas (“Ronilan”). Os tratamentos foram replicados quatro vezes e dispostos por rep em um sítio de campo experimental. Os tratamentos foram feitos iniciando a 5-10% de floração seguidos por duas aplicações em intervalos de 7-10 dias. As primeiras duas colheitas foram usadas para avaliar o controle de doenças e dado de produção de frutas foi coletado das últimas duas colheitas. Observações indicaram que frutas tratadas com harpin eram maiores e demonstravam mais vermelhidão do que frutas não tratadas, indicando que o amadurecimento foi acelerado por 1-2 semanas. O número de frutas maduras por agrupamentos carregando um mínimo de dez frutas foi determinado neste período e está resumido na tabela 26. Lotes de terra tratados com harpin tinham mais frutas maduras por 10 agrupamentos de framboesa do que tratamentos tanto com controle como com Ronilan. Rendimentos da produção combinados das duas últimas colheitas indicaram produção aumentada em plantas tratadas com Ronilan e harpin sobre o controle não tratado (tabela 27). TABELA 26 - Número de frutas framboesa maduras por agrupamentos com dez framboesas ou mais em 20 de junho de 1996 Tratamento Fruta madura/10 agrupamentos de framboesa % do Controle Controle 2,75 100,0 Ronilan 2,75 100,0 ____Haipin______________________7,25_________________________263,6_____ TABELA 27 - Produção de frutas framboesa médio em peso (kg) combinado com as duas últimas colheitas) Tratamento Produção total % de Controle Controle 14,75 45,4 Ronilan 17,02 52,39 Harpin 17,93 55,16 Exemplo 11 - Melhora no crescimento para feijões em vagem Feijões da variedade Blush Blue Lake foram tratadas por vários processos, plantadas em vasos de plástico de 25 cm-d carregados com mistura de vaso comercial, e colocadas em uma estufa aberta para a avaliação dos parâmetros de crescimento. Tratamentos incluíram sementes de feijão não tratadas (“Controle”), sementes tratadas com uma suspensão de 1,5% metil celulose preparada com água como diluente (“M/C”), sementes tratadas com 1,5% metil celulose seguidas por aplicação foliar do elicitor de resposta hipersensível (“harpin”) a 0,125 mg/ml (“M/C+H”), e sementes tratadas com 1,5% metil celulose mais harpin secadas por pulverização a 5,0 pg harpin por 50 sementes seguido por uma aplicação foliar de harpin a 0,125 mg/ml (“M/C-SD+H”). As sementes foram semeadas no dia 0, plantadas 3 por vaso, e reduzidas a 1 planta por vaso quando em germinação. Os tratamentos foram replicados 10 vezes e randomizados por replicação em uma estufa aberta. Vagens de feijão foram colhidas após 64 dias, e pesos novos de vagens de feijão de tamanho comercializável (> 10 cm x 5 cm em tamanho) foram colhidos como produção. Os dados foram analisados por análise de variação com LSD de Fisher usado para separar os meios de tratamento. TABELA 28 - Efeito do tratamento com harpin de Envinia amylovora por vários processos na produção de vagens de feijão de tamanho comercializável * Produção % de não tratados Tratamento comerciatizável. q1 (controlei M/C-SD+H 70.6 a 452 Ί H/C-H 58.5 ab 375 MfC 46.3 bc 2S7 M/C+H 42.3 bc 271 M/C-SD 40.0 Cd 256 controle 15.6 e 100 1 Produção comercializável incluiu todas as vagens de feijão de 10 cm x 0,5 cm ou maiores. Médias seguidas pelo mesma letra não são significativamente diferentes em p=0,05 de acordo com LSD de Fisher.

Como mostrado na tabela 28, a aplicação de harpin de Erwinia amylovora por vários processos de aplicação resultou em um aumento no produção de vagens de feijão de tamanho comercializável. Tratamento com metil celulose sozinho também resulta em um aumento na produção de feijão, mas foi substancialmente aumentado quando combinado com harpin como tratamentos de semente (sedado por pulverização) e foliares.

