KR100452106B1

KR100452106B1 - 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자 및그 용도

Info

Publication number: KR100452106B1
Application number: KR10-2002-0008187A
Authority: KR
Inventors: 황인규; 최진우
Original assignee: 최진우; 황인규
Priority date: 2002-02-15
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2004-10-08
Also published as: KR20030068302A

Abstract

본 발명은 잰토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis) 유래의 과민성 반응 유발인자 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물에서 과민성 반응을 유발하는 분리된 DNA, 식물에서의 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드, 상기 DNA에 의해 형질전환된 발현 벡터, 상기 과민성 유발인자 폴리펩티드를 이용한 식물의 질병 내성 부여방법, 식물의 생장촉진방법, 해충 방제 방법에 관계한다.

Description

잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자 및 그 용도{HYPERSENSITIVE RESPONSE ELICITOR FROM XANTOMONAS AXONOPODIS AND USE THEREOF}

본 발명은 잰토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis) 유래의 과민성 반응 유발인자 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물에서 과민성 반응을 유발하는 분리된 DNA, 식물의 과민성 반응 유발인자 폴리펩이드, 상기 DNA에 의해 형질전환된 발현 벡터, 상기 과민성 유발인자 폴리펩티드를 이용한 식물의 질병 내성 부여방법, 식물의 생장촉진방법, 해충 방제 방법에 관계한다.

식물들은 병균이나 환경적 스트레스에 의해 정교한 방어 기작(defense mechanism)이 나타나는데 이러한 방어기작은 전신적 혹은 국부적으로 일어난다. 이러한 식물의 방어 기작을 살펴보면, 먼저 식물체가 외부로부터 병원균의 침입을 수용체를 통하여 인지하는 과정으로부터 시작된다. 이렇게 인지된 신호는 식물 세포내의 정교한 신호 전달체계를 거친 후 크게 과민성 반응(hypersensitive reaction, HR)과 광범위한 병원체의 침입에 대한 방어효과(systematic acquired resistence: SAR)라는 과정을 통해서 외부의 침입인자로부터 자신을 방어하게 된다. 과민성 반응에 의해 식물 조직 내에 국부적인 괴사가 일어나는데, 감염된 식물세포가 죽게되면 세균은 더 이상 확산되지 않게 된다. 이러한 과민성 반응의 반응 메카니즘은 아직 확실하게 밝혀진 것은 아니지만, 세균에 의해 생산되는 과민성 반응 유발인자, 즉 엘리시터(Elicitor)가 식물의 수용체에 결합함으로써 시그널이 전달되어 다양한 방어 관련 유전자들(defense-related genes)이 발현되기 때문에 과민성 반응이 나타나는 것으로 추정된다.

식물의 과민성 반응의 엘리시터의 생산은 모든 병원 세균들이 공통적으로 지니고 있는 hrp 유전자로 불리우는 유전자 집단에 의해 조절된다. 현재까지 hrp 유전자는 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae pv. syringae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 잰토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)로부터 클로닝되어 있다. hrp 유전자는 hrp 유전자 발현을 조절하는 부위, 과민성 반응 유도체인 harpin 단백질을 발현하는 부위, 발현된 harpin을 분비하는데 관여하는 부위의 세부분으로 크게 나눌 수 있다. 현재 harpin 단백질로 알려져 있는 것은 세 가지인데, 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae pv. syrinage) 유래의 HrpZ, 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 유래의 HrpN, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 유래의 PopA이다.

식물의 자기 생체방어기작을 이해하게 되면, 이와 관련된 유전자들을 보다 활성화시키거나, 식물 및 미생물로부터 내병성 관련 유전자를 분리, 식물에 도입 발현시킬 수 있고, 이를 통해 식물이 병충해로부터 자기방어능력을 갖도록 만들어 줄 수 있기 때문에, 이러한 식물의 생체방어기작을 응용한 생물농약의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

Messenger^TM는 미국 워싱턴주에 소재하는 에덴 바이오사이언스사(Eden·Bioscience)에 의해 시판되기 시작한 생물농약으로서, 하핀(Harpin) 단백질의 특성을 살려서 제조된 것이다. 하핀 단백질은 광범위한 병원체의 침입에 대한 방어효과(systematic acquired resistence: SAR)를 나타내는 것으로 알려졌다. 또한 하핀은 조기 성장과 수확을 높이고 병충해에 대한 내성도 부여하는 것으로 확인되고 있다. 하핀 단백질은 사과나 배에 발생하는 화상병 (fire blight)을 야기시키는 세균이 발하는 아미노산의 집합체이며 이것을 엽면살포하면 식물은 세균이 침입을 개시했다고 착각하여 체내에 존재하는 자위기능을 가동시킨다. 그러나, 이러한 메신저는 실제 적용시 수돗물로 희석하여 사용하여야 하는데, 수돗물로 희석할 경우 수돗물 중의 염소 성분에 의해 성능이 저하되는 약점을 갖는다.