Exemplo 12 - Aumento na produção em pepineiros de aplicação foliar de HP-1000™ a pepineiros Transplantes e arbustos de pepineiros foram tratados com pulverizações foliares de HP-1000™ (EDEN Bioscience. Bothell, Washington) (formulações do elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) em taxas de 15, 30 ou 60 pg/ml do ingrediente ativo (a.i.). A primeira pulverização foi aplicada quando as primeiras folhas verdadeiras se expandiram. A segunda aplicação foi feita 10 dias depois da primeira pulverização. Todas as pulverizações foram aplicadas usando um pulverizador de mochila e um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Três dias após a segunda aplicação de HP-1000™, dez plantas de cada tratamento foram transplantadas em lotes de terra randomizados replicados três vezes. Isto deu um total de trinta plantas por tratamento. Sete dias após transplante, uma terceira pulverização foliar de HP-1000™ foi aplicada. Apesar da seca grave seguinte resultando em uma tensão de água significativa, um total de seis colheitas foram feitas seguindo um padrão de colheita comercial padrão. O peso total de frutas colhidas de cada tratamento é apresentado na tabela 29. Resultados indicam que plantas tratadas com HP-1000™ em taxas de 15 e 30 pg/ml deram significativamente mais frutas do que UTC. Plantas tratadas com HP-1000™ deram um aumento em produção moderada. Estes resultados indicaram que plantas tratadas com HP-1000™ eram significativamente mais tolerantes a condições de tensão de seca do que plantas não tratadas. TABELA 29 - Produção aumentada de pepineiros após tratamento com HP- 1_000™______________________________________________________________ Tratamento Taxa1 Produção,2 kg/10 % UTC acima plantas UTC - 4,40 a HP-1000™ 15 pg/ml 11,53b 161,4 HP-1000™ 30 pg/ml 14,80 236,4 HPUOOO™__________60_pg/ml__________5,08 a__________1_5_,9___________ 1 Ingrediente ativo (a.i.). 2 Médias seguidas por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, Ρ=0,05.

Exemplo 13 - Aumento na produção em algodão do tratamento com HP-1000™ Algodão foi plantado em quatro lotes de terra replicados de 3,66 m x 6,1 m em uma tentativa de campo em bloco completo randomizado (RCB). As plantas foram tratadas com HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora), HP-1000™ + Pix® (Pix® (BASF Corp., Mount Olive, N.J.) é um regulador de crescimento aplicado para manter plantas de algodão compactas em altura) ou Early Harvest® (Griffen Corp., Valdosta, Ga.) (um agente melhorador de crescimento competitivo). Um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Usando um pulverizador de mochila, aplicações foliares foram feitas de todos os tratamentos em três estágios de crescimento de culturas; primeiro as folhas verdadeiras, pré-florescência, e florescência prematura. Todos os fertilizantes e produtos de controle de ervas daninhas foram aplicados de acordo com práticas de agricultura convencionais durante todos os tratamentos. O número de bolas de algodão por planta dez semanas antes da colheita foi significativamente maior para as plantas tratadas com HP-1000™ comparado a outros tratamentos. Por colheita, tratamento com HP-1000™ mostrou ter uma produção de fibras de algodão significativamente melhorada (43%) comparado a UTC (tabela 30). Quando HP-1000™ foi combinado com Pix®, a produção de fibras de algodão aumentou em 20% sobre UTC. Uma vez que Pix® é comumente aplicado em grandes extensões de acre de algodão, este resultado indica que HP-1000™ pode ser misturado em tanques com Pix® com sucesso. Aplicação do agente melhorador de crescimento competitivo, Early Harvest® produziu somente um aumento de 9% na produção de fibras de algodão vs. UTC. TABELA 30 - Produção de fibras de algodão aumentada de algodão após tratamento com HP-1000™, HP-1000™ + Pix®, ou Early Harvest® Tratamento Taxa 1 Produção de fibras % acima de algodão (0,45 kg/0,4 ha) UTC - 942,1 UTC 56,5 g./acre. 1.077,4* 14,3 Early Harvest® 40 pg/ml+226 1.133,1* 20,4 HP-1000™+ Pix® g/0,4047 ha. 1.350,0* 43,3 HP-1000™ 40 μg/ml Isd = 122,4 (* significativo em p+0,05 1 Taxas para HP-1000™ são para ingrediente ativo (a.iõ; taxas para Early Harvest® e Pix® são produto formulado.