본 발명의 하나의 목적은 식물 병원체로부터 유래된 신규한 과민성 반응 유발인자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리된 DNA 분자로 형질전환된 발현 벡터, 상기 분리된 DNA 분자로 형질전환된 숙주, 분리된 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 식물 및 분리된 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 식물 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 이용한 식물의 질병 내성 부여 방법, 식물 성장 촉진 방법 및 해충 방제 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자의 유전자지도,

도 2는 본 발명에 의한 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자의 동정을 위한 과발현 시험 결과를 나타내는 전기영동 결과도,

도 3은 본 발명에 의한 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자를 이용한 과민성 반응 시험 결과를 보이기 위한 담배 잎 사진,

도 4는 본 발명에 의한 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자를 이용한 비기주에서의 과민성 반응 시험 결과를 보이기 위한 담배잎 사진,

도 5는 본 발명에 의한 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자와 시판 중인 Messenger^TM의 수돗물에서의 안정성을 비교한 결과를 보이기 위한 담배 잎 사진이다.

이하에서 첨부 도면을 참고하여 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 잰토모나스 악소노포디스 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines)로부터 기존에 알려진 hrp 유전자와 유사하게 식물의 과민성 반응을 유발하는 과민성 반응 관련 유전자(hypersensitivity response-related genes)를 분리하여 본 발명을 성안하게 되었다. 이러한 유전자들은 hpaG로 명명하였는데, 이들 유전자들은 기주에서의 병원성과 비기주에서의 과민성 반응에 관여한다.

도 1은 본 발명에 의한 신규한 과민성 유발인자인 hpaG를 포함하는 잰토모나스 악소노포디스 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 게놈 영역의 분자구조를 나타낸 도면이다. 도 1에서 박스 및 화살표는 유전자 또는 개방 리딩 프레임(open reading frame)을 나타낸다.

본 발명에 의한 신규한 과민성 유발 인자의 염기 서열은 다음과 같다(서열 1).

ATGAATTCTTTGAACACACAGCTCGGCGCCAACTCGTCCTTCTTTCAGGTTGACCCCGGCCAGAACACGCAATCTAGTCCGAACCAGGGCAACCAGGGCATCTCGGAAAAGCAACTGGACCAGCTGCTGACCCAGCTCATCATGGCCCTGCTTCAGCAGAGCAACAATGCCGAGCAGGGTCAGGGTCAAGGCCAGGGTGGTGACTCTGGCGGTCAGGGCGGCAATCCGCGGCAGGCCGGGCAGTCCAACGGCTCCCCCTCGCAATACACCCAGGCGCTGATGAATATCGTCGGAGACATTCTCCAGGCGCAGAATGGTGGCGGCTTCGGCGGCGGCTTTGGTGGTGGCTTCGGTGGCATCCTCGTCACCAGCCTTGCGAGCGACACCGGATCGATGCAGTAA(402bp)

본 발명의 신규한 과민성 반응 유발인자는 상기 서열 1의 분리된 DNA 분자 이외에, 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 서열 번호 1의 염기서열을 포함하는 DNA 분자에 혼성화되는 DNA 분자 및 상기 서열 1의 DNA 분자 또는 서열 1의 DNA 분자에 혼성화되는 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자도 포함한다. 엄격한 조건이란 예를 들어, 혼성화 온도가 60℃ 이상이거나 세척시 완충액 농도가 0.1xSSC에서 혼성화를 수행하는 것이다.

상술한 본 발명의 식물에서 과민성을 유발하는 분리된 DNA에 의해 코드화되는 식물의 과민성 유발인자 폴리펩티드(또는 단백질)는 서열목록의 서열 2에 상응하는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 과민성 유발 인자 폴리펩티드 또는 단백질, 즉 본 발명에 의한 HpaG 단백질은 크기는 13.4 kDa이고, pI는 3.85이며, 아미노산 중 글리신이 풍부하고 열에 안정한 특성을 갖는다.

MNSLNTQLGANSSFFQVDPGQNTQSSPNQGNQGISEKQLDQLLTQLIMALLQQSNNAEQGQGQGQGGDSGGQGGNPRQAGQSNGSPSQYTQALMNIVGDILQAQNGGGFGGGFGGGFGGILVTSLASDTGSMQ (133 아미노산)

본 발명의 상기 HpaG 단백질의 특성을 다른 과민성 유발 인자들과 비교하여 하기 표 1로 정리하였다.

	HpaG	HrpN	HrpZ
소스	잰토모나스 악소노포디스 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines)	어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)	슈도모나스 시린지 시린지(Pseudomonas syringae pv. syringae)
크기	402bp(133aa)	1212bp(403aa)	1023bp(341aa)
분자량	13.4kDa	39.7kDa	34.7kDa
pI	3.85	4.44	4.01

본 발명의 HpaG 단백질은 잰토모나스 악소노포디스 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines)에 의해 생산되는 천연 단백질로서, 식물방어반응을 일으키도록 하는 신호전달과정에 관여하는 것으로 추정된다. 이러한 신호 전달 과정은 식물의 성장, 질병 내성, 병충해 내성에 관계되기 때문에, 본 발명의 HpaG 단백질이 식물에 적용될 경우, 식물이 자신의 생장 및 방어 기구를 활성화하도록 유도하여 식물의 생장을 촉진시키고 각종 질병 및 병충해에 대한 내성을 부여한다. 본 발명이 적용될 수 있는 적당한 식물로는 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물을 모두 포함한다. 이러한 식물의 예들은 오이, 담배, 고추, 감자, 토마토, 상추, 배추, 무, 깻잎, 참께, 파프리카, 피망, 가지, 면화, 콩, 국화 등의 쌍떡잎 식물과 벼,보리, 밀, 옥수수 등의 외떡잎 식물을 포함한다.

따라서, 본 발명에 의한 신규한 과민성 반응 유발인자는 식물에 질병 내성을 부여하거나, 식물의 생장을 촉진시키거나 해충 방제를 위해서 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 양상에 따른 식물에 대한 질병 내성 부여 방법은 단백질 또는 폴리펩티드가 식물 또는 식물 종자의 세포에 접촉하여 질병 내성을 부여하는 조건 하에서 잰토모나스 악소노포디스 글리시네스 유래의 본 발명의 과민성 반응 유발 인자 단백질, 즉, HpaG를 비감염성 형태로 식물 또는 식물 종자에 적용하는 과정을 포함한다. 본 발명의 신규한 과민성 반응 유발인자를 이용하여 식물에 대하여 질병 내성을 부여하는 경우에, 질병에 대해 완전하게 면역화되는 것은 아니나, 질병의 정도가 경감되고 전개도 둔화되며, 병소의 면적도 감소된다. 본 발명의 질병 내성 부여 방법이 적용될 수 있는 식물의 질병의 예들은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생되는 질병, 파이톱소라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 의해 발생되는 질병, 파이톱소라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 의해 발생되는 질병, 레베루라 타우리카(Leveillula taurica)에 의해 발생되는 질병, 지베레라 지아(Gibberela zeae)에 의해 발생되는 질병, 푸치니아 그라미니스(Puccinia graminis)에 의해 발생되는 질병, 플라스모디오포라 브라시케 (Plasmodiophora brassicae)에 의해 발생되는 질병, 매그나포르테 그리시(Magnaporthe grisea)에 의해 발생되는 질병, 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)에 의해 발생되는 질병, 밸사 말리(Valsamali)에 의해 발생되는 질병, 글로메레라 싱굴라타(Glomerella cingulata)에 의해 발생되는 질병, 보트리티스 시네리(Botrytis cinerea)에 의해 발생되는 질병, 클라도스포리움 펄붐(Cladosporium fulvum)에 의해 발생되는 질병, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 의해 발생되는 질병, 잰토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris pv. citri)에 의해 발생되는 질병, 스트렙토마이세스 스카비스(Streptomyces scabies)에 의해 발생되는 질병, 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 발생되는 질병, 잰토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 발생되는 질병, 부크홀데리아 글루매(Bukholderia glumae)에 의해 발생되는 질병, 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)에 의해 발생되는 질병, 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)에 의해 발생되는 질병, 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae pv. glycinea)에 의해 발생되는 질병, 잰토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines)에 의해 발생되는 질병, 크라비박토 미시가넨스(Clavibacter michiganense subsp. michiganense)에 의해 발생되는 질병을 포함한다.