Exemplo 14 - Aumento na produção de beringela da China do tratamento com HP-1000™ Arbustos de beringela da China crescendo em sementeiras foram pulverizados uma vez com HP-1000™ a (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) 15, 30 ou 60 pg/ml (a.i.), depois transplantados em lotes de terra replicados três vezes para cada tratamento. Duas semanas após transplante, uma segunda aplicação de HP-1000™ foi preparada. Uma terceira e final aplicação de HP-1000™ foi aplicado aproximadamente duas semanas após a segunda pulverização. Todas as pulverizações foram aplicadas usando um pulverizador de mochila; controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Como o amadurecimento progrediu, um total de oito colheita para cada tratamento foi feito. Dados destas colheitas indicam que tratamento com HP-1000™ resultou em produção maior de fruta por planta. TABELA 31 - Produção aumentada para beringela da China após tratamento _comHP_-]°00™_____________________________________________________ Tratamento Taxa(a.i.) Produção %UTC (planta/kg) acima UTC - 0,658 HP-1000™ 15 pg/ml 0,92 40,0 HP-1000™ 30 pg/ml 0,86 31,0 HP-JOOO™________6_0_pg/ml___________________0,88___________3_4_,5__ Exemplo 15 - Produção aumentada de arroz do tratamento com HP-1000™ Arbustos de arroz foram transplantados em lotes de terra replicados três vezes, depois tratados com pulverizações foliares de HP-1000 ™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora), em três taxas diferentes, usando um pulverizador de mochila. Um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. A primeira aplicação de HP-1000™ foi feita uma semana após transplante, a segunda, três semanas após a primeira. Uma terceira e final pulverização foi feita exatamente antes dos grãos de arroz começarem a encher as cabeças. Resultados de colheita demonstraram que aplicações foliares de HP-1000™, ambas de 30 e 60 pg/ml, aumentaram significativamente a produção em 47 a 56%, respectivamente (tabela 32). TABELA 32 - produção aumentada de arroz após tratamento foliar com HP- 1J)00™____________________________________________________________ Tratamento Taxa (a.i.) Produção 1 % UTC (0,45 kg./0,4047 ha.) acima UTC - 3.853 a HP-1000™ 15 pg/ml 5.265 ab 35,9 HP-1000™ 30 pg/ml 5.710 b 47,3 HP-J00d™_________60_pg/ml_________________6.043_b__________5_6_,1__ 1 Médias seguidas por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 16 - Aumento da produção de feijões do tratamento com HP-1000™ Feijões foram plantados em lotes de terra randomizados replicados três vezes para cada tratamento. Um pulverizador de mochila foi usado para aplicar pulverizações foliares de HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) e um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Três taxas de HP-1000™ foram aplicadas começando em quatro folhas verdadeiras quando plantas tinham aproximadamente 20,24 cm de altura. Uma segunda pulverização de HP-1000™ foi aplicada dez dias após a primeira aplicação e uma terceira pulverização dez dias após a segunda. A altura das plantas medida dez dias após o tratamento com primeira pulverização indicou que aplicação de HP-1000™ resultou em melhoria de crescimento significativa (tabela 33). Além disso, plantas tratadas com HP-1000™ na taxa de 60 pg/ml começaram a florescer cinco dias antes do que com outros tratamentos. Aproximadamente dez dias após aplicação da terceira pulverização, o número de vagens de feijão por planta foi contado de dez plantas selecionadas aleatoriamente por replicação. Estes resultados indicaram que a melhora no crescimento do tratamento com HP-1000™ resultou em produção significativamente mais alto (tabela 34). TABELA 33 - Altura aumentada de plantas de feijão após tratamento foliar comHPjJOOO™______________________________________________________ Tratamento Taxa(a.i) Altura da planta1 %UTC (cm) acima UTC - 30,86 a HP-1000™ 15 pg/ml 33,39 b 8,3 HP-1000™ 30 pg/ml 35,67 c 16,2 HP-JOOO™_________60_pg/ml__________________36,17c_________1_7_,3__ 1 Médias «eguidas por diferente letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 34 - Conjunto de vagens aumentadas de feijões após tratamento _fdiarcomJP-Jj)00™1_______________________________________________ Tratamento Taxa (a.i) No de vagens/ % UTC planta1 acima UTC - 41,1 a HP-1000™ 15pg/ml 45,4 ab 10,4 HP-1000™ 30 μg/ml 47,4 b 15,4 HP-_1_000™______60_|ig/rnl________________48,4b____________17,7___ 1 Médias seguidas por diferente letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 17 - Aumento na produção de morangos do tratamento com HP-1000™ Duas tentativas de campo com HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensivel a Erwinia amylovora) foram conduzidas em duas variedades de morango., Camarosa e Selva. Para cada variedade, um projeto em bloco completo randomizado (RCB) foi estabelecido tendo quatro lotes de terra replicados (1,62 m x 3,05 m) por tratamento em um campo de morangos de produção comercial. Em cada lote de terra, plantas de morango foram plantadas em uma disposição em fileiras duplas. Um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Antes das aplicações começarem, todas as plantas foram limpadas de todas as flores e morangos. Pulverizações de HP-1000™ na taxa de 40 μ g/ml foram aplicadas em seis vezes por semana usando um pulverizador de mochila. Exatamente antes da aplicação de cada pulverização, todas as frutas maduras de cada tratamento foram colhidas, pesadas e classificadas em padrões comerciais. Em três semanas da primeira aplicação de HP-1000™ em plantas de morango Selva, a melhoria no crescimento foi discemível como biomassa acima do solo maior e uma aparência mais vigorosa, mais verde e mais saudável. Após seis colheitas (isto é, tempo de vida determinado para estas plantas), todos os dados de produção foram somados e analisados. Para a variedade Camarosa, produção de frutas comercializáveis de plantas tratadas com HP-1000™ foi significativamente aumentada (27%) sobre UTC, quando medido durante as últimas quatro colheitas (tabela 35). Diferenças significativas entre tratamentos não foram aparentes para esta variedade durante as primeiras duas colheitas. A variedade Selva foi mais respondente aos efeitos de melhora no crescimento do tratamento com HP-1000™; plantas de morango Selva deram uma fruta 64% mais comercializável estatisticamente significativa vs. o UTC quando medidos durante seis colheitas (tabela 35). TABELA 35 - produção aumentada de morangos após tratamento foliar com HP-JOOO™_______________________________________________________ Tratamento Taxa (a.i.) Produção 1 % acima (kg/rep) UTC