본 발명의 다른 양상에 따른 식물의 생장 촉진 방법은 단백질 또는 폴리펩티드가 식물 또는 식물 종자의 세포에 접촉하여 식물의 생장을 촉진시키는 조건 하에서 잰토모나스 악소노포디스 글리시네스 유래의 본 발명의 과민성 반응 유발 인자 단백질, 즉, HpaG를 비감염성 형태로 식물 또는 식물 종자에 적용하는 과정을 포함한다. 본 발명에 의한 식물 성장 촉진은 여러 가지 양상으로 나타나는데, 예를 들어, 단수 향상 및 조기 성숙 등의 효과가 수득될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에 따른 식물에 대한 해충 방제 방법은 단백질 또는 폴리펩티드가 식물 또는 식물 종자의 세포에 접촉하여 해충을 방제하는 조건 하에서 잰토모나스 악소노포디스 글리시네스 유래의 본 발명의 과민성 반응 유발 인자 단백질, 즉, HpaG를 비감염성 형태로 식물 또는 식물 종자에 적용하는 과정을 포함한다. 본 발명에 의한 과민성 유발 인자가 적용된 식물은 식물과 해충이 접촉하는 것을 방지하고 식물에 근접한 해충을 죽인다.

본 발명에 따른 과민성 유발 인자 폴리펩티드 또는 단백질은 단독으로 사용되거나 기타 첨가제를 포함하는 조성물의 형태로 식물에 직접 적용될 수 있다. 상기 조성물은 활성 성분으로 본 발명에 의한 과민성 반응 유발인자 단백질, HpaG를 포함하는 이외에, 비료, 살충제, 살균제, 완충제, 습윤제, 코팅제, 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질 조성물은 분사법, 주입법, 도포법, 침지법 등의 공지의 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 종자에 적용될 수 있다.

본 발명에 의한 신규한 과민성 반응 유발인자를 이용해서 식물에 질병 내성을 부여하거나, 식물의 생장을 촉진시키거나 해충을 방제하는 또 하나의 방법은 식물 또는 식물 종자를 본 발명의 분리된 DNA 분자로 형질전환시키는 것이다.

본 발명의 분리된 DNA 분자는 종래의 DNA 재조합 기술을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 식물에서는, 형질전환된 단일 세포로부터 번식력이 있는 식물체가 재분화될 수 있고, 따라서, 식물세포에 도입된 유전자는, 최종적으로, 종자를 통해 몇 세대에 걸쳐서 후손에 전해질 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 본 발명의 분리된 DNA 분자로 형질전환된 발현 벡터이다. 본 발명에서 사용가능한 발현벡터는 다양한 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터 등을 포함한다. 바람직한 발현 벡터의 예로는 pUC18, pBluescript를 들 수 있다.

본 발명의 신규한 과민성 반응 유발 인자 폴리펩티드 또는 단백질을 발현시키기 위한 숙주 벡터 시스템은 형질전환된 세균, 효모와 같은 미생물, 바이러스, 바이러스에 의해 감염된 곤충 세포 시스템, 세균에 의해 감염된 식물 세포를 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, E Coli-pBluescript 숙주-벡터 시스템을 들 수 있다.

본 발명에 따라 재조합된 분자는 여러 가지 방법에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 분리된 DNA를 세포에 도입하는 방법 가운데 하나는 Ti 플라스미드를 이용하는 방법이다. 토양 세균인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 Ti 플라스미드(Ti plasmid)라고 불리는 거대한(약 200,000 염기쌍) 플라스미드를 가지고 있다. 이 세균이 식물세포와접촉하면, T DNA(약 23,000 염기쌍)라고 불리는 단편이 Ti 플라스미드로부터 식물세포의 핵으로 옮겨지고, 형질전환을 하는 동안에 식물의 염색체 중 1개의 임의의 위치에 통합된다. 이와 유사하게 아그로박테리움 라이조지니(Agrobacterium rhizogenes)의 Ri 플라스미드를 이용할 수 있다.

분리된 DNA를 식물 세포에 도입하는 다른 방법은 바이오리스틱스(Biolistics)이다. 바이오리스틱스 (biological ballistics) 방법은 입자 충격(Particle bombardment)법이라고도 불리우는 것으로, 외래 유전자로 덥 씌워진 또는 내부에 포함하고 있는 작은 금속 입자를 식물에 쏨으로써 원하는 유전자를 식물세포 내로 도입하고 그 결과 식물의 형질전환을 이루고자 하는 방법이다. 바이오리스틱스 방법은 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법이 기능을 하지 못하는 많은 식물체들, 특히 단자엽 식물들을 형질전환시키는데 이용될 수 있다.

또 하나의 DNA 도입방법은 미세주입법(microinjection)이다. 미세주입방법은 현미경에 부착된 미세조작기(micromanipulator)를 이용하여 매우 가늘게 뽑은 유리 모세관을 통해 소량의 물질을 세포벽이 제거된 원형질체 형태의 식물 세포의 특정 부위에 주입하는 방법이다.

또 다른 방법은 리포좀(Liposome)을 이용한 방법이다. 지질(lipid) 용액을 DNA나 RNA의 수용액에 떨어뜨리면 지질 간의 소수결합(hydrophobic interaction)에의하여 DNA나 RNA 수용액을 소량 함유한 지질 소포(lipid vesicle(liposome))가 형성된다. DNA 또는 RNA를 함유한 리포좀은 화학적 성질이 원형질막과 유사하기 때문에 원형질체와 융합을 이룰 있으며 또는 미세주입법에 의하여 식물세포의 특정 내부기관(예, 액포)으로 주입될 수 있다.

본 발명의 분리된 DNA를 식물 세포내로 도입하는 다른 방법은 전기충격법(electroporation)과 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 이용법이다. 전기충격법은 도입하고자 하는 외래 DNA가 녹아있는 수용성 완충액에 식물 원형질체를 넣고 강하고 짧은 전류를 적용하여 순간적으로 DNA가 원형질체 내로의 도입되도록 함으로써 식물 염색체 내에 외래 유전자를 도입시킨다. 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))은 매우 강한 흡수력을 가지고 있으며 고농도 PEG 용액에 세포가 위치되면 세포막의 변성을 가져와 순간적으로 PEG 수용액에 첨가되어 있는 DNA가 세포 내로 전달된다.

기내 재분화 배지에 항생제 등의 선별표지를 첨가하여 외래 유전자 도입 후 형질전환된 세포를 선별해 낸 후 형질전환된 원형질체를 식물체로 재분화시킨다. 이러한 재분화 방법은 식물 종에 따라 달리 채용할 수 있는데, Evans et al., Handbook of Plant Cell, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., New York, 1983) 등의 문헌에 설명되어 있는 공지의 방법을 이용할 수 있다.

실시예

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 이하의 실시예들은 단지 설명을 위한 것으로, 이들 실시예들은 본 발명의 보호범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

hpaG 유전자의 과발현(overexpression)

hpaG를 발현 벡터로서 pT7-7에 넣은 클론이 pTJ1이며, 이 플라스미드를 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, 이러한 이. 콜라이 내에서 대량으로 과발현시킨다. 우선, LB 플레이트에서 자란 이. 콜라이 BL21(DE3) pTJ1의 단일 콜로니를 10㎖ LB 육즙에 접종한다. 접종한 세포를 37℃ 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 약 230rpm으로 밤새(약 12시간 내지 약 16시간) 배양한다. 밤새 배양한 10㎖의 1L LB 육즙에 2차 배양하여 37℃하에서 쉐이킹 인큐베이터에서 배양한다. 배양한 배양액을 4℃에서 6,000rpm으로 20분 동안 원심분리한다. 원심분리한 후, 상층액은 버리고 셀 펠렛(cell pellet)을 20ml 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 재현탁시킨다. 이 현탁액에 HpaG 단백질이 존재하며, 이 현탁액을 SDS-PAGE와 과민성 반응(HR) 시험으로 HpaG의 존재 유무를 확인한다. 이러한 실험의 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1)에 의해 발현된 본 발명의 과발현된 HpaG의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 분석 결과를 나타낸 사진이다.

도 2를 참조하면, 레인 1은 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1)로부터의 단백질이고, 레인 2는 IPTG-유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1)로부터 수득한 단백질이다. 레인 3은 IPTG-유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3)(pTJ1)로부터 수득한 초음파처리후 100℃에서 10분간 가열한 단백질이다.