Variedade: Camarosa UTC - 0,776 a HP-1000™ 40 pg/ml 0,985 b 27 Variedade: Selva UTC - 0,400 a HP-JOOO™_______________40_pg/ml__________0,653 b________6_4_ __ 1 Médias seguidas por diferente letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 18 - Maturidade prematura e produção aumentada de tomates do tratamento com HP-1000™ Tomates de mercado novos (var. Solar St) cresceram em lotes de terra (0,6 lm x 9,15 m) replicados 5 vezes em uma tentativa de campo de bloco completo randomizado (RCB) em um campo de produção de tomate comercial. Tratamentos incluíram HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora), um produto competitivo experimental (Actigard™ (Novartis, Greensboro, N.C.)) e um produto químico padrão (Kocide® (Griffen Corp., Valdosta, GA)) + Maneb® (DuPont Agricultural Products, Wilmington, D.E.)) para controle de doenças. A aplicação inicial de HP-1000™ foi feita como uma poção de 50 ml (de 30 pg/ml a.i.) despejada diretamente sobre o arbusto imediatamente após o transplante. A seguir, onze pulverizações foliares semanais foram aplicadas usando um pulverizador de mochila. A primeira colheita de todos os tratamentos foi feita aproximadamente seis semanas após transplante e somente tomates maduros, completamente maduros foram colhidos de cada tratamento. Resultados indicaram que plantas tratadas com HP-1000™ tiveram uma quantidade significativamente maior de tomates prontos para a primeira colheita (tabela 36). Estima-se que os tomates colhidos de plantas tratadas com HP-1000™ tinham 10-14 dias à frente de outros tratamentos. TABELA 36 - produção aumentada de tomates na primeira colheita após tratamento foliar com HP-1000™ Tratamento Taxa1 (a.i.) Produção2 % acima UTC (kg/rep) UTC — 0,276 a HP-1000™ 30 pg/ml 1,302 b 375 Actigard™ 14g/0,4047ha 0,204 a -25,1 Kocide® + 0,908 m/0,4047 ha. 0,140 a -49,1 Maneb® 0,454 m/0,4047 ha. 1 Taxas de Kocide® e Maneb® são para produto formulado. 2 Médias seguidas por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P = 0,05.

Exemplo 19 - Florescimento prematuro e melhora no crescimento de morangos do tratamento com HP-1000™ quando plantados em solo não fumigado Plantas de morango (“de cala aberta" e "com raiz sem vegetação") cv. Commander foram transplantadas em lotes de terra (0,61 m x 9,15 m) replicadas 5 vezes em uma tentativa de campo de bloqueio completo randomizado. Aproximadamente sessenta plantas individuais foram transplantadas em cada replicata. Tratamentos aplicados nesta tentativa, de campo são relacionados abaixo: Tratamento Processo de Aplicacão HP-1000™ (Plantas “de "cala aberta"”) HP-1000™ Solução em poção de 50 ml de HP-1000™ (40 plantas "com raiz sem (DEN Bioscience) (formulação de elicitor de vegetação") resposta hipersensível a Erwinia amylovora) a 40 pg/ml (a.i.)) despejada diretamente sobre as plantas individuais imediatamente após transplante em solo não fumigado1, seguido por aplicações foliares de HP-1000™ a 40 pg/ml a cada 14 dias. HP-1000™ Embeber a raiz em uma solução de HP-1000™ (40 (plantas "com raiz sem em pg/ml (a.i.) durante 1 h, imediatamente antes vegetação") de transplantar em solo não fumigado,1 seguido por aplicações foliares de HP-1000™ a 40 pg/ml a cada 14 dias.