-SDS-PAGE 시험 방법

BIO-RAD사의 미니-겔 장치를 조립한 후, 15% 분리 겔(S.D.W. 2.35 ml, 1.5M Tris-HCl, pH 8.8, 2.5ml, 10% SDS 0.1 ml, 30% 아크릴아마이드 용액 5ml, 10% APS 0.05ml, TEMEI 0.005ml)을 부어서 굳힌다. 그 위에 4% 농축 겔 (stacking gel)(S.D.W. 2.44 ml, 0.5M Tris-HCl, pH 6.8, 1ml, 10% SDS 0.04 ml, 30% 아크릴아마이드 용액 0.532ml, 10% APS 0.02ml, TEMED 0.004ml)을 붓고 콤(comb)을 꽂아 1시간 동안 굳힌다. 준비된 단백질 시료를 2×로딩 버퍼(0.5M Tris-HCl pH 6.8, 100% 글리세롤, 10% SDS, 2-멀캅토에탄올, 1% 브로모페놀 블루, S.D.W.)와 동량으로 섞은 후, 웰(well)에 로딩한다. 50V로 1시간 30분 동안 겔을 러닝시킨후, 염료가 농축 겔을 지나가 분리 겔에 도달하면 150V로 겔을 러닝시킨다. 염료가 겔 끝까지 도달했을 때, 정지시킨 후, 겔을 염색 용액(staining solution)(코마시블루 R-250 1.0g, 메탄올 450ml, 빙초산 100ml, S.D.W. 450ml)에 넣어 한 시간 동안 락커(rocker)에서 진탕하면서 염색하고 탈염 용액(destaining solution)(메탄올 100ml, 빙초산 100ml, S.D.W. 800ml)에 넣고 락커에서 흔들어서 탈염시킨다. 30분마다 탈염 용액을 교체해 주면서 4차례 겔을 세정한다. 탈염 과정이 완료되면 증류수로 교환해 준 후 밴드를 크기 마커(size marker)와 비교하여 확인한다.

- 과민성 반응 시험

위 과정에 의해 준비한 HpaG를 정량 희석하여 과민성 시험을 할 식물체의 잎에 주입한다. 주입 시에는 잎 뒷면을 바늘로 찔러 바늘자국을 낸 다음, 주사기를 이용하여 바늘 자국을 통하여 HpaG를 잎의 세포 간극에 주입시킨다. 주입 후 24시간 이내에 잎의 주입한 부분만 괴사를 일으키면 과민성 반응이 정상적으로 일어난 것으로 판단할 수 있다. 배양한 균을 살균수로 2회 세정하고 O.D.를 0.5로 희석한 후 균을 잎에 주입한 후 관찰한다.

도 3은 다음과 같은 실험 과정에 의해 침윤시킨 후 24시간이 경과한 상태에서의 반응을 나타낸 담배(cv. Samsun) 잎의 사진이다. 도 3의 잎 위에 표시된 각각의 숫자는 다음과 같이 처리하였다.

1. IPTG 유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1)으로부터 열처리된 세포 추출물.

2. IPTG 유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1)으로부터의 세포 추출물.

3. 생존한 IPTG 유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1).

4. 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1)으로부터의 세포 추출물.

5. 생존한 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pTJ1) 세포.

6. 50mM Tris-HCl, pH 8.0

7. IPTG 유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pT7-7)으로부터의 세포 추출물.

8. 생존한 IPTG-유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pT7-7).

9. 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pT7-7)으로부터의 세포 추출물.

10. 생존한 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) (pT7-7).

이 실험은 HpaG 유전자에서 생성된 폴리펩티드가 과민성반응을 유발시키는 인자임을 나타내준다. 페널 6∼10까지의 결과는 이 실험에서 사용된 E. coli BL21(DE3)(pT7-7)균주가 담배잎에 과민성반응을 전혀 유발시키지 않음을 보여주고 있으며 페널 1∼4의 결과는 여기에 HpaG 유전자를 삽입한 E. coli BL21(DE3)(pTJ1)균주에선 폴리펩티드가 IPTG에 의해 생성되어 과민성반응을 일으킴을 보여주고 있다. 또한 페널 1은 이렇게 생성된 폴리펩티드가 열에 매우 안정한 특성을 지니고 있음을 보여준다. 페널 5는 HpaG 유전자가 IPTG가 없을시 폴리펩티드를 생성치 않음을 나타낸다.

결론적으로 HpaG 유전자가 합성하는 폴리펩티드가 과민성 반응을 유발시키는 인자이며 이 유전자는 IPTG에 의해 폴리펩티드를 합성하게 되고 이렇게 합성되어진 과민성 유발인자는 열에 매우 안정한 특징을 지니고 있음을 확인할 수 있다.

비기주에서의 과민성 반응 유발 테스트

도 4는 비기주에서의 과민성 시험 결과를 나타낸다. 도 4a는 고추(cv. Chokwang)에서의 과민성 시험 결과를 나타낸 사진이고, 도 4b는 담배(cv. Samsun)에서의 과민성 시험 결과를 나타낸 사진이고, 도 4c는 토마토(cv. Seokwang)에서의 과민성 시험 결과를 나타낸 사진이다.

패널 1은 IPTG 유도된 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3)로부터의 열처리한 초음파처리물을 처리한 것이고; 패널 2는 멸균된 증류수를 처리한 것이며; 패널 3은 잰토모나스 악소노포디스 pv. 글리시네스 8ra(X. axonopodispv. glycines 8ra)를 처리한 것이며, 패널 4는 트랜스포손 Tn3gusA을 삽입하여 돌연변이를 유발시킨 잰토모나스 악소노포디스 pv. 글리시네스 8ra 4-9(X. axonopodispv. glycines 8ra)를 처리한 것이다. 잰토모나스 악소노포디스 pv. 글리시네스 8ra(X. axonopodispv. glycines 8ra)는 고추 및 토마토 식물에서는 과민성 반응을 유도하였으나, 담배에서는 과민성 반응을 유발하지 않았다. 또한 HpaG 단백질은 고추 및 담배에서는 과민성 반응을 유발하였으나, 토마토에서는 과민성 반응을 일으키지 않았다. 이러한 과민성 반응의 시험 결과를 하기 표 2에 요약하였다.

	고추	담배	토마토
HpaG	+	+	-
Xag 8ra	+	_	+
Xag 8ra hpaG::Tn3gusA 70-1	+	_	+

상기 표에서 +는 과민성 반응을 유발한 것이고, -는 과민성 반응을 유발하지 않았음을 가리킨다.

이 실험에서 본 발명에 의한 정제된 HpaG는 고추 및 담배에서는 엘리시터로작용하나 토마토에서는 엘리시터로 작용하지 않음을 보여준다. 반면 생합성 유전자 HpaG를 보유하고 있는 잰토모나스 악스노포디스는 고추와 토마토에서 엘리시터로 작용하고 담배의 경우는 생성된 폴리펩티드가 극히 미량이거나 세포밖으로 배출이 되지 않아 과민성 반응을 유발하지 못하는 것으로 볼 수 있다. 그리고 개방 리딩 프레임에 트랜스포손(transposon)[Tn3gusA]이 삽입된(도 1 참조) 돌연변이인 70-1은 HpaG 유전자가 없어 병원성을 상실하였지만 고추나 토마토에서는 여전히 과민성반응을 유도하는 엘리시터로 작용하였고 담배에선 반응을 유발하지 못했다.

상기 표 2의 결과를 통해서, HpaG에 의해 생성되는 폴리펩티드는 고추와 담배에 과민성 유발인자로 작용하고, 식물별로 다양한 물질이 과민성유발인자로 작용될 수 있다는 사실을 확인할 수 있다.

수돗물에서의 안정성 비교 시험

본 발명에 의한 잰토모나스 악소노포디스 유래의 과민성 반응 유발인자(HpaG 단백질)를 시판 중인 생물농약(Messenger^TM)에 포함되어 있는 HrpN(비교예 1), HrpZ(비교예 2) 단백질과 상호 비교하였다. 본 실험에 사용된 단백질들은 모두 별도로 과발현시켜 정제된 단백질을 사용하였으며 수돗물에서의 안정성과 농도비교실험을 실시하였고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

HpaG, HrpN, HrpZ의 수돗물에서의 농도 비교실험 결과

	실시예(HpaG)	비교예 1(HrpN)	비교예 2(HrpZ)
농도(㎍/ml)시간	100	10	1	0.1	100	10	1	0.1	100	10	1	0.1
4시간	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2시간	+(3)	+(6)	-(9)	-	-(3)	-(6)	-(9)	-	-	-	-	-
1시간	+(2)	+(5)	-(8)	-	+(2)	-(5)	-(8)	-	-	-	-	-
30분	+(1)	+(4)	-(7)	-	+(1)	-(4)	-(7)	-	-	-	-	-
0시간	+	+	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-

상기 표에서, "+"는 사용한 비기주 식물에서 과민성 반응을 유발한 것을 의미하고, "-"는 과민성 반응을 유발하지 않은 것을 의미한다. 또한 괄호 안의 숫자는 도 5에서의 패널 번호를 가리킨다.

상기 표 3에서 시간은 수돗물에 녹인 후 과민성 반응 시험을 개시하기 전까지의 경과 시간을 나타낸다. 이 실험에서 본 발명에 의한 과민성 유발인자는 기존의 과민성 유발인자들에 비해 농도면에서 10배 이상 효과적이며 수돗물에 대해서도 매우 안정적인 특성을 갖추고 있음을 확인할 수 있다.