Brometo de Fumigação do solo a 136,2 kg/0,4047 ha via metila/clorpicrina 75/25 injeção antes de transplantar, nenhum tratamento com HP-1000™ aplicado.

Telone/cloropicrina 70/30 Fumigação do dolo a 170 litros/0,4047 ha via injeção antes de transplantar, nenhum tratamento com HP-1000™ aplicado.

Controle não tratado (UTC) Nenhuma fumigação, nenhum tratamento com HP-1000™ 1 Solo não fumigado foi cultivado para ervilha durante os dois primeiros anos. 0 transplante foi feito no final do outono, quando o tempo frio tomava mais lento o crescimento das plantas. Duas semanas após transplante, a primeira aplicação foliar de HP-1000™ foi feita a 40 pg/ml (a.i.) com um pulverizador de mochila.. Três semanas após transplante, resultados preliminares foram reunidos comparando tratamento com HP-1000™ contra brometo de metil e UTC contando-se o número de flores em todas as plantas de morango “com a cala aberta” em cada replicação. Uma vez que o florescimento não tinha ocorrido em planta "com raiz sem vegetação", cada planta em replicadas para este tratamento foi avaliada para crescimento de folha prematuro medindo-se a distância da ponta da folha ao caule na folha central de 3 agrupamentos de folhas. Resultados (tabelas 37 e 38) indicaram que tratamento com HP-1000™ forneceu crescimento de flores prematuro melhorado e tamanho de folha para plantas de morango “de "cala aberta"” e "com raiz sem vegetação", respectivamente. TABELA 37 - Florescimento prematuro de transplantes de morangos “de "cala aberta"” após tratamento foliar com HP-1000™.

Tratamento Taxa (a.i.) N2 de % UTC flores/rep' acima UTC — 2,0 a HP-1000™ 40 pg/ml 7,5 b 275 Brometo de metila/clorpicrina 136,2 kg/0,4047 ha 5,3 b 163 1 Médias seguidas por letras diferentes são signifícativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 38 - Crescimento de folha aumentado em transplantes de morangos "com raiz sem vegetação" após tratamento foliar com HP-1000™ Tratamento Taxa(a.i.) Comprimento da folha1 % acima UTC (cm) UTC 3,18 a HP-_1_000™_________40_pg_/ml______________4,57b______________44________ ' Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 20- Melhoria de crescimento prematura de pimentas Jalapeno da aplicação de HP-1000™ Transplantes de pimenta Jalapeno (cv. Mittlya) foram tratados com uma porção de raiz de HP-1000 (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Ewrinia amylovora) (30 pg/ml a.i.) durante 1 h, depois transplantados em lotes de terra randomizados replicados quatro vezes. Um controle não tratado (UTC) foi também incluído. Iniciando-se 14 dias antes do transplante, plantas tratadas receberam três pulverizações foliares de HP-1000™ em intervalos de 14 dias usando um pulverizados de mochila. Uma semana após a terceira aplicação de HP-1000™ (54 dias após transplante), a altura da planta foi medida de quatro plantas selecionadas aleatoriamente por replicação. Resultados destas medições indicaram que plantas tratadas com HP-1000™ eram aproximadamente 26% mais altas do que plantas UTC (tabela 39). Além disso, o número de brotos, flores ou frutas em cada planta foi contado. Estes resultados indicaram que as plantas tratadas com HP-1000™ tiveram acima de 61% mais flores, frutas ou brotos comparadas a plantas UTC (tabela 40). TABELA 39 - Altura das plantas aumentada em pimentas Jalapeno após tratamento com HP-1000™.

Tratamento Taxa (a.i.) Altura da planta % UTC UTC (cm)1 acima UTC 17,71 a HP-J000™___________30jxg/ml__________21,75 b________23,_6___ 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 40 - Número aumentado de flores, frutos ou brotos em pimentas Jalapeno após tratamento com HP-1000™.