본 실험에서 비교예로는 시판되고 있는 메신저(Messenger^TM)를 이용하였고, 실시예로서 본 발명의 HpaG 단백질 동결건조분말을 이용하였다. 이와 같이 준비한 시약을 동일한 농도로 조정하여 담배(cv. Samsun) 잎에 주입한 후 24시간 동안 과민성 유발 여부를 관찰하고, 그 결과 사진을 도 5에 나타내었다. 도 5에서 상단의 A는 본 발명의 HpaG 단백질을 이용한 결과이고, B는 상기 메신저를 이용한 결과이다.

도 5의 결과를 통해서 확인되는 바와 같이, 기존의 Messenger^TM(B)는 수돗물에 희석할 경우 1시간 경과 후부터 거의 과민성 반응을 유도하지 못하는데 반하여, 본 발명의 HpaG 단백질(A)은 수돗물에 10배 희석하여도 수돗물 중 염소 성분에 의해 성능이 열화되지 않고 과민성 반응을 시현하였다. 따라서, 본 발명의 HpaG 단백질은 질병 내성 부여, 식물 성장 촉진 또는 병충해 방제용의 생물농약으로 제조되어 사용될 경우 수돗물로 희석해서 사용하여도 그 효능이 열화되지 않고 그대로 유지될 수 있는 이점을 갖는다.

본 발명에 의한 신규한 식물의 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 식물 또는 식물 종자에 적용될 경우, 식물에 질병에 대한 내성을 부여하고, 성장을 촉진하여, 해충을 방제하는 효과를 제공할 수 있다. 더욱이, 이러한 효과는 수돗물에 의해서도 저하되지 않는 이점을 제공한다.

한편, 본 발명에 의한 신규한 과민성 유발 인자 DNA에 의해 형질전환된 식물 또는 식물 종자로부터 육성된 식물은 우수한 내병성, 내해충성, 및 성장성을 갖는다.

<110> HWANG, IN GYU CHOI, JIN WOO <120> Hypersensitive response elicitor from Xanthomonas axonopodis and use thereof <130> JWC <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 402 <212> DNA <213> Xanthomonas axonopodis <400> 1 atgaattctt tgaacacaca gctcggcgcc aactcgtcct tctttcaggt tgaccccggc 60 cagaacacgc aatctagtcc gaaccagggc aaccagggca tctcggaaaa gcaactggac 120 cagctgctga cccagctcat catggccctg cttcagcaga gcaacaatgc cgagcagggt 180 cagggtcaag gccagggtgg tgactctggc ggtcagggcg gcaatccgcg gcaggccggg 240 cagtccaacg gctccccctc gcaatacacc caggcgctga tgaatatcgt cggagacatt 300 ctccaggcgc agaatggtgg cggcttcggc ggcggctttg gtggtggctt cggtggcatc 360 ctcgtcacca gccttgcgag cgacaccgga tcgatgcagt aa 402 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Xanthomonas axonopodis <400> 2 Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Leu Gly Ala Asn Ser Ser Phe Phe Gln 1 5 10 15 Val Asp Pro Gly Gln Asn Thr Gln Ser Ser Pro Asn Gln Gly Asn Gln 20 25 30 Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Thr Gln Leu Ile Met 35 40 45 Ala Leu Leu Gln Gln Ser Asn Asn Ala Glu Gln Gly Gln Gly Gln Gly 50 55 60 Gln Gly Gly Asp Ser Gly Gly Gln Gly Gly Asn Pro Arg Gln Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ser Asn Gly Ser Pro Ser Gln Tyr Thr Gln Ala Leu Met Asn Ile 85 90 95 Val Gly Asp Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly 100 105 110 Phe Gly Gly Gly Phe Gly Gly Ile Leu Val Thr Ser Leu Ala Ser Asp 115 120 125 Thr Gly Ser Met Gln 130

Claims

(a) 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 분자;

(b) 엄격한 조건하에서 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 DNA 분자에 혼성화되는 DNA 분자; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 DNA.
서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산을 갖는 식물의 과민성 반응을 유발하는 폴리펩티드.
제 1항의 분리된 DNA 분자로 형질전환된 발현 벡터
제 1항의 분리된 DNA 분자로 형질전환된 숙주.
제 1항의 분리된 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 식물.
제 1항의 분리된 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 식물 종자.
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제 2항의 폴리펩티드를 활성성분으로 포함하는 조성물.