Tratamento Taxa (a.i.) N2 de flores, % UTC UTC frutas ou acima brotos/planta1 UTC 20,6 a HP-1000™___________30_pg/ml__________l_2_,8b________61,_3___ 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 21 - Melhora no crescimento de tabaco da aplicação de HP-1000™ Arbustos de tabaco foram transplantados em lotes de terra randomizados replicados três vezes. Uma pulverização foliar de HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) foi aplicada após transplante em uma das três taxas: 15, 30 ou 60 pg/ml a.i. Sessenta dias depois, uma segunda aplicação foliar de HP-1000 foi feita. Dois após a segunda aplicação, altura da planta, número de folhas por planta e o tamanho da folha (área) foram medidos de dez plantas selecionadas aleatoriamente por tratamento. Resultados destas medições indicaram que tratamento com HP-1000™ melhorou significativamente o crescimento de plantas de tabaco (tabelas 41, 42 e 43). A altura da planta foi - i aumentada em 6-13%, enquanto plantas tratadas com HP-1000™ a 30 e 60 μ g/ml estavam na média de exatamente acima de 1 folha por planta do que UTC. Mais significativamente, no entanto, tratamento com HP-1000™ a 15, 30 e 60 pg/ml resultou em aumentos correspondentes na área da folha Plantas de tabaco com uma folha extra por planta e um aumento no tamanho de folha médio (área) representam uma resposta significativa comercialmente. TABELA 41 - Altura de plantas aumentada em tabaco após tratamento com HP-_10_0_0™.____________________________________________ Tratamento Taxa(a.i.) Altura da planta %UTC UTC (cm) acima UTC 72,0 HP-1000™ 15 pg/ml 76,4 5,3 HP-1000™ 30 pg/ml 79,2 9,0 HP-JOOO™__________60jig/ml________8_li3__________6,9____ TABELA 42 - Número aumentado de folhas de tabaco por planta após tratamento com HP-1000™.

Tratamento Taxa (a.i.) Folhas/Planta1 % UTC UTC acima UTC 16,8 HP-1000™ 15 pg/ml 17,4 3,6 HP-1000™ 30 pg/ml 18,1 7,7 HP-_1_000™________60_pg_/ml_________17,9_________6,5____ TABELA 43 - Área de folhas aumentada em tabaco planta após tratamento _comHP-]000™_.__________________________________________ Tratamento Taxa (a.i.) Folhas/Planta1 % UTC UTC (cm2) acima UTC 1.246 HP-1000™ 15 pg/ml 1.441 16 HP-1000™ 30 pg/ml 1.543 24 HP-_1_000™________60_pg/m_l________1.649________32___ Exemplo 22 - Melhora no crescimento de trigo semeado no outono da aplicação de HP-1000™ Semente de trigo semeado no outono foi “polvilhada” com HP-1000™ seco (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) em pó na taxa de 85 gramas do produto formulado (3% a.i.) por 45,4 kg de semente, depois plantada usando equipamento de semeadura convencional em lotes de terra com teste randomizado de 356 cm x 3050 cm de comprimento. Tratamentos adicionais incluíram um “polvilhamento” da semente com HP-1000™ em pó (3% a.i.) a 28,34 gramas do produto formulado por 45,4 kg de semente, um embebimento da semente em uma solução de HP-1000™ a uma concentração 20 pg/ml, a.i., durante quatro horas, depois secado ao ar antes do plantio, um “polvilhamento” com fungicida químico (Dividendo) padrão, e um controle não tratado (UTC). Oito dias após o plantio, sementes tratadas com HP-1000 ™ começam a emergir, enquanto que a semente tratada com produto químico padrão e UTC não emergiram até aproximadamente 14 dias após o plantio, o tempo normal esperado. A 41 dias após plantio, arbustos foram removidos do solo e avaliados. Massa de raiz para trigo tratada com HP-1000™ como um “polvilhamento” a 85 g/45,4 kg foi visualmente inspecionada e julgada ser aproximadamente duas vezes tão grande como quaisquer dos outros tratamentos.

Após a tentativa de campo, uma experiência em estufa foi designada para ganhar confirmação destes resultados. Tratamentos incluíram semear trigo polvilhado com HP-1000™ seco (10% a.i.) a uma taxa de 85 gramas por 45,4 kg de semente, embebimento da semente de HP-1000™ em concentração em solução de 20 mg/ml durante quatro horas antes do plantio, e um controle não tratado (UTC). Sementes de trigo de cada tratamento foram plantadas na taxa de 25 sementes por vaso, com cinco vasos servindo como replicadas para cada tratamento. Quinze dias após o plantio, dez arbustos selecionados aleatoriamente de cada vaso de tratamento foram removidos, limpados cuidadosamente e medidos para altura da raiz.Uma vez que a porção de solo acima de arbustos individuais não demonstrou qualquer efeito do tratamento, crescimento de raiz aumentado do tratamento com HP-1000™ não influencia a seleção de amostras. O aumento no crescimento da raiz de qualquer tratamento com HP-1000™ foi significativamente maior do que UTC (tabela 49); no entanto, o tratamento com polvilhamento da semente pareceu dar resultados ligeiramente melhores. TABELA 44 - Tamanho de raiz aumentado em arbustos de trigo após tratamento com HP-1000™.

Tratamento Taxa Comprimento da % UTC UTC raiz (cm)1 acima UTC - 35,6 HP-1000™ (polvilhamento) 85 g/45,4 kg 41,0 b 17,4 HP-1000™ (embebimento) 20 μg/ml 40,8 b 14,6 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 23 - Melhora no crescimento de pepineiros da aplicação de HP-1000™ Uma tentativa de campo de pepineiros produzidos comercialmente consistiu de quatro tratamento, HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) em duas taxas (20 ou 40 pg/ml), um produto químico padrão para controle de doenças (Bravo® (Zeneca Ag Products, Wilmington, Del.) + Maneb®) e um controle não tratado (UTC). Cada tratamento foi replicado quatro vezes em lotes de terra de 0,915 m x 22,87 m com um espaço entre as plantas de aproximadamente 0,61 m para cada tratamento. Pulverizações foliares de HP-1000™ foram aplicadas iniciando na primeira folha verdadeira e repetido em intervalos de 14 dias até a última colheita durante um total de seis aplicações. A mistura fungicida padrão foi aplicada a cada sete dias, ou mais cedo, se garantidas as condições. Colheita comercial começa aproximadamente dois meses após a primeira aplicação de HP-1000™ (após cinco pulverizações de HP-1000™ terem sido aplicadas), e uma colheita final foi feita aproximadamente 14 dias após a primeira colheita.

Resultados da primeira colheita indicaram que tratamento com HP-1000™ melhorou a produção médio dos pepineiros aumentando o número total de pepinos colhidos e não o peso médio de pepineiros individuais (tabelas 45-47). A mesma tendência foi observada na colheita final (tabelas 48-49). Foi comercialmente importante que o aumento na produção resultante do tratamento com HP-1000™ não foi obtido pelo tamanho de pepino médio aumentar significativamente. TABELA 45 - Produção de pepinos aumentada após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

Tratamento Taxa (a.i.) Produção /trt1 % UTC (kg) acima UTC — 10,0 a Bravo+Maneb rótulo 10,8 a 8,4 HP-1000™ 20 pg/ml 12,3 ab 22,8 HP-1000™____________40_pg_/ml_______l_3_,8b________38^0___ 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 46 - Número aumentado de frutos em pepineiros após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

Tratamento Taxa (a.i.) N- de frutos/trt1 % UTC (kg) acima UTC — 24,5 a Bravo+Maneb rótulo 27,6 a 12,8 HP-1000™ 20 pg/ml 31,2 ab 27,0 HP-_1_00_0™________40jig/m_l________3_4_,3b______39^8___ 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 47 - Peso médio dos pepinos após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

Tratamento Taxa (a.i.) Peso/ffuto % troca vs. UTC (kg) UTC — 406 Bravo+Maneb rótulo 390 -4 HP-1000™ 20 pg/ml 395 -3 HP-JOOO™___________40jxg/ml________4_0_3_________-_1____ TABELA 48 - Produção de pepinos aumentada após tratamento com HP-1000™, terceira colheita.

Tratamento Taxa (a.i.) Produção /trt1 % UTC (kg) acima UTC — 17,5a Bravo+Maneb rótulo 14,0 b -20,1 HP-1000™ 20 pg/ml 20,1a 15,3 HP-1000™___________40 pg/ml 20,2 a________15,6 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo cpm MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 49 - Número aumentado de frutos em pepineiros após tratamento com HP-1000™, terceira colheita.

Tratamento Taxa (a.i.) N2 de frutos/trt1 % troca vs. UTC — 68,8 ab Bravo+Maneb rótulo 60,0 a -12,7 HP-1000™ 20 pg/ml 82,3 b 19,6 HP-J000™___________40_pg_/m_l_______85,3 b_________24,0___ 1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 50 - Peso médio dos pepinos após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

Tratamento Taxa (a.i.) Peso/fhito % troca vs. UTC (kg) UTC — 255 Bravo+Maneb rótulo 232 -9 HP-1000™ 20 μg/ml 247 -3 HP-J000™___________40_pg_/ml_________2_37__________"_7____ Exemplo 24 - Harpinpss de Pseudomonas syringae pv syringae induz melhora no crescimento em tomate Para testar se harpinpSS (isto é, o elicitor de resposta hipersensível a Pseudomonas syringae pv syringae (He, S.Y. et al., “Pseudomonas syringae pv syringae Harpin^. A Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants,” Cell 73:1255-66 (1993), que é incorporado aqui por referência, também estimula o crescimento de planta, sementes de tomate (variedade Marglobe) foram semeadas em vasos de 20,24 cm com solo artificial. Dez dias após semeadura, os arbustos foram transplantados em vasos individuais. Por toda a experiência, fertilizante, irrigação de água, temperatura e umidade do solo foram mantidos uniformemente entre as plantas. Dezesseis dias após transplante, a altura da planta inicial foi medida e a primeira aplicação de harpinpss foi feita, isto é referido como dia 0. Uma seguilda aplicação foi feita no dia 15. Dado de crescimento adicional foi coletado no dia 10 e dia 30. A coleta do dado final no dia 30 incluiu ambos altura da planta e peso novo. O harpinpss usado para aplicação durante a experiência foi produzido fermentando DH5 de E. coli contendo o plasmídeo com o gene codificando harpinpSS (isto hrpZ). As células foram coletadas, ressuspensas em tampão de fosfato de potássio 5 mM, e rompidas por tratamento com som. O material tratado com som foi fervido durante 5 minutos e depois centrifugado durante 10 min a 10.000 rpm. O sobrenadante foi considerado como preparação de elicitor isento de célula (CFEP). Solução de 20 e 50 μ g/ml de harpinpss foi preparada com o mesmo tampão usado para preparar a suspensão de células. CFEP preparado da mesma cepa contendo o mesmo plasmídeo, mas sem o gene hrpZ foi usado como o material para tratamento de controle. O agente umectante, Pinene II (Drexel Chemical Co., Memphis, Tenn.) foi adicionado à solução de harpinpSS na concentração de 0,1%, depois harpi^s foi pulverizado em tomateiros até escoar. A tabela 51 mostra que houve uma diferença significativa entre grupos de tratamento com harpinpSS e o grupo de controle. Tomate tratado com harpinpSS aumentou mais do que 10% em altura. O dado suporta a reivindicação de que harpinpSS não age similar ao elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora, em que, quando aplicado a tomateiros e muitas outras espécies de plantas, existe um efeito melhorador do crescimento. Além de um aumento significativo de tomate tratado com harpinpss na altura do tomate e mais biomassa, folhas grandes, conjunto de flores prematuro e aparência total saudável. TABELA 51 - Harpirip^ melhora o crescimento de tomateiros.

Tratamento Altura da planta (cm)1 DiaO Dia 10 Dia 30 Controle CFEP 8,52(0,87)a3 23,9 (1,90) a 68,2 (8,60) a Harpinpss 20 pg/ml 8,8 (0,98) a 27,3 (1,75) b 74,2 (6,38) b Harpinpss 20 pg/ml 8,8 (1,13) a 26,8 (2,31) b 75,4 (6,30) b 1 Altura da planta foi medida próxima a 0,5 cm. Dia 0 refere-se ao dia em que as alturas da planta iniciais foram registradas e a primeira aplicação foi feita. 2 Médias são dadas com SD entre parênteses (n=20 para todos os grupos de tratamento. 3 Letras diferentes (a e b) indicam diferenças significativas (P=0,05) entre as médias. As diferenças foram avaliadas por ANOVA seguido por LSD Fisher.

Apesar da invenção ser descrita em detalhes para os fins de ilustração, compreende-se que os detalhes são somente para estes fins, e variações podem ser feitas na mesma pelos versados na arte sem sair do espírito e escopo da invenção que é definida pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Processo para melhorar o crescimento em plantas, caracterizado pelo fato de compreender: prover uma planta transgênica ou semente de planta transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de um patógeno de planta bacteriano, e cultivar as plantas transgênicas ou plantas transgênicas produzidas a partir das sementes de planta transgênica sob condições efetivas para melhorar o crescimento da planta.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de um patógeno selecionado dentre o grupo consistindo de Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, e misturas dos mesmos.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Erwinia chrysanthemi.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Erwinia amylovora.

5. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Pseudomonas syringae.

6. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Pseudomonas solanacearum.

7. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Xanthomonas campestris.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível codificado compreende SEQID NOs: 1,3, 5 ou 7, ou fragmentos elicitores de resposta hipersensível dos mesmos.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de dicotiledôneas e monocotiledôneas.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de arroz, trigo, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívias, repolho, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, cebola, alho, beringela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, moranga, zucchini, pepino, maçã, pera, melão, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo, e cana de açúcar.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de rosas, Saintpaulia, petúnia, pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo e zinia.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo de que uma planta transgênica é provida.

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma semente de planta transgênica é provida.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender: aplicar a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível às plantas propagadas para melhorar o crescimento da planta.